LiebermannBurchard test

From Wikipedia, the free encyclopedia

Jump to: navigation, search

The LiebermannBurchard or acetic anhydride test is used for the detection of
cholesterol. The formation of a green or green-blue colour after a few minutes is
positive.
LiebermanBurchard is a reagent used in a colourimetric test to detect cholesterol,
which gives a deep green colour. This colour begins as a purplish, pink colour and
progresses through to a light green then very dark green colour. The colour is due to the
hydroxyl group (-OH) of cholesterol reacting with the reagents and increasing the
conjugation of the un-saturation in the adjacent fused ring. Since this test uses acetic
anhydride and sulfuric acid as reagents, caution must be exercised so as not to receive
severe burns.
Method : Dissolve one or two crystals of cholesterol in dry chloroform in a dry test
tube. Add several drops of acetic anhydride and then 2 drops of conc.H2SO4 and mix
carefully. After the reaction finished, the concentration of cholesterol can be measured
using spectrophotometry.

References[edit]

Campbell, Mary K. & Shawn O. Farrell. Biochemistry. (4th ed.). Singapore:

Thomson Asia Pte Ltd. (2005).
http://www.clinchem.org/cgi/reprint/20/7/794.pdf

http://alquimiafacil.blogspot.com/2012/03/guia-para-complementar-la-10ma.html

Gua Para complementar la 10 ma. Prctica de Lab. Bioqumica

I,PRACTICA No. 10: RECONOCIMIENTO Y DIFERENCIACIN
DE ESTEROIDES .

FOLLETO PARA COMPLEMENTAR EL APRENDIZAJE DE BIOQUIMICA I

AREA: CIENCIAS DE LA SALUD

ASIGNATURA: laboratorio de Bioqumica I. MED195.

Gua Para complementar la 10 ma. Prctica de Lab.
Bioqumica I
Dr.DanielE.RodrguezC,M.A.(Farmacutico)..
PRACTICA No. 10: RECONOCIMIENTO Y DIFERENCIACIN
DE ESTEROIDES .

I.

Objetivos: reconocer y diferenciar los esteroides

colesterol y ergosterol .

Esteroides

Los esteroides se encuentran asociados a las grasas.

Poseen la estructurara del
ciclopentanoperhidrofunantreno. El colesterol es el
esteroide de origen animal mas conocido y uno de los
mas estudiados, su nombre procede del griego (chole,
que quiere decir bilis, por ser el componente ms
abundante de los clculos biliares). Est presente
normalmente en los tejidos. Por ejemplo se calcula que
en un hombre de 80 kilos, hay unos 240 gramos de
colesterol. A los mdicos por lo general les gusta ver el
colesterol total menor a 200mg/dL , con un LDL
(colesterol malo) inferior a 130 , el lmite elevado del
nivel casi ptimo , y el HDL (colesterol alto ) superior
a 40.

Las plantas contienen una variedad de esteroles.

El ergosterol es un esteroide de origen vegetal. Difiere

del colesterol por tener en su estructura dos doble
ligaduras adicionales, una entre C7C8 en el anillo B, y la
otra en la cadena lateral entre C22-C23.

El ergosterol tambin se diferencia del colesterol por

llevar un grupo metilo extra en posicin 2,4. Esta
sustancia es considerada como una pro-vitamina, ya
que por irradiacin con luz ultravioleta adquiere
propiedades antiraquticas ,como consecuencia de la
apertura del anillo B.

Otros esteroides de gran importancia bioqumica son

las hormonas sexuales, hormonas de la corteza
suprarrenal , vitamina D, glucsidos cardiacos y los
cidos biliares.(Asbun ,1972, p. 168)

Los esteroides se pueden analizar por medios

fotomtricos, esto es de manera cuantitativa, para esto
se lleva a cabo una reaccin qumica que desarrolle
color. Estas reacciones no son especficas, las dan todos
los esteroides que lleven uno o mas dobles enlaces en
el anillo A o B, los compuestos saturados no desarrollan
color.

Reacciones de los esteroides:

-REACCION DE LIEBERMAN- BUCHARD: en esta reaccin

se trata una muestra de esteroide en cloroformo con
anhdrido actico y cido sulfrico, se desarrolla un
color purpura que pasa a azul verdoso y se estabiliza en
verde.

- REACCION DE SALKOWSKI: cuando se trata la muestra

de solucin clorofrmica de un esteroide, se desarrolla
un color rojo-purpura

- REACCION DE ROSENHEIM: se utiliza para diferenciar

al ergosterol del colesterol, slo los compuestos que
dan la reaccin positiva son aquellos que tienen dos
dobles enlaces conjugados. El ergosterol ,por ejemplo,
posee dos dobles enlaces conjugados en el anillo B.
Esta reaccin consiste en tratar la muestra de solucin
clorofrmica de un esteroide con una solucin de cido
tricloroactico, el desarrollo de un color rojo que cambia
a azul plido indica una reaccin positiva.

Reactivos

-Solucin de colesterol 0.003 M: se pesan 0.116 g de

colesterol y se disuelven en cloroformo ,cantidad
suficiente para completar 100mL.

-Solucin de ergosterol 0.003 M:se disuelven 0.119 g de

ergosterol (recientemente recristalizado de etanol) en
cloroformo , se completa el volumen a 100mL.

-Anhdrido actico ,calidad reactivo.

-H2SO4 concentrado,calidad reactivo.

-cido tricloroactico.

Experimento I :Tcnica : Se toman dos tubos de ensayo

bien limpios y secos .A uno se le agrega 2 miL de
Solucin de colesterol 0.003 M y al otro 2 miL de
Solucin de ergosterol 0.003 M. Se le agrega a cada
tubo 6 miL de cloroformo , y 10 gotas de Anhdrido
actico ,calidad reactivo. Se mezcla bien y se adiciona 2
gotas de cido sulfrico. Se deja reposar en la
obscuridad durante una hora .Seguidamente
transcurrido ese tiempo, se mide la densidad ptica en
el espectrofotmetro. Empezando en 380 m, luego 400
m, luego en 20 m , hasta llegar a 680 m. Se usa
cloroformo como blanco. Cada vez que cambia la
longitud de onda se lleva la escala a 100 % T con el
blanco. Se anotan los valores obtenidos y se traza una
curva de absorcin para cada uno de los compuestos ,
indicando la densidad ptica sobre el eje de las
ordenadas y la longitud de onda ensobre el eje de las

abscisas. Se observara que el colesterol y el ergosterol

tienen curvas de absorcin similares.

Experimento II
REACCION DE ROSENHEIM: Tcnica : Se toman dos
tubos de ensayo bien limpios y secos .A uno se le
agrega 2 miL de Solucin de colesterol 0.003 M y al otro
2 miL de Solucin de ergosterol 0.003 M. Se le agrega a
cada tubo 2 miL de solucin de cido tricloroactico, 6
miL de cloroformo y se mezclan bien .Despus de 30
minutos se mide la densidad ptica de cada una de las
soluciones Empezando en 380 m , se toman lecturas
sucesivas incrementando la longitud de onda en 20mu
hasta llegar a los 680 m, se usa cloroformo como
blanco ,cada vez que se cambia la longitud de onda se
lleva la escala a 100% T con el blanco.

Con los datos obtenidos se construye una curva de

absorcin para el colesterol y otra para el ergosterol,
anotando la densidad ptica sobre el eje de las
ordenadas y la longitud de onda sobre el eje de las
abscisas . El colesterol al dar una reaccin negativa
carecer de de curva de absorcin en la frecuencia
sealada , en tanto que el ergosterol presentara una
marcada curva de absorcin.

Experimento III:

Obtencin del colesterol de clculos biliares.( se pueden

obtener stos en un hospital, hablar con las estudiantes
de enfermera).

En un matraz erlenmeyer de 100 miL se colocan 4 g de

clculos biliares pulverizados y se revuelven con 40 miL
de acetona , mientras se calienta la suspensin en
baoo de Mara, hasta disolucin del colesterol. La
solucin se filtra en caliente , en un embudo
previamente calentado. Si el filtrado esta muy oscuro ,
se le decolora con 0.1 g de carbn activado (norita, se
puede conseguir en el laboratorio de tecnologa
farmacutica), se vuelve a calentar y filtrar en caliente ,
utilizando dos hojas de papel filtro. Al filtrado se le
aaden 20 miL de metanol ,se vuelve a calentar hasta
ebullicin y se le va aadiendo agua hasta turbidez, se
calienta hasta disolucin y se deja enfriar. Los cristales
se recogen por succin , se secan y se pesan .el filtrado
se destila a la mitad de volumen y se deja enfriar
recogindose una segunda cosecha.

Hacer la prueba de LIEBERMAN- BUCHARD para

esteroides insaturados.

Mezclar 5 gotas de cloroformo con 4 gotas de anhdrido

actico y 1 gota de cido sulfrico. Tomar con un capilar
,un poco de esta mezcla y juntarla con 1-2 mg de
colesterol, observar los cambios de color en 5 minutos.

Observar y
apuntar________________________________________________
________________________________________________________
________________________________________________________
________________________________________________________
________________________________________________________
________________________________________________________
________________________________________________________
_______.

BIBLIOGRAFIA.

1-Asbun Wady, Ph.D.(1972). Bioqumica experimental.

Santo Domingo R.D. 1-Asbun Wady, Ph.D.(1972).
Bioqumica experimental. Santo Domingo R.D.
2-Brito,Franklin y Monz Antonio.(1979).Qumica
Orgnica. Santo Domingo R.D.
3-Casanova, Jos. (2006). Elementos de Qumica
Orgnica, Cuaderno de trabajo. Santo Domingo. ED
universitaria _UASD,. Pgs. 40-43.
4-Celsi, Santiago-Iacobucci, Alberto. Qumica elemental
moderna orgnica. Buenos Aires, Argentina (1964). ED
Kapelius. Pgs. 235-237.

5-Diccionario de Medicina Ocano Mosby. St. Louis,

Estados Unidos. ED Grupo Ocano. Pg. 804.
6-De los Santos, Aminta.(1997-).Qumica. Secretaria de
Estado De Educacin R.D.
7-Ege, Seyhan. (1997). Qumica Orgnica, Tomo I. ED
Revert .
8-Quillet, Arisitides. Enciclopedia autodidctica Quillet.
Mxico, 11 edicin, 1977. ED Cumbre, SA. Pg.76.
9- Ouellet, Robert J.(1971). Introduccin a la Qumica
Orgnica. Ohio, EUA . ED Harla. Pgs. 145-152.
10-Microsoft Encarta 2007. 1993-2006 Microsoft
Corporation. Reservados todos los derechos.
11-Nuez Sellas, Alberto. Introduccin al anlisis
orgnico. Santo domingo, REP. DOM. ED Pueblo y
Educacin. Pgs. 265-271
http://www.academia.edu/7664529/Development_and_Evaluation_of_ThinLayer_Chromatography-Digital_ImageBased_Analysis_for_the_Quantitation_of_the_Botanical_Pesticide_Azadirachti
n_in_Agricultural_Matrixes_and_Commercial_Formulations_Comparison_with_
ELISA_A