Arial Uk.

Font 12
Uk.
Font
12
Uk.
Font
14

Prosthodontic Dental Journal Vol. 1 No. 1 January-June 2011: 1-6

Research Report

Ekspresi TNF- pada tikus yang diinokulasi Candida albicans dan diberi
konsumsi ekstrak Mimba
(TNF- expression on rats were inoculated by Candida albicans and fed with Neem
extract)

I Dewa Ayu Ratna Dewanti

Uk.
Bagian Prostodonsia
Font 9 Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember
Jember Indonesia

ABSTRACT
Background: Neem are one of the trees traditional medicine known by society and has function as
immunomodulatory. Infection diseases was found in the mouth (80%) is candidiasis caused by Candida albicans (C.
albicans), while the immunity is important to C. albicans. In the other side the medicine price may not be reached by
the citizen, cause citizen choose the traditional medicine. Purpose: This research is to explain of TNF- expression on
Rats were Inoculated by Candida albicans and Fed with Neem Extract (Azadirachta Indica). Methods: There are
5groups, one group wich was called as controle group (KO) hadnt been fed aqueous extract from neem leaves and was
not inoculated by C albicans, the other group which was under treatment classicfied into 4 groups. First group was
Uk.
Font 10 inoculated by C albicans only (KP1), second group was fed with 50 mg/day/kg body weigth aqueous extracts from
neem leaves, then inoculated by C. albicans start from day 8 until day 21 (KP2), third group was fed with 100mg/day/kg
body weigth aqueous extract from neem leaves, then inoculated by C albicans start from day 8 until day 21 (KP3),
fourth group was fed with 200 mg/day/kg body weigth aqueous extract from neem leaves, then inoculated by C albicans
start from day 8 until day 21 (KP4). The data has collected at swabbing the tongues to calculate the Candida albicans
colonies on tongue. The rats was acclimated, and tongues net collected to immunohistochemistry measurement.
Result: The study showed that there were different result computed using anova, HSD test, Linier Regression. Anova
shows the significant different(p<0,01) between each groups. The HSD test shows the significant different (p<0,05)
each groups. TNF- are the stimuli sensore from environtment, use as parameter to see the effect from the change of
innate immune component to Candida albicans. Conclusion: Aqueous extract from neem leaves increased the
macrophage TNF- expression.
Key words: Aqueous extract from neem leaves, Azadirachta Indica, macrophage, phagocytosis, Candida albicans
Korespondensi (correspondence): I Dewa Ayu Ratna Dewanti, Bagian Prostodonsia, Fakultas Kedokteran Gigi
Universitas Jember. Jl. Kalimantan 37 Jember 68121, Indonesia. E-mail: dewa_dewanti@yahoo.com.

PENDAHULUAN

Uk.
Font 11

Mimba (Azadirachta Indica) dengan

komponen bioaktif yang sudah diketahui seperti
azadirachtin, salanine, meliantriole, nimbin,
nimbolide, gedunine, mahmodine, gallic acid,
catechin, epicatechin, margolone, margolonone,
isomargolonone,
cyclictrisulphide,
cyclictetrasulphide dan polisakarida telah
dikenal.1,2 Beberapa penelitian membuktikan
mimba memodulasi imunitas alami dan adaptif, 3-6

sedangkan imunitas alami (fagositosis) terutama

makrofag berperan penting dalam melawan
Candida albicans (C. albicans) yang merupakan
penyebab utama kandidiasis mulut. 7,8 Kandidiasis
mulut salah satu penyakit infeksi yang paling
banyak dijumpai di rongga mulut (80%). 7
Penelitian sebelumnya oleh penulis membuktikan
perasan daun mimba dapat menghambat
pertumbuhan C. albicans secara in vitro.9 Daun
mimba di samping mempunyai khasiat sebagai
anti
jamur
juga
berfungsi
sebagai
1

Prosthodontic Dental Journal Vol. 1 No. 1 January-June 2011: 1-6

Uk.
Font 11

imunomodulator. Berbagai obat anti jamur belum

tentu
berfungsi
sebagai
imunomodulator,
sedangkan infeksi C. albicans sangat tergantung
pada sistem imunitas. Penghancuran oleh sel
fagosit, eliminasi dapat berlangsung dengan cara
oksidatif dan non oksidatif. Oksidatif antara lain
dengan cara menghasilkan superoksid dan NO
yang dihasilkan sistem iNOS, dimana aktivitas
keduanya dapat diinduksi TNF-. Aktivitas
fagositosis meliputi fungsi penelanan (fungicidal
uptake) dan pembunuhan intraseluler (fungisidal),
sedangkan
cara
non
oksidatif
dengan
memproduksi sitokin, seperti TNF- yang dapat
memodulasi aktivitas fagositosis.10-12 Beberapa
penelitian membuktikan mimba memodulasi
imunitas alami dan adaptif. Begitu juga telah
dibuktikan mimba menyebabkan peningkatan
TNF- dan aktivitas makrofag secara in vitro,
namun belum diketahui bagaimana ekspresi TNF karena mimba terhadap C. albicans dan
rmekanisme peningkatan aktivitas fagositosis
ekstrak cair daun mimba terhadap C. albicans
juga belum diketahui.13 Hal tersebut menimbulkan
suatu rumusan masalah: Bagaimana ekspresi
TNF- pada tikus yang diinokulasi C. albicans
dan diberi konsumsi ekstrak cair daun mimba?.
Tujuan penelitian mengetahui ekspresi TNF-
pada tikus yang diinokulasi C. albicans dan
diberi konsumsi ekstrak cair daun mimba.

albicans (KP4). Masing-masing kelompok

dilakukan pengamatan pada hari ke 22 dengan
cara dilakukan swab ringan tanpa tekanan dengan
cotton bud pada dorsum lidah tikus dengan sekali
swab untuk penghitungan koloni C. albicans.
Selanjutnya tikus diaklitimasi dan dilakukan
pengambilan jaringan lidah tikus untuk dibuat
sediaan dan pengecatan imunohistokimia,
menggunakan anti mouse TNF-, direaksikan
dengan biotiyilized secondary anti rabbit (Ab)
dan
direaksikan dengan substrat diamine
benzidine
(DAB).
Sel
makrofag
yang
mengkspresikan TNF- (warna coklat) dihitung
pada 20 lapangan pandang. Data yang diperoleh
dianalisis dengan ANOVA dan dilanjutkan uji
HSD.
HASIL
Hasil penelitian menunjukkan ekspresi
TNF- pada makrofag pada kelompok yang
diinokulasi C. albicans terjadi penurunan
dibanding
kontrol,
sedangkan
kelompok
perlakuan dengan ekstrak cair daun mimba terjadi
peningkatan, dimana semakin tinggi dosis ekstrak
mimba yang diberikan semakin tinggi ekspresi
TNF-. C. albicans yang dapat mensupresi sistem
imun (TNF-), dengan adanya daun mimba maka
dapat ditingkatkan (dapat memperbaiki sistem
imun).

BAHAN DAN METODE

Uk.
Font 11

Penelitian ini merupakan eksperimental

laboratoris dengan jumlah sampel 25 ekor tikus
Wistar jantan, yang memenuhi Declaration of
Helsingki, dengan berat 100-200 gr, usia 2-3 bulan
yang dilakukan adaptasi 1 minggu, terdapat 5
kelompok yang terbagi menjadi kelompok kontrol
(KO) yang tidak diberi konsumsi ekstrak cair
daun mimba dan tidak diinokulasi C albicans,
kelompok perlakuan yang terdiri dari: kelompok
yang diinokulasi C. albicans (KP1), kelompok
yang diberi konsumsi ekstrak cair daun mimba
dosis 50 mg/hari/kg berat badan, kemudian mulai
hari ke 8 sampai hari ke 21 diinokulasi C.
albicans (KP2), kelompok yang diberi konsumsi
ekstrak cair daun mimba dosis 100 mg/hari/kg
berat badan, kemudian mulai hari ke 8 sampai hari
ke 21 diinokulasi C. albicans (KP3), kelompok
yang diberi konsumsi ekstrak cair daun mimba
dosis 200 mg/hari/kg berat badan, kemudian
mulai hari ke 8 sampai hari ke 21 diinokulasi C.

Gambar 1. Ekspresi TNF- makrofag dengan teknik

imunohistokimia (pembesaran 400x).
Keterangan :
Warna coklat menunjukkan terdapat ekspresi TNF- ( )
Warna biru menunjukkan tidak ada ekspresi TNF- ( )
A. Kontrol pengecatan (terlihat makrofag yang berwarna
biru); B. Ekspresi TNF- pada makrofag kelompok Kontrol
(K0); C. Ekspresi TNF- pada makrofag kelompok
Perlakuan 1 (KP1); D. Ekspresi TNF- pada makrofag
kelompok Perlakuan 2 (KP2); E. Ekspresi TNF- pada
makrofag kelompok Perlakuan 3 (KP3); F. Ekspresi TNF-
pada makrofag kelompok Perlakuan 4 (KP4).

Uk.
Font
10
Spasi
1 Uk.
Font
9
Spasi
1

Prosthodontic Dental Journal Vol. 1 No. 1 January-June 2011: 1-6

Uk.
Font Gambar 2. Grafik ekspresi TNF- makrofag.
10
Hasil
ANOVA
ekspresi
TNF-,
menunjukkan terdapat perbedaan bermakna
(p<0,01), kemudian dilakukan Uji HSD
memberikan hasil perbedaan bermakna (p>0,01)
antar semua kelompok. Hal itu menunjukkan
bahwa ekstrak cair daun mimba dapat
meningkatkan ekspresi TNF- dengan dosis 50,
Uk.
100, 200 mg/BB/hari, di sisi lain C. albicans
Font 11 menurunkan ekspresi TNF-. Selanjutnya
dilakukan
Uji
korelasi
(regresi
linier),
menggambarkan hubungan positif yang sangat
erat (0,985), artinya semakin tinggi dosis ekstrak
cair daun mimba, maka semakin besar jumlah sel
makrofag yang mengekspresikan TNF- (Gambar
3). Selanjutnya dilakukan penghitungan jumlah C.
albicans pada lidah tikus dan ditumbuhkan pada
saburouds agar yang dihitung menggunakan
colony counter, hasilnya dapat dilihat pada
gambar 4.
Uk.
Tabel 1. Uji HSD ekspresi TNF- pada makrofag
Font
Kelompok
Mean
SD
N
10
KPo
KP1
KP2
KP3
KP4
Total

2.6666
1.7334
11.2000
15.8000
26.6666
11.6133

.47146a
1.01113b
.44721c
1.26073d
.78181e
9.40825f

5
5
5
5
5
25

T
N
F
a LOibnsearvd

322500...0
11550...00
0.0.50.D
1b
0a
.(m
osiM
m
g/kB
)150.20.

Keterangan: Huruf yang berbeda menunjukkan adanya

perbedaan yang signifikan.

Uk.
Font
10

Gambar 3. Grafik regresi linier.

Uk.
Font
9
Spas
i1

Uk.
Gambar 4. Grafik jumlah koloni C. albicans.
Font
10
Gambar 4 terlihat jumlah koloni pada
kelompok kontrol tidak ditemukan C. albicans.
Kelompok dengan koloni C. albicans terbanyak
pada kelompok KP1, jumlah koloni C. albicans
terkecil pada KP4. Hasil ini membuktikan bahwa
semakin tinggi dosis ekstrak cair daun mimba,
semakin menurunkan jumlah koloni C. albicans.
Hasil anova menunjukkan perbedaan bermakna
(p<0,01), uji HSD terdapat perbedaan bermakna,
kecuali antara KP0 dengan KP4, menunjukkan
bahwa ekstrak cair daun mimba dengan dosis
200mg/BB/hari dapat menurunkan julmlah C.
albicans sampai mendekati normal.

PEMBAHASAN
Respons stimuli dievaluasi melalui imun
mukosa mulut (selaput mukosa, jaringan limfoid
mulut, kelenjar getah bening ekstraoral, jaringan
limfoid intraoral, jaringan limfoid kelenjar saliva,
jaringan limfoid gingiva. Pada penelitian ini
pengambilan sampel dilakukan pada lidah tikus
oleh karena kandidiasis paling umum ditemukan
pada lidah. Sistem imun mukosa mulut akan
mempengaruhi sistem imun sistemik melalui
sistem imun vaskuler.
Ekstrak cair daun mimba terbukti dengan
kandungan galic acid, catechin, epicatechin dapat
mempengaruhi respons makrofag diduga melalui
dua cara, yaitu secara langsung mempengaruhi C.
albicans dan tidak langsung langsung dengan
mempengaruhi makrofag. Efek pada C. albicans
diduga menyebabkan perubahan pada membran
sel C. albicans, sehingga lebih mudah dikenali
oleh makrofag untuk dilakukan fagositosis. Efek
tidak langsung ekstrak cair daun mimba dengan
cara merubah aktivitas makrofag terhadap paparan
C. albicans, dengan cara memodulasi respons
imun pada makrofag.
Penelitian
ini
dilaksanakan
untuk
memecahkan masalah tentang efek ekstrak cair
daun mimba terhadap aktivitas TNF- yang
berkaitan dengan aktivitas fagositosis makrofag
3

Prosthodontic Dental Journal Vol. 1 No. 1 January-June 2011: 1-6

Uk.
Font 11

Uk.
Font 11

terhadap C. albicans. CD14, TLR2, TLR4, TNF, aktivitas fagositosis dan jumlah koloni C
albicans menjadi solusi penting pada upaya
pemecahan masalah ini, karena CD14, TLR2,
TLR4, TNF-, aktivitas fagositosis adalah
komponen pada sistem imun innate yang bertugas
sebagai sensor stimuli dari lingkungan, sedangkan
jumlah koloni C. albicans digunakan sebagai
parameter adanya efek dari
perubahan
komponen imun innate terhadap C albicans.
Stimuli dari lingkungan dapat dikenali oleh sistem
sensor CD14, TLR2, TLR4 dan akan
ditindaklanjuti dengan seleksi, organisasi dan
interpretasi supaya respons terhadap stimuli
tersebut dapat disesuaikan dengan kebutuhan
hospes untuk tetap
survive kandidiasis
menyebabkan supresi pada CD14 yang berfungsi
meningkatkan aktivitas TLR, juga menghambat
TLR2 dan TLR4 yang mengakibatkan penurunan
aktivitas protein-protein transkripsi yang berada di
dalam sel makrofag. Selanjutnya fungsi
fagositosis dan TNF yang berperan penting pada
makrofag juga terganggu. Hal tersebut tentunya
juga akan mempengaruhi terjadinya penurunan
respons imun adaptif. C. albicans. Di sisi lain
dengan adanya ekstrak daun mimba keadaan
imunosupresi yang diakibatkan oleh C. albicans
akan diperbaiki.
Makrofag sebagai fagosit profesional
dengan fungsi utama menghancurkan imunogen
dan sebagai antigen precenting cells (APC)
mengenali mikroba melalui beberapa reseptor
yang berhubungan dengan fungsinya untuk
merangsang migrasi sel ke tempat infeksi dan
merangsang produksi substansi mikrobial.
Aktivasi makrofag pada innate immunity melalui
CD14 yang diekspresikan ke permukaan sel dan
mengaktifkan toll-like receptors (TLRs). Daun
mimba dengan komponen imunomodulator
(diduga galic acid, catechin, epicatechin)
membangun keseimbangan baru melalui regulasi
sistem imun yang hasilnya dapat kita kenali dari
produk yang dihasilkan sel makrofag, dalam
menghadapi stressor. Mekanisme peningkatan
TNF- oleh mimba terhadap C. albicans diawali
oleh adanya peningkatan CD14, TLR2 dan TLR4
(C. albicans menurunkan semua aktivitas imun).
TLR2
danTLR4
mempengaruhi
phospatidilinositol pada membran sel makrofag,
mengaktifkan protein Rac, selanjutnya akan
mengaktivasi NF-B dan AP-1 melalui jun kinase
melalui jalur the mitogen-activated protein kinase
(MAPK). Termasuk jalur ini extracelluler signalregulated kinase (ERK), c-jun N-terminal kinase
(JNK) dan p38. ERK mempengaruhi aktivitas jun,
sedangkan p38 mempengaruhi produksi IL-6, IL-

8 dan IL-12. Aktivitas p38 dan ERK dapat

mengaktivasi AP-1. Ketiga jalur MAPK dapat
diaktivasi dalam waktu yang sama. NF-B
merupakan regulator dari respons awal terhadap
pathogen dan sebagai aktivator respons imun. NFB adalah p50-p65 dari keluarga protein 8
heterodimer yang menstranskripsi bermacam gen.
Aktivasi NF-B memerlukan fosforilasi protein IB,
kemudian
terjadi
degradasi
yang
menyebabkan p50-p65 berada dalam nukleus dan
mengaktifkan gen. Setelah terjadi pelepasan I-B,
maka terjadi peningkatan aktivitas faktor
transkripsi NF-B yang menstimulasi ekspresi gen
yang mempengaruhi produksi TNF- dan aktivitas
fagositosis. Stimulasi ekspresi gen antara lain
mempengaruhi produksi TNF-. Dalam respons
imun terhadap C. albicans, TNF- berperan
sebagai imun primer dalam regulasi sistem imun.
Khusus pada makrofag sitokin ini meningkatkan
aktivitas dalam membunuh patogen, di mana aksi
ini menjadi mediator penting pada inflamasi.
Aktivitas respons imun innate ini dapat
mempengaruhi MHC, oleh karena terjadinya
perubahan pada aktivitas di dalam sel makrofag.
sehingga akan berefek pada aktivitas imun adaptif
(sel T dan sel B).14-16 Mekanisme ekstrak daun
mimba dalam mempengaruhi respons imun seperti
tersebut di atas dapat dilihat pada gambar 5
berikut ini.
Ekstrak cair daun mimba dengan komponen
galic acid, epicatechin, catechin, dapat
menurunkan jumlah koloni C. albicans melalui
peningkatan aktivitas TNF-, meskipun jumlah ini
tidak mutlak menunjukkan adanya infeksi, tetapi
dapat digunakan untuk menunjukkan adanya
infeksi. Jumlah yang lebih banyak dari kelompok
kontrol dapat digunakan sebagai parameter
terjadinya infeksi, satu saja bentuk hifa sudah
menunjukkan infeksi. Penelitian ini menunjukkan
jumlah koloni C. albicans yang semakin menurun
dengan semakin tinggi dosis ekstrak daun mimba,
dimana dosis 200 mg/kg BB terlihat jumlah
koloni paling sedikit. Penurunan jumlah koloni C.
albicans
diduga
karena
kandungan
imunomodulator (galic acid, epicatechin,
catechin) dan kandungan nimbidin, azadirachtin,
gedunin, cyclic trisulphide, cyclic tetrasulphide
yang dapat berfungsi sebagai antijamur.
Kandungan imunomodulator dapat meningkatkan
respons imun terhadap C. albicans, sedangkan
kandungan antijamur dapat membunuh jamur
secara langsung dengan cara merusak membran
sel jamur.

Prosthodontic Dental Journal Vol. 1 No. 1 January-June 2011: 1-6

Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa

ekstrak cair daun mimba meningkatkan ekspresi
TNF- pada tikus yang diinokulasi C. albicans.

DAFTAR PUSTAKA
1. Ganguli SJ. Neem : A therapeutic for all
seasons. Current Science 2002; 82-11.
2. Goel RK, Sairam K. Anti ulcer drugs from
indigenous source with emphasis on
Uk.
musasapientum,
tamrabhasma,
asparagus
Font
racemous and zingiber officinale. Indian J of
11
Pharmacology 2002; 34: 100-10.
Uk.
3. Upadhayay D, Garg S, Talwar GP.
Font
Immunomodulation
effects
of
Neem
10
(Azadirachta
indica)
oil.
Int
J
immunopharmacol 1992; 14(7): 1187-93.
4. Sairam K, Sharma SK, Havazhagan G, Kumar
D, Selavamurthy W.
Immunomodulatory
effect of NIM-76, a volatile fraction from
neem oil. J Ethnopharmacol 1997; 55(2): 1339.
5. Sastrodihardjo S. Evaluasi daya insektisida
dari ekstrak daun mimba (Azadirachta indica
A. juss). Seminar Hasil Penelitian Pangan dan
Gizi, Ilmu Hayati, Jakarta. 1988. h. 18.
6. Sadekar D, Kolte AY, Barnase BS, Desai VF.
Immunolpotentiating effects of Azadirachta
indica (Neem) dry leaves powder in broilers,
naturally infected with IBD virus. Indian J
Exp Biol 1998; 36(11): 1151-3.
7. Lehner, T. Immunologi of oral desease.
Imunologi pada penyakit mulut. Edisi 3.
Farida R, Suryadhana NG, editor. Jakarta:
Penerbit Buku Kedokteran EGC; 1992. H.
112-5.
8. Roeder A, Carsen J. Kir Ching, Rudolf A,
Rupec, Martin S, Gunther W, Hans CK. Tolllike receptors as key mediators in innate
antifungal immunity. Issue 2004; 107: 48598.
9. Dewanti R. Daya hambat pertumbuhan C.
albicans oleh perasan daun mimba
(Azadirachta
Indica
juss).
Majalah
Kedokteran Gigi (Dent J) 2003; Edisi khusus
Temu Ilmiah Nasional III: 342-4.

Candida albicans hyphae in vitro. J Clin

Invest 1991; 87: 711-20.
11. Newman SL, Angela H. Candida albicans is
phagocy-tosed, killed, and processed for
antigen presentation by human dendritic
cells. Infection and Immunity 2001; 69(11):
6813-22.
12. Ulmann BD, Hadley M, Wiriya C, Anna LL,
Qiang Z, Luis AV, Jose L, Lopez R, Paul RG,
Michael CG. Inducible defense mechanism
against nitric oxide in Candida albicans.
Eukaryotic Cell 2004; 3(3): 715-23.
13. Ray B, Banerjee BD, Sen PJ, Modulation of
hmoral and cell-mediated immune responses
by Azadirachta indica (Neem) in mice. Indian
J Exp Biol 1996; 34(7): 698-701.
14. Tada H, Eiji N, Hidetoshi S, Tshihiko W,
Takeshi M, Tatsuji M, Naohito O, Hiroshi T,
Ken-ichiro S, Sachiko A, Kensuke M, Shunji
S, Haruhiko T. Sachoromyces cerevisiae and
Candida albicans derived mannan induced
production of tumor necrosis factor alpha by
human monocytes in a CD14 and toll-like
receptor 4 dependent manner. Mycrobiology
and Immunology 2002; 46(7): 503-12.
15. Wang JE, Warris A, Ellingsen EA, Fio T,
Espevick T, Solberg S, Verwe PE.
Involvement of CD14 and toll-like receptors
in activation of human monocyte. 2001.
69(4): 2402-6.
16. Outburg S, Joke S, Janneke EH, Jolande AL,
Johan SF, Polein P, Salvador PS. Journal of
Translational Medicine. BMC Infectious
Diseases 2005; 5(114): 1471-86.

10. Diamond RD, Caron A, Lyman DR, Wysong.

Disparate effects of interferon and tumor
necrosis factor on early neutrophil
respiratory burst and fungicidal responses to
5