Bacillus Sp. KAYNAKLI PULLULANAZ ENZİMİNİ KODLAYAN GENİN KLONLANMASI VE EKSPRESYONU ÜZERİNE ÇALIŞMALAR

T.C.
AKDENZ NVERSTES
FEN BLMLER ENSTTS
Bacillus sp. KAYNAKLI PULLULANAZ ENZMN KODLAYAN GENN

KLONLANMASI VE EKSPRESYONU ZERNE ALIMALAR
FDAN ERDEN
YKSEK LSANS TEZ

GIDA MHENDSL ANABLM DALI
2012
1
T.C.
AKDENZ NVERSTES
FEN BLMLER ENSTTS

FDAN ERDEN
YKSEK LSANS TEZ
Bu tez TBTAK Aratrma Destek Programlar Bakanl (ARDEB) tarafndan

1002-Hzl Destek Program Kapsamnda 111T559 nolu proje ile desteklenmitir.
2012
2
T.C.
AKDENZ NVERSTES
FEN BLMLER ENSTTS

FDAN ERDEN
YKSEK LSANS TEZ

Bu tez 27/12/2012 tarihinde aadaki jri tarafndan (100) not takdir edilerek
Oybirlii/Oyokluu ile kabul edilmitir.
Yrd. Do. Dr. Barn KARAKA (Danman)
_____________________
Do. Dr. Mehmet NAN
_____________________
Yrd. Do. Dr. Cengiz KTEN
_____________________
ZET
FDAN ERDEN
Yksek Lisans Tezi, Gda Mhendislii Anabilim Dal
Danman: Yrd. Do. Dr. Barn KARAKA
Aralk 2012, 83 Sayfa
Bu almada Bacillus sp. kaynakl pullulanaz geninin izole edilmesi ve Pichia
pastoriste pullulanaz enziminin rekombinant retimi zerine allmtr. Gen kayna
olarak, daha nce tamamlanm bir alma ile snm ekmekten izole edilmi olan
Bacillus sular taranmtr. Pullulanaz geni, molekler biyoloji yntemleri kullanlarak
B. subtilis BK07 izolatnda bulunmutur ve izole edilmitir. Elde edilen genin C-ucuna
PZR yolu ile oklu histidin etiketi eklenmitir. Histidin etiketli gen, pPICZA
vektrne balanm ve P. pastoris KM71H suuna aktarlmtr. Ardndan metanol
indksiyonlu protein retimi gerekletirilmitir. almada B. subtilis PY22 suu
pozitif kontrol olarak kullanlm ve analizler bu su iin de e zamanl olarak
gerekletirilmitir.
P. pastoriste retilen BK07 ve PY22 pullulanaz enzimlerinin optimum alt
koullar, sras ile pH8-40C ve pH6-40 olarak saptanmtr. BK07 pullulanaz
aktivitesi 8,46 U/ml, PY22 pullulanaz aktivitesi 2,95 U/ml olarak tespit edilmitir.
Spesifik enzim aktiviteleri ise sras ile 144 U/mg ve 51 U/mg olarak saptanmtr. SDSPAGE ve Western blot analizleri BK07 pullulanaznn molekler arlnn yaklak 81
kDa, PY22 pullulanaznn ise yaklak 90 kDa olduunu gstermitir.
ANAHTAR KELMELER: Pullulanaz, Pichia pastoris, Bacillus sp., Rekombinant
protein retimi
i
JR: Yrd. Do. Dr. Barn KARAKA (Danman)

Do. Dr. Mehmet NAN
Yrd. Do. Dr. Cengiz KTEN
ii
ABSTRACT
STUDIES ON CLONING AND EXPRESSION OF THE GENE ENCODING
PULLULANASE FROM Bacillus sp.
FDAN ERDEN
M.Sc. Thesis in Food Engineering

Supervisor: Asst. Prof Dr. Barn KARAKA
December 2012, 83 Pages
This study focuses on isolation of the pullulanase gene from Bacillus sp. and
recombinant production of the enzyme in Pichia pastoris. Bacillus strains isolated from
ropey bread in a previous study were screened as sources of the gene and B. subtilis
BK07 was used as the gene source. Pullulanase gene which was amplified with PCR to
include a polyhistidine tag was transformed into P. pastoris KM71H yeast using the
pPICZA vector and the enzyme production was achieved by methanol induced
expression. In all steps, B. subtilis PY22 was used as positive control of the analysis.
Optimum pH and temperature conditions for BK07 and PY22 pullulanase were
investigated. Optimum pH and temperature was found as pH8-40C and pH6-40C,
respectively. BK07 pullulanase activity was determined as 8.46 U/ml in supernatant and
specific activity of the enzyme was calculated as 144 U/mg. PY22 pullulanase activity
was determined as 2.95 U/ml in supernatant and specific activity of the enzyme was
calculated as 51 U/mg. SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the
molecular weight of the recombinant enzyme BK07 pullulanase and PY22 pullulanase
were determined to be about 81 kDa and 90 kDa, respectively.
KEYWORDS:
Pullulanase, Pichia pastoris, Bacillus sp., Recombinant protein
production
iii
COMMITTEE: Asst. Prof Dr. Barn KARAKA (Supervisor)

Assoc. Prof Dr. Mehmet nan
Asst. Prof Dr. Cengiz KTEN
iv
NSZ
Molekler biyoloji alanndaki gelimeler son yirmi ylda ivme kazanmtr.
Kaydedilen bu ilerlemeler, molekler biyoloji uygulamalarnn kullanld bir ok alan
da etkilemeye devam etmektedir. Bu alanda edinilen bilgi birikimi dier temel ve
uygulamal bilimler ile birlikte endstri sektrne de nemli faydalar salamaktadr.
Bu almada gda alannda kullanlan bir enzim olan pullulanazn, Pichia
pastoris mayasnda rekombinant retimi gerekletirilmitir. alma, genin yerel
bakteri izolatlarnda taranmasn, genin izolasyonunu, rekombinant retimini ve
rekombinant enzimin karakterizasyonunu kapsamaktadr. Elde edilen veriler ve
kullanlan yntemler farkl aratrmalar iin kaynak olabilecei gibi, elde edilen enzime
ait zelliklerin enzim mhendislii almalar ile deitirilmesi ve gelitirilmesi de
mmkndr.
Bilgi ve tecrbeleri ile beni ynlendiren ve desteini hi esirgemeyen danman
hocam Sayn Yrd. Do. Dr. Barn KARAKAa, gsterdii emek ve ayrd zaman
iin sayglarm ve sonsuz teekkrlerimi sunarm.
Sayn Do. Dr. Mehmet NAN hocama bilgi ve tecrbesi ile beni ynlendirdii
iin, bu almaya olan ilgisi ve destei iin; ve ayrca bizim iin salam olduu
alma koullar iin sayglarm ve sonsuz teekkrlerimi sunarm.
Sayn Yrd. Do. Dr. Cengiz KTEN hocama, tezimi deerlendirdii ve son
halinin oluturulmasnda yapt ynlendirmeler iin teekkr eder sayglarm sunarm.
Ar. Gr. Fundagl EREM hocama, bu almada kullanm olduum yerel
izolatlar salad iin, deerli vaktini ayrarak verdii destek ve bilgi paylamlar iin
ok teekkr ederim.
Dr. Nisa Ertoya baz laboratuvar malzemelerinin temin edilmesinde olan
yardm ve ilgisi iin ok teekkr ederim.
v
Her zaman yanmda olan, yardm ve desteini hibir zaman es irgemeyen Mert
KARAOLANa zellikle laboratuvar almalarm srasnda verdii fikirler iin ve
malzemelerimizin temin edilmesinde gsterdii emek ve ayrd vakit iin ok teekkr
eder, baarlarnn ve baarlarmzn devam etmesini dilerim.
Deerli arkadam Semiramis YILMAZa her zaman yanmda olduu iin,
destei ve paylamlar iin, ayrca tezin son halinin oluturulmasnda verdii fikirler ve
yardmlar iin ok teekkr ederim.
Benden gerek maddi gerekse manevi hibir desteini esirgemeyen aileme bana
salad imkanlar iin sonsuz teekkr ederim.
Kardeim Mehmet ERDENe tezimi yazdm dnem boyunca hep yanmda
olduu iin, bu srete gsterdii anlay ve verdii destek iin ok teekkr ederim.
Hzl Destek (1002) program kapsamnda tez projemi destekleyen ve bu srete
burs imkn salayan TBTAKa teekkrlerimi sunarm.
almamzda kullanm olduumuz pullulan, Hayashibara (Japonya) firmas
tarafndan hibe edilmitir. Destek ve ilgileri iin Hayashibaraya teekkrlerimi sunarm
vi
NDEKLER
ZET
........................................................................................................................... i
ABSTRACT .....................................................................................................................iii
NSZ .......................................................................................................................... v
NDEKLER................................................................................................................vii
SMGELER VE KISALTMALAR ................................................................................... x
1. GR .......................................................................................................................... 1
2. KURAMSAL BLGLER VE KAYNAK TARAMALARI ......................................... 2
2.1.
Pullulanaz Enzimi Substrat Pullulan ............................................................ 2
2.2.
Pullulanaz Enzimi ............................................................................................. 3
2.3.
Pullulanaz Enziminin Kullanm Alanlar.......................................................... 4
2.3.1.
Gda sanayisinde kullanm alanlar .............................................................. 4
2.3.2.
Dier kullanm alanlar ................................................................................ 6
2.4.
Pullulanaz Enzimi zerine Yaplan almalar ............................................... 6
2.5.
Konuku Su Pichia pastoris ile Rekombinant Protein retimi ...................... 8
3. MATERYAL VE METOD ........................................................................................... 9

3.1.
Materyal ............................................................................................................ 9
3.1.1.
almada kullanlan bakteri ve maya sular.............................................. 9
3.1.2.
almada kullanlan tayc plazmitler ...................................................... 9
3.1.3.
Kimyasallar ve enzimler ............................................................................ 11
3.2.
Metod .............................................................................................................. 11
3.2.1.
Temel molekler biyoloji yntemleri ........................................................ 11
3.2.1.1.
DNA izolasyonu................................................................................. 11
3.2.1.2.
Polimeraz zincir tepkimesi (PZR)...................................................... 12
3.2.1.3.
Agaroz jel elektroforezi ..................................................................... 13
3.2.1.4.
Ligasyon ve transformasyon .............................................................. 13
3.2.1.5.
Plazmit izolasyonu ............................................................................. 14
3.2.1.6.
PZR rnlerinin saflatrlmas .......................................................... 15
3.2.1.7.
Jelden DNA paralarnn ekstraksiyonu ............................................ 15
3.2.1.8.
SDS-PAGE ve Western blot analizi .................................................. 15
3.2.1.9.
Southern blot analizi .......................................................................... 16

vii
3.2.1.10.
Koloni hibridizasyonu........................................................................ 17
3.2.2. Dier biyokimyasal analizler .......................................................................... 18

3.2.2.1.
Rekombinant proteinin saflatrlmas ............................................... 18
3.2.2.2.
Pullulanaz aktivitesinin tayini ............................................................ 19
3.2.2.3.
Rekombinant enzimin karakterizasyonu ............................................ 19
3.2.2.4.
Hidroliz rnlerinin tayini ................................................................. 20
3.2.2.5.
Toplam protein lm ...................................................................... 21
4. BULGULAR ............................................................................................................... 22
4.1.
Bakterilerin
Pullulanaz
retme
Yeteneklerinin
Kalitatif
Yntemle
Taranmas ....................................................................................................... 22
4.2.
Yerel zolatlardan Pullulanaz Genini Klonlama almalar ......................... 22
4.2.1.
DNA izolasyonu......................................................................................... 22
4.2.2.
PZR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ile genin amplifikasyon denemeleri 23
4.2.3.
Southern blot yntemi ile genin izolasyonu denemeleri ............................ 26
4.2.4.
Koloni hibridizasyonu................................................................................ 28
4.2.5.
Yeni primerlerle ve dier yerel bakteri izolatlarnda PZR denemeleri ...... 31
4.2.6.
BK07 ve PY22 pullulanaz genlerinin izole edilerek klonlama (pJET1.2)

ve ekspresyon (pPICZA) vektrlerine ligasyonu..................................... 34
4.2.7.
Konuku Pichia pastorise transformasyon ve pul+ klonlarn eldesi ......... 40
4.2.8.
Seilen klonlar ile protein retimi ve proteinin saflatrlmas .................. 41
4.2.9.
Enzim retimi iin optimum indksiyon sresinin belirlenmesi ............... 52
4.2.10. Enziminin optimum aktivite gsterdii pH deerinin belirlenmesi........... 53

4.2.11. Enziminin optimum aktivite gsterdii scaklk deerinin belirlenmesi ... 55
4.2.12. Enzimin termal stabilitesinin belirlenmesi................................................. 56
4.2.13. Pullulanaz Aktivitesi Tayini ...................................................................... 58
4.2.14. Rekombinant pullulanaz enziminin hidroliz rnlerinin belirle nmesi ...... 59
5. TARTIMA ................................................................................................................ 61
6. SONU ....................................................................................................................... 65
7. KAYNAKLAR............................................................................................................ 68
8. EKLER ........................................................................................................................ 72
Ek 8.1. DNS Analizi in Glikoz Kalibarasyon Erisi................................................ 72
viii
Ek 8.2. Toplam Protein Miktarnn Hesaplanmasnda Kullanlan Standart Protein

(BSA) Kurvesi ................................................................................................ 73
Ek 8.3. PZR almalarnda Kullanlan Primerler ve Sekanslar ............................... 74
Ek 8.4. pJET-PY22pul Plazmidi ile Elde Edilen Pullulanaz Geni Nkleotid Dizisi ve
Genin Kodlad Rekombinat Proteininin Amino Asit Dizisi ........................ 75
Ek 8.5. pPICZA-YBKpulH Plazmidi ile Elde Edilen Pullulanaz Geni Nkleotid
Dizisi ve Genin Kodlad Rekombinat Proteininin Amino Asit Dizisi......... 78
Ek 8.6. BK07 Pullulanaz Geni ile PY22 Pullulanaz Geninin Aminoasit Dizilerinin
Karlatrlmas .............................................................................................. 79
Ek 8.7. BK07 Pullulanaznn Farkl Kaynaklardan zole Edilmi Dier Pullulanaz
Enzimleri ile Aminoasit Dizilerinin Karlatrlmas .................................... 80
Ek 8.8. BK07 Pullulanaz Geni ile PY22 Pullulanaz Geninin Nkleotid Dizilerinin
Karlatrlmas .............................................................................................. 81
Enzimleri Nkleotid Baznda Karlatrlmas .............................................. 82
ZGEM
ix
SMGELER VE KISALTMALAR
Simgeler
cm
santimetre
Devir
dak
Dakika
kDa
Kilo dalton
Litre
Mikro (10-6 )
Mili (10-3 )
Molar
Nano (10-9 )
OD
Optik younluk (optical density)
Greceli santrifj kuvveti (relative centrifugal force, rcf)
Saniye
sa.
Saat
Tm
Erime scakl (melting temperature)
nite
Sonsuz
Ksaltmalar
ABD
Amerika Birleik Devletleri
Amp
Ampisilin
Baz ifti
BMGY
Tamponlanm Karmak Gliserol Besiyeri (Buffered Glycerol Complex

Medium)
BMMY
Tamponlanm Karmak Metanol Besiyeri (Buffered Methanol Complex

Medium)
DIG
Digoksijenin (digoxygenin)
DP
Polimerizasyon derecesi
DNA
Deoksiribonkleik Asit
TLC
nce Tabaka Kromatografisi
LB
Luria-Bertani
MA
Molekl Arl
OD
Optik younluk
PAGE
Poliakrilamid Jel Elektroforezi
PZR
Polimeraz Zincir Tepkimesi (PCR-Polymerase Chain Reaction)
RNA
Ribonkleik Asit
SDS
Sodyum Dodesil Slfat
SSC
Tuzlu Sodyum Sitrat (Saline Sodium Citrate)
YNB
Maya Azot Kayna (Yeast Nitrogen Base Sulfate without amino acids)
YPD
Maya Pepton Dekstroz (Yeast Peptone Dextrose)
TE
Tris-EDTA
xi
TAE
Tris-Asetat-EDTA
TGM
Tris-Glisin-Metanol
TGS
Tris-Glisin-SDS
xii
EKLLER DZN
ekil 2.1.
Pullulann kimyasal yaps ............................................................................. 2
ekil 2.2.
Niastay ve pullulan hidroliz eden enzimlerin etki ablonu ........................ 4
ekil 3.1.
Kt ulu DNA paralarnn ligasyonu iin kullanlan pJET1.2 plazmidi .... 10
ekil 3.2.
Ekspresyon vektr olarak kullanlan pPICZA plazmidi .......................... 10
ekil 4.1.
Bacillus sp. N16 izolat ve pullulanl agarda zon grnm ....................... 22
ekil 4.2.
Bakterilerden izole edilen genomik DNA'larn jel grnts ...................... 23
ekil 4.3.
a) WGF1-WGR1 b) PrF1-PrR2 c)PrF1-PrR1 d)PrF2-PrR1 primer iftleri ile

PY22 ve N16 genomik DNAlar ile gerekletirilen PZRden elde edilen
rnlerin agaroz jel elektroforez grntleri ............................................... 24
ekil 4.4.
a) K1 ve K4 b) K5, N2 ve N12 izolatlar ile WGF1-WGR1 primerleri

kullanlarak yaplan PZR ile elde edilen rnlerin agaroz jel elektroforez
grnts ...................................................................................................... 25
ekil 4.5.
PY22 pullulanaz geninin i blgesinden elde edilen probun etkinliinin

llmesi ...................................................................................................... 26
ekil 4.6.
PY22, N2, N12, N16 genomik DNAlarnn Southern blot-DIG etiketleme

sonucu X- n film grnts...................................................................... 27
ekil 4.7.
N12 genomik DNAsnn SalI ve StuI kesimi sonras yrtlen jelden

ekstraksiyon iin gerekli blgeler alndktan sonra ekilen grnt............ 28
ekil 4.8.
Koloni hibridizasyonu ile elde edilen membrann X- n film grnts... 29
ekil 4.9.
Plazmitlerin restriksiyon enzimleri ile kontrol........................................... 30
ekil 4.10. Geni iinden oaltan 2F-4R primerleri kullanlarak a) N12 genomik
DNAs ile b) K1, K4, K5, N2, N16 genomik DNAlar ile yaplan PZR ile
elde edilen rnlerin agaroz jel grnts. .................................................. 31
ekil 4.11. 2F-4R primerleri kullanlarak BK07, N10, K6, K18 ve N19 genomik
DNAlar ile yaplan PZR ile elde edilen rnlerin agaroz jel grnts. ... 32
ekil 4.12. pulATGF-5R primerleri kullanlarak BK07 ve N10 genomik DNAlar ile
yaplan PZR sonucu elde edilen rnlerin agaroz jel grnts.................. 33
ekil 4.13. BK21-BK27 klonlarndan elde edilen 1-7 plazmitlerin BglII restriksiyon
enzimi ile kontrol ....................................................................................... 34
xiii
ekil 4.14. XhoIF-puladpSTOP primerleri ile pJET-BK24 plazmitinden oaltlan

pullulanaz geni: BKpul................................................................................. 35
ekil 4.15. XhoIF-BK07stopht primerleri ile pJET-BKpul plazmitinden oaltlan
histidin eitketli pullulanaz geni: BKpulH..................................................... 36
ekil 4.16. pPICZA-BKpulH plazmiti SacI ile kesilerek kontrol edilmesi.................. 36
ekil 4.17. B. subtilis PY22 pullulanaz geninin yrtld agaroz jel grnts....... 37
ekil 4.18. PY22 pullulanaz geni ieren pJET1.2 plazmitlerinin restriksiyon sonucu jel
grnts ...................................................................................................... 38
ekil 4.19. pJETPY22pul plazmitinin restriksiyon sonucu jel grnts...................... 39
ekil 4.20. pPICZA-pul (a) ve pPICZA-pulH (b) plazmidinin HindIII restriksiyon
analizi sonucu ............................................................................................... 40
ekil 4.21. pPICZA-PY22pulH plazmitinin SacI ve MssI restriksiyon enzimleri ile
kesim sonu elde edilen DNA paralar......................................................... 40
ekil 4.22. SDS-PAGE jel grnts............................................................................. 41
ekil 4.23. Western blot membran grnts ................................................................ 42
ekil 4.24. pulATGF-puladpSTOP primerleri ile BK07 genomik DNAs kullanlarak
gerekletirilen PZR rnlerinin agaroz jel grnts ................................ 43
ekil 4.25. XhoIF-BK07stopht primerleri ile YBKpul PZR rn kullanlarak
oaltlan histidin etiketli BK07 pullulanaz geni: YBKpulH ................... 43
ekil 4.26. pPICZA-BKpulH plazmidinin SacI enzimi ile kesilerek dorulanmas .... 44
ekil 4.27. X33-YBKpulH (1-5) ve KM71H-YBKpulH (1-5) spernatantlar ile yaplan
Western blot analizi membran grnts..................................................... 45
ekil 4.28. SMD1168H-YBKpulH klonlarnn spernantlar ile yaplan Western blot
analizi membran grnts .......................................................................... 46
ekil 4.29.. SMD1168H-YBKpulH ile farkl pHlarda, 12. Ve 24. Saatte alnan
rneklerle yaplan Western blot analizi sonucu elde edilen membran
grnts ...................................................................................................... 47
ekil 4.30. KM71H-YBKpulH ile farkl pHlarda, 12. ve 24. Saatte alnan rneklerle
yaplan Western blot analizi sonucu elde edilen membran grnts ......... 47
ekil 4.31. KM71H-YBKpulH klonu ile 16C yaplan protein retiminden elde edilen
spernatantn histidin etiketli proteinini saflatrlma aamalarn gsteren
SDS-PAGE jel grnts............................................................................ 48
xiv
ekil 4.32. Histidin etiketli proteinin saflatrma aamalarnda elde edilen rneklerin
Western blot analizi...................................................................................... 49
ekil 4.33. KM71H-PY22pul klonlarnn pullulanaz retim yeteneklerini gsteren SDSPAGE grnts. ......................................................................................... 50
ekil 4.34. Western blot analizi sonucu membran grnts. ....................................... 51
ekil 4.35. Histidin
etiketli
PY22
pullulanaznn
spernatanttan
saflatrlmas
aamalarn gsteren SDS-PAGE jeli grnts.......................................... 51

ekil 4.36. BK07 Pullulanaz enziminin (BKpul)
optimum aktivite gsterdii pH
deerine ait sonular..................................................................................... 54

ekil 4.37. PY22 Pullulanaz enziminin (PY22pul) optimum aktivite gsterdii pH
ekil 4.38. BK07 pullulanaz enziminin (BKpul) optimum aktivite gsterdii scaklk
ekil 4.39. PY22 pullulanaz enziminin (PY22pul) optimum aktivite gsterdii scaklk
ekil 4.40. BK07 Pullulanaz enziminin termal stabilite sonular ................................. 56
ekil 4.41. PY22 Pullulanaz enziminin termal stabilite sonular ................................. 57
ekil 4.42. Saflatrlm enzimin reaksiyon rnlerini gsteren TLC plakas. ............. 60
ekil 5.1.
Farkl kaynaklarda izole edilen pullulanaz enzimlerinin homoloji aac .... 61
xv
ZELGELER DZN
izelge 2.1. Farkl pullulanaz kaynaklar ve izole edilen enzimlere ait baz zellikler.... 7
izelge 3.1. PZR s dng program iin sre ve scaklk koullar .............................. 12
izelge 4.1. BK07 pullulanaznn farkl indksiyon srelerinde elde edilen verileri ..... 52
izelge 4.2. PY22 pullulanaznn farkl indksiyon srelerinde elde edilen verileri ..... 53
xvi
1. GR
Enzimler,
hcrelerde
metabolik
faaliyetlerin
tmn
yneten
zel
katalizrlerdir. Organik kimyada kullanlan metotlar ile gerekletirilmesi ok g olan

birok reaksiyonun uygun ve spesifik enzimlerle kolaylkla gereklemesi, enzimlerin
canl hcrelerden izole edilerek eitli amalar iin kullanlmas fikirlerini dourmutur.
Bu sayede endstride enzimlerin kullanlmas ile ekonomik fayda da salanmaktadr.
Doal mikroorganizmalardan enzim retiminde, dk enzim verimi, dk
enzim aktivitesi ve zellikle hcre ii enzimlerin zahmetli saflatrma prosesleri gibi
zorluklarla karlalmaktadr.
Gen mhendislii teknikleri tm bu sorunlarn stesinden gelebilmektedir.
Molekler yntemle oaltlan spesifik gen, saf formda ve yksek miktarda izole
edilebilmekte ve yksek miktarda enzim retimi salanabilmektedir (Salleh vd. 2006).
Bu aratrmada, n denemeler kapsamnda pullulanaz reten yerel izolatlar
(Erem 2007) plaka zerinde kalitatif testle taranm, ardndan molekler biyoloji
yntemleriyle pullulanaz geninin varl aratrlmtr . Bu almalarn sonucuna gre,
B. subtilis BK07 izolat gen kayna olarak seilmitir ve bu izolattan pullulanaz
enzimini kodlayan genin izolasyonu gerekletirilmitir. Genin, C-ucu histidin ile
etiketlenmitir. Bu sayede hem Western blot analizi ile pullulanaz geni spesifik olarak
tespit edilebilir hale gelmitir hem de protein prifikasyonu ilemi kolaylatrlmtr.
Histidin etiketli pullulanaz geni, S. cerevisiase - mating faktr sayesinde hcre d
retimi mmkn klan pPICZA ekspresyon vektrne balanarak, konuku su olarak
Pichia pastoris mayasna aktarlm ve enzimin hcre d retimi gerekletirilmitir.
retilen rekombinant enzimin alt optimum scaklk ve pH deerleri belirlenerek,
enzimin substrat olarak pullulan ile reaksiyonu sonucunda edilen hidroliz rnleri tespit
edilmitir. Ayrca analizlerde pozitif kontol olarak yer verilen,
pullulanaz enzimi
rettii bilinen B. subtilis PY22 suundan da pullulanaz geni izole edilerek tm analizler
bu gen iin de e zamanl olarak gerekletirilmitir.
2.
2.1.
KURAMSAL BLGLER VE KAYNAK TARAMALARI

Pullulanaz Enzimi Substrat Pullulan
Pullulan, (nceden Pullularia pullulans veya Dematium pullulans olarak bilinen)
Aureobasidium pullulans tarafndan retilen suda znen bir polisakkarittir. Kimyasal

yap olarak -1,4 bal glikoz molekl nitesi olan maltotrioz lineer polimerlerinin,
-1,6 ba ile balanmas ile oluur. Pullulann fizyolojik fonksiyonu belirsizdir.
Aureobasidium sular tarafndan pullulann ykmlanmas, nemli saylabilecek lde
gereklememektedir. Bu durum pullulann depo maddesi olarak kullanlmadn
dndrmektedir. Genel olarak, pullulan ve benzer polisakkaritlerin, hcreleri
kurumaya kar koruduu ve hcrelerin doal substratlara balanmasna yardmc
olduu kabul edilmektedir (Leathers 2003).
ekil 2.1. Pullulann kimyasal yaps

Pullulan dk kalorili bir polisakkarittir ve memeli amilazlarna gsterdii
diren nedeniyle memeliler tarafndan tketildiinde diyet lifi olarak rol oynamaktadr.
Hem kat hem sv gda rnlerine niasta yerine eklenebilmektedir. Gdalarn
bozulmasna sebep olan bakteri ve kfler tarafndan sindirilebilir karbon ka yna olarak
deerlendirilememektedir ve bu nedenle gdalarn raf mrn gelitirmektedir. Ayrca
pullulan, su tutma asndan niastadan daha stndr ve gdalarn kuruyarak
bozulmasn geciktirmektedir (Singh 2008).
2.2.
Pullulanaz Enzimi
Pullulann -1,6 glikozidik balarn hidrolize edebilen enzimler pullulanazlar
olarak tanmlanmtr. Substrat spesifitesi ve rn ablonuna gre pullulanazlar, tip ve

tip olmak zere iki gruba ayrlmaktadr. Pullulanaz tip (EC 3.2.1.41), pullulanda ve
dallanm oligosakkaritlerde -1,6 balarn spesifik olarak hidrolize etmektedir.
Ykmlanma rnleri maltotrioz ve lineer oligosakkaritlerdir. Pullulanaz tip , glukanlarn (amiloz gibi) -1,4 balarna etki etmemektedir. Pullulanaz tip (veya
amilopullulanaz), pullulan tip gibi, pullulan ve dallanm oligosakkaritlerdeki -1,6
balarn hidrolize edebilmektedir. Ayrca dallanm ve lineer polisakkaritlerin -1,4
balarn da hidrolize etme yeteneine sahiptir. Pullulanaz tip nin amilopektin
zerine etkisi sonucu glukoz, maltoz ve maltotrioz gibi kk ekerler olumaktadr.
Daha nce tanmlanan pullulanazlarn aksine, pullulan hidrolaz tip ve tip nin,
pullulan ve dallanm substratlarda bulunan -1,6 balarn hidrolize etme yetenekleri
yoktur. Pullulann -1,4 balarn krmaktadr ve rn olarak panoz ve izopanoz
oluturmaktadr. Pullulan hidrolaz tip dier adyla neopullulanaz (EC 3.2.1.135),
pullulan panoza (-6-D-glikozilmaltoz) paralamaktadr. Pullulan hidrolaz tip dier
adyla izopullulanaz (EC 3.2.1.57), pullulan izopanoza (-6-D-maltozilglikoz)
paralamaktadr. En son pullulan hidrolaz tip tanmlanmtr. Bu arkeal enzim
pullulann -1,4- ve -1,6-glikozidik balarn paralayarak maltotrioz, panoz ve maltoz
oluturmaktadr (Bertoldo ve Antranikian 2002).
Pullulanazlar gibi izoamilazlar da (EC 3.2.1.68) -1,6 glikozidik balarn
hidrolize ederek dallanmay kran enzimlerdir. Pullulanazlar ile izoamilazlar arasndaki
temel fark,
pullulan hidrolize etme yeteneidir.
Pullulanazlar,
pullulan
ve
amilopektindeki -1,6 glikozidik balarn hidrolize edebilme yeteine sahiptir fakat

izoamilaz sadece amilopektindeki -1,6 glikozidik balarn hidrolize edebilmektedir
(Maarel vd 2002). Ayrca -amilaz (1,4- -D-glukan glukanhidrolaz, EC 3.2.1.1) -1,4
balarn hidrolize eder, fakat -amilaz da pullulana kar hibir aktivite gstermez
(Moubasher vd 2010).
ekil 2.2. Niastay ve pullulan hidroliz eden enzimlerin etki ablonu (Bertoldo ve
Antranikian 2002)
2.3. Pullulanaz Enziminin Kullanm Alanlar

2.3.1. Gda sanayisinde kullanm alanlar
Pullulann enzimatik hidrolizi ile maltotriozca zengin urup retiminde
pullulanazdan yararlanlmaktadr. Bu urup, dk donma noktas, hafif tatll, nemde
tutulmas, gda rnlerinde niastann retrogradasyonunu nlemesi; maltoz urubu,
4
glikoz urubu ve sakkaroza gre daha az renk oluumuna sebep olmas; scaklk
stabilitesinin iyi olmas, dk zelti viskozitesi, yksek fermente edilebilirlii ve
cams hali desteklemesi gibi, gda ve ila sanayisinde nemli olan pek ok mkemmel
zellie sahiptir. Gda sanayisinde tatl retimi, frnclk ve biraclkta; ila sanayisinde
damar ii beslenmede glikoz yerine kullanlabilir (Singh vd 2010).
Pullulanazn en yaygn endstriyel uygulamas glukoz ve maltoz urubu
retimidir. Sakkarifikasyon ilemi srasnda, srasyla glukoamilaz ve -amilaz ile
birlikte kullanlr (Bertoldo 1999). Niastadan glikoz retmek iin glukoamilaz enzimi
ile birlikte; maltoz retimi iin -amilaz enzimi ile birlikte kullanlmaktadr.
Sakkarifikasyon
ilemi
srasnda
pullulanazn
ilave
edilmesi
substrat
konsantrasyonunu artrmakta, reaksiyon sresini ksaltmakta ve rn verimini

artrmaktadr (Nair vd 2006).
Glukoamilaz ve pullulanaz enzimleri sakkarifikasyon ileminde ayn anda
kullanldnda, glukoamilaz sadece lineer -1,4-glikozidik balarn hidrolize ederken,
pullulanazn spesifik olarak amilopektin kalntlarnn dallanma noktasn krmas daha
etkili
sakkarifikasyon
depolimerizasyon
ilemini
seviyesi daha
mmkn
yksektir.
klmaktadr.
Sonu
Glukoamilazla
olarak
birlikte
ulalan
pullulanaz
kullanmnn pratik avantaj daha az glukoamilaz aktivitesinin kullanlmasdr. Bu da %

60a varan oranda daha az glukoamilaz kullanmn salamaktadr. Bu sayede
glukoamilaz enziminin katalize ettii, D-glikozun izomaltoza polimerizasyonu daha az
gereklemektedir (Ling vd 2009).
Frn rnlerinde bayatlamay nleyici ajan olarak kullanlan -amilazn hafif
doz
am
halinde
ekmekte
yapkanlk
meydana
gelmektedir.
Pullulanaz,
yapkanlktan sorumlu bileiklerin uzaklatrlmasn salayarak bu problemi ortadan

kaldrmaktadr (Van Der Maarel vd 2002).
2.3.2. Dier kullanm alanlar

Dallanm siklodekstrin retimi, pullulanazn ilgin ve yksek ekonomik deere
sahip bir uygulama alandr. Siklodekstrinler ve maltozil-siklodekstrin ve glikozilsiklodekstrin gibi dallanm siklodekstrinler, sadece glikoz birimlerinden oluan
homojen siklik oligosakkaritlerdir (Salleh vd. 2006). Siklodekstrinler ve dallanm
siklodekstrinler deiken materyalleri stabilize etmede, koku maskelemede ve
znemeyen veya az znen ilalarn znr hale getirilmesinde yaygn olarak
kullanlmaktadr (Tanimoto vd 2005).
2.4. Pullulanaz Enzimi ze rine Yaplan almalar
Son zamanlarda endstriyel uygulamalarn teviki ile, bir ok pullulanaz
tanlanm ve allmtr (Erra-Pujada vd 2001). Yaplan almalarda, Bacillus sp.
US149 (Roy vd 2003), Bacillus sp KSM-1876 (Hatada vd 2001), Bacillus sp. KSM1378 (Ara vd 1995), Bacillus sp. S-1 (Lee vd 1997) izolatlatlar, pullulanaz enzimini
reten mezofil karakterli organizmalardr. Ayrca termofil karakterli Bacillus
thermoleovorans US105 (Messaoud vd 2002), Bacillus sp. DSM 405 (Brunswick vd
1999), Clostridium thermosulfurogenes SV9 (Swamy ve Seenayya 1996) izolatlarnn
ve hipertermofil karakterli Fervidobacterium pennavorans Ven5 (Bertoldo vd 1999)
izolatnn da pullulanaz enzimi rettii tespit edilmitir.
Farkl kaynaklardan izole edilen pullulanaz enziminin molekler ar lnn
geni bir aralkta deitii grlmektedir. Genelde, pullulanaz tip Iin molekler arl
70-80 kDa arasnda iken, pullulanaz tip IInin molekler arl 100-210 kDa arasnda
deimektedir (Kim vd 2000).
Stefanova vd (1999), Lee vd (1997) ve Ara vd (1995) pullulanaz enziminin

aktivitesi ve stabilitesi zerine Ca++ iyonlarnn bir etkisi olmadn bildirmilerdir.
Fakat Ling vd (2009) tarafndan yaplan almada 2mM Ca++ ilavesi ile pullulanaz
aktivitesinde %70 art kaydedilmitir. Saha vd (1988) yaptklar almann sonucunda
pullulanaz enziminin aktivitesi iin Ca++ iyonuna ihtiya duymad fakat enzimin
termal stabilitesinde ve konformasyonunun korunmasnda nemli rol oynuyor
6
olabileceini bildirmilerdir. Leveque vd (2000), Ca++ iyonlarnn pullulanaz enzimini

stabilize etme ve aktifletirme mekanizmas zerine herhangi bir sonuca varlamadn
bildirmitir.
izelge 2.1de farkl kaynaklardan elde edilen pullulanaz enzimlerine ait zellikler
zetlenmitir.
izelge 2.1. Farkl pullulanaz kaynaklar ve izole edilen enzimlere ait baz zellikler
Kaynak
MA 1
Optimu m
(kDa)
En zimin
tipi
Referans
pH
Optimu m
Scaklk
(C)
77
6.0
85
Koch vd. 1997
Te2
5.6
75
Messaoud vd. 2002
Bacillus sp. US149
200
5.0
60
II
Roy vd. 2003
Bacillus acidopullulyticus
97
5.5
60
Te
Stefanova vd. 1999
Bacillus sp. DSM 405
126
6.0
70
II
Brunswick vd. 1999
Bacillus sp. S-1
140
9.0
60
Lee vd. 1997
Desulfucoccus mucosus
74
5.0
85
II
Duffner vd. 2000
Thermus IM 6501
80
6.0
70
Kim vd. 2000
Te
9.0
60
Salleh vd. 2006
Fervidobacterium
Pennavorans VEN 5
Bacillus thermoleovorans
US105
Exiguobacterium sp.
MAAC-1
1
Molekler a rlk; 2 Tespit edilmed i
Bunlara ilaveten pullulanaz enzimlerinde dikkat eken bir zellik, tm

pullulanaz tip I enzimlerinde bulunan ve YNWGYDP olmak zere yedi aminoasitten
oluan korunmu blgedir (Bertoldo vd 2004). Pullulanaz tip II enzimleri bu korunmu
blgeyi iermemektedir (Bertoldo vd 1999). Yamashita vd (1997), bu korunmu
blgenin -1,6 glikozidik balarnn degradasyonunda veya enzimin substrata
balanmasndan sorumlu olabileceini ne srmlerdir.
2.5. Konuku Su Pichia pastoris ile Rekombinant Protein retimi

Metilotrofik bir maya olan P. pastoris
rekombinant protein retimlerinde
kullanm olduka yaygn olan karyotik konuku sistemdir (Higgins ve Cregg 1998).
P. pastoris yabanc proteinlerin retiminde gerek akademik olarak gerekse endstriyel
boyutta olduka ilgilenilen bir organizmadr (Cereghino ve Cregg 1999).
Rekombinant protein retimlerinde konuku olarak P. pastoris kullanmnn
salad baz avantajlar yle sralanabilir; (1) verimli ve sk denetim altnda alan
AOX1 promotorunun mevcut oluu, (2) glikozilasyonun genellikle en fazla 20 adet
kalnt ile ve nispeten daha ksa zincirli N bal yksek- mannozlu oligosakaritlerle
gereklemesi, (3) entegrasyonu salanan genlerin oklu kopyalar halinde bulunduu
kararl yapda transformantlarn elde edilebilmesi, (4) yabanc proteinleri yksek
seviyelerde salglayabilme yetenei ve (5) yksek hcre yo unluklu retime uygunluu
ve lek bytmenin kolay oluudur (Demain 2005).
P. pastorisde yabanc bir genin ekspresyonu 3 temel aamada gerekleir: (a)
ekspresyon vektrne genin sokulmas, (b) ekspresyon vektrnn P. pastoris
genomuna sokulmas ve (c) yabanc geni potansiyel olarak ekspres eden sularn
seilmesidir. Yabanc bir DNA sekansnn ekspresyon vektrne sokulmas ise genelde
E.colide yaplmaktadr. Bu yzden P. pastorisin tm ekspresyon vektrleri E.coli/P.
pastoris mekik(shuttle) vektrdr. Bakteride kalabilmesi iin bakteriyel replikasyon
orijini ierir (Cereghino vd 2001).
Yabanc proteinlerin salglanmas iin baz ekspresyon vektrleri salglama
sinyalini kodlayan sekanslar ierir. Bunlar yabanc gen ile ayn ereve iindedir.
Genellikle bu salglama sinyalleri; P. pastoris asit fosfataz (PHO1) ve S. cerevisiase mating faktr (-MF) olmaktadr.
Bu almada, S. cerevisiase - mating faktr ieren pPICZA ekspresyon
vektr kullanlmtr. Konuku organizma olarak ise metanol kullanm doal tipe gre
daha yava olan P. pastoris KM71H suu seilmitir.
8
3. MATERYAL VE METOD
3.1. Materyal
3.1.1. al mada kullanlan bakte ri ve maya sular
Gen kayna olarak kullanlmas dnlen yerel izolatlar, Akdeniz niversitei
Gda Mhendislii Blmnde tamamlanm bir alma ile Erem vd. (2009)
tarafndan elde edilmitir. Pozitif kontrol ve B plan kapsamnda deerle ndirilen
Bacillus subtilis PY22 suu, Nebraska niversitesi, Gda Bilimi ve Teknolojisi
Blmnde grevli Prof. Dr. Andrew Benson tarafndan salanmtr.
Yaplan almalarda plazmitlerin oaltlmas amac ile transformasyona
elverili E. coli suu olan DH5 (Invitrogen, CA, ABD) kullanlmtr. Rekombinant
enzim retiminde kullanlmak zere, konuku sistem olarak Pichia pastoris KM71H
(arg4 aox1::ARG4) (Invitrogen, CA, ABD) suu kullanlmtr.
3.1.2. al mada kullanlan tayc plazmitle r
Kt ulu DNA paralarnn ligasyonu iin pJET 1.2 (Fermentas, MD, ABD)
klonlama vektr kullanlmtr. Hcred protein retimi iin, P. pastoris pPICZA
(Invitrogen, CA, ABD) ekspresyon vektr kullanlmtr. ekil 3.1 de pJET 1.2
plazmidinin, ekil 3.2 de
pPICZA plazmidinin haritas ve endonkleaz kesim
blgeleri verilmitir.
ekil 3.1. Kt ulu DNA paralarnn ligasyonu iin kullanlan pJET1.2 plazmidi
ekil 3.2. Ekspresyon vektr olarak kullanlan pPICZA plazmidi

10
3.1.3. Kimyasallar ve enzimler

almada kullanlan restriksiyon endonkleazlar ve bunlarn tampon zeltileri
Fermantas (MD, ABD) firmasndan temin edilmitir. Endonkleazlar kullanlrken
retici firmann talimatlar uygulanmtr. Farkl ekilde belirtilmedii takdirde
kullanlan kimyasallarn tamam Sigma-Aldrich (MO, ABD) ve Merck (Darmstadt,
Almanya) firmalarndan temin edilmitir. almalarda aksi belirtilmedii takdirde
Japon Firmas olan Hayashibara tarafndan hibe yolu ile temin edilen pullulan
kullanlmtr.
3.2. Metod
3.2.1. Temel molekler biyoloji yntemleri
Temel molekler biyoloji yntemlerinin uygulanmasnda kaynak olarak
Sambrook ve Russele (2001) bavurulmutur. Buna ek olarak, zellikle de P.
pastorisde klonlama almalarnda Inan vd (2007) kaynak olarak kullanlmtr.
3.2.1.1.
DNA izolasyonu
DNA izolasyonu iin, Luria Bertani (LB) Lennox agar zerinde gelitirilen saf
kltrdeki tek koloniden alnarak, 4 mL LB Lennox sv besiyerine ekim yaplmtr ve
bir gece gelitirilen kltrler kullanlmtr. alkalamal inkbatr ( Excella E24, New
Brunswick Scientific, NJ, ABD) kullanlarak tplerde veya engelli erlenlerde gelitirilen
kltr svs santrifjlenerek hcre peleti elde edilmitir ve hcrelerden DNA izolasyonu
MasterPureT M Gram Positive DNA Purification Kit (Epicentre) ile retici firmann
talimatlar dorultusunda gerekletirilmitir.
Pelet, hcre paralayc enzimlerle muamele edilerek hcre lizat elde edilmitir.
Lizatta bulunan proteinler uygun zelti kullanlarak ktrlerek uzaklatrlmtr ve
daha sonra peletlenen DNA da ykandktan sonra TE tamponunda zlmtr. lemler
srasnda >10 000 g kapasiteli Centrifuge 5424 (Eppendorf, Almanya) ve soutmal
gerektiinde Allegra 25R (Beckman Coulter, CA, ABD) santrifj ekipmanlar
11
kullanlmtr. Elde edilen DNA izolatlar PCR ve Southern blot analizlerinde

kullanlmak zere saklanmtr.
3.2.1.2.
Polimeraz zincir tepkimesi (PZR)
almalarda gerekletirilen tm PZR reaksiyonlar iin TGradient (Biometra

Biomedizinische Analytik GmbH, Almanya) thermocycler (s dng cihaz) ve KOD
HotStart DNA polymerase (Novagen, Almanya) enzim kiti kullanlmtr.
Kullanlan gradient PZR cihaznda, reaksiyon iin kullanlacak primerlerin
balanma scaklk aralklar, primerlerden dk erime scaklna sahip olan primerin
balanma scaklnn (Tm) 5C olacak ekilde programlanmtr. Yrtlen almada
PZR analizlerinde kullanlan primerler ve bunlara ait baz zellikler Ek 8.2de
verilmitir.
PZR cihaznda amplifikasyon sresi, beklenilen PZR rnn kb cinsinden
bykl gz nnde tutularak DNA polimeraz kitinde ngrlen sre belirlenmitir.
Kapak scakl tepkime suresince 99Cde tutulmu ve tepkime sonrasnda tplerin
bekletilecei scaklk ise 4C olacak ekilde ayarlanmtr. Gradient PZR denemelerinde
35 dng ieren dz program kullanlmtr. izelgede uygulanan dng program iin
uygulanan artlar verilmitir.
izelge 3.1. PZR s dng program iin s re ve scaklk koullar
Is Dng Program Ak
Sra
Scaklk (C)
Sre (sn.)
94
120
94
30
Tm5
30
70
15-150
72
300
12
Dng Komutu
34 kere 2.ye git.
3.2.1.3.
Agaroz jel elektroforezi
PZR rnlerinin varl/doruluu ve restriksiyon endonkleazlar ile yaplan

kesimlerin kontrol agaroz jel elektroforezi ile gerekletirilmitir. Agaroz jel
hazrlanrken, 1TAE tampon zeltisine (Tris-Asetat-EDTA, 40 mM Tris, 20 mM
asetik asit, 1 mM EDTA) %1 orannda agaroz (SeaChem, FMC Bioproducts, ME,
ABD) ilave edilerek zndrlmtr. Hazrlanan bu zeltiye 1l/50 mL etidiyum
bromr zeltisi (10 mg/mL) ilave edilmitir. Uygun ebatta ve ekilde seilen jel
kalplarna dklerek jel donuncaya kadar beklenmi ve jel blou elde edilm itir. Jel
kuyularna yklenecek rnekler 5 l rnein ve 1 l 6 Loading Dye jel ykleme
tamponunun ultra saf su ile seyreltilmesiyle toplam 10-20 l hacimde hazrlanmtr. Jel
blou 1TAE tampon iinde tutularak rnekler jel kuyularna yklenmitir. Daha sonra
elektroforez uygulamas ile DNA rnekleri jel iinde yrtlmtr. Elektroforez
uygulamalar 120 V doru akm altnda, 45-90 dak. sreyle gerekletirilmitir. Agaroz
jel iinde molekler byklklerine gre yatay bantlara ayr lan DNA moleklleri
etidiyum bromr varlnda UV k (312nm) kaynandan yararlanlarak jel
grntleme sistemi (Vilber Lourmant E-Box-VX2) ile grntlenmitir. Agaroz jel
iemlerinde markr olarak (M) GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas)
kullanlmtr.
3.2.1.4.
Ligasyon ve transformasyon
Transformasyon ilemlerinde, CaCl2 metodu ile kimyasal transformasyona

yetenekli hale getirilmi E.coli DH5 suu kullanlmtr. Kimyasal transformasyon
ilemleri buz zerinde gerekletirilmitir.
E.coli DH5 suu kimyasal trasformasyona uygun hale getirilmesi iin CaCI2
metodu ile transformasyona yetenekli hale getirilmitir. Kimyasal transformasyona
uygun
bakteri
hcrelerine
yaplan
transformasyon
ilemleri
buz
stnde
gerekletirilmitir. Buz stnde tutulan hcrelere 1-5 l plazmit zeltisi veya ligasyon
karm dorudan ilave edilmi ve 30 dak. sre ile buz zerinde inkbe edilmitir.
Hcrelere 42Cye ayarlanm s blounda (Techne Dri- Block DB-2D) 60 sn tutularak
s oku uygulanm ve tekrar buz zerinde 5 dak. inkbe edilmitir. Daha sonra 200 l
13
sv Luria-Bertani (LB) Miller (5 g/L maya ekstrakt, 10 g/L pepton, 10 g/L NaCI) veya
sv Luria-Bertani (LB) Lennox besiyerinden 5 g/L maya ekstrakt, 10 g/L pepton, 5 g/L
NaCI) ilave edilen hcreler, 1 saat sreyle 37Cde alkalamal inkbatrde
inkbasyona braklmtr. Elde edilen hcre svs 100 g/mL Ampisilin ieren LB
Miller agar veya 25 g/mL Zeosin ieren LB Lennox agar petrilerine yayma yntemi ile
ekilmitir. Petriler bir gece 37 Cde remeye braklmtr.
P. pastoris hcrelerinin elektroporasyona uygun hale getirilmesi iin lityum
asetat metodu kullanlmtr (Wu ve Letchworth 2004). Maya hcrelerine yaplan
elektrokimyasal transformasyonda hcreler buz stnde bekletilerek zndrlmtr.
zerine lineer hale getirilmi DNA paras veya plazmitlerden 1-10 l olacak ekilde
ilave edilmitir. Ardndan buz stnde bekletilerek soutulmu 2 mm yzey geniliine
sahip elektroporasyon kvetlerine aktarlmtr. Eppendorf Eporator (Ependorf Eporator
4309) cihaznda 1500 V gerilimde ve 5 ms sre ile elektrotransformasyon ilemi
gerekletirilmitir. Akm uygulanan hcreler derhal buz zerine alnarak 1 ml souk 1
M sorbitol zeltisi ilave edilmitir. Temiz 1.5 ml hacimli mikro santrifj tplerine
alnan karm 1 saat 30Cde inkbe edildikten sonra 100 g/mL Zeosin ilaveli YPD
plakalarna yayma ekim yaplm ve transformasyon petrileri kolonilerin geliimi iin 23 gn sre ile 30Cde inkbe edilmitir.
Ligasyon
ilemlerinde
retici
firmann
nerdii
kullanm
talimatlar
dorultusunda plazmit ve ligasyonu yaplmak istenen DNA parasnn molar oranlar

1:3 veya 1:5 olacak ekilde ayarlanmtr. Tm ligasyon reaksiyonlar 15-25 l toplam
hacimde gerekletirilmitir. Ligasyon ilemlerinde Fermentas (Fermentas, MD, ABD)
ve Roche (Roche, Almanya) ligasyon kitleri kullanlmtr.
3.2.1.5.
Plazmit izolasyonu
Plazmit izolasyonu yaplacak bakteriler 3-4 mL uygun antibiyotikli sv

besiyerinde 37Cde 18-20 saat gelitirilmitir. Plazmit izolasyonu ilemlerinde
QIAprepSpin Miniprep Kiti (Qiagen, CA, ABD) kullanlmtr. Plazmit izolasyonu
retici firmann talimatlar dorultusunda gerekletirilmitir. Elsyon ilemleri 50 l
14
10 mM Tris (pH 8.0) ile yaplmtr. Plazmit izolasyonu esnasnda santrifj ilemleri >
20 000 g hzda Centrifuge 5424 (Eppendorf, Almanya) cihaz ile gerekletirilmitir.
Plazmit izolasyonlarnn kalitesi ve doruluu restriksiyon endonkleazlar ile yaplan
uygulamalar ile agaroz jelde yrtlerek kontrol edilmi ve daha sonra DNA miktarlar
belirlenmitir.
3.2.1.6.
PZR rnlerinin saflatrlmas
PZR rnlerinin saflatrlmasnda MinElute PCR Purification Kit (Qiagen, CA,

ABD) kullanlmtr. lemler, kitin talimatlar izlenerek gerekletirilmitir. Elsyon
10-20 l 10mM Tris (pH 8) ile yaplmtr. lemler srasnda santrifj iin > 20 000 g
hzda Centrifuge 5424 (Eppenddorf, Almanya) cihaz kullanlmtr.
3.2.1.7.
Jelden DNA paralarnn ekstraksiyonu
DNA paralar %1lik dk erime noktal agaroz jelde (SeaKem, FMC

Bioproducts, ME, ABD) yrtlm ve istenen bant jelden kesilmitir. Jel ztleme
ilemleri iin MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, CA, ABD) kullanlmtr. lemler
retici firmann talimatlar dorultusunda gerekletirilmitir. Santrifj ilemleri
>20,000 g hzda Centrifuge 5424 (Eppenddorf, Almanya) cihaz ile gerekletirilmitir.
3.2.1.8.
SDS-PAGE ve Western blot analizi
SDS-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) Owl P8D8 (Thermo

Scientific) cihaz ile %5 poliakrilamit ykleme jeli ve %7.5 poliakrilamit ayrma jeli
olacak ekilde hazrlanarak yrtlmtr.
rnekler, toplam hacim 25 l olacak ekilde protein retiminden alnan
spernatanlarn 1:3 orannda 4X SDS jel ykleme tamponu (200 mM Tris-Cl, pH 6.8,
%8 SDS, %0.4 Bromphenol Blue, %40 Glycerol, 100 mM DTT) ile kartrlmas ve 70
Cde 10 dakika denatre edilmesi ile hazrlanmtr. Ardndan 20 llik ksm jele
yklenmitir.
15
Elektroforez ilemi, 1X TGS (0.025 M Tris base, 0.192 M Glycine, %0.1 SDS,
pH 8.3) tamponunda 150 V deerinde 60 dakika yrtlmesi ile gerekletirilmitir.
Daha sonra jel, IRDye Blue Protein Stain (Odyssey) ile 1 saat orbital alkalayc
zerinde boyanm, saf su ile 15 dakika ykandktan sonra LiCor (Odyssey) ile
grntlenmitir.
Western blot analizi yaplacaksa, jelde yrtme ileminden hemen sonra
proteinler, Owl HEP-1 Electroblotter (Thermo Scientific) kullanlarak 60 dakika sre ile
20 V gerilim uygulanarak PVDF membrana (Millipore) aktarlm ve oda scaklnda
gece boyu kapatma tamponu (0.2xPBS+%0.1 Casein) ile orbital alkalaycnn zerinde
muamele edilmitir.
Polihistidin etiketli proteinin tespit edilmesi iin primer antikor olarak Penta-His
Antibody (Mouse anti-(H)5, Qiagen), sekonder antikor olarak Goat-Anti Mouse
IRDye800cw (Licor) Antibody kullanlmtr. Hibridizasyon ilemi tamamlandktan
sonra membran Licorda (Odyssey) 800nm dalga boyunda taranarak grntlenmitir.
3.2.1.9.
Southern blot analizi
Yerel bakteri izolatlarndan genomik DNA izolasyonu yaplm ve farkl

restriksiyon enzimleri ile kesilmitir. Restriksiyon ileminin ardndan %0.8 agaroz jele
yklenen rnekler 120V gerilimde 2 saat 1TAE tamponu iinde yrtlmtr.
Elektroforez ilemi tamamlandktan sonra jel 45dak. denatrasyon zeltisi
(1.5M NaCl, 0,5M NaOH) ile ardndan 30 dak. ntralizasyon zeltisi (1.5M NaCl,
0.5M Tris-HCl (pH 7.5), 1mM EDTA) ile orbital alkalayc zerinde muamele
edilmitir. Bu ilemin sonunda DNAnn naylon membrana transferi gerekletirilmitir.
Naylon membran (2020 cm Positively Charged Nylon Membran, Roche,
ABD), 10SSC blotlama tamponu (3M NaCl, 0.3M Sodyum Sitrat, 1mM EDTA) ile
slatlmtr. Southern blot dzenei kurulmu ve membran, jelin alt yz ile temas
16
edecek ekilde jelin zerine yerletirilmitir. Transfer ilemi yaklak olarak 3 saat
srmtr.
Transfer ileminin ardndan membran oda scaklnda 5 dakika kurutulmu ve
ultraviyole apraz balayc (CL-1000 Ultraviolet Crosslinker, UVP, CA, ABD) ile 3
kez 120mJ UV n uygulanarak DNA moleklleri membran zerine balanmtr.
Hibridizasyon ilemi ile devam edilmitir. Membran, 41Cde 1 saat n hibridizasyon
zeltisi (DIG Easy Hyb, Roche, Almanya) ile muamele edilmitir. Ardndan DIG
etiketli probu ieren hibridizasyon zeltisi eklenerek ayn scaklkta gece boyu
hibridizasyona braklmtr. Hibridizasyon srasnda spesifik olmayan balanmala r
ortadan
kaldrmak
iin
hibridizasyon
ilemimin
sonunda
ykama
ilemleri
gerekletirilir. Hibridizasyon tpne nce birinci ykama zeltisi (2SSC+%0.1 SDS)

eklenmi ve oda scaklnda 5er dakika olmak zere ilem iki kez tekrar edilmitir.
Ardndan 68Cde 15er dakika olmak zere 2 kez ikinci ykama zeltisi
(0.5SSC+%0.1 SDS) ile muamele edilmi ve immnolojik tayine geilmitir.
Membran, ileme uygun bir kaba alnarak, orbital alkalayc zerinde 1 saat
kapatma tamponu (1DIG Blocking Solution, Roche) uygulanmtr. Ykama tamponu
(0.1M Maleik asit pH 7.5, %0.3 (v/v) Tween 20) ile 2 kez 5er dakika ykandktan sonra
1 saat anti-DIG-Alkalin Fosfataz antikor zeltisi ile muamele edilmitir. Ykama
ileminden sonra 5 dak. dedeksiyon tamponunda (0.1M Tris pH 9.5 ve 0.1M NaCl)
bekletilmitir. Ardndan dedeksiyonu gerekletirmek iin, membran effaf propilen zar
iine yerletirilerek zerine CSPDR (alkalin fosfataz substrat, Roche) damlatlmtr.
Oda scaklnda 5 dak. ardndan 37 Cde 10 dak. inkbe edildikten sonra X- n film
kasedine yerletirilmitir. Sonraki ilemler karanlk odada gerekletirilmitir. X- n
filmi ile st ste 20-60 dak. inkbe edildikten sonra Kodak film gelitirme zeltileri ile
muamele edilerek grntleme gerekletirilmitir.
3.2.1.10. Koloni hibridizasyonu

Southern blot analizi ile genomik DNA restiriksiyon enzimleri ile paralanm
ve aranlan genin bulunma olasl olan blgeler prob ile belirlenmitir. Bu sonuca gre
17
belirlenen restriksiyon enzimi ile genomik DNA yeniden kesilerek jelde nceki
koullarda yrtlmtr. nceki analizde belirlenen blge jelden kesilerek, DNA
ekstrasiyonu gerekletirilmitir. Restriksiyon analizinde kullanlan enzim ile pUC18
plazmidi de kesilmi ve ekstrakte edilen DNA fragmentleri ile ligasyon ilemi
gerekletirilmitir ve transformasyona yetenekli E.coli hcrelerine aktarlmtr.
Transformasyon sonucu elde edilen koloniler numaralandrlm iki plakaya
kopya halinde ekilmilerdir ve 1 gece 37Cde inkbe edilmilerdir.
Plaka boyutlarna uygun ekilde kesilmi pozitif ykl membran, plakann
zerine dorudan braklmtr. Dzgn ekilde kaldrldktan sonra oda scaklnda 5
dak. kurutulmutur. Ardndan %10 SDS zeltisi ile doyurulmu Whatman katlar
zerinde 3 dakika, Southern blot analizinde kullanlan denatrasyon ve ntralizasyon
zeltileriyle doyurulmu Whatman katlar zerinde sras ile 5er dak. slatlmtr.
Ardndan 10SSC tamponu ieren bir kaba alnarak orbital alkalayc zerinde 10 dak.
muamele edilmitir. Oda scaklnda 5 dak. kurutulduktan sonra apraz balaycda 3
kez 120 mJ UV n uygulanarak DNAnn membrana balanmas salanmtr.
Hibridizasyon, immnolojik tayin ve grntlme Southern blot analizinde olduu gibi
gerekletirilmitir.
3.2.2. Dier biyokimyasal analizle r
3.2.2.1.
Rekombinant proteinin saflatrlmas
Protein (pullulanaz) hcred ve polihistidin etiketli retilmitir. Hcreler, 96

saat metanol indksiyonunun ardndan 6000 gde 5dak. santrifjlenerek ktrlmtr
ve elde edilen spernatandan histidin etiketli proteinin prifikasyonu iin HisPur NiNTA Purification Kit (Thermo Scientific Pierce, IL, ABD) kullanlmtr. Kitin
talimatlar dorultusunda ilemler gerekletirilmitir.
Saflatrma prensibine gre histidin etiketli proteinler, nikel kolonda balanarak,
etiketsiz proteinlerden ayrlmaktadr. Kolonda balanm proteinler, 100 mM PBS (pH
18
7.4) (phosphate-buffered saline) iinde farkl imidazol konsantrasyonlar ieren

hazrlanm solsyonlar ile muamele edilerek ykanm ve ardndan els yonlar
gerekletirilmitir. Elsyon zeltisinde bulunan imidazolun uzaklatrlmas iin
diyaliz membran (Skin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO, Thermo Scientific, IL, ABD)
kullanlarak %5 gliserol ieren 100 mM PBS iinde, +4Cde gece boyu diyaliz
gerekletirilmitir. Saflatrma ilemi, SDS-PAGE analizi ile kontrol edilmitir.
3.2.2.2.
Pullulanaz aktivitesinin tayini
Pullulanaz aktivitesinin kantitatif olarak belirlenmesinde Hyun ve Zeikus (1985)

tarafndan kullanlan DNS yntemi baz modifikasyonlar yaplarak k ullanlmtr.
Yntemin esas, pullulann paralanmas ile aa kan indirgen ekerlerin llmesine
dayanmaktadr.
Reaksiyon karm, 200l enzim zeltisi ve 200l substrat zeltisi (100mM
pH 6 potasyum fosfat tamponunda hazrlanm %1 pullulan) ile hazrlanmtr. Karm
37Cde 1 saat inkbe edilmitir. nkbasyon ilemi sonunda 800l DNS zeltisi (%1
DNS, %30 sodyum potasyum tartarat tetrahidrat ve 400mM NaOH) eklenerek enzim
aktivitesi sonlandrlmtr. Ardndan 100Cde 5 dak. inkbe edilerek renk geliimi
salanm ve spektrofotometrede 540nm dalga boyunda okunan absorbans deerleri
kaydedilmitir. Okuma ilemi srasnda kr olarak, 0.dak.da DNS solsyonu eklenerek
aktivitesi durdurulmu olan ayn reaksiyon karm kullanlmtr.
Pullulanaz enzim aktivitesi iin 1 nite, yukarda belirtilen koullar altnda 1ml
enzimin 1 dakikada aa kard glikoz cinsinden indirgen eker miktarnn
mikromolar cinsinden ifadesi olarak tanmlanmtr (Salleh vd. 2006).
3.2.2.3.
Rekombinant enzimin karakterizasyonu
Iqbalin (1994) almas modifiye edilerek, rekombinant enzimin alma

koullarnn belirlenmesi iin optimum aktivite gsterdii scaklk ve pH aratrlmtr.
ncelikle 37Cde optimum pH deeri belirlenmi, bunun iin pH 3-10 aralndaki
19
enzim aktivitesi llmtr. Bunun iin sodyum-asetat (pH 3-6); sodyum- fosfat (pH 78) ve glisin-NaOH (pH 9-10) tampon sistemleri kullanlmtr.
Belirlenen optimum pHda farkl scaklklarda (4-70C) enzim reaksiyonu
gerekletirilmi ve enzimin alt optimum scaklk deeri belirlenmitir. Enzimin
termal stabilitesinin llmesi iin, enzim reaksiyondan nce farkl scaklk (30-70C)
ve srelerde (15, 30 ve 60dak.) inkbe edilmi ve enzimin kalan aktivitesi llmtr.
3.2.2.4.
Hidroliz rnlerinin tayini
Enzim substrat etkileimi sonucunda aa kan hidroliz rnleri ince tabaka

kromatografisi (TLC, Thin Layer Chromatography) yntemi ile Reddy vd. (1998)e
gre modifiye edilerek saptanmtr. Piyasadan hazr satn alnm 20x20 ebatlarndaki
hazr TLC plakalar (Merck 5567) kullanlmtr. Plakalar analizden nce 80Cde 3
saat stlarak aktifletirilmitir.
TLC tankna zgen zeltisi (n-butanol, asetik asit, distile su karm; 3:1:1)
analizden 30dak. nce doldurulmu ve tankn zgen buhar ile doymas salanmtr.
Hidroliz rnleri saptanacak olan reaksiyon karm DNS metodunda anlatld gibi
hazrlanm ve gece boyu inkbe edilmitir. rnekler plakaya zgenin 1 cm daha
ykseinde olacak ekilde yklenmitir. Plaka TLC tankna yerletirilmitir ve yrtme
ilemi zgen seviyesi plaka st snrna 1 cm kalana kadar srdrlmtr. lem
yaklak 3 saatte tamamlanmtr.
Oda scaklnda kurutulmu olan plakaya (0.5g difenilamin ve 0.5ml anilinin
50ml aseton iinde zldkten sonra kullanlmadan hemen nce 10ml fosforik asit
eklenmesi ile hazrlanan) grntleme zeltisi pskrtlmtr ve 80Cde 4 saat
inkbe edilerek rnlerin grnr hale gelmesi salanmtr.
20
3.2.2.5.
Toplam protein lm
Hcre spernatantlarnn protein ierii Pierce 660 nm Protein Assay (Thermo

Scientific, IL, ABD) kiti kullanlarak gerekletirilmitir. Bu test srasnda protein
konsantrasyonu, rneklerle birlikte okutulan bir seri BSA standart solsyonlarnn (125
g/ml, 250 g/ml, 500 g/ml, 750 g/ml, 1000 g/ml, 1500 g/ml, 2000 g/ml)
absorbans deerleri referans alnarak belirlenmitir. Protein miktarlar llecek olan
hcre ztleri, reaksiyon ayrac ile 1:15 orannda kartrlm, 5 dakika oda
scaklnda inkbasyondan sonra UV spektrofotometre cihaznda (Biochrom Libra
S50, ngiltere) 660 nm dalga boyunda absorbans deerleri llmtr. Paralel olarak
llen standart serisinden elde edilen absorbans deerleri ile izilen standart
grafiinden, bilinmeyen rnein protein miktar hesaplanmtr. Deneyler srasnda elde
edilen standart grafiklerinden biri ekil 8.2'de rnek olarak verilmitir.
21
4. BULGULAR
4.1. Bakterilerin Pullulanaz retme Yeteneklerinin Kalitatif Yntemle Taranmas
Bu projeye altyap oluturacak n denemeler daha nce tamamlanm bir
alma ile snm ekmekten izole edilen Bacillus soylar ile yaplmtr. Bu izolatlar,
pullulanaz enzimini retme potansiyelleri bakmndan kalitatif yntemle taranmtr.
Yntemin esas, pullulann etanolle ktrlmesine dayanr ve buna bal olarak hcre
d pullulanaz reten hcrelerin evresinde berrak zon oluumu gzlenir. n
denemelerde, 27 izolat taranm ve K1, K4, K5, N2, N12 ve N16 izolatlarnn
evresinde berrak zon olutuu gzlenmitir. Dierlerine gre daha geni zona sahip
olan N16 suunun gen kayna olarak kullanlabilecei dnlmtr. ekil 4.1de
pullulan agarn etanol ile ktrlmesinden sonra N16 izolatnn evresinde gzlenen
zonlar grlebilmektedir.
ekil 4.1. Bacillus sp. N16 izolat ve pullulanl agarda zon grnm
4.2. Ye rel zolatlardan Pullulanaz Genini Klonlama al malar
4.2.1. DNA izolasyonu
Kalitatif test sonucunda plakada evresinde zon gzlenen dolays ile potansiyel
pullulanaz retici olabilecei dnlen bakteri sularndan (K1, K4, K5, N2, N12 ve
N16) ve analizlerde pozitif kontrol olarak kullanlacak olan Bacillus subtilis PY22 (B.
subtilis 168 mutant) suundan genomik DNA izolasyonu yaplmtr. Bakterilerden
elde edilen genomik DNA izolatlarnn jel grnts ekil 4.2de verilmitir. Jelde
22
kontrol edilen genomik DNA izolatlar daha sonraki analizlerde kullanlmak zere
+4Cye kaldrlmtr.
ekil 4.2. Bakterilerden izole edilen genomik DNA'larn jel grnts

4.2.2. PZR (Polime raz Zincir Reaksiyonu) ile genin amplifikasyon denemeleri
NCBI GenBank BLAST tarama motoru kullanlarak, yakn Bacillus trlerine ait
pullulanaz gen dizilerinin homolog blgelerine gre farkl primerler tasarlanmtr (Ek
8.2de de verilen WGF1, WGR1, PrF1, PrR1, PrF2, PrR2) ve gen bulmaya ynelik
almalara ilk olarak PZR denemeleri ile balanmtr. Kalitatif pullulanaz aktivitesi
testlerinde plakada en geni zon verdii iin, ilk olarak N16 genomik DNAs PZR
denemelerinde kalp DNA olarak kullanlmtr. N16 izolat ile farkl primer iftleri
kullanlarak farkl primer balanma scaklklarnda gerekletirilen PZR analizlerinin
sonucu elde edilen jel grntleri aada verilmitir. ekil 4.3de verilmitir.
PZR analizinde pozitif kontrol olarak kullanlan PY22 genomik DNAs ile tm
PZR reaksiyonlarnda baarl ekilde gereklemitir. WGF1 ve WGR1, pullulanaz
genini tm gen halinde amplifiye etmek iin denenmi primer iftidir fakat ekil
4.3.ada grld gibi N16 genomik DNAsndan spesifik olmayan rnler
oalmtr. Geni iinden oaltmak zere tasarlanm primerler farkl kombinasyonlar
23
halinde (ekil 4.3 b, c ve d) denenmi fakat N16 DNA kalb ile spesifik rn elde
edilememitir.
a)
b)
c)
d)
ekil 4.3. a) WGF1-WGR1 b) PrF1-PrR2 c)PrF1-PrR1 d)PrF2-PrR1 primer iftleri ile

PY22 (pozitif kontrol) ve N16 genomik DNAlar ile gerekletirilen
PZRden elde edilen rnlerin agaroz jel elektroforez grntleri
Bunun zerine dier izolatlarn (K1, K4, K5, N2, N12) genomik DNAlar ile
PZR analizlerine devam edilmitir. ekil 4.4de bu analizlerin jel grntlerinden
bazlar verilmitir.
K1, K4, K5, N2 ve N12 izolatlarnn genomik DNAs ile hem geni i
blgelerden oaltmak iin tasarlanm primerler (PrF1, PrR1, PrF2, PrR2) hem de tm
geni elde etmek iin tasarlanm primerler (WGF1, WGR1) ile PZR gerekletirilmitir.
K1, K4, K5, N2 ve N12 genomik DNAlar ile iten tasarlanan primerler kullanlarak
gerekletirilen reaksiyonlarda PZR rn elde edilememitir ve bu sebeple jel
grnts verilmemitir.
24
a)
b)
ekil 4.4. a) K1 ve K4 b) K5, N2 ve N12 izolatlar ile WGF1-WGR1 primerleri

kullanlarak yaplan PZR ile elde edilen rnlerin agaroz jel elektroforez
grnts
ekil 4.4de ayn izolatlar ile tm geni oaltmak iin yaplan reaksiyon sonucu
elde edilen jel grnts verilmitir. Burada ekil 4.4a ve 4.4bde grlecei zere K1,
K4, K5 ve N2den spesifik rn oalmamtr ancak N12 izolatnn 58C primer
balanma scaklnda gerekletirilen reaksiyonu sonucunda pozitif kontrolde oalan
rn (yaklak 2200 b) ile yakn byklkte rn oald grlmektedir (ekil
4.4.b). Bu nkleotid uzunluu pullulanaz geni iin beklenen nice liktedir. Fakat
reaksiyon tekrar edildiinde ayn rn tekrar elde edilememitir. Olumsuz sonulanan
25
bu PZR denemeleri iin jel grntleri verilmemitir. Bunun zerine geni bulmaya
ynelik almalara Southern blot yntemi ile devam edilmitir.
4.2.3. Southern blot ynte mi ile genin izolasyonu dene meleri
Southern blot analizinde kullanlan prob, B. subtilis PY22 genomik DNAsndan
PrF1-PrR2 primerleri ile oaltlan yaklak olarak 635 b byklndeki PZR
rnnn digoksigenin (DIG) ile etiketlenmesi ile eld e edilmitir. Etiketleme ilemi iin
DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche, Almanya)
kullanlmtr. Etiketlenen probun etkinlii llmtr ve standart DIG probu ile
karlatrlmtr (ekil 4.5). Prob, 0.1 pg/l konsantrasyona kadar tespit edilebilmitir.
Bu sonu retilen probun iyi altn gstermektedir.
ekil 4.5. PY22 pullulanaz geninin i blgesinden elde edilen probun etkinliinin
llmesi a) DIG etiketli DNA standard b) PY22 probu
N2, N12, N16 ve PY22 genomik DNAlar, farkl restriksiyon endonkleazlar
(SalI, StuI, KpnI ve XhoI) ile kesilerek %0.8lik agaroz jelde 100Vda 2 saat
yrtlmtr. Jelde ayrm salanan DNAlar Southern blot metoduna uygun olarak
membrana aktarlm ve PY22 pullulanaz geninin i blgesinden hazrlanm DIG
etiketli prob ile hibridizasyon ilemleri gerekletirilmitir. Analiz sonucu elde edilen
X-n film grnts ekil 4.6da verilmitir.
26
ekil 4.6. PY22, N2, N12, N16 genomik DNAlarnn Southern blot-DIG etiketleme
sonucu X- n film grnts
Elde edilen grntde PY22 genomuna ait ksmda probun erit boyunca
balanabildii grlmekte, bunun da PY22 genomik DNAs ile kesimin tam olarak
gerekleemedii iin olduu dnlmektedir. N12 genomik DNAsnn SalI ve StuI
kesimi sonucu, belirgin, molekler arl tahmin edilen gen byklnden daha
yksek ve tek bant halinde olan DNA fragmanlar gzlenmitir. N2 ve N16da ise
gzlenen bantlarn silik ve tahmin edilen gen byklnden daha dk molekler
arlkta olmas nedeni ile bu sular zerinde daha fazla durulmamtr.
N12 genomik DNAsnn SalI kesimi sonucu elde edilen bandn, DIG etiketli
markra gre 2322-4361 b bantlar arasnda yer ald ve byklnn yaklak 3300
b olduu grlmektedir. Ayn izolatn StuI kesimi ile elde edilen bandn ise DIG
etiketli markrda bulunan 6557 b byklndeki bant hizasnn biraz zerinde olduu
gzlenmitir.
N12 genomik DNAs SalI ve StuI enzimleriyle kesilerek ayn artlarda tekrar
jelde yrtlmtr. Southern blot sonucunda bandn gzlendii pullulanaz genini
ierdii dnlen blge jelden kesilerek alnm ve jel ekstraksiyonu ile ierdikleri
nkleik asitler izole edilmitir. ekil 4.7de jelden kesilen blgeler grlmektedir.
27
ekil 4.7. N12 genomik DNAsnn SalI ve StuI kesimi sonras yrtlen jelden
ekstraksiyon iin gerekli blgeler alndktan sonra ekilen grnt
Jelden ekstrakte edilen StuI ile kesilmi DNA fragmanlar, pJET vektrne; SalI
ile kesilmi DNA fragmanlar ise SalI ile dorusal hale getirilmi ve defosforile edilerek
ligasyona hazrlanan pUC18 plazmid vektrne balanarak kimyasal transformasyona
yetenekli E. coli hcrelerine transfer edilmitir. Ampisilin ieren kat besiyerinde pJET
transformasyonundan 79 koloni, pUC18 transformasyonundan 14 koloni gelimitir.
4.2.4. Koloni hibridizasyonu

Transformantlar, ampisilin ieren LB miller agar plakaya numaralandr lm
halde 2 kopya olarak ekilmilerdir. pJET plazmidi ieren E. coli hcreleri 6-85 ile
numaralandrlm karelere, pUC18 plazmidi ieren E. coli hcreleri ise 86-99 ile
numaralandrlm karelere izilerek ekilmitir. Pozitif kontrol olarak PY22 pullula naz
genini ieren pJET plazmitini tayan E. coli hcresi 0 nolu kareye. Negatif kontrol
olarak, ampisilin ieren besiyerinde geliebilecek ancak herhangi bir gen aktarlmam
pUC18 plazmidi ieren E. coli hcresi 128 nolu kareye izilerek ekilmitir. Gelitirilen
hcreler, yntemler blmnde anlatld ekilde koloni hibridizasyonu ile pozitif
ykl membrana aktarlm, Southern blot ynteminde belirtildii gibi hibridizasyon ve
dedeksiyon ilemleri gerekletirilmitir. Hibridizasyon ileminde prob olarak daha
28
nceki Southern blot analizinde kullanlan, PY22 pullulanaznn i blgesinden

oaltlm, 635 b. byklndeki DIG etiketli PZR rn kullanlmtr.
Dedeksiyon ilemi sonucunda elde edilen X-n film grnts ekil 4.8de
verilmitir. Pozitif kontrol ile ayn younlukta gzlenen koloniler seilerek saf sv
kltr halinde gelitirilmitir. pJet ieren 23, 34, 46, 47 ve 61 numaral klonlar ile
pUC18 ieren 86 ve 99 numaral klonlar kopya plakadan, ampisilin ieren 3 mL LB
miller besiyerine inokle edilmitir ve 37Cde 18 saat inkbasyonun ardndan plazmit
izolasyonu gerekletirilmitir.
ekil 4.8. Koloni hibridizasyonu ile elde edilen membrann X- n film grnts
Plazmide giren DNA fragmentini kontrol etmek iin, pJET plazmitleri (23,34,
46, 47 ve 61) BglII, pUC18 plazmitleri (86 ve 99) SalI enzimi ile kesilmitir. Kesim
sonras yrtlen agaroz jelinin grnts ekil 4.9da verilmitir.
29
ekil 4.9. Plazmitlerin restriksiyon enzimleri ile kontrol

Elde edilen 23, 34 ve 99 numaral klonlarda plazmit bulunmad grlmektedir.
ine fragmannn entegregre olduu gzlenen 4 klondan (34, 46, 47 ve 86) plazmit
izolasyonu yaplm ve plazmit izolatlar dizileme merkezine (RefGen, Ankara)
gnderilmitir. Dizileme sonucu elde edilen verilerin NCBI GenBank Blast tarama
motoruna gre, B. amyloliquefaciens mikroorganizmasna ait farkl gen (pullulanaz
enzimi dnda) blgelerini kodlayan dizilerle homoloji gsterdii grlmtr. Koloni
kaldrma analizi sonucu elde edilen veriler, Bacillus sp. kaynakl pullulanaz genini
bulmaya ynelik yanl pozitif (false positive) sonu vermitir. Bu durum, kullanlan
probun pullulanaz d blgelerle hibridize olma yetenei bulunmasndan kaynaklanm
olabilir.
Bunun zerine, fakl Bacillus cinslerine ait pullulanaz genleri arasnda homoloji
gsteren blgelerden yeniden primer tasarlanarak, yerel izolatlarda PZR denemeleri ile
devam edilmitir. Ayrca ayn alma (Erem 2007) ile elde edilmi olan 5 izolat (BK07,
N10, K6, K18 ve N19) daha almalara dahil edilmitir.
30
4.2.5. Ye ni prime rle rle ve dier yerel bakteri izolatlarnda PZR denemeleri
NCBI GenBank BLAST tarama motoru kullanlarak, farkl Bacillus trleri

arasndaki homoloji gsteren blgelerden yeniden primer tasarm yaplmtr. Yeni
primerlerle ncelikle, nceki izolatlara ait (N2, N12, N16, K1, K4 ve K5) genomik
DNAlarn reaksiyonlar gerekletirilmitir.
Yerel izolat N12de Southern blot analizlerinde de umut verici sonular elde
edildiinden PZR analizinde ncelik verilmi ve farkl primer balanma scaklklarnda
reaksiyonlar gerekletirilmitir. N12 genomik DNAs ve 2F-4R primerleri ile elde
edilen reaksiyon rnlerinin yrtld jel grnts 4.10ada verilmitir. Fakat
ekilden de grld gibi spesifik rn elde edilememitir. Ayn primer ifti ile N2,
N12, K1, K4 ve K5 izolatlarnda da 58C primer balanma scaklnda gerekletirilen
reaksiyon sonucunda da yine spesifik rn elde edilememitir (ekil 4.10b).
a)
b)
ekil 4.10. Geni iinden oaltan 2F-4R primerleri kullanlarak a) N12 genomik
DNAs ile b) K1, K4, K5, N2, N16 genomik DNAlar ile yaplan PZR ile
elde edilen rnlerin agaroz jel grnts. Pozitif kontrol: PY22
almaya sonradan ilave edilen BK07, N10, K6, K18 ve N19 genomik
DNAlar ve 2F-4R primerleri ile 58C primer balanma scaklnda gerekletirilen
polimeraz zincir reaksiyonu sonunda, BK07, N10, K6, K18 izolatlarnda PY22
reaksiyonundan (pozitif kontrol) elde edilen rnle ayn byklkte (teorik olarak 716
b) rn elde edilmitir. N19 izolatnda ise reaksiyon rn gzlenememitir.
31
ekil 4.11. 2F-4R primerleri kullanlarak BK07, N10, K6, K18 ve N19 genomik
DNAlar ile yaplan PZR ile elde edilen rnlerin agaroz jel grnts.
Pozitif kontrol: PY22
ekil 4.11de BK07 ve N10 genomik DNAlar ile elde edilen PZR rnlerinin
daha konsantre retilmi olmas nedeni ile daha spesifik bir rn olduu dnlmtr.
Ardndan BK07 ve N10 genomik DNAlar kalp olarak kullanlarak, genin daha byk
bir ksmn elde etmeyi salayacak olan ve balang kodonunu da ieren pulATGF-5R
primerleri ile yeniden PZR gerekletirilmitir. Farkl primer balanma scaklklarnda
gerekletirilen bu PZR sonunda beklenen rn teorik olarak PY22ye gre yaklak
2100 b uzunluundadr. Bu PZR ile elde edilen rnlerin jel grnts ekil 4.12de
verilmitir.
32
ekil 4.12. pulATGF-5R primerleri kullanlarak BK07 ve N10 genomik DNAlar ile
yaplan PZR sonucu elde edilen rnlerin agaroz jel grnts
ekil 4.12de grld gibi BK07 genomik DNAs ile gerekletirilen
reaksiyonlar sonucunda teorik olarak yaklak 2100 b uzunluunda olmas beklenen
DNA paras gzlenmitir.
Fakat N10da yaklak 2000 b uzunluunda rn
gzlenmitir. Bunun zerine BK07de retilmi olan yaklak 2100 b uzunluundaki

rn jelden ekstrakte edilmitir. Elde edilen DNA paras pJET1.2 klonlama vektrne
balanarak transformasyona elverili E.coli XL1 blue hcrelerine aktarlmtr. Elde
edilen transformantlardan rastgele 7 adedi seilerek, bu hcrelerden plazmit izolasyonu
yaplmtr. Seilen 7 koloni sras ile BK21, BK22, BK23, BK24, BK25, BK26 ve
BK27 olarak adlandrlmtr. ekil 4.13de bu plazmitlerin BglII restriksiyon enzimi
ile kesilerek kontrol edildii agaroz jel grnts verilmitir. Kolonilerden elde edilen
plazmitler aada sras ile 1-7 olarak numaralandrlmtr.
33
ekil 4.13. BK21-BK27 klonlarndan elde edilen 1-7 plazmitlerin BglII restriksiyon
enzimi ile kontrol
ekil 4.13te de grld gibi 1 ve 7de yaklak 2100 b (PZR rn) ve 2900
b uzunluunda DNA paras (pJET1.2 vektr); 2, 3, 4 ve 6da ise 500 b, 1600 b ve
2900 b (pJET1.2 vektr); 5 nolu plazmitte ise 1900 b (PZR rn) ve 2900 b
(pJET1.2 vektr) uzunluunda DNA paralar elde edilmitir. Kesim sonucunda farkl
rnler elde edilen BK24 ve BK27 klonlarna ait sras ile 4 ve 7 nolu plazmitler
dizileme merkezine gnderilmitir. Dizilemeden gelen sonuca gre BK24 plazmitinde
bulunan DNA parasnn, B. subtilis PY22 pullulanaz geni ile %75 benzerlik gsterdii
tespit edilmitir.
4.2.6. BK07 ve PY22 pullulanaz genlerinin izole edilerek klonlama (pJET1.2) ve

ekspresyon (pPICZA) vektrlerine ligasyonu
Dizilenen ve pullulanaz genine ait olduu belirlenen DNA parasnn pullulanaz
balama kodonu bulunmaktadr fakat genin sonlandrma kodonu bulunmamaktadr.
Literatrde genin son blgesinde aktiviteden sorumlu bir blge ya da substrat balanma
noktasnn olduuna dair herhangi bir bilgiye rastlanmamtr. Bu nedenle farkl
Bacillus
trlerinin
pullulanaz genlerine ait
homoloji
gsteren blgelerinden
yararlanlarak, dizilemeden gelen sekansn son birka aminoasitini de (5R primerinden
34
gelen) kapsayacak ekilde sonlandrma kodonu ieren yeni bir primer tasarlanm ve
puladpSTOP olarak adlandrlmtr (Ek 8.3de sekanslar verilmitir).
Kalp DNA olarak pJET-BK24 kullanlarak, XhoIF ve puladpSTOP primerleri
ile PZR gerekletirilmi ve teorik olarak 2200 b byklnde olmas beklenen,
BK07 pullulanaz geni (BKpul) elde edilmitir. PZR rnnn agaroz jel grnts
ekil 4.14de verilmitir. Elde edilen gen pJET1.2 klonlama vektrne balanarak
transformasyona elverili XL1-Blue hcrelerine aktarlmtr. Elde edilen plazmit pJETBKpul olarak isimlendirilmitir.
ekil 4.14. XhoIF-puladpSTOP primerleri ile pJET-BK24 plazmitinden oaltlan

pullulanaz geni: BKpul
Histidin etiketlemek iin, histidin etiketli BK07stopht primeri ve XhoIF primeri
ile BKpul PZR rn kalp olarak kullanlarak PZR gerekletirilmitir. Reaksiyon
sonunda elde edilen histidin etiketli pullulanaz geni (BKpul) jelden kesilerek izole
edilmitir (ekil 4.15). Gen, ekspresyon vektr pPICZA plazmitine balanmak zere
XhoI-NotI endonkleazlar ile kesilmitir. XhoI-NotI ile kesilmi pPICZA plazmitine
ligasyon gerekletirilmitir. Ardndan elde edilen bu plazmit (pPICZA-BKpulH)
E.coli XL1-Blue hcrelerine aktarlmtr.
35
ekil 4.15. XhoIF-BK07stopht primerleri ile pJET-BKpul plazmitinden oaltlan

histidin eitketli pullulanaz geni: BKpulH
Daha nce dizileme sonularna gre BK07 pullulanaz geninin SacI kesim
blgesi (346.b) olduu bilinmektedir. Bu nedenle pPICZA-BKpulH plazmiti SacI ile
kontrol edilmitir. Bu kesim sonucunda beklenen DNA paralar teorik olarak 1322 ve
4478 b. uzunluundadr. ekil 4.16da bu kesim sonucu elde edilen DNA paralarnn
yrtld jel grnts verilmitir. Sonu olarak 1, 3, 4 ve 6 nolu plazmitlerin geni
ierdii dorulanm ve almalara 1 nolu plazmit ile devam edilmitir.
ekil 4.16. pPICZA-BKpulH plazmidinin SacI ile kesilerek kontrol edilmesi
Sonu olarak histidin etiketli BK07 pullulanaz geni (BKpulH) elde edilmitir ve
ekspresyon vektr olan pPICZA vektrne ligasyonu tamamlanarak, P. pastorise
transformasyona hazr hale gelmitir.
36
almada pozitif kontrol olarak kullanlan PY22 genomik DNAs ile XhoI
forward ve NotI restriksiyon blgesi eklenmi reverse primer ifti kullanlarak PY22
pulluluanaz geni (PY22pul olarak adlandrlmtr) PZR ile amplifiye edilmitir.
Yaklak 2200 b uzunluundaki PZR rn olan DNA parasnn agaroz jel grnts
ekil 4.17de verilmitir.
ekil 4.17. B. subtilis PY22 pullulanaz geninin yrtld agaroz jel grnts
Elde edilen PZR
rn, pJET1.2
klonlama vektrne balanm
ve
transformasyona yetenekli E. coli DH5 hcrelerine aktarlmtr. Seilen 3

transformant ile plazmit izolasyonu gerekletirilmi ve restriksiyon enzimi ile kesilerek
plazmitlerin kontrol gerekletirilmitir.
zole edilen plazmitler, XhoI ve NotI restiriksiyon enzimleri ile kesilerek
pullulanaz geninin plazmite girip girmedii; geni 5- ucundan 390 b ieriden kesmesi
beklenen HindIII ile kesilerek de genin doru ynde girip girmedii kontrol edilmitir.
ekil 4.18de restiriksiyon enzimleri ile yaplan kesim rnlerinin yrtld jel
grnts verilmitir. ekilde p1 ve p1: pJETPY22pul klon1; p2 ve p2: pJETPY22pul
klon2; p3 ve p3: pJETPY22pul klon3ten izole edilmi plazmitlerdir. Her bir plazmitin
sanda sras ile o plazmitin XhoI-NotI ve HindIII ile kesilmi rnekleri
yklenmitir.
37
ekil 4.18. PY22 pullulanaz geni ieren pJET1.2 plazmitlerinin restriksiyon sonucu jel
grnts
Plazmitlerin, XhoI-NotI enzimleri ile kesilmesi sonucu dorusallaan pJET1.2

vektrne ait yaklak 3000 b uzunluunda bir bant ve 2200 b uzunluunda ikinci bir
bant gzlenmesi genin plazmite entegrasyonun gerekletiini dorulamaktadr. Entegre
olan fragmann bykl de PY22 pullulanaz geni iin beklenen uzunluktur.
Plazmitlerin, genin iinden kesen HindIII ile kesilmesi sonucu teorik olarak 3109 ve
2022 baz ifti uzunluundaki fragmanlarn gzlenmesi genin plazmite doru ynde
girdiini gstermektedir. Bu ekilde, restiriksiyon enzimleri ile plazmitin kontrolnn
yaplmasnn ardndan plazmitler dizileme merkezine gnderilerek klonlanan gende,
herhangi bir mutasyon gereklemedii dorulanmtr ve 3 numaral klon ile
almalara devam edilmitir. Dizilemede kullanlan primerler Ek 8.3te, elde edilen dizi
ve protein translasyonu ise Ek 8.4te verilmitir.
pJETPY22pul-klon3
plazmidi,
XhoI-NotI enzimleri
ile kesilerek
jelde
yrtlm ve yaklak 2200 baz ifti uzunluundaki fragman jelden kesilerek, Qiagen
Gel Purifacation Kit ile retici firmann talimatlar dorultusunda TE (Tris-EDTA)
tamponu iine ztlenmitir. ekil 4.19da restiriksiyon enzimleri ile kesilmi
pJETPY22pul-klon 3 plazmitinin yrtld jel grnts verilmitir. ekilde grnen
jel hazrlanrken 1 nolu kuyucua hi kesilmemi plazmit, 2 nolu kuyucua
restiriksiyon enzimleri ile kesilen plazmit yklenmitir. Dolaysyla, 2 nolu kuyucukta
gzlenen a band pullulanaz geni, b band pJet plazmitidir.
38
ekil 4.19. pJETPY22pul plazmitinin restriksiyon sonucu jel grnts

Jel ztleme ile ligasyona hazr hale getirilmi olan PY22 pul geni, pPICZA
ekspresyon
vektrne
XhoI-NotI
restriksiyon
blgelerinden
balanm
ve
tranformasyona elverili E. coli DH5 hcrelerine aktarlmtr.

Ayrca pJETPY22pul-klon3 plazmidi, kalp DNA olarak kullanlarak, XhoIFPul22NotIHTR primer ifti ile PZR reaksiyonu gerekletirilerek PY22 pullulanaz geni
histidin etiketli olarak (PY22pulH) oaltlm ve XhoI-NotI restriksiyon blgelerinden
pPICZA vektrne balandktan sonra tranformasyona elverili E. coli DH5
hcrelerine aktarlmtr.
Transformasyon plakalarndan rastgele seilen ko lonilerle her iki plazmit iin
izolasyon yaplm ve plazmitler HindIII restriksiyon enzimi ile kontrol edilerek
dorulanmtr. Teorik olarak pPICZA-PY22pul iin beklenen fragmentler 726 ve
5074 b byklndedir. Restriksiyon analizlerinin jel grntleri ekil 4.20de
verilmitir. Bundan sonra gerekletirilen klonlama ilemlerinde histidin etiketli
pullulanaz geni ile (pPICZA-PY22pulH kullanlarak) allmtr.
39
ekil 4.20. pPICZA-pul (a) ve pPICZA-pulH (b) plazmidinin HindIII restriksiyon

analizi sonucu (verilen baz byklkleri markr bantlar iindir)
4.2.7. Konuku Pichia pastorise transformasyon ve pul+ klonlarn eldesi
Yaygn olarak kullanlan SacI kesim blgesi BKpulH geninin iinde olduundan
pPICZA-BKpulH plazmitinde ikinci MssI kesim blgesinin olup olmad kontrol
edilmitir. ekil 4.21de pPICZA-BKpulH plazmitinin SacI ve MssI ile kesimi
sonucunda elde edilen DNA paralar grlmektedir. ekilde de grld gibi MssI
plazmiti tek yerden keserek dorusal hale getirmektedir.
ekil 4.21. pPICZA-BKpulH plazmitinin SacI ve MssI restriksiyon enzimleri ile kesim
sonu elde edilen DNA paralar
MssI ile dorusal hale getirilen pPICZA-BKpulH plazmiti elektroporasyon ile
P .pastoris X33 ve SMD1168H sularna aktarlmtr.
40
pPICZA-PY22pulH plazmidi ise SacI enzimi ile dorusal hale getirilerek,

elektroporasyon ile P. pastoris X33, SMD1168H ve KM71H hcrelerine aktarlmtr.
4.2.8. Seilen klonlar ile protein retimi ve proteinin saflatrlmas
Seilen klonlar 1 gece 30Cde YPD sv besiyerinde gelitirilmitir ve ardndan
balang ODsi 0.1 olacak ekilde BMGY besiyerine (%2 pepton, %1 yeast extract,
%1.34 YNB, %410-5 biotin, 100mM pH 6 fosfat tamponu ve %1 gliserol) inokle
edilmitir. nkbasyonun 18-20. saatinde 12-15 ODye gelimeleri salanm hcreler
hasat edilerek (santrifjlenerek), BMMY besiyerine (%2 pepton, %1 yeast extract,
%1.34 YNB, %410-5 biotin, 100mM pH 6 fosfat tamponu ve %1 metanol)
geirilmitir. Son metanol konsantrasyonu %1 olacak ekilde 24 saatlik aralklarla
indksiyon (tetikleme) yaplmtr.
BK07 pullulanaz iin zeocin ieren YPD agardan seilen 4er koloni, protein
retme yetenekleri kontrol edilmek zere BMGY ve ardndan BMMY besiyerinde
gelitirilmi; Spernatanlar ile SDS-PAGE (ekil 4.22) ve Western blot (ekil 4.23)
analizi yaplarak protein retimleri kontrol edilmitir.
ekil 4.22. SDS-PAGE jel grnts

SDS-PAGE jelinde protein bantlar (85-100 kDa DNA standartlar arasnda)
gzlenmektedir. Fakat kontrol olarak yklenmi olan gen aktarlmam olan
SMD1168H ve X33 spernatantlarnda da ayn bant gzlendii iin, rneklerdeki
bandn pullulanaza spesifik olduu kesin olarak sylenemez. Bunun zerine Western
41
blot analizi ile devam edilmitir. ekil 4.23te, histidin etiketli bu rneklerin (anti- his
ile) Western blot analizi sonucunda elde edilen membran grnts verilmitir.
ekil 4.23. Western blot membran grnts (yklenen rnekler 1) X33 kontrol, 2-5)
X33 BKpulH 1-4, 6) SMD1168H kontrol, 7-11) SMD1168H-BkpulH 1-4,
12-15) SMD1168H-PY22pulH 1-3
Western membrannda sadece SMD1168H-PY22pulH 1-3 klonlarnda protein
band gzlenmitir. Elde edilen grntde, X33- ve SMD1168H-BKpulH klonlarnda
protein band gzlenmemitir.
X33-BKpulH
ve
SMD1168H-BKpulH
klonlarnda
protein
retimi
gerekletirilememitir. Bu klonlar BKpulH geninin plazmit zerinden o altlmas ile

oluturulmutur. Herhangi bir mutasyonun protein retimine engel olmu olabilecei
dnlerek , yeniden klonlama almasnda kullanlacak olan YBKpulH geni, BK07
genomik DNAs kalp olarak PZR yntemi ile elde edilmitir. Polimeraz zincir
reaksiyonunda pulATGF-puladpSTOP primerleri kullanlarak bu kez tm gen elde
edilmitir. Reaksiyon rnlerinin yrtld agaroz jel grnts ekil 4.24de
verilmitir. Beklenen DNA band jelden ekstrakte edilmitir.
42
YB Kpul
ekil 4.24. pulATGF-puladpSTOP primerleri ile BK07 genomik DNAs kullanlarak

gerekletirilen PZR rnlerinin agaroz jel grnts
Histidin etiketleme ilemi iin, YBKpul olarak isimlendirilen PZR rn kalp
olarak kullanlmtr ve XhoIF-BK07stopht primerleri ile PZRsi yaplmtr. Bu
reaksiyonun rnlerinin yrtld agaroz jel grnts ekil 4.25te verilmitir. Elde
edilen rn YBKpulH olarak adlandrlmtr.
YB Kpul H
ekil 4.25. XhoIF-BK07stopht primerleri ile YBKpul PZR rn kullanlarak oaltlan

histidin etiketli BK07 pullulanaz geni: YBKpulH
YBKpulH (elde edilen histidin etiketli yeni BK pullulanaz geni, PZR rn)
XhoI-NotI ile kesilerek, bu restriksiyon blgelerinden kesilerek lineer hale getirilmi
pPICZA ekspresyon vektrne balanmtr ve transformasyona elverili E.coli XL1Blue hcrelerine aktarlmtr. Seilen 6 transformant hcreden plazmit izolasyonu
yaplmtr. ekil 4.26da elde edilen plazmitlerin (pPICZA-YBKpulH) dorulanmas
iin SacI enzimi ile kesildikten sonra yrtld agaroz jel grnts verilmitir. Bu
kesim sonucunda teorik olarak beklenen rnler 1322 b ve 4478 b. uzunluundadr.
43
Jelden grlen sonuca gre, 2, 3 ve 5 nolu plazmitler dond urulmu kltr olarak
saklanm; 2 nolu plazmit dizileme merkezine gnderilmitir. Dizileme merkezinden
gelen sonuca gre BKpul ile PY22pula ait aminoasit dizisinin %80 (Bkz. Ek 8.4);
farkl kaynaklardan izole edilen pullulanaz enzimlerinin aminoasit dizilerinin %66 (Bkz.
Ek 8.5) homoloji gsterdii grlmtr.
ekil 4.26. pPICZA-YBKpulH plazmidinin SacI enzimi ile kesilerek dorulanmas

Dizilenen ve dorulanan pPICZA-YBKpulH plazmiti MssI restriksiyon enzimi
ile lineer hale getirilerek transformasyona elverili P. pastoris X33 ve KM71H sularna
aktarlmtr. Elde edilen transformantlarn protein retme yetenekleri Western blot
analizi ile aratrlmtr. ekil 4.27de bu analiz sonucunda elde edilen membran
grnts verilmitir. Teorik olarak 85-100 kDa byklkleri arasnda bir protein band
beklenmektedir. Sonuca gre KM71H klonlarnda proteinin retildii fakat degrade
olduu, X33 klonlarnda ise protein retiminin gereklemedii grlmektedir.
44
ekil 4.27. X33-YBKpulH (1-5) ve KM71H-YBKpulH (1-5) spernatantlar ile yaplan

Western blot analizi membran grnts
Bunun zerine proteaz aktivitesine bal degradasyon olduu dnlerek,

pPICZA-BKpulH plazmiti proteaz inaktif P. pastoris suu olan SMD1168Hye
aktarlmtr. SMD1168H klonlarnn spernatantlar ile yaplan Western blot analizi
membran grnts ekil 4.28de verilmitir. Fakat ekilde de grld gibi
degradasyon problemi SMD1186H suu ile de devam etmitir.
45
ekil 4.28. SMD1168H-YBKpulH klonlarnn spernantlar ile yaplan Western blot

analizi membran grnts
Bunun zerine, P. pastoris KM71H-YBKpulH ve SMD1168H-YBKpulH
transformantlarndan 1 nolu klonlar alnarak farkl pH deerlerinde (P.pastorisin
geliebildii pH aral gz nnde bulundurularak pH 3-8de) protein retimi
denenmitir. Tampon sistemi olarak tek bir sistemin (disodyum hidrojen fosfat-sitrik
asit) farkl pHlarda hazrlanm zeltileri kullanlmtr. Bu retimlerden 12, 24, 36 ve
48. saatlerde rnek alnarak bu rnekler ile Western blot analizi gerekletirilmitir.
ekil 4.29da SMD1168H-YBKpulH klonunun pH 3-8 aralndan 12. ve
24.saatte alnan rnekleri ile Western blot analizi membran grnts verilmitir. Fakat
ekilde de grld gibi degradasyon problemi devam etmitir.
46
ekil 4.29. SMD1168H-YBKpulH ile farkl pHlarda, 12. Ve 24. Saatte alnan
rneklerle yaplan Western blot analizi sonucu elde edilen membran
grnts
ekil 4.30da KM71H-YBKpulH klonunun pH 3-8 aralndan 12. ve 24.saatte
alnan rnekleri ile Western blot analizi membran grnts verilmitir.
ekil 4.30. KM71H-YBKpulH ile farkl pHlarda, 12. ve 24. saatte alnan rneklerle
yaplan Western blot analizi sonucu elde edilen membran grnts
47
ekil 4.30da da grld gibi, elde edilen sonuca gre hem 12. saat hem de
24.saatte alnan rneklerde pH 5-7 arasnda teorik olarak beklenen byklkte (85100kDa) protein gzlenmitir fakat keskin bir bant halinde deildir. Ayrca bir mik tar
degradasyonun devam ettii anlalmaktadr. Daha iyi sonu elde edilebilmek iin
KM71H-YBKpulH ile pH 6da (disodyum hidrojen fosfat-sitrik asit tamponunda)
16Cde protein retimi gerekletirilmitir ve HisPur Ni-NTA Purification Kit ile
histidin etiketli proteini saflatrma analizi yaplmtr. Saflatrma aamalarnda alnan
rneklerin
yrtld
SDS-PAGE
jeli
grnts
ekil
4.31de
verilmitir.
ekil 4.31. KM71H-YBKpulH klonu ile 16C yaplan protein retiminden elde edilen
spernatantn histidin etiketli proteinini saflatrlma aamalarn gsteren
SDS-PAGE jel grnts (1: KM71H konuku, 2: KM71H-YBKpulH
spernatant, 3: Reineye balanmayan sznt (FT), 4: I. Ykama, 5: II.
Ykama, 6: III. Ykama, 7: I. Elsyon, 8: II. Elsyon, 9: III. Elsyon
ekil 4.31de rneklerin isimleri eklin altnda verilmitir. Jel grntsnde de
grld gibi, I. elsyon rneinde (7 nolu kuyucukta) ve beklenilen byklkte (85100 kDa) protein band gzlenmitir ve bu rnein diyalizi ile analize devam edilmitir.
Ardndan saflatrma aamalarndaki rneklerin (I.elsyon yerine diyalizden sonraki
48
rnek) yklendii Western blot analizi gerekletirilmitir. Elde edilen membran

grnts ekil 4.32de verilmitir.
ekil 4.32. Histidin etiketli proteinin saflatrma aamalarnda elde edilen rneklerin
Western blot analizi (1: KM71H konuku, 2: KM71H-YBKpulH
spernatant, 3: Reineye balanmayan sznt (FT), ), 4: I. Ykama, 5: II.
Ykama, 6: III. Ykama, 7: I. Elsyon (diyaliz edildikten sonra, yaklak
200 ng protein yklenmitir), 8: II. Elsyon, 9: III. Elsyon
Western blot membran grntsnde de grld gibi diyalizden sonra
yaklak 81 kDa olduu tahmin edilen protein bandnn BK07 pullulanazna spesifik
olduu belirlenmitir. Protein band, rnekte keskin bir bant olarak gzlenememitir,
buna proteinin glikozile olmas neden olmu olabilir fakat diyalizden sonra elde edilen
bant keskin ve tek bir banttr.
PY22 pullulanaz enzimi retimi de KM71H klonlar ile yaplmtr. Protein
retimini gsteren SDS-PAGE jeli grnts ekil 4.33de verilmitir.
49
ekil 4.33.
KM71H-PY22pul klonlarnn pullulanaz retim yeteneklerini gsteren

SDS-PAGE grnts. M:protein markr, (1-7): Klonlar, NK: KM71H
konuku
Yrtlen eritlerde teorik byklk olarak 81 kDa civarnda bir protein band
grnmesi beklenmitir. Klon rneklerinde protein band beklenen byklkte
gzlenmi ancak konuku kontrolde de yaklak ayn byklkte ve daha ince bir bant
grlmtr. SDS-PAGE ile klonlar ve kontrol arasnda yeterli ayrmn yaplamamas
nedeniyle Western blot teknii kullanlarak proteinin pululanaz olup olmad
aratrlmtr.
Membran grnts ekil 4.34de verilmitir. ekilde de grld gibi

klonlarda protein band gzlenmitir fakat gen aktarlmam KM71H klonunda, SDSPAGEde gzlenen bant Western Blot sonucunda gzlenmemitir. Bylece iki bandn
(pullulanaz ve konukunun hcre d proteininin) birbirine ok yakn byklkte
olduundan SDS-PAGEde ayrlamadn ancak bantlardan birinin pullulanaz enzimine
spesifik olduu kantlanmtr.
50
ekil 4.34. Western blot analizi sonucu membran grnts. K: Western kontrol iin
histidin etiketli kontrol protein, (1-7): Klonlar, NK: Negatif kontrol, (M):
Protein standard
HisPur Ni-NTA Purification Kit ile histidin etiketli PY22 pullulanaz proteinini
saflatrma analizi yaplmtr. Saflatrma aamalarnda alnan rneklerin yrtld
SDS-PAGE jeli grnts ekil 4.35te verilmitir.
ekil 4.35. Histidin etiketli PY22 pullulanaznn spernatanttan saflatrlmas

aamalarn gsteren SDS-PAGE jeli grnts (1: KM71H-PY22pulH
spernatant, 2: Reineye balanmayan sznt (FT), 3: I. Ykama, 4: II.
Ykama, 5: III. Ykama, 6: I. Elsyon, 7: II. Elsyon, 8: III. Elsyon
SDS-PAGE analizinde saflatrlan proteinin molekler arlnn protein

standardnda gzlenen 85-100 kDa bantlar arasnda bulunduu grlmekte ve 90 kDa
51
olduu tahmin edilmektedir. Normalde nkleotid dizisinden 81 kDa civarnda

bykle sahip olmas beklenen proteinin daha byk molekl arlna sahip olarak
ekspres edilmesi maya sisteminde ekspresyon srasnda glikozile olmu olmas ile
aklanabilir.
4.2.9. Enzim retimi iin optimum indksiyon sresinin belirlenmesi
Protein retiminde optimum indksiyon sresinin belirlenmesi iin daha nce de
anlatld gibi 1 gece YPD besiyerinde gelitirilen kltrden, 20ml BMGY besiyerine
balang ODsi 0.1 olacak ekilde inoklasyon yaplmtr. nkbasyonun (28Cde)
18-20. saatinde 12-15 ODye geliimleri salanm olan hcreler hasat edilerek BMMY
besiyerine geirilmitir. BK07 pullulanaz enziminin retimi 16Cde, PY22 pullulanaz
enziminin retimi 28C Her 24 saatin sonunda rnek alnm ve kalan kltre son
konsantrasyon %1 olacak ekilde %100 metanol ile indksiyon yaplmtr.
Her 24 saatte bir rnek alnarak, enzim aktivitesi ve protein miktar llmtr.
Ayrca indksiyon boyunca hcrelerin ODsi de takip edilmitir. Elde edilen veriler
BK07 pullulanaz iin izelge 4.1de, PY22 pullulanaz iin izelge 4.2de
zetlenmitir.
izelge 4.1. BK07 pullulanaznn farkl indksiyon srelerinde elde edilen verileri
24.sa
48.sa
72.sa
96.sa
120.sa
34
45
46
49,2
51,5
Enzi m akti vitesi (U/ ml )
5,75
8,46
7,63
2,83
3,56
Protein miktar (g/ml )
56,5
58,7
63,1
65,4
67,6
Spesifik enzim akti vitesi (U/ mg)
101
144
121
43
52
Hcre OD deeri
BK07 pullulanaz enzimi iin elde edilen veriler en yksek enzim aktivitesinin
48.saat rneinde olduunu gstermitir. Enzim aktivitesi, hcre younluunun 34
ODden 45 ODye kt 48.saatte yaklak 1.5 kat art gstermitir. Hcreler 4872.saatler arasnda 1 OD artarken enzim aktivitesinde 48.saate gre %10 orannda
azalma tespit edilmitir. OD art oranndaki d hcrelerin duraan faza girdiini
52
gstermekte ve durumun enzim aktivitesini de etkiledii grlmektedir. Enzim

aktivitesi 96.saatte ise, 48.saate gre %70 orannda dmtr. Enzim aktivitesindeki bu
d, hcre oalma hznn dmesi, ortamda metabolitlerin artmas ve duraanda
fazda paralanan hcrelerin hcre ii proteaz enzimlerinin spernatanta geerek protein
degradasyonuna neden olmas ile aklanabilir.
izelge 4.2. PY22 pullulanaznn farkl indksiyon srelerinde elde edilen verileri
24.sa
48.sa
72.sa
96.sa
120.sa
30,32
48
54,2
45,4
40,3
2,52
2,95
3,56
Protein miktar (g/ml )
55
57,5
82
136
131
Spesifik enzim akti vitesi (U/ mg)
46
51
43
Hcre OD deeri
Enzi m Akti vitesi (Unit/ ml)
BK07 pullulanaz enzimi iin elde edilen veriler en yksek enzim aktivitesinin
U/ml olarak 72.saat rneinde olduunu gstermitir. Fakat spesifik aktivite baznda
(U/mg) dnldnde en yksek aktivite 48.saatte gzlenmitir. 72.saatteki protein
art oranndaki ykselme hcrenin duraan faza girmi olmas nedeni ile paralanan
hcrelerin hcre ii proteinlerinden kaynaklanyor olabilir. 72.saatten sonra 96.saatte
alnan rneklerde hcrelerin younluunda d gzlenmitir. Protein miktarndaki
yksek art oran ve enzim aktivitesinin gzlenmemesi bunun sebebinin paralanan
hcrelerin proteazlarndan kaynakl degradasyonu olarak deerlendirilebilir.
4.2.10. Enziminin optimum aktivite gsterdii pH deerinin belirlenmesi
retilen rekombinant pullulanaz enzimlerinin optimum pH deerinin saptanmas
iin sodyum-asetat (pH 3-6); sodyum- fosfat (pH 7-8) ve glisin-NaOH (pH 9-10) tampon
sistemleri kullanlmtr. Sabit scaklk (37C) ve farkl pHlarda yaplan enzim
reaksiyonlar sonucunda elde edilen veriler Bkpul iin ekil 4.36da, PY22pul iin ekil
4.37de gsterilmitir.
53
ekil 4.36. Farkl pH deerlerinde BK07pul enziminin sergiledii aktivite

BK07 pullulanaz enziminin optimum aktivite gsterdii PH aralnn pH 7-9
arasnda olduu tespit edilmitir. Enzim optimum aktivtesi pH 8de gsterirken, pH
7de % 82, pH 9da %74 aktivite sergilemitir.
ekil 4.37. Farkl pH deerlerinde PY22pul enziminin sergiledii aktivite
54
PY22 pullulanaz enzimin optimum aktivite gsterdii pH aral arlkl olarak

pH 5-6 arasnda yer almtr. Enzim optimum aktivitesini pH 6da gsterirken, pH 5te
%94 aktivite gzlenmitir.
4.2.11. Enziminin optimum aktivite gsterdii scaklk deerinin belirlenmesi
Enzimin optimum aktivite gsterdii scaklk deerinin belirlenmesi iin, BKpul
iin pH 8de (optimum pH), PY22pul iin pH 6da (optimum pH) 4-70C arasnda
farkl scaklklarda enzim aktivitesi llmtr. Elde edilen veriler BKpul iin ekil
4.38de, PY22pul iin ekil 4.39da verilmitir.
ekil 4.38. Farkl scaklk deerlerinde BK07pul enziminin sergiledii aktivite
ekil 4.39. Farkl scaklk deerlerinde PY22pul enziminin sergiledii aktivite
55
BKpul, optimum pHs olan pH 8de en yksek aktiviteyi 40Cde gstermitir.

Elde edilen sonular enzimin 20Cde optimum aktivitenin %40, 30Cde %78i,
50Cde %81i dzeyinde bal aktivite ile altn gstermitir. PY22pul, optimum
pHs olan pH 6da en yksek aktiviteyi 40Cde gstermitir. Enzim 20Cde optimum
aktivitenin %70i kadar aktivite gsterirken, scaklk 30Cye ykseldiinde aktivite
%94 dzeyine km, 50Cde ise %71 aktivite tespit edilmitir.
4.2.12. Enzimin termal stabilitesinin belirlenmesi

Enzimin termal stabilitesini saptamak iin 30-70C scaklk aralnda 30 ve 60
dakika sre ile n inkbasyonu gerekletirilmi, ardndan enzimin kalan aktivitesi
llmtr. Elde edilen sonular BKpul iin ekil 4.40da, PY22pul iin ekil 4.41de
verilmitir.
ekil 4.40. BK07 Pullulanaz enziminin termal stabilite sonular

Sonular deerlendirilirken aktivite bal olarak hesaplanmtr. n inkbasyona
tabi tutulmam rnein aktivitesi %100 aktivite olarak kabul edilmi ve bu deer BK07
pullulanaz iin 5,7 U/mldir. BKpullulanaz enzimin termal stabilitesinin en yksek
56
olduu deer 40C olarak tespit edilmitir ve bu sonu enzimin optimum aktivite
gsterdii scaklk deeri ile uyum gstermektedir.
Genel olarak deerlendirildiinde 30 ve 50Cdeki termal stabilite deerleri,
40Cye gre daha dktr fakat ilk 30 dakika bu fark ok yksek deildir. 30
dakikann sonunda 30Cde ve 50Cde alan enzimler %62; 40Cdeki enzim ise
%68 dzeyinde aktivite ile almaktadr. Enzim 60Cde 15 dakika sren n
inkbasyon sonunda aktivitesinin ancak %20sini koruyabilmitir. n inkbasyon
scakl 70Cye ykseldiinde ise 15 dakikada enzimin tm aktivitesini kaybettii
tespit edilmitir.
ekil 4.41. PY22 Pullulanaz enziminin termal stabilite sonular

PY22nin n inkbasyona tabi tutulmam rneinin aktivitesi (%100 aktivite)
ise 2,35 U/ml olarak llmtr. PY22 pullulanaz enziminin, 30 ve 40Cde 1 saat
srenin sonunda aktivitesinin yaklak olarak %50sini koruduu gzlenmitir.
Enzimin, 30 ve 40Cdeki termal stabilitesine ait elde edilen veriler birbirlerine olduka
yakndr ve bu iki scaklk enzimin termal stabilitesinin en yksek olduu scaklk
deerleridir. Enzim aktivitesi, 50C scaklkta 15 dakika sre sonunda
optimum
koullardaki aktivitesinin %50si dzeyine derken, 1 saatin sonunda %20sine

dmtr. Enzimin 60Cde 15 dakika inkbasyonu
57
aktivitesinde %85 orannda
kayba neden olurken, 70Cde 15 dakika sre sonunda enzim tm aktivitesini

kaybetmektedir.
4.2.13. Pullulanaz Aktivitesi Tayini

Nicel
pullulanaz
aktivitesi
tayini
metot
ksmnda
anlatld
gibi
gerekletirilmitir. Enzim aktivitesi lmleri, optimum koullar yani BKpul iin pH

8de ve 40Cde, PY22pul iin pH 6da 40Cde gerekletirilmitir. almann bu
aamasnda protein saflatrma ileminin ve CaCl2 ile EDTA ilavesinin enzim aktivitesi
zerinde etkisi aratrlmtr.
Histidin etiketli proteinlerin prifikasyonu (Histag prifikasyon) ilemi ile BK07
pulllulanazn ieren spernatant 10 kat konsantre edilmitir. Fakat spernatantta 4.3
U/ml olarak llen enzim aktivitesi, 0,458 U/ml dzeylerine dmtr. Bu dn
sebebi proteinin histidin etiketi ksmnda gereklemi olabilecek bir degradasyon
sonucu, proteinin etiketini kaybetmesi ve prifikasyon ileminde proteinin nikel kolona
balanamayarak kayb olabilecei gibi gibi, saflatrma aamalarnda da protein ve/veya
aktivite kayb gereklemi olabilir. Bunun zerine enzimin optimum alma
koullarnn belirlenmesinde, CaCl2 ve EDTA ilavesinin enzim aktivitesi zerindeki
etkilerinin aratrlmasnda spernatant ile allmtr.
Yaplan almalar BKpul enzim aktivitesinin, 2mM CaCl2 ilavesi ile %73
orannda arttn, 2mM EDTA ilavesi ile ise %8 orannda dtn gstermitir.
Histidin etiketli proteinlerin prifikasyonu (Histag prifikasyon) ilemi ile PY22
pullulanazn ieren spernatant 11 kat konsantre edilmitir ve 2mM CaCl2 varlnda
aktivitesi, spernatant aktivitesinin (2.063 U/ml) yaklak 2,5 katna karak 4,985 U/ml
olarak kaydedilmitir. Enzimin optimum alma koullarnn belirlenmesi ve CaCl2 ve
EDTA ilavesinin enzim aktivitesi zerinde aratrlmas saflatrlm ve diyaliz edilmi
rnekler gerekletirilmitir. Elde edilen veriler 2mM CaCl2 ilavesinin enzim
aktivitesini %89 orannda artrdn, 2mM EDTA ilavesinin ise enzim aktivitesinin
tamamen inhibe ettiini gstermitir.
58
4.2.14. Rekombinant pullulanaz enziminin hidroliz rnlerinin belirlenmesi

Rekombinant enzimin hidroliz rnlerinin belirlenmesi iin, balangta HPLC
analizi dnlmtr ancak HPLCde (Shimadzu SPD-M20A, Japonya) RID
dedektr kullanlarak elimizde mevcut bulunan amin (Inertsil NH2 ) ve C18 (Nucleosil
5) kolonlar ve uygun tayc fazlar ile denemeler yaplmtr. Ancak, kolonlar ile
standart seyreltileriyle yrtlen denemelerde pullulanaza zg hidroliz rn olan
maltotrioz standard iin pik gzlenememitir.
Bunun zerine daha hzl ve pratik bir metot olan TLC ynteminden
faydalanlmtr. Saflatrlm PY22 pullulanaz enzimi zeltisi ile gerekletirilen
enzim reaksiyonu sonucunda elde edilen TLC plaka grnts ekil 4.42de verilmitir.
Enzim aktivitesi dk saptandndan, reaksiyon rnlerinin TLC plakasnda
saptanabilir olabilmesi iin reaksiyon sona erdiinde reaksiyon zeltisi 60Cde 45
dakika sreyle konsantre edilmitir (Eppendorf Concentrator Plus, Almanya). Bu
nedenle elde edilen TLC plaka grntsnde, rneklerde ((1) ve (2)) pullulan
konsantrasyonu daha yksek gzlenmitir. Enzim aktivitesi dk olduu iin substrat
byk lde hidrolize uramadan kalm ve hidroliz rn (maltotrioz) band DP3
standard ile ayn seviyede, ancak ok solgun ekilde gzlenebilmitir.
59
ekil 4.42. Saflatrlm enzimin reaksiyon rnlerini gsteren TLC plakas. DP1-DP7:
10ar g 1-7 monomer niteden oluan eker standartlar (Sigma-Aldrich);
pullulan (Sigma-Aldrich); 1 ve 2 enzim reaksiyonu zeltisidir
BK07 pullulanaz enzimi ile gerekletirilen reaksiyonlar, prifikasyonda

yaanlan problem nedeni ile spernatant zeltisi ile gerekletirilmitir. Enzim
aktivitesinin dk olmasnn yannda spernatanttan gelen kirlilik de hidroliz
rnlerinin TLC analizi tespit edilebilmesini gletirmi ve bu nedenlerden dolay
TLC plakasnda spesifik hidroliz rnleri net bir ekilde grntlenememitir (TLC
plaka grnts verilmemitir).
60
5. TARTIMA
Yaplan alma ile yerel izolat olan ve daha nce yaplan bir almada B.
subtilis dorulanan BK07 izolatndan pullulanaz enzimini kodlayan gen izole edilmitir
ve dizisi belirlenmitir. Elde edilen sonular BK07 ve PY22 pullulanaz enzimini
kodlayan genlerin hem aminoasit hem de nkleotit baznda %80 orannda ayn
olduunu
gstermitir.
BK07
ve
PY22
pullulanazlarnn
aminoasit
baznda
karlatrlmas Ek 8.6da, nkleotit dizisi bazndan karlatrlmas Ek 8.8de

verilmitir.
BK07 pullulanaz enzimini kodlayan gen dizisi, farkl kaynaklardan izole edilen
dier pullulanaz enzimleri ile protein baznda %66, nkleotit baznda %67 aynlk
gstermektedir.
BK07 pullulanaznn dier pullulanazlarla aminoasit baznda
karlatrlmas Ek 8.7de, nkleotit dizisi bazndan karlatrlmas Ek 8.9da

verilmitir.
Farkl kaynaklardan izole edilen pullulanazlarn homoloji aac ise ekil 5.1de
verilmitir.
ekil 5.1. Farkl kaynaklarda izole edilen pullulanaz enzimlerinin homoloji aac
61
ekilde de grld gibi BK07 pulllulanaznn protein olarak en yakn olduu

gen kaynaklar B. subtilis spizizenii ATCC6633, B.vallismortis ve B. subtilis PY22
olduu belirlenmitir.
Bu alma ile BK07
ve PY22
izolatlarnn pullulanaz enzimlerinin
karakterizasyonu yaplmtr. Elde edilen sonular iki enziminde optimumum alt

scaklk deerinin 40C olduunu, PY22nin optimum alma pHsnn 6 iken
BK07nin pH 8 olduu tespit edilmitir. ki enzimin termal stabilitesi zerine yaplan
almalarn sonucu ise 40Cde 1 saat inkbasyon sresi sonunda, BK07 pullulanaz
aktvitesinin %89, PY22 pullulanaz aktivitesinin ise %68 seviyesine dtn
gstermitir. Bu sonu BK07nin termostabilitesinin PY22ye nazaran daha yksek
olduunu gstermektedir.
Yaplan almalar BKpul enzim aktivitesinin, 2mM CaCl2 ilavesi ile %73
orannda arttn, 2mM EDTA ilavesi ile ise %8 orannda dtn gstermitir.
PY22 pullulanazndan alnan sonular ise 2mM CaCl2 ilavesinin enzim aktivitesini %89
orannda artrdn, 2mM EDTA ilavesinin ise enzim aktivitesini tamamen inhibe
ettiini gstermitir.
Bu sonular CaCl2 nin her iki enzimin de aktivitesini artrdn gstemitir. Bu
bulgular Ling vd (2009) tarafndan yaplan almada 2mM CaCl2 varlnda pullulanaz
aktivitesinde %70 art kaydetmeleriyle benzerlik gstermektedir.
EDTAnn ise BK07 pullulanaz aktivitesi zerine nemli dzeyde etki
etmezken, PY22 pullulanaznn aktivitesini tamamen inhibe ettiini tespit edilmitir.
Buradan BK07nin almas iin 2 deerlikli metal iyonlarna ihtiya duymazken,
PY22nin enzim aktivitesi iin 2 deerlikli metal iyonlarna ihtiya duyduu sonucuna
varlabilir.
62
ki enzim iin de en yksek enzim aktivitesi 48.saat sonunda hasat edilen

hcrelerde belirlenmitir. Aktivite deeri BK07 pullulanaznda 8,46 U/ml, PY22
pullulanaznda 2,95 U/ml olarak tespit edilmitir.
Literatrde, alkalamal inkbatrde yaplan enzim retimlerinde, Samah vd
(2008), B. flavothermus KWF1 pullulanaz ile balangta 0.791 U/ml, optimize edilmi
koullarda 3.498 U/ml aktivite kaydetmilerdir. Salleh vd. (2006), Exiguobacterium sp.
MAAC-1 pullulanaznn balang aktivitesini 0.126 U/ml bulurken, optimize edilmi
koullarda 1.208 U/ml olarak tespit etmilerdir. Iqbal (1994), yerel Bacillus sp.
izolatlarndan elde edilen pullulanaz aktivitelerini lmtr. zolatlarn pullulanaz
aktivitesi arlkl olarak 1.11-6.00 U/ml olarak gzlenmitir, en yksek aktivite ise
19.50 U/ml olarak bildirilmitir.
Ling (2006), Raoultella planticola DSMZ 4617 pullulanaznn alkalamal
inkbasyon ile 500 ml hacimde retiminde 0.32 U/ml, optimize edilmi besiyeri
kompozisyonu ile fermentrde 2L hacimde retiminde 2.22 U/ml aktivite kaydetmitir.
Abdel-Naby vd (2011), B. licheniformis NRC22 pullulanaznn aktivitesinin,
kesikli ve srekli fermentasyon retimlerinde incelemilerdir. Kesikli fermentasyon ile
18 U/ml enzim aktivitesi elde ederken, srekli fermentasyon ile 14.8 U/ml enzim
aktivitesi elde etmilerdir. mmobilize edilmi hcrelerden, srekli fermentasyon
retimi ile elde edilen aktivite ise 16.8 U/ml olarak saptanmtr.
Bertoldo vd (2004), YNWGYDP olmak zere yedi aminoasitten oluan
blgenin korunmu blge olduunu ve tm pullulanaz tip I enzimlerinde bulunduunu
ve pullulanaz tip II enzimlerinin bu korunmu blgeyi iermediini bildirmitir.
Yamashita
vd
(1997),
bu
korunmu
blgenin
-1,6
glikozidik
balarnn
degradasyonunda veya enzimin substrata balanmasndan sorumlu olabileceini ne

srmlerdir. Bu alma ile elde edilen, PY22 ve BK07 pullulanazna ait aminoasit
dizilerinde (sras ile Ek 8.4 ve Ek 8.5) bu blgenin (YNWGYDP) bulunduu
grlmektedir ve bu sonu elde edilen rekombinant enzimlerin pullulanaz tip I snfna
girdiini gstermektedir. Bu durumda pullulan substratnn -1,6 glikozidik balarnn
hidrolizi ile beklenen hidroliz rn de maltotriozdur.
63
Bertoldo ve Antranikian (2002), pullulanaz tip enziminin pullulanda ve

dallanm oligosakkaritlerde -1,6 balarn spesifik olarak hidrolize ederek ykmlanma
rnleri olarak maltotrioz ve lineer oligosakkaritleri oluturduunu belirtmilerdir.
64
6. SONU
1.
Bu projede almaya temel oluturan Bacillus soylar Akdeniz niversitesi Gda

Mhendislii Blmnde tamamlanm olan bir alma ile snm ekmek iinden
izole edilmitir (Erem 2007). Bu balamda potansiyel pullulanaz reticisi
olabilecei dnlen yerel olarak izolale edilen bakteri sularnda (K1, K4, K5,
N2, N12 ve N16) pullulanaz geni aratrlmtr. Tm analizlere pozitif kontrol
olarak Bacillus subtilis PY22 (B. subtilis 168 mutant) suu dahil edilmitir.
2.
Yerel izolatlardan BK07den ve pozitif kontrol olarak almada yer verilen

PY22den tm gen halinde pullulanaz geni izole edilerek gen dizisi belirlemitir.
Sonu bu iki proteinin birbiri ile %80 orannda ayn olduunu gstermitir.
3.
BK07 ve PY22 pullulanaz genlerine PZR yolu ile histidin etiketleme yaplm ve
pPICZA vektrne balanarak
P. pastoriste aktarlm
ve alkalamal
inkbatrde erlende protein retimleri gerekletirilmitir.

4.
Hcrednda retilen proteinlerin tespit edilmesi iin SDS-PAGE ve Western

analizleri yaplmtr ve elde edilen veriler, BK07 pullulanaznn yaklak 81 kDa,
PY22 pullulanaznn ise yaklak 90 kDa olduunu gstermitir.
5.
Enzim aktivitesi 48.saat sonunda hasat edilen rneklerde en yksek seviyede tespit
edilmitir. Bu rneklerde BK07 pullulanaz aktivitesi 8,46 U/ml, PY22 pullulanaz
aktivitesi 2,95 U/ml olarak tespit edilmitir. Toplam protein miktarna gre
hesaplanan spesifik enzim aktiviteleri ise sras ile 144 U/mg ve 51 U/mg olarak
saptanmtr.
6.
P. pastoriste retilen BK07 ve PY22 pullulanaz enzimlerinin optimum alma

koullar (optimum pH ve optimum scaklk) aratrlmtr. En yksek aktiviteyi
BK07 pullulanaz 40C scaklkta pH 8de gsterirken; PY22 pullulanaz 40C
scaklkta pH 6da gstermitir.
65
7.
BK07pul ve PY22pul enzimlerinin farkl scaklk ve srelerde n inkbasyonu

yapldktan sonra kalan aktiviteleri llerek, termal stabiliteleri tespit edilmitir.
ki enzim iin de termal stabilitenin en iyi olduu, en yksek scaklk deeri 40C
olarak saptanmtr ve bu sonu enzimin optimum scaklk deeri ile uyum
gstermitir. Elde edilen verilere gre, BK07 pullulanaz aktivitesi, 40Cde (pH
8de) 1 saat inkbasyon sonunda %89; PY22 pullulanaz aktivitesi ise 40Cde (pH
6da) 1 saat inkbasyon sonunda %68 seviyesinde korunmutur.
8.
Enzim aktivitesi zerinde +2 deerlikli metal iyonlarnn etkisinin olup olmad ve

CaCl2 varlnn enzim aktivitesi zerindeki etkisi aratrlmtr. Enzim reaksiyon
zeltisinde 2mM CaCl2 varl BK07 pullulanaznn aktivitesini %73 orannda
artrrken, PY22 pullulanaznn aktivitesini %89 orannda artrmtr. 2mM EDTA
BK07 pullulanaznn aktivitesini etkilemezken, PY22 pullulanaznn aktivitesini
inhibe etmitir. Bu sonu, BK07 pullulanaznn aktivite gsterebilmesi iin +2
deerlikli iyonlara gerek duymadn fakat PY22 pullulanaznn aktivitesinde +2
deerlikli iyonlarn rolnn olduunu gstermektedir.
9.
Bertoldo vd. (2004), YNWGYDP olmak zere yedi aminoasitten oluan blgenin
korunmu blge olduunu ve tm pullulanaz tip I enzimlerinde bulunduunu ve
pullulanaz tip II enzimlerinin bu korunmu blgeyi iermediini bildirmitir. Sras
ile EK 8.4 ve EK 8.5te grld gibi PY22 ve BK07 pullulanazna ait aminoasit
dizilerinde bu blgenin bulunmas her iki enzimin de pullulanaz tip I snfna
girdiini iaret etmektedir.
10. Bertoldo vd. (2004), pullulann -1,6 balarn hidroliz eden pullulanaz tip I
enzimlerinin beklenen hidroliz rnnn maltotrioz olduunu belirtmitir. TLC
yntemine gre gerekletirilen hidroliz rnleri analizinde enzim aktivitesinin
testin duyarllna gre dk kalmas sebebiyle enzimin son rn olmas
beklenen
maltotrioz band PY22
pullulanaz enzimi
ile
solgun
ekilde
gzlenebilmitir. BK07 pullulanaz enzimi ile gerekletirilen reaksiyonlar,

prifikasyonda
yaanlan
problem
nedeni
ile
spernatant
zeltisi
ile
gerekletirilmitir. Enzim aktivitesinin dk olmasnn yannda s pernatanttan

gelen kirlilik de hidroliz rnlerinin TLC analizi tespit edilebilmesini gletirmi
66
ve bu nedenlerden dolay TLC plakasnda spesifik hidroliz rnleri net bir ekilde
grntlenememitir
Bu alma ile elde edilen P. pastoris KM71H-PY22pul ve P. pastoris KM71HBK07pul sular kullanlarak pullulanaz enziminin retim veriminin ve enzim
aktivitesinin arttrlmas zerine allabilir. Bunun iin fermentrde retimi ve
optimizasyonu; ve ayrca hcred svnn daha verimli ekilde (rnein histidin
saflatrmada kullanlan farkl tekniklerden faydalanlarak) saflatrlmas iin farkl
teknikler denenebilir.
Rekombinant enzimin termal stabilitesinin arttrlmas yada optimum alma
koullarnn deitirilmesi gibi, enzimin zelliklerini gelitirecek ve deitirecek
almalar da protein mhendislii teknikleri ile mmkndr.
67
7. KAYNAKLAR
ABDEL-NABY, M.A., OSMAN, M.Y. and ABDEL-FATTAH, A.F. 2011. Production
of Pullulanase by Free and immobilized cells of Bacillus licheniformis NRC22
in Batch and Continuous Cultures. World Journal of Microbiology &
Biotechnology, 27, 2903-2911.
ARA, K., SAEKI, K., IGARASHI, K.,TAKAIWA, M., UEMURA, T., HAGIHARA,
H., LAWAI, S. and ITO, S. 1995. Purificiation and Characterization of an
Alkaline Amylopullulanase with Both -1,4 and -1,6 Hydrolytic Activity
from Alkalophilic Bacillus sp. KSM-1378. Biochimica et Biophysica Acta
1243: 315-324.
BERTOLDO, C., DUFFNER, F., JORGENSEN, P.L. and ANTRANIKIAN, G. 1999.
Pullulanase Type I from Fervidobacterium pennavorans Ven5: Cloning,
Sequencing, and Expression of the Gene and Biochemical Characterization of
the Recombinant Enzyme. Applied and Environmental Microbiology, 2084
2091.
BERTOLDO, C. and ANTRANIKIAN, G. 2002. Starch-Hydrolyzing Enzymes from
Thermophilic Archaea and Bacteria. Current Opinion in Chemical Biology, 6,
151-160.
BERTOLDO, C.,ARMBRECHT, M., BECKER, F., SCHAFER, T., ANTRANIKIAN,
G. and LIEBL, W. 2004. Cloning, Sequencing and Characterization of a Heatand Alkali-Stable Type I Pullulanase from Anaerobranca gottschalkii. Applied
and Environmental Microbiology 70, no. 6: 3407-3416.
BRUNSWICK, J.M., KELLY, C.T. and FOGARTY, W.M. 1999. The
Amylopullulanase of Bacillus sp. DSM 405. Applied Microbiology and
Biotechnology, 51, 170-175.
CEREGHINO, G.P. and CREGG, J.M. 1999. Application of Yeast in Biotechnology:
Protein Production and Genetic Analysis. Current Opinion Biotechnology.
Vol.10: 422-427.
CEREGHINO, G.P., SUNGA, A.J., CEREGHINO, J.L. and CREGG, J.M. 2001.
Expression of Foreign Genes in the Yeast Pichia pastoris, In Genetic
Engineering: Principles and Methods. Editor: SETLOW, J. Kluvwer
Academic/Plenum Publishers, New York. Vol.23: 157-169.
DEMAIN, A.L. 2005. Industrial Mycology: Past, Present and Future. Editor: AN, Z.
Handbook of Industrial Mycology. Marcel Dekker, New York.1-25.
EREM, F., CERTEL, M. and KARAKA, B. 2009. Identification of Bacillus Species
Isolated From Ropey Breads Both with Classical Methods and API
68
Identification Kits, Akdeniz niversitesi Ziraat Fakltesi Dergisi, 22, 2, 201

210.
ERRA-PUJADA, M., FLORENT CHANG, P.H., DEBEIRE, P., DUCHIRON, F. and
ODONOHUE, M.J. 2001. Purification and Properties of the Catalytic Domain
of the Thermostable Pullulanase Type II from Thermococcus hydrothermalis.
Biotechnology Letters 23: 1273-1277.
HATADA, Y., SAITO K., HAGIHARA, H., OZAKI, K. and ITO, S. 2001. Nucleotide
and Deduced Aminoacid Sequence of an Alkaline Pullulanase from the
Alkaline Bacterium Bacillus sp. KSM-1876. Biochemica and Biophysica Acta
1545: 367-371.
HIGGINS, D.R. and CREGG, J.M. 1998. Introduction to Pichia pastoris. Methods of
Molecular Biology. Vol. 103:1-15.
HYUN, H.H. and ZEIKUS J.G. 1985. Regulation and Genetic Enhancement of
Glucoamylase
and
Pullulanase
Production
in
Clostridium
thermohydrosulfuricum, Journal of Bacteriology, 164, 3, 1146-52.
IQBAL, J. 1994. Studies on the Production of Thermostable Pullulanase by Bacillus
Species. Phd. Thesis. University Of The Punjab.
KIM, T.J., PARK, W.S., CHOI S.K., YOON, Y.J., PARK, K.H. and KIM, J.W. 2000.
Molecular Cloning and Characterization of a Thermostable Pullulanase from a
Thermus Strain IM6501. Food Science Biotechnology 9(3): 188-194.
KOCH, R., CANGANELLA, F., HIPPE, H., JAHNKE, K.D. and ANTRANIKIAN, G.
1997. Purication and Properties of a Thermostable Pullulanase from a Newly
Isolated Thermophilic Anaerobic Bacterium, Fervidobacterium pennavorans
VEN5. Applied and Environmental Microbiology 63, no. 3: 1088-1094.
LEATHERS, T.D. 2003. Biotechnological production and applications of pullulan. Appl
Microbiol Biotechnol, 62: 468-473.
LEE, M.J., LEE, Y.C. and KIM, C.H. 1997. Intracellular and Extracellular Forms of
Alkaline Pullulanase from an Alkaline Bacillus sp. S-1. Archives of
Biochemistry and Biophysics 337, 2, 308-316.
LING, H.S. 2006. Production of Pullulanase by Raoultella planticola DSMZ 4617
Using Sago Starch as Carbon Source, (Phd. Thesis), Malaysia Putra
University.
LING, H.S., LING T.C., Mohamad, R. and Ariff A.B. 2009. Characterization of
Pullulanase Type II from Bacillus cereus H1.5, American Journal of
Biochemistry and Biotechnology, 5, 4, 170-179.
69
MESSAOUD, E.B., AMMAR, Y.B., MELLOULI, L. and BEJAR, S. 2002.

Thermostable Pullulanase Type I from New Isolated Bacillus theroleovorans
US105: Cloning, Sequencing and Expression of the Gene in E. coli. Enzyme
and Microbial Technology, 31, 827-832.
NAIR, S.U., SINGHAL, R.S. and KAMAT M.Y. 2006. Enhanced Production of
Thermostable Pullulanase Type 1 Using Bacillus cereus FDTA 13 and Its
Mutant, Production of Pullulanase from B. cereus, Food Technology and
Biotechnology, 44, 2, 275282.
REDDY P.R.M., SWAMY M.V. and SEENAYYA G. 1998. Purification and
Characterization of Thermostable -amylase and Pullulanase from High
Yielding Clostridium thermosulfurogenes SV2, World Journal of Microbiology
& Biotechnology, 14, 89-94.
ROY, A., MESSAOUD, E.B. and BEJAR, S. 2003. Isolation and Purification of an
Acidic Pullulanase Type II from Newly Isolated Bacillus sp. US149. Enzymes
and Microbial Technology, 33, 720-724.
SAHA, B.C., MATHUPALA, S.P. and ZEIKUS, J.G. 1988. P urification and
Characterization of A Highly Thermostable Novel Pullulanase From
Clostridium thermohydrosulfuricum. Biochemical Journal 252(2): 343-348.
SALLEH, M. Md., ILLIAS, R., HASSAN, O., KAMARUDDIN, K. and SHAHAB N.
2006. Cloning and Expression of Pullulanase a Gene from Locally Isolated
Bacillus. (Proje sonu raporu). Faculty of Science, Skudai, Johor.
(Unpublished).
SAMAH, R.A., MAHMOOD, N.A.N., MAU, G.K., HASSAN O. and ILLIAS, R.M.
2008. Production of Thermostable Pullulanase from Bacillus flavothermus
KWF-1: Medium Development Using Experimental Design with Data
Transformation. Jurnal Teknologi, 49, 383-396.
SAMBROOK, J. and RUSSEL, D. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor.
SINGH, R.S., SAINI, G.K. and KENNEDY, J.F. 2008. Pullulan: Microbial sources,
production and applications. Carbohydrate Polymers 73, 515-531.
SINGH, R.S., SAINI G.K. and KENNEDY J.F. 2010. Maltotriose syrup preparation
from pullulan using pullulanase. Carbohydrate Polymers, 80, 401407.
TANIMOTO, T., OMATSU, M., IKUTA, A., YUK, N., MURAKAMI, H., NAKANO,
H. and KITAHATA, S. 2005. Synthesis of Novel Heterobranched Cyclodextrins Having -D-N-Acetylglucosaminyl-Maltotriose on the Side
Chain. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 69(4): 732-739.
70
STEFANOVA, M.E., SCHWERDTFEGER, R., ANTRANIKIAN, A. and

SCANDURRA, R. 1999. Heat-Stable Pullulanase from Bacillus
acidopullulyticus: Characterization and Refolding After Guanidinium
Chloride-Induced Unfolding. Extremophiles 3: 147-152.
VAN DER MAAREL, M.J.E.C., VAN DER VEEN, B., UITDEHAAG J.C.M.,
LEEMHUIS H. and DIJKHUIZEN L. 2002. Properties and applications of
starch-converting enzymes of the a-amylase family, Journal of Biotechnology
94:137155.
WU, S. and LETHWORTH G.J. 2004. High efficiency transformation by
electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and
dithiothreitol. BioTechniques 36:152:154.
71
8. EKLER
Ek 8.1. DNS Analizi in Glikoz Kalibarasyon Erisi
72
Ek 8.2. Toplam Protein Miktarnn Hesaplanmasnda Kullanlan Standart Protein

(BSA) Kurvesi
73
Ek 8.3. PZR al malarn Kullanlan Primerler ve Sekanslar

Primer
Sekans
WGF1
ATGGTCAGCATCCGCCGCAGC
WGR1
CCGTTCCGATGCCGTTTACTGC
PrF1
CTCCAAATTGGCGCGGTCATCCGGACG
PrF2
ATGCATACAATTGGGGATATAACCCGCTTCA
PrR2
TGAAGCGGGTTATATCCCCAATTGTATGCAT
PrR1
ATCATTGCCAACGCCGGTGCC
XhoIF
CTCTCGAGAAGAGAATGGTCAGCATCCGCCG
NotIR
GCGGCCGCTCAAGCAAAACTCTTAAGATCTGATG
Pul22NotIHTR
TTGCGGCCGCTCAATGATGATGATGATGAT
GAGCAAAACTCTTAAGATCTGATG
168pul-520F
TGGATGGAAACAGTTGACC
168pul-551R
GCCTTGGCATACTGGTCAA
168pul-991F
CGAGTCATTCTGGATGTTGT
168pul-1180R
AATAGACCACGCAATCCG
168pul-1507F
GGATGGAAGGCATTAGCAC
168pul-158R
AAAGGTGTGATTGTCGTGTG
410F
ACCAATCCAGTGACAGCATC
461R
ATAAACGGAACTCCCTGGG
446F
ACACGCTTCAAATGACACG
504R
ATCTCCAGCCACTGTAACG
pulATGF
ATGGTCAGCATCCGCCGCAGCTTCGAAG
1F
TTCTCCATCCATGAAAACAGCGG
2F
AAT TGG GGA TAT AAC CCG CTT CAT TT
2R
AAA TGA AGC GGG TTA TAT CCC CAA TT
3F
ACG GCA CCG GCG TTG GCA ATG A
4R
CATTTTATCCCAAAAGGTGTGATTGTCGTG
5R
TATAAGATAACCGTTCCGATGCCGTT
puladpSTOP
BK07stopht
TCAAGCAAAACTCTTAAGATCTGATGCTAAA
TATAAGATAACCGTTCCGATGCCGTT
TTGCGGCCGCTCAATGATGATGATGATGAT
GAGCAAAACTCTTAAGATCTG
74
Ek 8.4. pJET-PY22pul Plazmidi ile Elde Edilen Pullulanaz Geni Nkleotid Dizisi
ve Genin Kodlad Rekombinat Proteininin Amino Asit Dizisi
718 AA(2154 bases), MW=80967

1
1
ATGGTCAGCATCCGCCGCAGCTTCGAAGCGTATGTCGATGACATGAATATCATTACTGTT
M V S I R R S F E A Y V D D M N I I T V
61
21
CTGATTCCTGCTGAACAAAAGGAAATCATGACACCGCCGTTTCGGCTTGAGACAGAAATA
L I P A E Q K E I M T P P F R L E T E I
121
41
ACAGATTTTCCTCTGGCTGTCAGGGAGGAATACTCCCTTGAAGCAAAATACAAGTACGTC
T D F P L A V R E E Y S L E A K Y K Y V
181
61
TGCGTATCCGACCATCCTGTGACATTTGGAAAAATCCATTGCGTCAGAGCATCCAGCGGC
C V S D H P V T F G K I H C V R A S S G
241
81
CACAAAACGGATCTCCAAATTGGCGCGGTCATCCGGACGGCAGCGTTTGATGACGAATTT
H K T D L Q I G A V I R T A A F D D E F
301
101
TATTATGACGGAGAGCTGGGCGCCGTTTATACCGCGGATCATACCGTATTTAAAGTATGG
Y Y D G E L G A V Y T A D H T V F K V W
361
121
GCGCCTGCTGCAACCTCAGCTGCTGTCAAGCTTTCACACCCCAATAAAAGCGGGCGCACA
A P A A T S A A V K L S H P N K S G R T
421
141
TTCCAAATGACTCGCTTGGAAAAAGGCGTCTATGCCGTTACGGTCACAGGTGACCTTCAC
F Q M T R L E K G V Y A V T V T G D L H
481
161
GGATATGAGTATTTGTTTTGCATCTGCAACAATTCAGAATGGATGGAAACAGTTGACCAG
G Y E Y L F C I C N N S E W M E T V D Q
541
181
TATGCCAAGGCTGTGACTGTAAATGGAGAGAAGGGCGTCGTCTTGCGCCCGGATCAAATG
Y A K A V T V N G E K G V V L R P D Q M
601
201
AAATGGACTGCTCCTCTTAAACCATTCTCACACCCTGTGGATGCCGTCATCTATGAGACG
K W T A P L K P F S H P V D A V I Y E T
661
221
CATCTTCGCGACTTCTCCATCCATGAAAACAGCGGCATGATAAACAAGGGAAAATACTTA
H L R D F S I H E N S G M I N K G K Y L
721
241
GCGCTGACGGAAACTGATACACAAACCGCAAATGGCAGTTCTTCGGGATTAGCGTATGTA
A L T E T D T Q T A N G S S S G L A Y V
781
261
AAAGAGCTTGGTGTGACACATGTGGAGCTTCTGCCGGTGAATGATTTTGCCGGAGTTGAT
K E L G V T H V E L L P V N D F A G V D
841
281
GAAGAGAAGCCGCTTGATGCATACAATTGGGGATATAACCCGCTTCATTTCTTTGCCCCG
E E K P L D A Y N W G Y N P L H F F A P
75
901
301
GAGGGAAGCTATGCCTCAAATCCTCATGATCCTCAAACGAGAAAAACAGAGCTGAAACAA
E G S Y A S N P H D P Q T R K T E L K Q
961
321
ATGATCAATACCCTGCATCAGCACGGTCTGCGAGTCATTCTGGATGTTGTTTTTAACCAT
M I N T L H Q H G L R V I L D V V F N H
1021
341
GTGTATAAGAGGGAGAATTCCCCCTTTGAAAAGACAGTGCCCGGTTATTTTTTCCGGCAC
V Y K R E N S P F E K T V P G Y F F R H
1081
361
GACGAATGTGGGATGCCATCAAACGGCACCGGCGTTGGCAATGATATTGCATCAGAAAGA
D E C G M P S N G T G V G N D I A S E R
1141
AGGATGGCAAGAAAATTCATTGCGGATTGCGTGGTCTATTGGCTTGAAGAATACAATGTT
381
1201
401
GACGGCTTCCGCTTTGATCTCCTCGGGATTTTAGATATTGACACCGTGCTTTATATGAAA
D G F R F D L L G I L D I D T V L Y M K
1261
421
GAGAAAGCAACTAAGGCAAAGCCCGGAATCCTGCTTTTTGGAGAAGGGTGGGACCTGGCT
E K A T K A K P G I L L F G E G W D L A
1321
441
ACACCGCTGCCGCATGAACAGAAAGCTGCTTTGGCGAACGCGCCAAGAATGCCGGGCATC
T P L P H E Q K A A L A N A P R M P G I
1381
461
GGCTTTTTTAATGATATGTTTCGTGACGCTGTAAAAGGGAACACCTTTCACCTTAAGGCA
G F F N D M F R D A V K G N T F H L K A
1441
481
ACAGGGTTTGCGCTCGGCAACGGTGAATCAGCACAAGCTGTGATGCATGGAATTGCCGGG
T G F A L G N G E S A Q A V M H G I A G
1501
501
TCTTCCGGATGGAAGGCATTAGCACCGATTGTTCCGGAACCAAGCCAGTCCATCAATTAT
S S G W K A L A P I V P E P S Q S I N Y
1561
521
GTCGAATCACACGACAATCACACCTTTTGGGATAAAATGAGCTTTGCGCTTCCTCAAGAA
V E S H D N H T F W D K M S F A L P Q E
1621
541
AATGACAGCCGAAAGCGAAGCAGGCAAAGGCTTGCAGCCGCGATTATTTTGCTTGCCCAA
N D S R K R S R Q R L A A A I I L L A Q
1681
561
GGGGTGCCGTTTATTCACAGCGGCCAGGAATTTTTCCGGACGAAGCAGGGAGTGGAAAAC
G V P F I H S G Q E F F R T K Q G V E N
1741
581
AGCTATCAATCCAGTGACAGCATCAACCAGCTCGACTGGGATCGCCGTGAAACATTCAAA
S Y Q S S D S I N Q L D W D R R E T F K
1801
601
GAAGATGTTCACTATATCCGCAGGCTGATCTCGCTGAGAAAAGCGCATCCTGCATTCCGT
E D V H Y I R R L I S L R K A H P A F R
1861
CTTAGGTCCGCTGCAGACATCCAGCGCCATCTTGAATGCTTGACGCTAAAAGAACACCTT
76
621
1921
641
ATCGCATACAGGCTTTATGATCTTGACGAGGTTGACGAATGGAAAGATATCATTGTTATC
I A Y R L Y D L D E V D E W K D I I V I
1981
661
CATCACGCGAGTCCAGACTCCGTCGAGTGGAGGCTGCCAAACGACATACCTTATCGGCTT
H H A S P D S V E W R L P N D I P Y R L
2041
681
TTATGTGATCCATCAGGATTTCAGGAAGACCCAACAGAAATCAAGAAAACGGTTGCAGTA
L C D P S G F Q E D P T E I K K T V A V
2101
701
AACGGCATCGGAACGGTTATCTTATATTTAGCATCAGATCTTAAGAGTTTTGCTTGA
N G I G T V I L Y L A S D L K S F A *
77
Ek 8.5. pPICZA-YBKpulH Plazmidi ile Elde Edilen Pullulanaz Geni Nkleotid

Dizisi ve Genin Kodlad Rekombinat Proteininin Amino Asit Dizisi
BKp ulH ( 1-2 17 5)
Uni ver sa l c od e
Tot al am ino a cid n umb er : 7 24 , M W= 80 770
Max OR F sta rt s a t AA po s 1 (m ay be D NA po s 1 ) for 7 24 AA (21 72 ba se s), M W=8 07 70
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
1
A TG GTC AG CAT CC GCC GC AGC TT CG AAG CG TAT GC CGA TG AAA TG AAT AT TAT TA CGG TT CTG AT TCC TG CTG AT CAA AA AGA TA CCT TT ACG CC GC CTT TT CAG CT TGA GA CAG AT ACA
1
M V S I R R S F E A Y A D E M N I I T V L I P A D Q K D T F T P P F Q L E T D T
121
41
1 30
1 40
1 50
1 60
1 70
1 80
1 90
2 00
2 10
220
230
240
G CG GAA AT TCC TC TGA CA GTC AG TC AGG AA TGG CA AAT AG AAG GG AAA TG CAA GT ATG TA TGT GT AGC TG AAC AG CCG GT GAC TT TCG GA AAA AC GC ATC AT GTC AA AGC AT CCG GC GGC
A E I P L T V S Q E W Q I E G K C K
Y V C V A E Q P V T F G K T H H V K A S G G
241
81
2 50
2 60
2 70
2 80
2 90
3 00
3 10
3 20
3 30
340
350
360
G GA AAA AC GGA TC TCC AA ATC GG GG CGG TT GTC AG GAC GG ATG CG TTT GA TGC TG CAT TT TAT TA TGA CG GAG AG CTC GG AGC TG TTT AC ACT TC GG ATT AT ACT GA ATT TA AGG TA TGG
G K T D L Q I G A V V R T D A F D A A F Y Y D G E L G A V Y T S D Y T E F K V W
361
121
3 70
3 80
3 90
4 00
4 10
4 20
4 30
4 40
4 50
460
470
480
G CG CCT GC TGC GA CGT CA GCT GC CG TCA AG CTG TC ACA TC CCG AG AAA AG CGG GC ACA CG CTT CA AAT GA CAC GA ATG GA AAA TG GAG TA TAC GC CG TTA CA GTG GC TGG AG ATC TG CAC
A P A A T S A A V K L S H P E K S G H T L Q M T R M E N G V Y A V T V A G D L H
481
161
4 90
5 00
5 10
5 20
5 30
5 40
5 50
5 60
5 70
580
590
600
G GT TAT GA GTA TG TGT AC CGG AT TT GCA AC AAT TT AGA AT GGA CA GAA AC GGT TG ATC CG TAT GC AAA AG CTG TG ACG GT CAA CG GAG AG AAG GG TG TTG TG CTG CG CCC TG ATC AA GCA
G Y E Y V Y R I C N N L E W T E T V D P Y A K A V T V N G E K G V V L R P D Q A
601
201
6 10
6 20
6 30
6 40
6 50
6 60
6 70
6 80
6 90
700
710
720
A AT TCG GC TCC TT CGC TT GCA CC AT TTT CA GAT CC CGT TG ATG CC ATT AT TTA TG AGA TG CAC AT CCG AG ACT TC TCC AT TCA TG AAA AC AGC GG TA TGA AG AAC AA GGG GA AAT AT GCG
N S A P S L A P F S D P V D A I I Y E M H I R D F S I H E N S G M K N K G K Y A
721
241
7 30
7 40
7 50
7 60
7 70
7 80
7 90
8 00
8 10
820
830
840
G CG CTT GC TGA AA CGG AC ACC AA AA CGA AA AAT GG CAG TT CTA CA GGA CT TTC TT ATT TA AAA GA GCT TG GCG TT ACA CA TAT AG AAC TT TTA CC GT TAA AC GAT TA TGC CG GAG TT GAT
A L A E T D T K T K N G S S T G L S Y L K E L G V T H I E L L P L N D Y A G V D
841
281
8 50
8 60
8 70
8 80
8 90
9 00
9 10
9 20
9 30
940
950
960
G AA GAA AA CCC AC TTG CC GCC TA CA ATT GG GGC TA TAA TC CGC TT CAT TT TTT CG CCC CG GAG GG AAG CT ATG CC TCC AA TCC TC ACG AC CCT CA GA CAA GA AAC AC AGA AG TAA AA CAA
E E N P L A A Y N W G Y N P L H F F A P E G S Y A S N P H D P Q T R N T E V K Q
961
321
9 70
9 80
9 90
10 00
10 10
10 20
10 30
10 40
10 50
1 060
1 070
1 080
A TG ATT CA CAC CC TGC AT CAG CA TG GCC TG CGT GT CAT TC TGG AT GTT GT TTA TA ACC AT GTA TA CCA AA GAG AG CAC TC GCC CT TTG AA AAA AC GG TGC CC GGT TA TTT CT TCC GG CAT
M I H T L H Q H G L R V I L D V V Y N H V Y Q R E H S P F E K T V P G Y F F R H
108 1
361
10 90
11 00
11 10
11 20
11 30
11 40
11 50
11 60
11 70
1 180
1 190
1 200
G AT CAA TT CGG GA TGC CT TCA AA TG GCA CC GGC GT AGG GA ATG AC ATC GC CTC AG AAA GG CGG AT GGC AA GAA AA TTC AT TAC GG ATT GC GTT AT GT A TT GG GTG AA GGA AT ACG AT GTC
D Q F G M P S N G T G V G N D I A S E R R M A R K F I T D C V M Y W V K E Y D V
120 1
401
12 10
12 20
12 30
12 40
12 50
12 60
12 70
12 80
12 90
1 300
1 310
1 320
G AC GGC TT CCG CT TTG AT CTG CT CG GCA TT TTA GA TAT TG AAA CG GTT CT TCA TA TGA AA GAA AA AGC AT CTG AG GTA AA GCC CG GAA TC CTT CT CT TTG GG GAA GG CTG GG ATT TG GCA
D G F R F D L L G I L D I E T V L H M K E K A S E V K P
G I L L F G E G W D L A
132 1
441
13 30
13 40
13 50
13 60
13 70
13 80
13 90
14 00
14 10
1 420
1 430
1 440
A CA CCG CT GCC GC CTG AA CAG AA AG CGA CA TTG GC GAA TG CAT CG AAA AT GCC GG GCG TC GGT TT TTT TA ATG AT T CG TT TCG TG ACG CT GTT AA AG GGA AT ACC TT TCA TA TCG CG GCG
T P L P P E Q K A T L A N A S K M P G V G F F N D S F R D A V K G N T F H I A A
144 1
481
14 50
14 60
14 70
14 80
14 90
15 00
15 10
15 20
15 30
1 540
1 550
1 560
G CG GGT TT TGC CC TTG GG AAC GG CG AAC AA ACG GA AAC AG TCA TG CGC GG GAT TG CCG GA TCT TC AGG AT GGA AA GAG AC AGC CC CGC TT GTG TC TG CGC CG AGC CA GTC CA TCA AT TAT
A G F A L G N G E Q T E T V M R G I A G S S G W K E T A P L V S A P S Q S I N Y
156 1
521
15 70
15 80
15 90
16 00
16 10
16 20
16 30
16 40
16 50
1 660
1 670
1 680
G TC GAG TC GCA TG ACA AC CAC AC AT TTT GG GAT AA AAT GA ACC TC GCG CT TCC AC AAG AA AGT GA CAG CC GAA AG AGA AG CCG GC AAA AG CTG GC GA CTG CA ATC AT TCT GC TGG CC CAG
V E S H D N H T F W D K M N L A L P Q E S D S R K R S R Q K L A T A I I L L A Q
168 1
561
16 90
17 00
17 10
17 20
17 30
17 40
17 50
17 60
17 70
1 780
1 790
1 800
G GA GTT CC GTT TA TTC AC AGC GG AC AGG AA TTT TT CCG GA CGA AG CAG GG GGT GG AAA AC AGC TA CCA AT CCA GT GAC AG CAT CA ACC AG CTG GA CT GGT CG CGG TG TGA AA CAT TC AAG
G V P F I H S G Q E F F R T K Q G V E N S Y Q S S D S I N Q L D W S R C E T F K
180 1
601
18 10
18 20
18 30
18 40
18 50
18 60
18 70
18 80
18 90
1 900
1 910
1 920
C AG GAT GT TAA CT ATG TT CAC AG GC TGA TT TCG CT CAG AA AAG CG CAT CC GGC AT TCC GT CTT AC GTC AT CAG CC GAT AT TCA GC GCT GC CTT GA AT GTC TG GCT CT CAA AG AGC AC CTT
Q D V N Y V H R L I S L R K A H P A F R L T S S A D I Q R C L E C L A L K E H L
192 1
641
19 30
19 40
19 50
19 60
19 70
19 80
19 90
20 00
20 10
2 020
2 030
2 040
A TT GTA TA CCG GC TGT TT AAC CT CG GCG CA GTC GA CGA AT GGG AA GAA AT CAT TG TCA TC CAT CA TGC CA GCC CT GAT TC TGT TA CAT GG CAG CT GC CGA AA GAT AA GGC TT ACC GC CTT
I V Y R L F N L G A V D E W E E I I V I H H A S P D S V T W Q L P K D K A Y R L
204 1
681
20 50
20 60
20 70
20 80
20 90
21 00
21 10
21 20
21 30
2 140
2 150
2 160
C TA TGT GA TAC TG ACG GG TTT CG TG CTG AT TCT GG AGA AA TCA AG AAA GC GGT TG CTG TA AAC GG CAT CG GAA CG GTT AT CTT AT ATT TA GCA TC AG ATC TT AAG AG TTT TG CTC AT CAT
L C D T D G F R A D S G E I K K A V A V N G I G T V I L Y L A S D L K S F A H H
216 1
721
21 70
C AT CAT CA TCA TT GA
H H H H *
78
Ek 8.6. BK07 Pullulanaz Geni ile PY22 Pullulanaz Geninin Aminoasit Dizile rinin
Karlatrlmas
Bacillus subtilis PY22
BKpul
Consensus
MVSIRRSFEAYVDDMNIITVLIPAEQKEIMTPPFRLETEITDFPLAVREEYSLEAKYKYV
MVSIRRSFEAYADEMNIITVLIPADQKDTFTPPFQLETDTAEIPLTVSQEWQIEGKCKYV
mvsirrsfeay d mniitvlipa qk
tppf let
pl v e
e k kyv
60
60

BKpul
Consensus
CVSDHPVTFGKIHCVRASSGHKTDLQIGAVIRTAAFDDEFYYDGELGAVYTADHTVFKVW
CVAEQPVTFGKTHHVKASGGGKTDLQIGAVVRTDAFDAAFYYDGELGAVYTSDYTEFKVW
cv
pvtfgk h v as g ktdlqigav rt afd fyydgelgavyt d t fkvw
120
120

BKpul
Consensus
APAATSAAVKLSHPNKSGRTFQMTRLEKGVYAVTVTGDLHGYEYLFCICNNSEWMETVDQ
APAATSAAVKLSHPEKSGHTLQMTRMENGVYAVTVAGDLHGYEYVYRICNNLEWTETVDP
apaatsaavklshp ksg t qmtr e gvyavtv gdlhgyey
icnn ew etvd
180
180

BKpul
Consensus
YAKAVTVNGEKGVVLRPDQMKWTAPLKPFSHPVDAVIYETHLRDFSIHENSGMINKGKYL
YAKAVTVNGEKGVVLRPDQANSAPSLAPFSDPVDAIIYEMHIRDFSIHENSGMKNKGKYA
yakavtvngekgvvlrpdq
l pfs pvda iye h rdfsihensgm nkgky
240
240

BKpul
Consensus
ALTETDTQTANGSSSGLAYVKELGVTHVELLPVNDFAGVDEEKPLDAYNWGYNPLHFFAP
ALAETDTKTKNGSSTGLSYLKELGVTHIELLPLNDYAGVDEENPLAAYNWGYNPLHFFAP
al etdt t ngss gl y kelgvth ellp nd agvdee pl aynwgynplhffap
300
300

BKpul
Consensus
EGSYASNPHDPQTRKTELKQMINTLHQHGLRVILDVVFNHVYKRENSPFEKTVPGYFFRH
EGSYASNPHDPQTRNTEVKQMIHTLHQHGLRVILDVVYNHVYQREHSPFEKTVPGYFFRH
egsyasnphdpqtr te kqmi tlhqhglrvildvv nhvy re spfektvpgyffrh
360
360

BKpul
Consensus
DECGMPSNGTGVGNDIASERRMARKFIADCVVYWLEEYNVDGFRFDLLGILDIDTVLYMK
DQFGMPSNGTGVGNDIASERRMARKFITDCVMYWVKEYDVDGFRFDLLGILDIETVLHMK
d gmpsngtgvgndiaserrmarkfi dcv yw ey vdgfrfdllgildi tvl mk
420
420

BKpul
Consensus
EKATKAKPGILLFGEGWDLATPLPHEQKAALANAPRMPGIGFFNDMFRDAVKGNTFHLKA
EKASEVKPGILLFGEGWDLATPLPPEQKATLANASKMPGVGFFNDSFRDAVKGNTFHIAA
eka
kpgillfgegwdlatplp eqka lana mpg gffnd frdavkgntfh a
480
480

BKpul
Consensus
TGFALGNGESAQAVMHGIAGSSGWKALAPIVPEPSQSINYVESHDNHTFWDKMSFALPQE
AGFALGNGEQTETVMRGIAGSSGWKETAPLVSAPSQSINYVESHDNHTFWDKMNLALPQE
gfalgnge
vm giagssgwk ap v psqsinyveshdnhtfwdkm alpqe
540
540

BKpul
Consensus
NDSRKRSRQRLAAAIILLAQGVPFIHSGQEFFRTKQGVENSYQSSDSINQLDWDRRETFK
SDSRKRSRQKLATAIILLAQGVPFIHSGQEFFRTKQGVENSYQSSDSINQLDWSRCETFK
dsrkrsrq la aiillaqgvpfihsgqeffrtkqgvensyqssdsinqldw r etfk
600
600

BKpul
Consensus
EDVHYIRRLISLRKAHPAFRLRSAADIQRHLECLTLKEHLIAYRLYDLDEVDEWKDIIVI
QDVNYVHRLISLRKAHPAFRLTSSADIQRCLECLALKEHLIVYRLFNLGAVDEWEEIIVI
dv y rlislrkahpafrl s adiqr lecl lkehli yrl l vdew iivi
660
660

BKpul
Consensus
HHASPDSVEWRLPNDIPYRLLCDPSGFQEDPTEIKKTVAVNGIGTVILYLASDLKSFA
HHASPDSVTWQLPKDKAYRLLCDTDGFRADSGEIKKAVAVNGIGTVILYLASDLKSFA
hhaspdsv w lp d yrllcd gf d eikk vavngigtvilylasdlksfa
718
718
79

Enzimleri ile Aminoasit Dizilerinin Karlatrlmas
Bac._licheniformis.seq
Bac._sub._spizizenii_ATCC6633.seq
Bacillus_atrophaeus.seq
Bacillus_bataviensis.seq
Bacillus_cereus_ATCC_10987.seq
Bacillus_methanolicus.seq
Bacillus_subtilis_PY22.seq
Bacillus_thuringiensis.seq
Bacillus_vallismortis.seq
Bacillus_weihenstephanensis.seq
Geobacillus_kaustophilus.seq
BKpul
Consensus
LESGQKATLQNARKVPAVGFFNDRFRNAVKGSTFELGDRGYALGDTGKKAELQHGIAGS........PGFLLPPQ
LPQEQKATLANATKMPGIGFFNDTFRDAVKGNTFHLTAAGFALGNGEAAETVMHGIAGSS.GWKALAPIVPEPSQ
ISDDKKATLANAFQLPGIGFFNDSFRDAVKGSTFQREAAGFALGNGDQIDAVIHGITGSA.GWKETDPMVQEPSQ
LPLDQKATIGNQAKMPHIAQFNDKFRDIIKGSTFNLFDKGYALGNDHHLDAAMEVLTGSVGLTKQGTRLFNEPFQ
LPLEEKATLNNAKKMPHIAQFNDQFRDGIKGSTFHINKRGFAFGGYVDCNHLQYIASGSL.LSMKETGLFLEPVQ
IPPEKKANIRNQKYLPEIGQFNDWFRDSIKGSTFNLYDRGYALGNEYYYESAKQLLVGSIGFEKMDKGIFTEPIQ
LPHEQKAALANAPRMPGIGFFNDMFRDAVKGNTFHLKATGFALGNGESAQAVMHGIAGSS.GWKALAPIVPEPSQ
LPLEEKATLNNANKMPHIAQFNDQFRDGIKGSTFHINKRGFAFGGHVDRNHLRYIASGSL.LSMKETGLFLEPVQ
LPHEQKATLANASKMPGIGFFNDMFRDAVKGNTFHLMAAGFALGCGEAAETVMHGIAGSS.GWKALAPIVPEPSQ
LPLEEKATLNNANKMPCIAQFNDQFRDGIKGSTFNINKRGFAFGGHVDCNHLQYIVAGSL.LSMKETGLFLEPVQ
LPPEQKATMANAKQLPRFAYFNDRFRDAVKGSTFHLPDRGFALGNPGGREQVKLAIAGS...LRALGGLFCHPRQ
LPPEQKATLANASKMPGVGFFNDSFRDAVKGNTFHIAAAGFALGNGEQTETVMRGIAGSS.GWKETAPLVSAPSQ
ka
n
p
fnd fr
kg tf
g a g
gs
p q
512
516
516
520
517
520
516
517
516
517
519
516
BKpul
Consensus
SINYAECHDNHTFWDKMAFCS.EEDACTKRLRQRLALSIVLLSQGVPFLHAGQEFCRTKNGDSNSYRSGDGINRL
SINYVESHDNHTFWDKMGFVLSQETDSRKRSRQRLAAAIILLAQGVPFIHSGQEFFRTKQGVENSYQSSDSINQL
SVNYVESHDNHTFWDKMQYALPHETDSAKRSRQKLATAVVLLAQGIPFIHSGQEFFRTKRGDENSYQSGDSVNRL
SVNYVECHDNHTLWDKLNACFPDADQETRMKYHRLATGIVLLSQGIPFLHSGQEFFRTKNGEGNSYRSPDAVNQL
SINYVECHDNMTMWDKLMRSNEES.EEILKKRHLLATAMVILSQGIPFLHAGQEFYRTKQGNENSYNANDEINQL
SVNYVECHDNHTMWDKINLCEEGTDEEIKQKHHRLATVMVLLSQGIPFLHSGQEFFRTKKGVGNSYRSPDEINWL
SINYVESHDNHTFWDKMSFALPQENDSRKRSRQRLAAAIILLAQGVPFIHSGQEFFRTKQGVENSYQSSDSINQL
SINYVECHDNMTMWDKLMRSNEES.EEILKKRHVLATAMVILSQGIPFLHAGQEFYRTKQGNENSYNANDEINQL
SINYVESHDNHTFWDKMSFALPQETDSRKRSRQRLAAAIILLAQGVPFIHSGQEFFRTKQGVENSYQSSDSINQL
SINYVECHDNMTMWDKLVQSNPES.EEILKRRHRLATAMVILSQGIPFLHAGQEFYRTKQGNENSYNANDEINQL
SINYVECHDNHTFWDKMEAANHDEPEWLRRKRQKLATAIVLLAQGIPFLHSGQEFYRTKGGDGNSYRSPDAVNQL
SINYVESHDNHTFWDKMNLALPQESDSRKRSRQKLATAIILLAQGVPFIHSGQEFFRTKQGVENSYQSSDSINQL
s ny e hdn t wdk
la
l qg pf h gqef rtk g nsy
d n l
586
591
591
595
591
595
591
591
591
591
594
591
BKpul
Consensus
DWEKRAELCEDVEYVRQLIRLRRSHPAFRLQKEEEVNEHLSFMS.GTGEVTAYKLKNIAAFDPWNEIIVVHCPSA
DWDRRETFKEDVDYIRRLISLRTTHPAFRLNSSVDIQSHLECLT.LREHLIAYRLYDLNGIDQWEDIIVIHHASP
DWTRRSEFREDVEYVRRLIEIRKAHPAFRLKRAAEVVRHLDFLE.VRGHLIAYRLFDLETMDEWKEIIIVHHSSP
DWERKSKFKENVDYIKGLIQIRKTFSCFRIRTSKEIHSQIHPLS.FTAPVLGYLFKKDHEE.....VIIIINPSN
DWDRKEKEIETVNYIKGLIAIRKEHGAFRLQNADLIKKHMTFLQ.TSPEVLAYHLEHVESFGPWKEIVVLFNSSL
DWDRKIQFADNVEYIKGIISIRKSHKAFRFHRADLIRKHIRFLP.YPKPLIGCFYEDVQEFGHWKTILVVLNPLR
DWDRRETFKEDVHYIRRLISLRKAHPAFRLRSAADIQRHLECLT.LKEHLIAYRLYDLDEVDEWKDIIVIHHASP
DWDRKEKEIETVNYIKGLIAIRKEHGAFRLQNADLIKKHMTFLQ.TSPEVLAYHLEHVESFGPWKEIVVLFNSSL
DWGRRETFKEDVDYIRRLISLRKAHPAFRLRSAADIKRHLECLT.LNELLIAYRLFDLGEVDEWEDIIVIHHASP
DWDQKEKEMETVNYIKGLIAIRKGHGAFRLQNVDLIKKHMTFLQ.TSTEVLAYHLEHVELFGPWKEIVVLFNSGL
DWERKSRYEDDVRYVQGLIALRRAHGAFRLATEAEVLRHFTFLEPLPPSVIAYRLHDAAVYGPWEDIIVVHHNEE
DWSRCETFKQDVNYVHRLISLRKAHPAFRLTSSADIQRCLECLA.LKEHLIVYRLFNLGAVDEWEEIIVIHHASP
dw
v y
i r
fr
660
665
665
664
665
669
665
665
665
665
669
665
BKpul
Consensus
KKETLELPAQKQYLLHCDPFTFFNGKV..QAEKRLRLNGIGTYVLYEPKGIF...
DFVEWELPNDKTYRLLCDTSGFHHDPK..EIKKAVAVNSIGTVILYLASDLKSFS
DKAEMRLPAGKTYCLLCDPSGFREQPK..EIKEELIIEGIGTCILYI........
MKQFIHLPDG.DWSVLASQKHAGISSIAVLQGGANAIDPISLNVLLKK.......
EAKTVQLPKEETWHVLVNEKQAKIEPISSFRGKELRLAPISTYILTIM.......
TVQKIDLPLGGKWEILADHKNAKAKPFRSISQKQIEVNPVSSYVLVK........
DSVEWRLPNDIPYRLLCDPSGFQEDPT..EIKKTVAVNGIGTVILYLASDLKSFA
EAKTVQLPKEETWHVLVNEKQAKIEPISSFRGKELRLSPISTYILTIM.......
ESVEWKLPNDKTYRLLCDTSGFRQDLK..EIKKAVAVNGLGTVILYLASDLKSFA
EAKTVQLPKEETWHVLVNEKQAKIEPISSFRGKELQLAPISTYILTIM.......
KETAIALPDEREWAVVCDGQRCGTTPFG.QARGMLRLDGIGTWVLVHPAG.....
DSVTWQLPKDKAYRLLCDTDGFRADSG..EIKKAVAVNGIGTVILYLASDLKSFA
lp
l
710
718
710
711
713
716
718
713
718
713
718
718
80
Ek 8.8. BK07 Pullulanaz Geni ile PY22 Pullulanaz Geninin Nkleotid Dizile rinin
Karlatrlmas
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
ATGGTCAGCATCCGCCGCAGCTTCGAAGCGTATGCCGATGAAATGAATATTATTACGGTTCTGATTCCTGCTGATCAAAAAGATACCTTT
ATGGTCAGCATCCGCCGCAGCTTCGAAGCGTATGTCGATGACATGAATATCATTACTGTTCTGATTCCTGCTGAACAAAAGGAAATCATG
atggtcagcatccgccgcagcttcgaagcgtatg cgatga atgaatat attac gttctgattcctgctga caaaa ga a c t
90
90
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
ACGCCGCCTTTTCAGCTTGAGACAGATACAGCGGAAATTCCTCTGACAGTCAGTCAGGAATGGCAAATAGAAGGGAAATGCAAGTATGTA
ACACCGCCGTTTCGGCTTGAGACAGAAATAACAGATTTTCCTCTGGCTGTCAGGGAGGAATACTCCCTTGAAGCAAAATACAAGTACGTC
ac ccgcc tttc gcttgagacaga a a c ga ttcctctg c gtcag aggaat
t gaag aaat caagta gt
180
180
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
TGTGTAGCTGAACAGCCGGTGACTTTCGGAAAAACGCATCATGTCAAAGCATCCGGCGGCGGAAAAACGGATCTCCAAATCGGGGCGGTT
TGCGTATCCGACCATCCTGTGACATTTGGAAAAATCCATTGCGTCAGAGCATCCAGCGGCCACAAAACGGATCTCCAAATTGGCGCGGTC
tg gta c ga ca cc gtgac tt ggaaaaa cat
gtca agcatcc gcggc
aaaacggatctccaaat gg gcggt
270
270
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
GTCAGGACGGATGCGTTTGATGCTGCATTTTATTATGACGGAGAGCTCGGAGCTGTTTACACTTCGGATTATACTGAATTTAAGGTATGG
ATCCGGACGGCAGCGTTTGATGACGAATTTTATTATGACGGAGAGCTGGGCGCCGTTTATACCGCGGATCATACCGTATTTAAAGTATGG
tc ggacgg gcgtttgatg g attttattatgacggagagct gg gc gttta ac cggat atac g atttaa gtatgg
360
360
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
GCGCCTGCTGCGACGTCAGCTGCCGTCAAGCTGTCACATCCCGAGAAAAGCGGGCACACGCTTCAAATGACACGAATGGAAAATGGAGTA
GCGCCTGCTGCAACCTCAGCTGCTGTCAAGCTTTCACACCCCAATAAAAGCGGGCGCACATTCCAAATGACTCGCTTGGAAAAAGGCGTC
gcgcctgctgc ac tcagctgc gtcaagct tcaca ccc a aaaagcgggc cac t caaatgac cg tggaaaa gg gt
450
450
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
TACGCCGTTACAGTGGCTGGAGATCTGCACGGTTATGAGTATGTGTACCGGATTTGCAACAATTTAGAATGGACAGAAACGGTTGATCCG
TATGCCGTTACGGTCACAGGTGACCTTCACGGATATGAGTATTTGTTTTGCATCTGCAACAATTCAGAATGGATGGAAACAGTTGACCAG
ta gccgttac gt c gg ga ct cacgg tatgagtat tgt
g at tgcaacaatt agaatgga gaaac gttga c g
540
540
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
TATGCAAAAGCTGTGACGGTCAACGGAGAGAAGGGTGTTGTGCTGCGCCCTGATCAAGCAAATTCGGCTCCTTCGCTTGCACCATTTTCA
TATGCCAAGGCTGTGACTGTAAATGGAGAGAAGGGCGTCGTCTTGCGCCCGGATCAAATGAAATGGACTGCTCCTCTTAAACCATTCTCA
tatgc aa gctgtgac gt aa ggagagaaggg gt gt tgcgccc gatcaa
aa t g ct ct c ctt accatt tca
630
630
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
GATCCCGTTGATGCCATTATTTATGAGATGCACATCCGAGACTTCTCCATTCATGAAAACAGCGGTATGAAGAACAAGGGGAAATATGCG
CACCCTGTGGATGCCGTCATCTATGAGACGCATCTTCGCGACTTCTCCATCCATGAAAACAGCGGCATGATAAACAAGGGAAAATACTTA
a cc gt gatgcc t at tatgaga gca t cg gacttctccat catgaaaacagcgg atga aacaaggg aaata
720
720
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
GCGCTTGCTGAAACGGACACCAAAACGAAAAATGGCAGTTCTACAGGACTTTCTTATTTAAAAGAGCTTGGCGTTACACATATAGAACTT
GCGCTGACGGAAACTGATACACAAACCGCAAATGGCAGTTCTTCGGGATTAGCGTATGTAAAAGAGCTTGGTGTGACACATGTGGAGCTT
gcgct c gaaac ga ac aaac
aaatggcagttct c gga t c tat taaaagagcttgg gt acacat t ga ctt
810
810
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
TTACCGTTAAACGATTATGCCGGAGTTGATGAAGAAAACCCACTTGCCGCCTACAATTGGGGCTATAATCCGCTTCATTTTTTCGCCCCG
CTGCCGGTGAATGATTTTGCCGGAGTTGATGAAGAGAAGCCGCTTGATGCATACAATTGGGGATATAACCCGCTTCATTTCTTTGCCCCG
t ccg t aa gatt tgccggagttgatgaaga aa cc cttg gc tacaattgggg tataa ccgcttcattt tt gccccg
900
900
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
GAGGGAAGCTATGCCTCCAATCCTCACGACCCTCAGACAAGAAACACAGAAGTAAAACAAATGATTCACACCCTGCATCAGCATGGCCTG
GAGGGAAGCTATGCCTCAAATCCTCATGATCCTCAAACGAGAAAAACAGAGCTGAAACAAATGATCAATACCCTGCATCAGCACGGTCTG
gagggaagctatgcctc aatcctca ga cctca ac agaaa acaga t aaacaaatgat a accctgcatcagca gg ctg
990
990
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
CGTGTCATTCTGGATGTTGTTTATAACCATGTATACCAAAGAGAGCACTCGCCCTTTGAAAAAACGGTGCCCGGTTATTTCTTCCGGCAT
CGAGTCATTCTGGATGTTGTTTTTAACCATGTGTATAAGAGGGAGAATTCCCCCTTTGAAAAGACAGTGCCCGGTTATTTTTTCCGGCAC
cg gtcattctggatgttgttt taaccatgt ta a ag gag a tc ccctttgaaaa ac gtgcccggttattt ttccggca
1080
1080
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
GATCAATTCGGGATGCCTTCAAATGGCACCGGCGTAGGGAATGACATCGCCTCAGAAAGGCGGATGGCAAGAAAATTCATTACGGATTGC
GACGAATGTGGGATGCCATCAAACGGCACCGGCGTTGGCAATGATATTGCATCAGAAAGAAGGATGGCAAGAAAATTCATTGCGGATTGC
ga aat gggatgcc tcaaa ggcaccggcgt gg aatga at gc tcagaaag ggatggcaagaaaattcatt cggattgc
1170
1170
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
GTTATGTATTGGGTGAAGGAATACGATGTCGACGGCTTCCGCTTTGATCTGCTCGGCATTTTAGATATTGAAACGGTTCTTCATATGAAA
GTGGTCTATTGGCTTGAAGAATACAATGTTGACGGCTTCCGCTTTGATCTCCTCGGGATTTTAGATATTGACACCGTGCTTTATATGAAA
gt t tattgg t a gaatac atgt gacggcttccgctttgatct ctcgg attttagatattga ac gt ctt atatgaaa
1260
1260
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
GAAAAAGCATCTGAGGTAAAGCCCGGAATCCTTCTCTTTGGGGAAGGCTGGGATTTGGCAACACCGCTGCCGCCTGAACAGAAAGCGACA
GAGAAAGCAACTAAGGCAAAGCCCGGAATCCTGCTTTTTGGAGAAGGGTGGGACCTGGCTACACCGCTGCCGCATGAACAGAAAGCTGCT
ga aaagca ct agg aaagcccggaatcct ct tttgg gaagg tggga tggc acaccgctgccgc tgaacagaaagc c
1350
1350
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
TTGGCGAATGCATCGAAAATGCCGGGCGTCGGTTTTTTTAATGATTCGTTTCGTGACGCTGTTAAAGGGAATACCTTTCATATCGCGGCG
TTGGCGAACGCGCCAAGAATGCCGGGCATCGGCTTTTTTAATGATATGTTTCGTGACGCTGTAAAAGGGAACACCTTTCACCTTAAGGCA
ttggcgaa gc c a aatgccgggc tcgg ttttttaatgat gtttcgtgacgctgt aaagggaa acctttca t
ggc
1440
1440
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
GCGGGTTTTGCCCTTGGGAACGGCGAACAAACGGAAACAGTCATGCGCGGGATTGCCGGATCTTCAGGATGGAAAGAGACAGCCCCGCTT
ACAGGGTTTGCGCTCGGCAACGGTGAATCAGCACAAGCTGTGATGCATGGAATTGCCGGGTCTTCCGGATGGAAGGCATTAGCACCGATT
c gg tttgc ct gg aacgg gaa a c aa c gt atgc gg attgccgg tcttc ggatggaa g
agc ccg tt
1530
1530
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
GTGTCTGCGCCGAGCCAGTCCATCAATTATGTCGAGTCGCATGACAACCACACATTTTGGGATAAAATGAACCTCGCGCTTCCACAAGAA
GTTCCGGAACCAAGCCAGTCCATCAATTATGTCGAATCACACGACAATCACACCTTTTGGGATAAAATGAGCTTTGCGCTTCCTCAAGAA
gt c g cc agccagtccatcaattatgtcga tc ca gacaa cacac ttttgggataaaatga c t gcgcttcc caagaa
1620
1620
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
AGTGACAGCCGAAAGAGAAGCCGGCAAAAGCTGGCGACTGCAATCATTCTGCTGGCCCAGGGAGTTCCGTTTATTCACAGCGGACAGGAA
AATGACAGCCGAAAGCGAAGCAGGCAAAGGCTTGCAGCCGCGATTATTTTGCTTGCCCAAGGGGTGCCGTTTATTCACAGCGGCCAGGAA
a tgacagccgaaag gaagc ggcaaa gct gc c gc at att tgct gccca gg gt ccgtttattcacagcgg caggaa
1710
1710
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
TTTTTCCGGACGAAGCAGGGGGTGGAAAACAGCTACCAATCCAGTGACAGCATCAACCAGCTGGACTGGTCGCGGTGTGAAACATTCAAG
TTTTTCCGGACGAAGCAGGGAGTGGAAAACAGCTATCAATCCAGTGACAGCATCAACCAGCTCGACTGGGATCGCCGTGAAACATTCAAA
tttttccggacgaagcaggg gtggaaaacagcta caatccagtgacagcatcaaccagct gactgg
cg gtgaaacattcaa
1800
1800
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
CAGGATGTTAACTATGTTCACAGGCTGATTTCGCTCAGAAAAGCGCATCCGGCATTCCGTCTTACGTCATCAGCCGATATTCAGCGCTGC
GAAGATGTTCACTATATCCGCAGGCTGATCTCGCTGAGAAAAGCGCATCCTGCATTCCGTCTTAGGTCCGCTGCAGACATCCAGCGCCAT
a gatgtt actat t c caggctgat tcgct agaaaagcgcatcc gcattccgtctta gtc c gc ga at cagcgc
1890
1890
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
CTTGAATGTCTGGCTCTCAAAGAGCACCTTATTGTATACCGGCTGTTTAACCTCGGCGCAGTCGACGAATGGGAAGAAATCATTGTCATC
CTTGAATGCTTGACGCTAAAAGAACACCTTATCGCATACAGGCTTTATGATCTTGACGAGGTTGACGAATGGAAAGATATCATTGTTATC
cttgaatg tg c ct aaaga caccttat g atac ggct t t a ct g cg gt gacgaatgg aaga atcattgt atc
1980
1980
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
CATCATGCCAGCCCTGATTCTGTTACATGGCAGCTGCCGAAAGATAAGGCTTACCGCCTTCTATGTGATACTGACGGGTTTCGTGCTGAT
CATCACGCGAGTCCAGACTCCGTCGAGTGGAGGCTGCCAAACGACATACCTTATCGGCTTTTATGTGATCCATCAGGATTTCAGGAAGAC
catca gc ag cc ga tc gt
tgg gctgcc aa ga a
ctta cg ctt tatgtgat c
gg tttc g ga
2070
2070
BKpul
PY22_pullulanase
Consensus
TCTGGAGAAATCAAGAAAGCGGTTGCTGTAAACGGCATCGGAACGGTTATCTTATATTTAGCATCAGATCTTAAGAGTTTTGCTTGA
CCAACAGAAATCAAGAAAACGGTTGCAGTAAACGGCATCGGAACGGTTATCTTATATTTAGCATCAGATCTTAAGAGTTTTGCTTGA
c
agaaatcaagaaa cggttgc gtaaacggcatcggaacggttatcttatatttagcatcagatcttaagagttttgcttga
2157
2157
81
ATGACAAAAAGATTAATTAACAAATCAGTTTTATTACTTACTATAATTGTTATGTTCGCATCTATTTTCTCTATTCAAAGTGTAAAGGCAGTTTCAAATTCGAAAACAACTGAAGTTATCATTCATTACAAAGAGCAGCTTGGAAATACA
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
AAAGACTGGAATCTTTGGTTATGGGGAGAAAATGCAAATGGTACATCTTATGAATTTACTGGTGAAGATGAATTTGGAAAGTACGCTAAGATTAATATAGATGGTGACTATAATCGTGTAGGATTCATCATTCGTACAAATGAGTGGGAA
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
AAAGATGGTGGGGATCGTTGGATTGAAAATATAAAGGACGGTCGTGCTGAAGTATGGATTCTTTCTGGTGATGAAAAGGTATATAACGCTAAGCCTTCTTCGGATCTATCA.ATTCAAAAAGCAACTATTGATAGTTTCAATGAAATCAC
..............................................................................................ATGCCGGGTATCAGCCGCCCTTTTGAAGCTTATCTCGATGAAATGAGAACGATCAC
..............................................................................................ATGGTCAGCATCCGCCGCAGCTTCGAAGCGTACGTCGATGACATGAATATCATTAC
..............................................................................................ATGGTCAGCATCCGCCGCAGCTTCGAAGCGTATGTCGATGACATGAATATCATTAC
..............................................................................................ATGGTCAGCATCCGCCGCAGCTTCGAAGCGTATGTCGATGACATGAATATCATTAC
..............................................................................................ATGGTCAGCATCCGCCGCAGCTTCGAAGCGTATGCCGATGAAATGAATATTATTAC
t
g atc
c
aagc
gat
t a
at ac
TGTAACGA...CGAATGCTCCATTTCATATTAAGGAACAGAAAATCGAAATTGAAGGTATTAAAATTAAGAATATTACTCCTTATGATATA.AACAGTGGAGATATTACGAATAAGGTGAAAATAATTACGGAACAGAA.....AATTGA
TGTTTTAGTTCCGAAGAGCCGTGCGTCAAGCTGCAGTCCTCCTTTTCTGCTTGAAGATGATCAAGGAGAGAGGATAGAGCTTTCGGTAAAAGCGCAGGTGGAGCTTGAGGAACAATTCAAGTATGTTCTTGAAAGCAGCTGCACCGTTCC
CGTTCTGATTCCTGCTGAACAAAAAGAAATCATGACACCGCCGTTTCGGCTTGAGACAGAAACAACCGATT...TTCCTCTGGCTGTCAGAGAGGAATACCGCCTTGAAGACACATACAAGTACGTCTGCGTATCAGACCGTCCAGTGAC
CGTCCTGATTCCTGCTGAACAAAAGGAAATCATGACACCGCCGTTTCGGCTTGAGACAGAAACAACAGATT...TTCCTCTGGTTGTCAGGGAGGAATACTCCCTTGAAGCAAAATACAAGTACGTCTGCGTATCCGACCATCCTGTGCC
TGTTCTGATTCCTGCTGAACAAAAGGAAATCATGACACCGCCGTTTCGGCTTGAGACAGAAATAACAGATT...TTCCTCTGGCTGTCAGGGAGGAATACTCCCTTGAAGCAAAATACAAGTACGTCTGCGTATCCGACCATCCTGTGAC
GGTTCTGATTCCTGCTGATCAAAAAGATACCTTTACGCCGCCTTTTCAGCTTGAGACAGATACAGCGGAAA...TTCCTCTGACAGTCAGTCAGGAATGGCAAATAGAAGGGAAATGCAAGTATGTATGTGTAGCTGAACAGCCGGTGAC
gt
c
c
a
c
t
ttga
a
a
t
c
g a
a
a g
a
a a
g a
t
TTTAAAACAAACATACAAAGTTAAAATAGAAAACTTAGCTGATACGAATACTGAAATTGGTAAAGTCATTCGTAGTGAGGAATTTGATCATTTATTTTATTATGGTGGTAACGATTTAGGAAATACATATACCGTGCAACATACAAAGTT
ATTCGGAAGAGTTCACAAAGTATGCTGTGAAGAAAGCGTCTGGACAGACCTGCAAATCGGCTCTGTTACGAGAAGCGCGGCGTTTGACAAGGCTTTTTTTTATGACGG...CCGCCTCGGCGCTTTTTATTCAAAAGGAAGTACTTTATT
ATTCGGAAAAATACATGCCGTCAGAGCGTCCAGCGGCGACAAAACGGATCTCCAAATTGGCGCGGTCATCCGGACCGATACGTTTGATGATTCATTTTATTATGACGG...AGAGCTGGGGGCTGTTTATACTGCGAATTATACTGATTT
ATTTGGAAAAATCCATTGCGTCAGAGCATCCAGCGGCCACAAAACGGATCTCCAAATTGGCGCGGTCATCCGGACGGCTGCGTTTGATGACGAATTTTATTATGACGG...AGAGCTGGGCGCCGTTTATACCTCGGATCATACCGTATT
ATTTGGAAAAATCCATTGCGTCAGAGCATCCAGCGGCCACAAAACGGATCTCCAAATTGGCGCGGTCATCCGGACGGCAGCGTTTGATGACGAATTTTATTATGACGG...AGAGCTGGGCGCCGTTTATACCGCGGATCATACCGTATT
TTTCGGAAAAACGCATCATGTCAAAGCATCCGGCGGCGGAAAAACGGATCTCCAAATCGGGGCGGTTGTCAGGACGGATGCGTTTGATGCTGCATTTTATTATGACGG...AGAGCTCGGAGCTGTTTACACTTCGGATTATACTGAATT
tt
a a
a
gt
ac a
aaat gg
gt
g a g
tttga
tttt ttatg gg
t gg
ta c
tac
tt
CCGTGTATGGGCTCCTACTGCGAGTGAAGCGAAGTTAGTTACATATAAAAAATGGAACGATAAAATAGGTACTGAAATAAATATGCAACAAGGTGAAAAGGGCACCTGGAAAGCAGAACTTAAAGGGAATCAAAAAGGTCTCTATTATAC
TAAGGTATGGGCGCCGACCGCGAGTGCGGCAG...CGATCAAGCTGGAGGACCCTGATTCGCTTCAAACAAATACTTTTCAAATGATGCGCAGAAAAAAGGGCGTTTTTGAGGTAACGGTCGAAGGCGATCTAAACGGCTGGTCCTATTT
TAAAGTATGGGCGCCTGCCGCAACCTCAGCTG...CTGTCAAGCTTTCCCATCCGAATAAAAG.CGGCCGCATA..TTCCAAATGATTCGGATGGAAAAAGGCGTCTATACCGTTACTGTCAACGGTGATCTTCACGGTTATGAATATGT
TAAAGTATGGGCTCCTGCTGCAACCTCAGCTG...CTGTCAAGCTTTCACACCCCAATAAAAG.CGGGCGCACA..TTCCAAATGACTCGGTTGGAAAAAGGCGTCTATGCCGTTACGGTCACAGGTGACCTTCACGGATATGAGTATTT
TAAAGTATGGGCGCCTGCTGCAACCTCAGCTG...CTGTCAAGCTTTCACACCCCAATAAAAG.CGGGCGCACA..TTCCAAATGACTCGCTTGGAAAAAGGCGTCTATGCCGTTACGGTCACAGGTGACCTTCACGGATATGAGTATTT
TAAGGTATGGGCGCCTGCTGCGACGTCAGCTG...CCGTCAAGCTGTCACATCCCGAGAAAAG.CGGGCACACG..CTTCAAATGACACGAATGGAAAATGGAGTATACGCCGTTACAGTGGCTGGAGATCTGCACGGTTATGAGTATGT
gtatgggc cc c gc a
gc
t a
a
a
t a atg
c
aaaa gg
t
g
t
gg a c
a gg
tat
GTATAAGGTAAAAATTGGTGATAAGTGGAAAGAAGCAGTTGATCCGTATGCACGTGCTGCTTCTGTAAATGGAGATAAAGGTGCGGTTATTGATTTAGAAGAAACAAATCCGAAAAAATGGAACACGAACAAAAAGCCTAAATTAAAAAA
ATATGAGCTTTATGTAAATGGGAAGCCGTTATTGACAGTCGATCCTTATGCAAAAGCCGTTACGGCAAACGGTGAAAAAGGCGTTGTATTAGATCCAGAGGAAGTCAAGGTGGAAAAAC..ACCGCGCTCCAAGA.......CTTCACAG
GTTCTGCATCTGCAACAATTCAGAATGGACAGAAACGGTTGACCCGTATGCAAAGGCAGTGACAGTAAATGGAGAGAAGGGTGTCGTCCTGCGCCCGGATCAAATGAAATGGGCTGACA..AGCTCAAACCAT.........TCTCAAAC
GTTTTGCATCTGCAACAATTCAGAATGGATGGAAACCGTTGACCCGTATGCTAAGGCTGTGACTGTAAATGGAGAGAAGGGCGTCGTCTTGCGCCCGGATCAAATGAAATGGACTGCTC..CTCTTAAACCAT.........TCTCACAC
GTTTTGCATCTGCAACAATTCAGAATGGATGGAAACAGTTGACCAGTATGCCAAGGCTGTGACTGTAAATGGAGAGAAGGGCGTCGTCTTGCGCCCGGATCAAATGAAATGGACTGCTC..CTCTTAAACCAT.........TCTCACAC
GTACCGGATTTGCAACAATTTAGAATGGACAGAAACGGTTGATCCGTATGCAAAAGCTGTGACGGTCAACGGAGAGAAGGGTGTTGTGCTGCGCCCTGATCAAGCAAATTCGGCTCCTT..CGCTTGCACCAT.........TTTCAGAT
t
t
t
a
g
c gt ga c tatgc
gc g
c g aa gg ga aa gg g gt t
ga aa
aa
g
c
c a
a a
TCCGGAAGATGCTATTATTTATGAATTGCATGTACGTGATCTTTCTATTCAGCCCGAAAGTGGCATTAAACAGAAAGGAAAATATTTAGGTGTAACAGAAAAAGGAACAAGAGGGCCTGAAGATGTGAAAACAGGACTTGATCATATAAA
TCCGTGCGATGCGGTTATATATGAGGTTCACATCCGCGATTTCTCGATTCATGAAGACAGCGGTATGCGCCATAAAGGCAAATATGTTGCTTTTACTGAGGACGGAACTGAAACATCCGGCGGCTTCTCAACGGGAATCGCCTATTTGAA
CCTGTG.GATGCTGTCATCTATGAGATGCACATCCGCGACTTCTCCATCCATGAAAACAGCGGCATGAAAAACAAGGGAAAATACTTAGCGCTGACGGAAACAGAAACGCAAACCATAAATGGCTGTTCTTCCGGATTGGCGTATATAAA
CCTGTG.GATGCCGTCATCTATGAGACGCACCTTCGCGACTTCTCCATCCATGAAAACAGCGGCATGATAAACAAGGGAAAATACTTAGCGCTGACGGAAACTGATACACAAACCGCAAATGGCAGTTCTTCGGGATTAGCGTATGTAAA
CCTGTG.GATGCCGTCATCTATGAGACGCATCTTCGCGACTTCTCCATCCATGAAAACAGCGGCATGATAAACAAGGGAAAATACTTAGCGCTGACGGAAACTGATACACAAACCGCAAATGGCAGTTCTTCGGGATTAGCGTATGTAAA
CCCGTT.GATGCCATTATTTATGAGATGCACATCCGAGACTTCTCCATTCATGAAAACAGCGGTATGAAGAACAAGGGGAAATATGCGGCGCTTGCTGAAACGGACACCAAAACGAAAAATGGCAGTTCTACAGGACTTTCTTATTTAAA
c g
gatgc t at tatga
ca t cg ga t tc at ca
a ag gg at
a aa gg aaata
g
t c ga
g ac
a
g
c gga t
at t aa
AGATCTTGGTGTTACACACGTTCAGCTTTTGCCGATATTTGATTATGCTTCAGTAAATGAAGAGAATGTAAACGAACCACAATATAACTGGGGATATGATCCAAAAAACTTTAACGTACCAGAGGGGTCCTATTCTACAAATCCATACGA
AGAGCTCGGCGTCACCCACATCGAGGTTCTGCCCTTTCACGATTTTGCCGGAGTGGATGAGCTGTCTCCTGATCAATCT...TATAATTGGGGCTATAACCCCCTCCATTTTAATGCCCCGGAAGGAAGTTATTCGCTCGATCCGCAGAA
AGAGCTAGGCATTACACATGTAGAGCTTCTGCCGGTAAATGATTTTGCCGGAATTAATGAGGAGAAGCCGCTTGATGCT...TACAATTGGGGATATAACCCGCTTCATTTTTTTGCTCCGGAGGGAAGCTATGCCTCAAACCCTCATGA
AGAGCTTGGTGTGACACATGTGGAGCTTCTGCCGGTGAATGATTTTGCCGGAGTTGATGAAGAGAAGCCGCTTGATGCA...TACAATTGGGGATATAACCCGCTTCATTTCTTTGCCCCGGAGGGAAGCTATGCCTCAAATCCTCATGA
AGAGCTTGGTGTGACACATGTGGAGCTTCTGCCGGTGAATGATTTTGCCGGAGTTGATGAAGAGAAGCCGCTTGATGCA...TACAATTGGGGATATAACCCGCTTCATTTCTTTGCCCCGGAGGGAAGCTATGCCTCAAATCCTCATGA
AGAGCTTGGCGTTACACATATAGAACTTTTACCGTTAAACGATTATGCCGGAGTTGATGAAGAAAACCCACTTGCCGCC...TACAATTGGGGCTATAATCCGCTTCATTTTTTCGCCCCGGAGGGAAGCTATGCCTCCAATCCTCACGA
aga ct gg t ac ca t a tt t cc t
gatt tgc
a t atga
c
ta aa tgggg tat a cc
a tt
g cc ga gg
tat c
a cc a a
Bacillus_cereus
Bacillus_licheniformis
Bacillus_sipizinenii
Bacillus_subtilis_WY34
Bacillus_subtilis_PY22
BKpul
Consensus
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
82
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
1340
938
929
929
929
929
1190
791
782
782
782
782
1040
641
633
633
633
633
890
500
494
494
494
494
740
353
350
350
350
350
590
206
203
203
203
203
449
56
56
56
56
56
300
0
0
0
0
0
150
0
0
0
0
0

Enzimleri Nkleotid Baznda Karlatrlmas
83
GCCAACTGTTCGAATAACTGAATTAAAACAAATGATTCAAACACTACATGATAATAATCTTCGTGTTGTTATGGATGTAGTTTATAACCATATGTATAATGCTGCTGAATCTAATTTTCATAAGTTAGTTCCCGGTTATTATTATCGTTA
CCCCAAATGCAGAATCACCGAGCTGAAAACGATGATTCAGTCGCTGCACAAACACGGCTTCTCCGTGATTATGGATGCCGTATATAATCATGTGTACAAGAGGGAAACGTCCCCTTTTGAAAAAACGGTTCCCGGGTATTTTTTCAGACA
TCCTCAAACAAGAAAAACAGAGTTAAAACAAATGATCAAAACCCTTCATCAGCATGGACTGAGAGTTATTCTGGATGTCGTCTTTAATCACGTGTACGAGAGGGAGAATTCACCTTTTGAAAAGACAGTGCCAGGTTATTTTTTCCGGCA
TCCTCAAACGAGAAAAACAGAGCTGAAACAAATGATCAATACCCTGCATCAGCACGGTCTGCGAGTCATTCTGGATGTTGTTTTTAACCATGTGTATAAGAGGGAGAATTCCCCCTTTGAAAAGACAGTGCCCGGTTATTTTTTCCGGCA
TCCTCAAACGAGAAAAACAGAGCTGAAACAAATGATCAATACCCTGCATCAGCACGGTCTGCGAGTCATTCTGGATGTTGTTTTTAACCATGTGTATAAGAGGGAGAATTCCCCCTTTGAAAAGACAGTGCCCGGTTATTTTTTCCGGCA
CCCTCAGACAAGAAACACAGAAGTAAAACAAATGATTCACACCCTGCATCAGCATGGCCTGCGTGTCATTCTGGATGTTGTTTATAACCATGTATACCAAAGAGAGCACTCGCCCTTTGAAAAAACGGTGCCCGGTTATTTCTTCCGGCA
cc
gaa ac ga t aaa
atgat a c ct ca a a
t
gt tt tggatg gt t taa ca t ta a
g
tc
ttt a aa
gt cc gg tatt t
g a
CAATGAAGATGGAACATTTGCAAATGGAACCGGTGTAGGAAATGATACGGCTTCAGAAAGAAAAATGATGAGGAAATTTATGATAGATTCCGTCACATATTGGGCAAAAGAATACAATTTAGACGGATTCCGTTTTGATTTAATGGGTAT
TAATGAATACGGTTTTCCATCCGACGGAACAGGCGTCGGAAATGATATTGCTTCTGAGCGGCTGATGGTGCGAAAATATATTCTCGATTCTGTCCGCTATTGGCTGGAAGAATATGATGTCGACGGCATTCGTTTTGATTTAATGGGCAT
TGACGAATTTGGGATGCCGTCAAACGGCACCGGCGTTGGCAATGACATCGCGTCAGAAAGACGGATGGCAAGAAAATTCATAGCGGATTGCGTCATATACTGGATTGAGGAATACGATGCCGACGGCTTCCGCTTTGATCTGCTTGGCAT
CGACGAATGTGGGATGCCATCAAACGGCACCGGCGTTGGCAATGATATTGCATCAGAAAGAAGGATGGCAAGAAAATTCATTGCGGATTGCGTGGTCTATTGGCTTGAAGAATACAATGTTGACGGCTTCCGCTTTGATCTCCTCGGGAT
CGACGAATGTGGGATGCCATCAAACGGCACCGGCGTTGGCAATGATATTGCATCAGAAAGAAGGATGGCAAGAAAATTCATTGCGGATTGCGTGGTCTATTGGCTTGAAGAATACAATGTTGACGGCTTCCGCTTTGATCTCCTCGGGAT
TGATCAATTCGGGATGCCTTCAAATGGCACCGGCGTAGGGAATGACATCGCCTCAGAAAGGCGGATGGCAAGAAAATTCATTACGGATTGCGTTATGTATTGGGTGAAGGAATACGATGTCGACGGCTTCCGCTTTGATCTGCTCGGCAT
a aa
gg
c a gg ac gg gt gg aatga a gc tc ga g
atg
g aaat at
gatt gt
ta tgg
a gaata at
gacgg t cg tttgat t t gg at
TCATGATTATGAAACGATGAATGAAATACGTAAAGCTGTTAATCAAATTGACCCTTCTATTATACTGCATGGAGAAGGTTGGGATTTAAATACACCTCTTGCAGCAGAGTTGAAAGCAAATCAAAAAAATGCAGAGAAAATGAAAGGGAT
TCTTGATATTGAAACCGTCCGCCAAATCAGTACGCTTGCCGAGAATGTAAAGCCGGGCGTGCCTCTGTTCGGAGAGGGCTGGGATTTAAATACCCCGCTTGACAGCGGGCAAAAAGCAACATTGCAAAATGCCGGAAAAGTTCCGGCGGT
TTTAGATATTGATACAGTGCTTTATATGAAAGAAAAAGCAACTGCGGTAAAGCCTGGAATCCTGCTTTTTGGAGAAGGGTGGGATTTGGCGACACCTCTGCCGCAAGAACAAAAAGCGACCTTGGCGAACGCTACAAAAATGCCGGGCAT
TTTAGATATTGACACCGTGCTTTATATGAAAGAGAAAGCAACTAAGGCAAAGCCCGGAATCCTGCTTTTTGGAGAAGGGTGGGATCTGGCTACACCGCTGCCGCATGAACAGAAAGCTGCTTTGGCGAACGCGCCAAGAATGCCGGGCAT
TTTAGATATTGACACCGTGCTTTATATGAAAGAGAAAGCAACTAAGGCAAAGCCCGGAATCCTGCTTTTTGGAGAAGGGTGGGACCTGGCTACACCGCTGCCGCATGAACAGAAAGCTGCTTTGGCGAACGCGCCAAGAATGCCGGGCAT
TTTAGATATTGAAACGGTTCTTCATATGAAAGAAAAAGCATCTGAGGTAAAGCCCGGAATCCTTCTCTTTGGGGAAGGCTGGGATTTGGCAACACCGCTGCCGCCTGAACAGAAAGCGACATTGGCGAATGCATCGAAAATGCCGGGCGT
t
gat tga ac t
a at
g
a cc
t
ct
gg ga gg tggga t
ac cc ct
g
aaagc
aa gc
a a t
g
t
TGCTCATTTTAACGATAATATACGTGATGGATTAAAAGGTAGTGTATTTGAAGAGAAAGAAAATGGGTTTGTAAATGGAAAGGAACACATGGAAGACCGTATTAAAAAAGGTATTACCGCAGGCATTGACTATGATACAAATTCGTCGAC
CGGCTTTTTTAATGATCGGTTCAGGAACGCAGTCAAAGGGAGTACATTCGAGCTTAGCGACCGCGGATATGCTTTAGGGGACACCGGAAAAAAAGCGGCGCTTCAGCACGGTATTGCCGGTTCACCCGGAT...................
CGGTTTTTTTAATGATACGTTTCGTGATGCTGTGAAAGGGAACACCTTTCACCTCACGGCAGCGGGATTTGCGCTCGGAAACGGTGAGGCAGCGGAAACCGTTATGCACGGGATAGCCGGCTCTTCCGGATGGAAGGCATTAGCACCAAT
CGGCTTTTTTAATGATATGTTTCGTGACGCTGTAAAAGGGAACACCTTTCACCTTAAGGCAGCAGGGTTTGCGCTCGGCAGCAGTGAATCAGCACAAGCTGTGATGCATGGAATTGCCGGGTCTTCCGGATGGAAGGCATTAGCACCGAT
CGGCTTTTTTAATGATATGTTTCGTGACGCTGTAAAAGGGAACACCTTTCACCTTAAGGCAACAGGGTTTGCGCTCGGCAACGGTGAATCAGCACAAGCTGTGATGCATGGAATTGCCGGGTCTTCCGGATGGAAGGCATTAGCACCGAT
CGGTTTTTTTAATGATTCGTTTCGTGACGCTGTTAAAGGGAATACCTTTCATATCGCGGCGGCGGGTTTTGCCCTTGGGAACGGCGAACAAACGGAAACAGTCATGCGCGGGATTGCCGGATCTTCAGGATGGAAAGAGACAGCCCCGCT
g
ttttaa gat
t g a g
t aaagg a
tt a
g
gg t tg
gg
t
gg at ccg
g t
TTACCAAGATCCAGAGCAGGTACTAACGTATGTGGAAGCACATGATAATCATACATTATGGGATAAACTTGAGTTGACTAATCCAAGTGACAGTGAAGAAGTGCGAAAACAAATGCATAAATTATCTTCTTCGATTTTATTAACATCACA
..TCTTGCAGCCGGCACAGTCAATCAATTATGTGGAATGCCATGACAATCATACATTTTGGGATAAAATG.GCCTTATGTTT..TGAAGAAGATGCGGACACTAAACGGCTTAGGCAAAGGCTCGCGGTGTCGATCGTCCTGCTTTCGCA
TGTTCCTGAACCCAGCCAGTCCATCAATTATGTTGAGTCACACGACAATCACACCTTTTGGGATAAAATGGGCTTTGTGCTGTCTCAAGAAACTGATAGCCGAAAGAGAAGCAGGCAAAGGCTGGCAGCCGCGATTATCTTGCTTGCCCA
TGTTCCGGAACCAAGCCAGTCCATCAATTATGTCGAATCACACGACAATCACACCTTTTGGGATAAAATGAGCTTTGCGCTTCCTCAAGAAAATGACAGCCGAAAGCGAAGCAGGCAAAGGCTTGCAGCCGCGATTATTTTGCTTGCCCA
TGTTCCGGAACCAAGCCAGTCCATCAATTATGTCGAATCACACGACAATCACACCTTTTGGGATAAAATGAGCTTTGCGCTTCCTCAAGAAAATGACAGCCGAAAGCGAAGCAGGCAAAGGCTTGCAGCCGCGATTATTTTGCTTGCCCA
TGTGTCTGCGCCGAGCCAGTCCATCAATTATGTCGAGTCGCATGACAACCACACATTTTGGGATAAAATGAACCTCGCGCTTCCACAAGAAAGTGACAGCCGAAAGAGAAGCCGGCAAAAGCTGGCGACTGCAATCATTCTGCTGGCCCA
cc
cag
t a tatgt ga
ca ga aa ca ac tt tgggataaa t
t
ga
tg
gca a
t c
c at t t
c ca
AGGTATTCCGTTCTTACATGCGGGACAAGAGTTTATGCGCACGAAATATGGTGATCATAACAGTTACAAATCTCCAGATTCAATTAACCAGATGGACTGGTTGCGCCGTGCAACGTTTAATAATGAAGTGGATTATATGAAGGGTTTAAT
AGGCGTTCCATTTCTTCACGCCGGGCAGGAATTTTGCCGAACAAAGAATGGGGACAGCAACAGCTACAGGTCCGGAGATGACATCAATAAGCTTGATTGGGAAAAGCGTGCGGAGCTTTGCGAGGATGTCGAATATGTGCGCCAGCTGAT
AGGGGTGCCGTTCATTCATAGCGGACAGGAATTTTTCCGGACGAAGCAGGGAGTGGAAAACAGCTATCAATCCAGTGACAGCATCAACCAGCTGGATTGGGATCGGCGTGAAACGTTCAAAGAAGATGTTGACTATATCCGCAGGCTGAT
AGGGGTGCCGTTTATTCACAGCGGCCAGGAATTTTTCCGGACGAAGCAGGGAGTGGAAAACAGCTATCAATCCAGTGACAGCATCAACCAGCTCGACTGGGATCGCCGTGAAACATTCAAAGAAGATGTTCACTATATCCGCAGGCTGAT
AGGGGTGCCGTTTATTCACAGCGGCCAGGAATTTTTCCGGACGAAGCAGGGAGTGGAAAACAGCTATCAATCCAGTGACAGCATCAACCAGCTCGACTGGGATCGCCGTGAAACATTCAAAGAAGATGTTCACTATATCCGCAGGCTGAT
GGGAGTTCCGTTTATTCACAGCGGACAGGAATTTTTCCGGACGAAGCAGGGGGTGGAAAACAGCTACCAATCCAGTGACAGCATCAACCAGCTGGACTGGTCGCGGTGTGAAACATTCAAGCAGGATGTTAACTATGTTCACAGGCTGAT
gg t cc tt t ca
gg ca ga ttt
cg ac aa a gg g
aacag ta
tc
ga
at aa ag t ga tgg
gtg
t
a ga gt a tat t
t at
AGAATTACGCAAAAAGTACTCAGCTTTTCGAATGACATCTGCAGAGCAAATAAAAACACATGTATCATTTATTGATGCTCCGAAAAATACTATAGCTTATACAAT............AGAGGGGAATAAAAATGAATACTTTACGGTGGC
CCGGCTGCGAAGAAGCCATCCCGCTTTTCGTCTGCAAAAAGAGGAAGAAGTCAAGGAGCATCTTTCTTTTATGGACGGTACAGGAGAGGTAACGGCCTACAAGCTGAAGAACATTGCAGCAATTGATCCCTGGAACGAAATCATAGTGGT
TTCACTGAGAACAACGCATCCGGCATTTCGTCTCAATTCCTCTGTAGACATTCAGAGCCATCTTGAATGTTTAACGCTAAGAGAACACCTTATTGCCTACAGGCTTTATGATCTTAACGGGATCGACCAATGGGAAGACATCATCGTCAT
CTCGCTGAGAAAAGCGCATCCTGCATTCCGTCTTAGGTCCGCTGCAGACATCCAGCGCCATCTTGAATGCTTGACGCTAAAAGAACACCTTATCGCATACAGGCTTTATGATCTTGACGAGGTTGACGAATGGAAAGATATCATTGTTAT
CTCGCTGAGAAAAGCGCATCCTGCATTCCGTCTTAGGTCCGCTGCAGACATCCAGCGCCATCTTGAATGCTTGACGCTAAAAGAACACCTTATCGCATACAGGCTTTATGATCTTGACGAGGTTGACGAATGGAAAGATATCATTGTTAT
TTCGCTCAGAAAAGCGCATCCGGCATTCCGTCTTACGTCATCAGCCGATATTCAGCGCTGCCTTGAATGTCTGGCTCTCAAAGAGCACCTTATTGTATACCGGCTGTTTAACCTCGGCGCAGTCGACGAATGGGAAGAAATCATTGTCAT
t g a a
a c gc tt cg t
g
a t a
t
t
t
a
a g ta
t
g
a
a a t a gt
TCACAATGCAAATAGAGAAACTGTTGAAATAACACTTCCATCGAAAGGTCCTTGGAAAGTACTAGTAGACGGGAAGCAGGCGGGAAGTAAATCCCTTTATGTTGTGCATGACAATAAAATTAAAGTTCCTGCGTTAAGTTCATTTGTTTT
GCATTGTCCGTTTGCAAAAAAGGAGACGCTTAAGCTGCCCGATCAGAAACAGTACTTGCTGCACTGCGATCCTTTTACGTTCTTCAATGGGAAGGTTCAAGCGGAAAAAAGGCTTCGGCTGAACGGCATCGGGACCTATGTTTTATA...
TCATCACGCGAGTCCGGACTTCGTTGAATGGGAGCTGCCAAACGACAAAACGTACCGGCTTTTATGTGATACATCAGGTTTTCATCATGACCCGAAAGAAATCAAGAAAGCGGTTGCGGTAAACAGCATCGGAACGGTTATCTTATATTT
CCATCACGCGAGTCCAGACTCCGTCGAGTGGAGGCTGCCAAACGACATACCTTATCGGCTTTTATGTGATCCATCAGGATTTCAGGAAGACCCAACAGAAATCAAGAAAACGGTTGCAGTAAACGGCATCGGAACGGTTATCTTATATTT
CCATCACGCGAGTCCAGACTCCGTCGAGTGGAGGCTGCCAAACGACATACCTTATCGGCTTTTATGTGATCCATCAGGATTTCAGGAAGACCCAACAGAAATCAAGAAAACGGTTGCAGTAAACGGCATCGGAACGGTTATCTTATATTT
CCATCATGCCAGCCCTGATTCTGTTACATGGCAGCTGCCGAAAGATAAGGCTTACCGCCTTCTATGTGATACTGACGGGTTTCGTGCTGATTCTGGAGAAATCAAGAAAGCGGTTGCTGTAAACGGCATCGGAACGGTTATCTTATATTT
ca
c
a
g
ct cc
a
t
t
ga
a
a
t
t aa
g
t
tt
AAAAACAGA..GAAACCGATTAAATAA.
.....CGAACCAAAAGGGATTTTTTAG.
AGCATCAGATCTTAAGAGTTTTTCTTGA
AGCATCAGATCTTAAGAGTTTTGCTTGA
c a
aa g tt
t
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
Bacillus_cereus
BKpul
Consensus
2553
2133
2157
2157
2157
2157
2528
2111
2129
2129
2129
2129
2378
1964
1979
1979
1979
1979
2240
1814
1829
1829
1829
1829
2090
1664
1679
1679
1679
1679
1940
1519
1529
1529
1529
1529
1790
1388
1379
1379
1379
1379
1640
1238
1229
1229
1229
1229
1490
1088
1079
1079
1079
1079
ZGEM
Fidan ERDEN, 1987 ylnda Kdz. Erelide dodu. lkretim ve liseyi Kdz.
Erelide tamamlad. 2005 ylnda Akdeniz niversitesi Gda Mhendislii
Blmnde lisans renimine balad. 2010 ylnda Mhendislik Fakltesi ikincisi ve
onur rencisi olarak Gda Mhendisi nvan ile mezun oldu. Ayn yl Akdeniz
niversitesi Fen Bilimleri Enstits Gda Mhendislii Anabilim Dalnda Yksek
Lisans renimine balad. Halen bu kurumda renimine devam etmektedir.

Bacillus Sp. KAYNAKLI PULLULANAZ ENZİMİNİ KODLAYAN GENİN KLONLANMASI VE EKSPRESYONU ÜZERİNE ÇALIŞMALAR

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Bacillus Sp. KAYNAKLI PULLULANAZ ENZİMİNİ KODLAYAN GENİN KLONLANMASI VE EKSPRESYONU ÜZERİNE ÇALIŞMALAR

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

T.C.

Bacillus sp. KAYNAKLI PULLULANAZ ENZMN KODLAYAN GENN

YKSEK LSANS TEZ

Bacillus sp. KAYNAKLI PULLULANAZ ENZMN KODLAYAN GENN

Bu tez TBTAK Aratrma Destek Programlar Bakanl (ARDEB) tarafndan

Bacillus sp. KAYNAKLI PULLULANAZ ENZMN KODLAYAN GENN

YKSEK LSANS TEZ

Yrd. Do. Dr. Barn KARAKA (Danman)

Do. Dr. Mehmet NAN

Yrd. Do. Dr. Cengiz KTEN

JR: Yrd. Do. Dr. Barn KARAKA (Danman)

M.Sc. Thesis in Food Engineering

Pullulanase, Pichia pastoris, Bacillus sp., Recombinant protein

COMMITTEE: Asst. Prof Dr. Barn KARAKA (Supervisor)

Pullulanaz Enzimi Substrat Pullulan ............................................................ 2

Pullulanaz Enzimi ............................................................................................. 3

Pullulanaz Enziminin Kullanm Alanlar.......................................................... 4

Gda sanayisinde kullanm alanlar .............................................................. 4

Dier kullanm alanlar ................................................................................ 6

Pullulanaz Enzimi zerine Yaplan almalar ............................................... 6

Konuku Su Pichia pastoris ile Rekombinant Protein retimi ...................... 8

3. MATERYAL VE METOD ........................................................................................... 9

almada kullanlan bakteri ve maya sular.............................................. 9

almada kullanlan tayc plazmitler ...................................................... 9

Kimyasallar ve enzimler ............................................................................ 11

Temel molekler biyoloji yntemleri ........................................................ 11

Polimeraz zincir tepkimesi (PZR)...................................................... 12

Agaroz jel elektroforezi ..................................................................... 13

Ligasyon ve transformasyon .............................................................. 13

Plazmit izolasyonu ............................................................................. 14

PZR rnlerinin saflatrlmas .......................................................... 15

Jelden DNA paralarnn ekstraksiyonu ............................................ 15

SDS-PAGE ve Western blot analizi .................................................. 15

Southern blot analizi .......................................................................... 16

3.2.2. Dier biyokimyasal analizler .......................................................................... 18

Rekombinant proteinin saflatrlmas ............................................... 18

Pullulanaz aktivitesinin tayini ............................................................ 19

Rekombinant enzimin karakterizasyonu ............................................ 19

Hidroliz rnlerinin tayini ................................................................. 20

Toplam protein lm ...................................................................... 21

Yerel zolatlardan Pullulanaz Genini Klonlama almalar ......................... 22

PZR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ile genin amplifikasyon denemeleri 23

Southern blot yntemi ile genin izolasyonu denemeleri ............................ 26

Yeni primerlerle ve dier yerel bakteri izolatlarnda PZR denemeleri ...... 31

BK07 ve PY22 pullulanaz genlerinin izole edilerek klonlama (pJET1.2)

Konuku Pichia pastorise transformasyon ve pul+ klonlarn eldesi ......... 40

Seilen klonlar ile protein retimi ve proteinin saflatrlmas .................. 41

Enzim retimi iin optimum indksiyon sresinin belirlenmesi ............... 52

4.2.10. Enziminin optimum aktivite gsterdii pH deerinin belirlenmesi........... 53

Ek 8.2. Toplam Protein Miktarnn Hesaplanmasnda Kullanlan Standart Protein

Optik younluk (optical density)

Greceli santrifj kuvveti (relative centrifugal force, rcf)

Erime scakl (melting temperature)

Amerika Birleik Devletleri

Tamponlanm Karmak Gliserol Besiyeri (Buffered Glycerol Complex

Tamponlanm Karmak Metanol Besiyeri (Buffered Methanol Complex

nce Tabaka Kromatografisi

Poliakrilamid Jel Elektroforezi

Polimeraz Zincir Tepkimesi (PCR-Polymerase Chain Reaction)

Sodyum Dodesil Slfat

Tuzlu Sodyum Sitrat (Saline Sodium Citrate)

Maya Pepton Dekstroz (Yeast Peptone Dextrose)

Pullulann kimyasal yaps ............................................................................. 2