STRUCTURA

GENELOR
Conf. dr. E.V. GORDUZA
11

U.M.F IAI

1. GENA - UNITATE DE STRUCTUR A

MATERIALULUI GENETIC

un segment de cromozom,
precis delimitat,
continuu (indivizibil),
ocup o poziie fix,
numit locus*
determin un anumit caracter

GENA =

--------------------------* Plural = loci

GENA X
locus

CARACTER

Cromozom

Polialelie

U.M.F IAI

GENE ALELE. POLIALELIE

GENA

PROTEIN

mutaie 1

CARACTER

Culoarea ochilor
(ochi negri)

O gen (A) mai multe mutaii

diferite alele multiple (A1, A2, A3),
cu efecte fenotipice (N sau An)
Cromozom
limitate la acelai caracter.
Locusul ABO :
alele A1, A2, B i O

mutaie 2

Gene alele
M1

Variant / alel
normal

OCHI ALBATRI

O gen normal poate

suferi o mutaie * ce
produce o variant a
genei numit alel.
ALELA este o form
alternativ a genei.
- ocup acelai locus,
- influeneaz acelai
caracter*

M2

Variant / alel
anormal

ALBINISM OCULAR

U.M.F IAI

GENE ALELE. POLIALELIE

Un caracter (fenotip) va fi determinat

de o pereche de gene alele (genotip*)
situate n aceeai poziie (locus) pe
cromozomii omologi.
Genele alele segreg n meioz:
gameii (haploizi) sunt puri genetic
(posed o singur alel);
Genele alele situte pe o pereche de crz.
omologi (ex., Dd) segereg (n meioz)
independent de genele alele situate pe
alt pereche (ex., Mm) formndu-se
gamei cu combinaii genice diferite.
4

U.M.F IAI

HOMOZIGOT. HETEROZIGOT. HEMIZIGOT

Genele alele (N sau A), ce ocup loci omologi, pot fi :

identice (NN sau AA) HOMOZIGOT
diferite (Na sau An) HETEROZIGOT
( A1A2 )

HETEROZIGOI COMPUI

La brbaii XY o gen autozomal de pe X nu are echivalent pe

Y genotip HEMIZIGOT (XaY)

U.M.F IAI

DOMINANT. RECESIV. CODOMINANT

La heterozigoi, genele alele diferite

se pot manifesta fenotipic diferit,
n funcie de "fora" lor de expresie.
GenotipFenotip
Gena i caracterul care se
A1A1 A1
manifest la heterozigoi sunt
A1A2 A1
numite dominante.
Ex., Genele ABO
A1 o A1
Na caracter N
B B B
An caracter A
[(A1>A2)=B]>0
Gena (a sau n) care NU se
B o B
manifest la heterozigoi se
A1B A1B
numete recesiv;
A2B A2B
ea se exprim numai la
homozigoi (aa sau nn).
Dac ambele gene alele se
manifest fenotipic la heterozigoi
codominante
6

U.M.F IAI

2. FENOMENELE DE NLNUIRE GENIC (LINKAGE) I

NCRUCIARE CROMOZOMIAL (CROSSING-OVER)

Un cromozom = mai multe gene

nealele
- situate n loci distinci
- dispuse liniar ("n monom")
- determin caractere
Prezena a dou sau mai multe gene
distincte pe acelai cromozom se
numete SINTENIE.

gene
A

cromozom

U.M.F IAI

a). NLNUIREA GENIC (LINKAGE)

Genele nealele,
- situate foarte aproape una de alta pe
acelai cromozom,
- nu segreg (nu se separ) n meioz i
- se transmit mpreun (n bloc) de la
prini la descendeni.

meioz

Acest fenomen se numete NLNUIRE

GENIC ("linkage")
Fenomenul de nlnuire se refer la
LOCI i nu la alele.
Ex., locusul D (pentru o boal genetic)
este nlnuit cu un locus marker (ce are
variantele alelice M i m);
n unele familii alela D este nlnuit cu
alela M iar n altele D cu m.

gamei

U.M.F IAI

NLNUIREA GENIC (LINKAGE)

Genele dintr-o regiune cromozomial care se transmit

mpreun formeaz un grup de nlnuire sau un
HAPLOTIP.

U.M.F IAI

DEZECHILIBRUL DE NLNUIRE

Uneori o gen boal (B) se asociaz mai

frecvent cu o anumit alel a locusului
marker = asociere alelic preferenial
sau dezechilibru de nlnuire
Ex.: 85% dintre bolnavii cu hemocromatoz
ereditar (HE) din Europa au o mutaie
unic (n codonul 282 din gena HFE) care
se asociaz cu alela HLA A3
Explicaie: cei mai muli bolnavi cu HE
provin dintr-un strmo comun (efect de
fondator) care a avut gena mutant
asociat cu HLA A3

Hemocromatoza ereditar
Boal ereditar (AR)
frecvent, 1:400
Absorbie crescut de fier
ce produce acumulare
excesiv de fier n ficat
(ciroz), cord (insuficien
cardiac), pancreas
(diabet), piele
(pigmentaie bronzat),
glande endocrine.
Gena HFE pe cromozomul
6p lng gena HLA A
10

U.M.F IAI

APLICAII PRACTICE A FENOMENULUI DE NLNUIRE GENIC

Diagnosticul (prenatal sau presimptomatic) al

unor boli genetice
prin studiul transmiterii unei gene marker , uor de
identificat, nlnuit cu gena mutant (gena boal)

11

U.M.F IAI

Diagnosticul prenatal al unor boli genetice:

identificarea mutaiei (aa) la ft posibil dar

presupune cunoaterea prealabil a mutaiei la copilul
bolnav; laborioas i scump
studiul transmiterii unei gene marker , uor de
identificat, nlnuit cu gena mutant (gena boal)

gena pentru enzima 21 hidroxilaz (CYP21B) este localizat

pe cromozomul 6p i se transmite strns nlnuit cu gena B
a complexului HLA (gen marker cu mai multe alele)

12

U.M.F IAI

Transmiterea genei mutante pentru 21-hidroxilaz

ntr-o familie i diagnosticul molecular al bolii
(transmis AR) se pot stabili prin analiza genei
marker HLA-B, cu care gena mutant este strns
nlnuit.

U.M.F IAI

Valoarea diagnostic a nlnuirilor genice dintre un

locus boal i un locus marker a nceput s fie larg
utilizat dup 1980 prin folosirea markerilor ADN
polimorfici .

14

U.M.F IAI

b). NCRUCIARE CROMOZOMIAL (CROSSING-OVER)

nlnuirea genic NU este un
fenomen absolut numai
genele situate foarte aproape
una de alta se transmit totdeauna
mpreun, nlnuite.
Genele situate la distan una
de alta, pe acelai cromozom pot
fi separate prin fenomenul de
ncruciare cromozomial sau
crossing-over (n profaza
meiozei primare).

CO

Profaza
meioz I

Gamei
M

recombinani

15

U.M.F IAI

NCRUCIARE CROMOZOMIAL (CROSSING-OVER)

MECANISM CO:
- sinapsa (gen la gen) a
cromozomilor omologi (n zigoten);
- ncruciarea cromatidelor (chiasm);
- ruperea lor la locul de contact +
schimb EGAL de gene
- rezult o nou dispoziie a genelor
parentale = RECOMBINARE GENIC
OMOLOAG.
Recombinarea genic omoloag SURS
IMPORTANT DE VARIABILITATE.
16

U.M.F IAI

CARACTERISTICILE CO:
Recombinrile genice omologe,
produse n meioz prin CO, sunt
fenomene aleatorii i
imprevizibile;
frecvena de producere a CO ntre
dou gene/ loci este direct
proporional cu distana fizic
dintre ele; aplicaii n
cartografierea genic.
17

U.M.F IAI

IMPORTANA CUNOATERII

CO

CO INEGAL:
mperechere greit a unor secvene
asemntoare dar neomolage, situate
pe cromosomii omologi prin CO
schimbul inegal de segmente
deleii i duplicaii genice.
RECOMBINARE OMOLOAG NEALELIC
BOLI GENOMICE.

18

U.M.F IAI

B. CONCEPIA ACTUAL DESPRE

STRUCTURA GENEI
GENA = un ansamblu liniar de secvene
nucleotidice de ADN necesar pentru a produce
un produs funcional: un polipeptid sau o
molecul de ARN
Gena este o unitate de transcripie.
Genele :
segmente de ADN,
imprecis delimitate
divizibile = structur discontinu
ocup un locus distinct
19

U.M.F IAI

1. ANATOMIA UNEI GENE CARE CODIFIC PROTEINE

prezint o regiune central, transcris integral n ARN
mesager precursor, numit "cadrul de lectur" al
informaiei genetice necesar pentru sinteza proteinei;
flancat de dou pri laterale, ne transcrise, cu rolul de a
regla expresia genei

U.M.F IAI

ANATOMIA UNEI GENE CARE CODIFIC PROTEINE

1.1.REGIUNEA CENTRAL
transcris integral n ARN
mesager precursor (ORF*);
alternana de secvene
codante = exoni i
necodante = introni
ncepe cu:
- situsul de iniiere al
transcripiei (SIR sau
INR) i
- regiunea netrasnlat
5UTR ce conine i
codonul iniiator ATG
5-CCAGCCATG-3

U.M.F IAI

REGIUNEA CENTRAL A GENEI

EXONII
secvene transcrise
n pre ARNm i
pstrate n ARNm
matur.
Regiuni codante pt
anumite pti din
protein = domenii.

22

U.M.F IAI

REGIUNEA CENTRAL A GENEI

INTRONII
(secvene intercalante=IVS)
Secvene necodante
Transcrise iniial n preARNm i
apoi decupate precis i
ndeprtate din ARNm matur,
alctuit numai din asamblarea
exonilor (matisare)
ncep cu 5 GT i sfresc cu
AG 3 semnale pentru
decuparea precis*.
Rol puin cunoscut probabil n
matisarea alternativ (selecia
anumitor exoni)
23

U.M.F IAI

REGIUNEA CENTRAL A GENEI

Regiunea central se
termin cu o secven
3UTR necodant ce
conine:
Unul din codonii stop (TAA;
TAG, TGA)
Situsul de terminare al
transcripiei (AATAAA)
Situsul de poliadenilare
locul de desprindere a
moleculei de ARNm sintetizat
i adugare unui segment
poliadenilic (rol n stabilitatea
i transportul ei din nucleu)

24

U.M.F IAI

ANATOMIA UNEI GENE CARE CODIFIC

PROTEINE

1.2. REGIUNILE
LATERALE
Flancheaz regiunea
central (ORF)
Netranscrise
Rol de reglare a
transcripiei

U.M.F IAI

ANATOMIA UNEI GENE CARE CODIFIC

PROTEINE

a). Regiunea lateral 5'

(n amonte de ORF)
3 situsuri:

PROMOTOR
Situs de specificitate tisular
Situs de modulare a activitii genice

Servete la:
iniierea transcripiei
(fixarea ARN polimerazei)
reglarea anumitor gene n anumite
esuturi (specificitate tisular), n
anumite stadii de dezvoltare (specificitate
temporal) sau la anumite semnale /
stimuli din mediu
(ex. hormoni)
Reglarea intensitii transcripiei

U.M.F IAI

REGIUNEA LATERAL
5

PROMOTORUL conine mai multe

elemente sau module pe care se
ataeaz proteine reglatoare
(trans-activatoare) numite factori de
transcripie (TF II);
TF se fixeaz la miezul promotorului
(TATA; CAAT; GC) i are rolul s
fixeze, s poziioneze i s
activeze ARN polimeraza II, astfel
ca transcripia s nceap exact la
SIT, cu primul nucleotid (+1)
Ali TF regleaz specificitatea
tisular, rspunsul la semnale i
intensitatea transcripiei
27

U.M.F IAI

b. REGIUNEA LATERAL 3

Regiunea lateral 3' - situat n aval de cadrul de

lectur al genei.
o secven netranscris, imprecis delimitat i
cunoscut,
rol structural i funcional.
n aceast regiune se gsesc secvene semnal care
afecteaz procesarea, stabilitatea i durata de via a

ARNm.

28

U.M.F IAI

2. TIPURI DE GENE
2.1. Gene comune i gene
specifice
Gene comune - ubicuitare
(housekeeping genes)
Se exprim n toate celulele.
Codific proteine
indispensabile funciilor celulare
fundamentale.
Trasncripie continu, la nivel
sczut.

Gene specifice:
Expresie limitat spaial
(anumite esuturi / celule) sau
temporal (anumite stadii)
Codific proteine specifice

2.2. Gene unice i familii de gene

Majoritatea genelor sunt unice,
puine sunt duplicate
Unele copii ale genelor unice
sunt nefuncionale (gene
trunchiate; fragmente de gene;
pseudogene)
Familii de gene:
Au o structur identic
Produc proteine asemntoare
Au o origine comun (prin
duplicaia unei gene ancestrale

29

U.M.F IAI

C. METODE DE CLONARE I ANALIZ A GENELOR

(TEHNOLOGIA ADN)
Pn n 1970 genele erau entiti materiale inaccesibile analizei
directe :
dimensiuni foarte mici
imposibilitatea obinerii unei cantiti suficiente de material pentru
studiu.

Dup 1970 s-au descoperit:

enzimele de restricie, veritabile "bisturie" genetice, cu ajutorul crora
a devenit posibil secionarea ADN i izolarea genelor*.
tehnici de amplificare unui fragment specific de ADN = clonarea
genelor (celular sau acelular PCR)**.
tehnici de analiz i secveniere*
30

U.M.F IAI

TEHNOLOGIA ADN
a ianugurat era ingineriei
moleculare cu multiple i
importante aplicaii practice:
analiza structurii, cartografierii
lu funciei genelor;
elucidarea patogeniei bolilor
genetice i dobndite (infecii,
cancere);
diagnosticul bolilor:
preimplantator, prenatal,
presimptomatic;
biosinteza unor molecule
terapeutice (insulin, hormon de
cretere, eritropoietin etc)
tratamentul bolilor genetice i
terapia genic
31

U.M.F IAI

1. CLONAREA ADN
Clonarea ADN este amplificarea selectiv a unei
gene sau fragment de ADN prin multiple runde de
replicare care vor produce un numr mare de copii a
fragmentului respectiv, ce vor permit analiza structurii i
funciei sale.
2 tipuri majore de clonare:
Celular, in vivo, utilizeaz mecanismul natural de replicare
a unor fragmente de ADN obinute prin diferite metode i
introduse cu ajutorul unor vectori (plasmide, bacteriofagi,
cromozomi artificiali) n celule gazd (bacterii, levuri)
Acelular, in vitro, folosind o reacie de plomerizare n lan
(PCR)
32

U.M.F IAI

1.1. OBINEREA UNOR GENE SAU

FRAGMENTE DE ADN

Trei metode:
(1). Secionarea ADN
genomic, cu ajutorul
enzimelor de restricie;
Enzimele de restricie (Pr.
Nobel, 1978) recunosc i taie
ADN la nivelul unor secvene
nucleotidice specifice
(situsuri de restricie)
producnd fragmente de ADN
cu capete adezive.
33

U.M.F IAI

OBINEREA UNOR GENE SAU FRAGMENTE DE ADN

(2). Obinerea de ADN

complementar unei
molecule de ARNm, cu
ajutorul transcriptazei
inverse
Transcriptaza invers (Pr.
Nobel, 1975) sintetizeaz o
caten de ADNc pe baza unei
molecule de ARNm extras din
celule.
34

U.M.F IAI

OBINEREA UNOR GENE SAU FRAGMENTE DE ADN

(3). Sinteza artificial (chimic)

a unor fragmente de ADN
prin polmerizarea dezoxiribonucleotidelor ntr-o ordine
determinat anterior (de ex.,
pe baza secvenei de
aminoacizi i codului genetic).
Fragmentele de ADN vor fi
utilizate ca sonde sau amorse n
alte tehnici.
35

U.M.F IAI

1.2. CLONAREA ADN N CELULE

Clonarea ADN in vivo utilizeaz
mecanismul natural de replicare
al ADN n celule a unor segmente
de ADN introduse n celule cu
ajutorul unor vectori
formarea ADN recombinant,
prin ataarea in vitro a
fragmentelor de ADN uman la
"un vector sau replicon "
capabil de replicare
independent;
transferarea moleculelor de
ADN recombinant n celule
gazd, n care vectorul
recombinant se replic
independent de cromosomul
celulei gazd;
amplificarea sau producerea de
clone celulare multiple.
izolarea clonelor de ADN
recombinant.

36

U.M.F IAI

1.3. CLONAREA ACELULAR A ADN (metoda PCR)

Folosete tehnica "polymerase
chain reaction" (PCR) (Mullis i
Smith; Premiul Nobel, 1993)
se poate amplifica selectiv o
secven scurt de ADN sau ARN.
Amplificarea se realizeaz pe baza
principiului extensiei unei amorse
("primer").
PCR este o reacie n lan deoarece
catenele de ADN nou sintetizate
vor aciona ca matrie pentru
sinteza ADN n ciclurile urmtoare.
Amplificarea este considerabil (de
miliarde de ori) i rapid (n cteva
ore), fiind integral automatizat.

37

U.M.F IAI

2. METODE DE ANALIZ A ACIZILOR NUCLEICI

n medicina practic analiza direct a genei sau

produselor sale este folosit pentru:
studiul patologiei moleculare;
diagnosticul genotipic prenatal sau presimptomatic al
unor boli, chiar i atunci cnd gena i efectele ei nu sunt
cunoscute sau nu sunt evidente;
recunoaterea unei infecii virale.
38

U.M.F IAI

METODE DE ANALIZ A ACIZILOR NUCLEICI:

PRINCIPII

Pentru a identifica o gen este necesar o

sond genotipic adecvat care s permit:

fie recunoaterea genei (sonde directe)

fie recunoaterea unor markeri genotipici (secvene
necodante) situai n vecintatea genei (sonde
indirecte).

Aceast recunoatere se realizeaz pe principiul

hibridizrii moleculare a acizilor nucleici.
39

U.M.F IAI

METODE DE ANALIZ A ACIZILOR NUCLEICI:

PRINCIPII
Hibridizarea molecular se bazeaz pe capacitatea unor
sonde monocatenare de acid nucleic de a forma, pe
baz de complementaritate, molecule bicatenare cu o
secven de acid nucleic int (monocatenar).
Fragment ADN:
...T T A T A C G G T C A T C G T C G C A T G C T A G

A T* G C C A*G T A
Sond oligonucleotidic marcat

Pentru a identifica i izola hibridul molecular sonda este

marcat cu un trasor radioactiv (32P) sau cu un compus
fluorescent.
40

U.M.F IAI

METODE DE ANALIZ A ACIZILOR NUCLEICI:

TEHNICI
a).Analiza ADN genomic uman
prin metoda de transfer
Southern
b). Analiza cu sonde oligonucleotidice specifice unei
alele (ASO) (dot blot).
c). Analiza ARNm prin Northern
blot.
d). Analiza proteinelor prin
Western blot.
e) Secvenierea unor gene

41