Microb Aplic

Microbiologia Aplicada
Darlene Ana de Paula Vieira

Nayara Cludia de Assuno Queiroz Fernandes
INSTITUTO FEDERAL DE
EDUCAO, CINCIA E TECNOLOGIA
GOIS
Campus Inhumas
Inhumas - GO
2012
Presidncia da Repblica Federativa do Brasil

Ministrio da Educao
Secretaria de Educao Profissional e Tecnolgica
Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia de Gois
Este caderno foi elaborado em parceria entre o Instituto Federal de Educao,
Cincia e Tecnologia de Gois/IFG-Inhumas e a Universidade Federal de Santa
Maria para o Sistema Escola Tcnica Aberta do Brasil Rede e-Tec Brasil.
Equipe de Elaborao Instituto Federal de
Educao, Cincia e Tecnologia de Gois/
IFG-Inhumas
Reitor
Paulo Csar Pereira/IFG-Inhumas
Diretor Geral
Cleiton Jos da Silva/IFG-Inhumas
Coordenao Institucional
Daniel Aldo Soares/IFG-Inhumas
Coordenador de Curso
Rodrigo Cndido Borges/IFG-Inhumas
Professor-autor
Darlene Ana de Paula Vieira/IFG-Inhumas
Nayara Cludia de A. Queiroz Fernandes/IFG-Inhumas
Equipe Tcnica
Renata Luiza da Costa/IFG-Inhumas
Shirley Carmem da Silva/IFG-Inhumas
Viviane Margarida Gomes/ IFG-Inhumas
Comisso de Acompanhamento e Validao

Colgio Tcnico Industrial de Santa Maria/CTISM
Coordenador Institucional
Paulo Roberto Colusso/CTISM
Coordenao Tcnica
Iza Neuza Teixeira Bohrer/CTISM
Coordenao de Design
Erika Goellner/CTISM
Reviso Pedaggica
Andressa Rosemrie de Menezes Costa/CTISM
Francine Netto Martins Tadielo/CTISM
Marcia Migliore Freo/CTISM
Reviso Textual
Eduardo Lehnhart Vargas/CTISM
Lourdes Maria Grotto de Moura/CTISM
Vera Maria Oliveira/CTISM
Reviso Tcnica
Josiane Pacheco Menezes/CTISM
Ilustrao
Marcel Santos Jacques/CTISM
Rafael Cavalli Viapiana/CTISM
Ricardo Antunes Machado/CTISM
Diagramao
Gustavo Schwendler/CTISM
Leandro Felipe Aguilar Freitas/CTISM
Muren Fernandes Massia/CTISM
Ficha catalogrfica elaborada por Maria Aparecida Rodrigues de Souza

CRB 1/1497 bibliotecria do IFG Campus Inhumas
Vieira, Darlene Ana de Paula
V658m Microbiologia Aplicada / Darlene Ana de Paula Veira, Nayara
Cludia de Assuno Queiroz Fernandes. Inhumas: IFG;
Santa Maria: Universidade Federal de Santa Maria, 2012.
90 p. : il.
Bibliografia.
Caderno elaborado em parceria entre o Instituto Federal
de Educao, Cincia e Tecnologia de Gois/IFG-Inhumas e a
Universidade Federal de Santa Maria para o Sistema Escola
Tcnica Aberta do Brasil e-Tec Brasil.
1. Microbiologia Aplicada. 2. Acar Processo de Produo.
3. lcool Processo de Produo. 4. Fernandes, Nayara Cludia
de Assuno Queiroz. I. Ttulo.
CDD 660.62
Apresentao e-Tec Brasil

Prezado estudante,
Bem-vindo ao e-Tec Brasil!
Voc faz parte de uma rede nacional pblica de ensino, a Escola Tcnica
Aberta do Brasil, instituda pelo Decreto n 6.301, de 12 de dezembro
2007, com o objetivo de democratizar o acesso ao ensino tcnico pblico,
na modalidade a distncia. O programa resultado de uma parceria entre
o Ministrio da Educao, por meio das Secretarias de Educao a Distncia
(SEED) e de Educao Profissional e Tecnolgica (SETEC), as universidades e
escolas tcnicas estaduais e federais.
A educao a distncia no nosso pas, de dimenses continentais e grande
diversidade regional e cultural, longe de distanciar, aproxima as pessoas ao
garantir acesso educao de qualidade e ao promover o fortalecimento
da formao de jovens moradores de regies distantes dos grandes centros
geograficamente ou economicamente.
O e-Tec Brasil leva os cursos tcnicos a locais distantes das instituies de
ensino e para a periferia das grandes cidades, incentivando os jovens a concluir o ensino mdio. Os cursos so ofertados pelas instituies pblicas de
ensino, e o atendimento ao estudante realizado em escolas-polo integrantes das redes pblicas municipais e estaduais.
O Ministrio da Educao, as instituies pblicas de ensino tcnico, seus
servidores tcnicos e professores acreditam que uma educao profissional
qualificada integradora do ensino mdio e educao tcnica, capaz
de promover o cidado com capacidades para produzir, mas tambm com
autonomia diante das diferentes dimenses da realidade: cultural, social,
familiar, esportiva, poltica e tica.
Ns acreditamos em voc!
Desejamos sucesso na sua formao profissional!
Ministrio da Educao
Janeiro de 2010
Nosso contato
etecbrasil@mec.gov.br
e-Tec Brasil
Indicao de cones
Os cones so elementos grficos utilizados para ampliar as formas de
linguagem e facilitar a organizao e a leitura hipertextual.
Ateno: indica pontos de maior relevncia no texto.
Saiba mais: oferece novas informaes que enriquecem o

assunto ou curiosidades e notcias recentes relacionadas ao
tema estudado.
Glossrio: indica a definio de um termo, palavra ou expresso
utilizada no texto.
Mdias integradas: sempre que se desejar que os estudantes
desenvolvam atividades empregando diferentes mdias: vdeos,
filmes, jornais, ambiente AVEA e outras.
Atividades de aprendizagem: apresenta atividades em
diferentes nveis de aprendizagem para que o estudante possa
realiz-las e conferir o seu domnio do tema estudado.
e-Tec Brasil
e-Tec Brasil
Tecnologia da Informtica
Sumrio
Palavra do professor-autor
Apresentao da disciplina
11
Projeto instrucional
13
Aula 1 Tcnicas bsicas utilizadas em microbiologia

1.1 Normas de segurana e de conduta em laboratrio
15
15
1.2 Materiais e equipamentos usados em laboratrio de microbiologia

17
1.3 Tcnicas de esterilizao e desinfeco de materiais
20
Aula 2 Importncia da microbiologia no processo de produo 23

2.1 Microbiologia na indstria de acar e lcool
23
2.2 Etapas do processamento industrial da cana-de-acar 24
2.3 Anlises rotineiras durante o processamento
27
Aula 3 Microrganismos relevantes em processos industriais de

produo de acar e lcool
31
3.1 Leveduras Saccharomyces
31
3.2 Microrganismos contaminantes
32
3.3 Antibiticos e bactericidas
35
Aula 4 Meios de cultura

4.1 Classificao dos meios de cultura
4.2 Preparo de meios de cultivo
39
39
41
Aula 5 Tcnicas de colorao e de contagem microbiolgica 47

5.1 Tcnicas de colorao de microrganismos
47
5.2 Tcnicas bsicas de contagem microbiolgica
49
Aula 6 Mtodos microbiolgicos aplicados produo de lcool 55

6.1 Leveduras
55
6.2 Bactrias
60
6.3 Dextrana em caldo
65
6.4 Delta pH
67
e-Tec Brasil
6.5 Acidez sulfrica
67
6.6 Nvel de floculao
67
6.7 Teste de sensibilidade de bactrias a antimicrobianos
68
Aula 7 Microbiologia do acar

7.1 A importncia da microbiologia do acar
73
73
7.2 Principais microrganismos relacionados ao processo de fabricao do acar

74
7.3 Anlises microbiolgicas
79
7.4 Padres internacionais para o controle microbiolgico do

acar
85
e-Tec Brasil
Referncias
87
Currculo do professor-autor
89
Palavra do professor-autor
Caro aluno!
O processo de ensinar e aprender na modalidade de ensino distncia apresenta suas prprias peculiaridades, pressupondo-se uma relao de reciprocidade, na qual o aluno deve participar de forma ativa e dinmica. Este material de estudo representa, portanto, um canal de comunicao elaborado
com a finalidade de auxiliar e apontar caminhos para que voc, estudante,
possa conduzir seus prprios estudos e construir novos conhecimentos.
Nele foram apresentadas informaes bsicas sobre Microbiologia Aplicada
e as principais tcnicas voltadas produo de acar e lcool, visando fornecer subsdios para o seu aprendizado e atuao profissional.
Cabe voc, como protagonista na construo do seu prprio conhecimento, se empenhar na busca incessante e atualizao das informaes
adquiridas, no se atendo somente ao contedo e atividades propostas,
mas interagindo e ampliando as idias e conceitos formados. Para isso, voc
poder explorar as diferentes mdias propostas no ambiente virtual. Aproveite bem e bons estudos!
Um forte abrao.
As autoras.
e-Tec Brasil
Apresentao da disciplina
Este caderno de estudos foi elaborado com o intuito de fornecer a voc, estudante, conceitos e tcnicas importantes na rea da Microbiologia Aplicada
produo de acar e lcool. Para tornar a exposio dos contedos mais
clara e organizada, o material foi dividido em aulas, tratando inicialmente
dos princpios bsicos da microbiologia em laboratrio e em seguida das
tcnicas especficas aplicadas indstria sucroalcooleira, facilitando assim os
seus estudos.
A aula 01 fornece noes e regras bsicas de segurana em laboratrio.
Apresenta os principais materiais e equipamentos utilizados nesse ambiente
de trabalho e as formas de limpeza e desinfeco.
Na aula 02 foram apresentadas, resumidamente, as principais etapas do
processamento da cana-de-acar. Assim, o estudante poder compreender
como a microbiologia pode ser aplicada nos processos de produo de acar e lcool.
A aula 03 apresenta os microrganismos comuns ao processo fermentativo e
os seus contaminantes. Nela tambm falamos sobre antibiticos e bactericidas, que so utilizados para tratamento das infeces na fermentao.
Para que o aluno possa entender melhor cada tcnica a ser utilizada, as aulas
04 e 05 falam sobre meios de cultivo, formas de visualizao e mtodos de
contagem de microrganismos, respectivamente.
Para concluir, as aulas 06 e 07 tratam especificamente das tcnicas utilizadas para o monitoramento microbiolgico na indstria de acar e lcool,
visando garantir a qualidade dos produtos finais.
11
e-Tec Brasil
Palavra instrucional
Projeto
do professor-autor
Disciplina: Microbiologia Aplicada (carga horria: 60h).
Ementa: Procedimentos bsicos de anlises microbiolgicas aplicadas ao processo de acar e lcool. Testes de seleo de antibiticos e bactericidas. Tcnicas de verificao das reas do processo.
CARGA
HORRIA
(horas)
AULA
OBJETIVOS DE
APRENDIZAGEM
1. Tcnicas bsicas
utilizadas em
microbiologia
Compreender a importncia das

normas de segurana em laboratrio
e identific-las.
Conhecer os principais materiais
utilizados em laboratrio de
microbiologia.
Compreender a importncia da utilizao
de medidas de higiene e limpeza em
laboratrio, reconhecendo as principais
tcnicas utilizadas.
Ambiente virtual:
plataforma moodle.
Apostila didtica.
Recursos de apoio: links,
exerccios.
05
2. Importncia
da microbiologia
no processo de
produo
Apresentar noes do processo de

produo de acar e lcool.
Compreender a importncia e aplicao
da microbiologia nas diversas etapas de
produo de acar e lcool.
Ambiente virtual:
plataforma moodle.
Apostila didtica.
exerccios.
10
3. Microrganismos
relevantes em processos industriais
de produo de
acar e lcool
Apresentar os microrganismos presentes

nos processos de produo de lcool.
Identificar os principais contaminantes
dos processos fermentativos.
Apresentar o uso de antibiticos e
bactericidas na fermentao.
Ambiente virtual:
plataforma moodle.
Apostila didtica.
exerccios.
10
4. Meios de cultura
Definir meios de cultivo e apresentar

noes dos principais tipos existentes.
Caracterizar os diferentes meios de
cultura e a finalidade de cada um.
Apresentar o preparo de meios de
cultivo importantes utilizados nos
processos industriais de produo de
lcool e suas aplicaes.
Ambiente virtual:
plataforma moodle.
Apostila didtica.
exerccios.
05
5. Tcnicas de
colorao e de
contagem
microbiolgica
Conhecer as principais tcnicas de

colorao de microrganismos.
Conhecer a tcnica de colorao de
Gram e sua aplicao.
Conhecer as tcnicas bsicas de
contagem microbiolgica.
Ambiente virtual:
plataforma moodle.
Apostila didtica.
exerccios.
05
MATERIAIS
13
e-Tec Brasil
AULA
e-Tec Brasil
OBJETIVOS DE
APRENDIZAGEM
MATERIAIS
CARGA
HORRIA
(horas)
6. Mtodos
microbiolgicos
aplicados
produo
de lcool

monitoramento microbiolgico no
processo industrial de produo de
lcool, seus objetivos e aplicaes.
Apresentar os principais testes de
deteco de bactrias e leveduras
contaminantes, testes de sensibilidade
de bactrias a antimicrobianos,
caracterizao de Bacillus e Lactobacillus,
entre outros procedimentos.
Ambiente virtual:
plataforma moodle.
Apostila didtica.
exerccios.
15
7. Microbiologia
do acar
Conhecer os principais microrganismos

contaminantes do acar, suas
caractersticas e importncia.
anlises de bactrias, leveduras e
bolores em acar.
Apresentar os padres microbiolgicos
nacionais e internacionais para
qualidade do acar.
Ambiente virtual:
plataforma moodle.
Apostila didtica.
exerccios.
10
14
Aula 1 Tcnicas bsicas utilizadas em

microbiologia
Objetivos
Compreender a importncia das normas de segurana em laboratrio e identific-las.
Conhecer os principais materiais utilizados em laboratrio de microbiologia.
Compreender a importncia da utilizao de medidas de higiene e
limpeza em laboratrio, reconhecendo as principais tcnicas utilizadas.
1.1 Normas de segurana e de conduta em

laboratrio
O laboratrio de microbiologia deve ser considerado como um local sujeito
a possveis fontes de contaminao, bem como aos mais variados tipos de
acidentes envolvendo materiais, substncias qumicas e microrganismos,
representando, portanto, um risco em potencial para todos os envolvidos no
trabalho e manuseio. Para minimizar tais riscos fundamental que se tomem
medidas preventivas e que se conhea bem o ambiente de trabalho, para
que os acidentes possam ser evitados ou controlados. Portanto, comearemos os nossos estudos apresentando as principais normas de segurana, os
materiais mais frequentemente usados em laboratrio de microbiologia e as
formas de limpeza e desinfeco.
Algumas regras importantes devem ser observadas no exerccio do trabalho
em laboratrio:
a) No consumir alimentos e bebidas no laboratrio.
b) No fumar no laboratrio.
c) O laboratrio deve ser mantido limpo e em ordem, devendo ser dele retirados quaisquer materiais que no tenham relao com o trabalho. Livros
e outros objetos nunca devem ser deixados sobre a bancada de trabalho.
Aula 1 - Tcnicas bsicas utilizadas em microbiologia
15
e-Tec Brasil
d) Usar obrigatoriamente jaleco no laboratrio, abotoado ou fechado, de

maneira a cobrir a maior parte do corpo.
e) Lavar cuidadosamente as mos antes e depois do trabalho prtico.
f) No levar boca o material de trabalho (lpis, canetas, etc.) e evitar colocar as mos na boca, nos olhos e no nariz.
g) Limpar as bancadas de trabalho com lcool a 70% antes e depois do
trabalho prtico.
h) Usar os equipamentos do laboratrio apenas para seu propsito designado.
i) Proteger o cabelo da chama do bico de Bunsen e de contaminao microbiana.
j) Nunca pipetar ou sugar diretamente com a boca materiais perigosos,
biolgicos, custicos, txicos, radioativos ou cancergenos. Para pipetar,
usar pipetadores de borracha ou automticos.
k) Transportar os meios de cultura nos suportes prprios.
l) Colocar o material contaminado (pipetas, esptulas, lminas e lamnulas) aps a sua utilizao em recipientes prprios contendo desinfetante,
para depois ser efetuada a lavagem e esterilizao dos mesmos.
m) Relatar imediatamente ao responsvel pelo laboratrio qualquer acidente que provoque leso corporal ou que origine derrame dos microrganismos para fora dos respectivos meios de cultura.
n) Aps a quebra de qualquer recipiente contendo microrganismos, cobrir
imediatamente o local com soluo desinfetante e toalhas de papel, deixando agir, por no mnimo, 15 minutos.
o) No final da atividade, o local de trabalho deve ficar devidamente limpo
e arrumado.
e-Tec Brasil
16
1.2 Materiais e equipamentos usados em

laboratrio de microbiologia
Autoclave aparelho usado para esterilizao de meios de cultura, lquidos,
etc., atravs do calor mido.
Cmara de fluxo laminar remove as impurezas do ar por meio de um
filtro absoluto. Aps filtrado e puro, o ar dirigido sobre a rea de trabalho
em fluxo direto, mantendo as condies de esterilidade.
Banho-maria forma geralmente usada para aquecimento brando (at
100C), em que se utiliza um lquido em ebulio.
Estufa de incubao cmara de incubao para colnias de microrganismos.
Estufa de esterilizao tipo de forno utilizado para esterilizao, dessecao ou secagem.
Balana analtica usada para se obter massas de slidos e lquidos com
alta exatido.
Bico de Bunsen um bico de gs, alimentado por um tubo de borracha,
fixado em uma base metlica com entrada de ar, cuja chama utilizada para
tcnicas de flambagem e esterilizao de materiais contaminados.
Vidrarias Erlenmeyer, proveta, balo volumtrico, bquer, pipetas graduadas, bureta, placas de Petri, tubos de ensaio, lminas e lamnulas.
Outros agitador para tubos; contador de colnias; exaustor; centrfuga;
destilador de gua; lavador de pipetas; potencimetro; refrigerador; ala de
Drigalski; etc.
Microscpio ptico utilizado em observao de imagem ampliada at
centenas de vezes por meio de dois conjuntos de lentes: as objetivas, que
ficam prximas do objeto, e ampliam a imagem real; e as oculares, prximas do olho do observador, que ampliam a imagem novamente. constitudo por duas partes uma parte mecnica e uma parte ptica. Cada parte
engloba uma srie de componentes constituintes do microscpio. A parte
mecnica (Figura 1.1) serve para dar estabilidade e suportar a parte ptica.
constituda por base ou p, parafusos macro e micromtricos, haste ou
brao, mesa ou platina, charriot, presilha, tambor ou revlver das objetivas
17
e-Tec Brasil
e canho. A parte ptica (Figura 1.1) constituda por fonte de iluminao,

lente condensadora ou condensador, boto do condensador, diafragma e
pelas lentes oculares e objetivas o conjunto de lentes que permitem a
ampliao do objeto. A ampliao dada ao microscpio igual ao produto
da ampliao da objetiva pela ampliao da ocular. Devido a estes componentes serem de alta preciso e porque o microscpio um instrumento
caro, requer cuidados especiais de transporte, utilizao e manuteno.
Figura 1.1: Partes do microscpio ptico

Fonte: CTISM
e-Tec Brasil
18
Cmara de Neubauer em microbiologia, comum o uso da cmara de

Neubauer, tambm conhecida por lmina hematimtrica ou hemacitmetro. utilizada na contagem de microrganismos visveis ao microscpio
ptico, de forma precisa e rpida na quantificao de clulas de leveduras,
esporos, bactrias e outras partculas. uma lmina especial de microscopia,
mais espessa que uma lmina normal, com marcaes em quadrantes, precisamente divididos em 9 quadrados de 1 mm2 de rea. Como a rea de cada
quadrado de 1mm2, a rea total compreendida pelos 9 quadrados de 9
mm2. Ao se cobrir a lmina com uma lamnula, formado um volume sobre
cada quadrado, de 0,1 mm3.
O quadrado central dividido em 25 quadrculos de 0,2 mm de lado ou
superfcie 0,04 mm2. Estes quadrculos esto subdivididos em 16 retculos de
0,0025 mm2 de superfcie, sendo os quadrculos separados por linhas trplices,
chegando-se assim aos 400 retculos.
Observando-se ao microscpio, percebe-se que existem trs tipos de quadrantes, com subdivises de tamanhos diferentes, denominados A, B e C, e que
juntos formam um quadrado maior (Figura 1.2). O critrio utilizado na escolha
do quadrante a ser utilizado na contagem, deve ser o tamanho dos microrganismos que sero quantificados. Assim, microrganismos muito pequenos
so contados no quadrante C, os de tamanho intermedirio no quadrante B,
enquanto os grandes so contados no quadrante A.
Para saber mais sobre contagem

de clulas em cmara de
Neubauer, acesse:
http://bervieira.sites.uol.com.br/
neubauer.htm
Figura 1.2: Lmina hematimtrica ou cmara de Neubauer

Fonte: CTISM
19
e-Tec Brasil
1.3 Tcnicas de esterilizao e desinfeco

de materiais
Em microbiologia importante a esterilizao de meios, solues e material de vidro ou metal que se utiliza. Um produto microbiologicamente
estril quando no contm nenhuma forma de microrganismo vivo. Para
tal objetivo podem ser utilizados tanto meios fsicos (como calor, radiaes
ionizantes e filtrao), como agentes qumicos, (como gs, xido de etileno,
lcool etlico a 70%, etc.).
esterilizao
Destruio ou remoo de todas
as formas de vida, inclusive
esporos, atravs de agentes
fsicos ou qumicos.
desinfeco
Processo que promove a inibio,
morte ou remoo de vrios
microrganismos, na forma
vegetativa, (patognicos ou no)
em objetos inanimados, sem
eliminar todas as formas de vida.
O calor um dos agentes fsicos mais prticos e eficientes utilizados em

tcnicas de esterilizao e/ou desinfeco. O calor pode ser empregado
por meio do controle do tempo e da temperatura, sob duas formas: seco e
mido.
1.3.1 Calor seco

Incinerao processo drstico de eliminao de microrganismos, que destri o produto.
Ao rubro processo onde os materiais so levados incandescncia, promovendo a destruio de todos os microrganismos.
Flambagem processo onde o material submetido diretamente ao fogo,
seja seco ou embebido em lcool. Bastante utilizado na desinfeco de alas
de vidro.
Estufa esterilizante amplamente utilizado para vidrarias e outros materiais, submetidos determinada temperatura.
Por meio da utilizao do bico de Bunsen, atravs do calor seco, pode-se
proceder esterilizao mantendo-se a pea na chama at se tornar incandescente. As bocas de frascos de vidro contendo os meios de cultura, devem
sempre que destapados ser chamuscados chama do Bunsen, por meio da
tcnica de flambagem, sem deixar que se tornem rubros. A esterilizao por
calor seco pode se dar ainda por exposio prolongada numa estufa a 160C
por no mnimo 45 minutos, a 170C por 18 minutos ou 180C por 7 minutos
e meio. Este tipo de esterilizao utilizada para vidrarias, metais, placas de
Petri, etc., mas no muito efetivo contra bactrias e fungos que produzem
esporos resistentes secura.
e-Tec Brasil
20
1.3.2 Calor mido

Outra forma de esterilizao pode-se dar atravs do uso da autoclave, para
meios contaminados com culturas de bactrias. Utiliza-se este tipo de esterilizao pelo calor mido para meios de cultura e diversas solues. Seu
funcionamento se d semelhantemente ao da panela de presso, no qual
a gua ferve sob presso de 1,0 atm, sendo a temperatura necessria para
esterilizao de 121C, e o tempo de esterilizao de cerca de 15 a 30 minutos. O calor mido inativa as bactrias por desnaturao das protenas e
cidos nuclicos, enquanto o calor seco provoca a oxidao destas. O vapor
dgua tem maior poder de penetrao do que o ar, tendo maior capacidade
de rompimento das pontes de hidrognio. Devido a isso, o calor mido pode
ser considerado um processo mais eficiente do que o calor seco.
Placas de Petri de plstico com culturas, bem como outro material de plstico
utilizado, aps autoclavagem devem ser colocados em sacos de plstico e
enviados para incinerao. Vidrarias contaminadas, por sua vez, aps autoclavagem devem ser lavadas com detergente neutro, rigorosamente enxaguadas, passando por gua destilada e secadas em estufa. Para limpeza
de materiais de vidros difceis de serem limpos com solventes orgnicos,
utiliza-se soluo sulfocrmica (soluo de bicromato de potssio a 3% +
cido sulfrico concentrado).
As pipetas de vidro utilizadas no laboratrio devero ser imersas em lquido
desinfetante e posteriormente lavadas e autoclavadas.
Alguns instrumentos como tesouras, pinas, etc., podem ser desinfetados
mergulhando-os em lcool a 70% (70 ml de etanol absoluto e 30 ml de
gua destilada). As bancadas tambm podem ser desinfetadas utilizando-se
este produto.
Para saber mais sobre materiais

e equipamentos de laboratrio,
sua limpeza e desinfeco,
acesse:
http://recife.ifpe.edu.br/recife/
manual_microbiologia_5_
ed_2007_final.pdf
Em condies ideais, o laboratrio deve ser isolado, ou ento o trabalho

dever ser realizado dentro de uma cmara de fluxo laminar.
Resumo
Nessa aula, estudamos alguns aspectos bsicos envolvidos em um laboratrio de microbiologia, como: as principais normas de conduta e regras de
segurana, os materiais e equipamentos utilizados nesse ambiente e as formas de limpeza e desinfeco de materiais. A fixao desses conceitos
21
e-Tec Brasil
importante para o desenvolvimento de um bom trabalho no laboratrio,

minimizando assim os riscos de acidentes e garantindo a eficincia das prticas e de seus resultados.
Atividades de aprendizagem
1. Fale sobre a importncia de se observar normas de conduta no ambiente
de trabalho do laboratrio de microbiologia.
2. Cite cinco medidas de segurana a serem seguidas em laboratrio.
3. Cite cinco materiais utilizados em laboratrio e descreva suas aplicaes.
4. Diferencie esterilizao e desinfeco.
5. Quais as formas que o calor pode ser utilizado para esterilizao e desinfeco de materiais? Exemplifique.
6. Qual forma de utilizao do calor pode ser considerada mais eficiente?
Explique.
e-Tec Brasil
22
Aula 2 Importncia da microbiologia

no processo de produo
Objetivos
Apresentar noes do processo de produo de acar e lcool.
Compreender a importncia e aplicao da microbiologia nas diversas
etapas de produo de acar e lcool.
2.1 Microbiologia na indstria de acar e

lcool
O caldo de cana utilizado como matria-prima na produo de acar e
lcool normalmente apresenta uma ampla e variada microbiota, devido
associao de caractersticas consideradas fundamentais para o desenvolvimento da maioria dos microrganismos, como: alto teor de nutrientes orgnicos e inorgnicos, gua, pH e temperatura favorveis.
No entanto, no decorrer de todas as etapas do processamento da cana o
nmero de bactrias no caldo pode aumentar significativamente. Vrios fatores podem influenciar nesse processo como: a qualidade da matria-prima
(cana), o tempo prolongado entre o corte e a moagem, o tempo de queima,
a forma de colheita, que pode ser manual ou mecanizada, determinando a
quantidade de terra agregada, o armazenamento, as condies e variaes
climticas, e at mesmo a falta de higienizao nos equipamentos que ficam
em contato com o caldo. Durante essas etapas, a cana pode sofrer leses
que favorecem a penetrao de microrganismos nos colmos, agravando o
problema.
Essa contaminao do mosto, embora muito comum, consiste em um problema srio nas usinas de acar e lcool, que pode representar reduo
no rendimento e na produtividade da fermentao. Isso ocorre devido
formao de diversos compostos indesejveis provenientes do metabolismo
desses microrganismos, com degradao da sacarose e formao de cidos orgnicos que ocasionam perda de acar e intoxicao das leveduras,
alm da perda do rendimento do lcool produzido, representando prejuzos
importantes para a indstria.
Aula 2 - Importncia da microbiologia no processo de produo
23
mosto
Lquido apto a ser fermentado.
sacarose
Dissacardeo (acar) composto
por duas molculas de acar
simples (glicose + frutose).
Basicamente, a sacarose o
principal componente da
cana-de acar.
e-Tec Brasil
sanitizao
Processo que leva reduo dos
microrganismos, a nveis seguros,
de acordo com os padres de
sade pblica (elimina 99,9%
das formas vegetativas).
O laboratrio de microbiologia dentro da usina de acar e lcool tem,

portanto, um papel fundamental no controle de qualidade, desde a matria-prima at o produto final. Por meio de tcnicas adequadas, possvel
minimizar perdas, prever e solucionar eventuais acidentes no processo de
fermentao (infeco, morte de leveduras, floculao, etc.), avaliar as caractersticas do fermento utilizado nas dornas, manter a limpeza e sanitizao
durante todas as fases de processamento, realizar testes microbiolgicos nos
produtos finais (acar e lcool), contribuindo assim para o aumento na
qualidade e rendimento do processo industrial.
2.2 Etapas do processamento industrial da

cana-de-acar
Atualmente predomina no Brasil, entre as usinas mais avanadas, um modelo
de produo simultnea de etanol e acar, a partir da mesma matria-prima:
a cana-de-acar.
Figura 2.1: Fluxograma de produo de acar e lcool

Fonte: CTISM
e-Tec Brasil
24
2.2.1 Produo do acar

O processo de industrializao de acar dividido basicamente em trs
etapas. Primeiro: a cana-de-acar processada para extrao do caldo.
Segundo: o caldo filtrado para remover qualquer impureza e fervido at o
acar cristalizar, formando um xarope espesso. Terceiro: o xarope passado
em uma centrfuga que produz acar bruto e melao. O acar bruto refinado, seco e embalado. A partir da, o melao pode seguir a via de produo
de etanol.
Seguem abaixo as principais etapas do processamento industrial da canade-acar:
Lavagem da cana lavagem da cana antes do processamento para
retirar impurezas.
Extrao do caldo moagem ou difuso para extrao do caldo da
cana atravs do esmagamento por cilindros compressores.
Peneiramento do caldo separao de slidos insolveis existentes no
caldo.
Tratamento trmico processo de aumento da temperatura do caldo
para promover a floculao de impurezas.
Evaporao constitui o primeiro estgio de concentrao do caldo
proveniente da etapa de tratamento, que contm cerca de 85% de gua.
A evaporao tem como objetivo reduzir essa porcentagem para aproximadamente 40%. O caldo concentrado chamado de xarope.
Cozimento uma nova etapa de concentrao do xarope, em que h
a formao de cristais em virtude da precipitao da sacarose dissolvida
na gua. O produto final, cristais de acar envolvidos em mel (soluo
aucarada), chamado de massa cozida.
Cristalizao a massa cozida enviada a cristalizadores que a resfriam
lentamente com o auxlio de gua. Dessa maneira, consegue-se recuperar
parte da sacarose, que ainda estava contida no mel, por sua deposio
nos cristais j existentes, gerando o consequente aumento dos mesmos.
25
e-Tec Brasil
Centrifugao a massa cozida segue s centrfugas para a separao

do acar. O mel removido coletado e retorna aos cozedores para um
maior esgotamento. O acar descarregado das centrfugas apresenta
alto teor de umidade (0,5 a 2%) e temperatura elevada (65 a 95C).
Secagem os cristais de acar seguem para a secagem por meio de ar
quente. Este acar pode ser comercializado desta forma como acar
cristal, ou ento, utilizado para a fabricao de outros produtos como o
acar invertido, o acar refinado ou o acar lquido.
2.2.2 Produo do etanol

O etanol pode ser obtido por meio de um processo qumico denominado
fermentao, ou seja, um processo de transformao dos acares contidos
no caldo da cana-de-acar e melao. O melao resultante misturado ao
caldo da cana-de-acar e levedura em tanques. O subproduto resultante
do processo de fermentao, denominado mosto fermentado, contm
um teor alcolico de aproximadamente 7,0% a 9,0%. Depois do processo
de fermentao, de aproximadamente 10 horas, o mosto fermentado centrifugado, de forma que a levedura possa ser separada do lquido e reaproveitada posteriormente. O mosto fermentado ento fervido a diferentes
temperaturas, separando o etanol dos outros lquidos.
Seguem abaixo as principais etapas da produo de etanol:
Lavagem da cana lavagem da cana antes do processamento para retirar impurezas. Essa etapa importante, pois possibilita a remoo parcial
dos contaminantes, dependendo da qualidade da gua. Se a mesma no
apresentar condies microbiolgicas saudveis, pode levar, no entanto,
ao aumento drstico desses contaminantes.
Extrao do caldo moagem ou difuso para extrao do caldo da
cana atravs do esmagamento por cilindros compressores.
Peneiramento do caldo separao de slidos insolveis existentes no
caldo.
Tratamento trmico processo de aumento da temperatura do caldo
para promover a floculao de impurezas.
e-Tec Brasil
26
Resfriamento processo que visa adequar o caldo tratado ao processo

fermentativo por meio da diminuio da sua temperatura.
Preparao do caldo a fermentao realizada com o caldo composto de aproximadamente 20% de acar, preparado com caldo (do
tratamento), melao (da produo de acar) e gua. Esse caldo deve ser
mantido a uma temperatura de, aproximadamente, 30C.
Fermentao a fermentao do caldo resultado da ao da levedura,
que primeiramente inverte a sacarose em glicose e frutose (monossacardeo) e posteriormente converte o monossacardeo em etanol e dixido
de carbono. Essa reao ocorre em uma dorna de fermentao, juntamente com o caldo e a levedura.
Centrifugao posteriormente fermentao, o produto resultante
centrifugado para separar a levedura do mosto fermentado (vinho), uma
soluo de aproximadamente 9% v/v (GL) de etanol.
Tratamento da levedura a levedura resultante da centrifugao
tratada com cido sulfrico e devolvida s dornas de fermentao para
ser novamente utilizada.
Assista ao vdeo Acar e lcool

(A produo do lcool) em:
http://www.unica.com.br/
multimedia/videocast/default.
asp?mmdcode=9a64fc42-5ca74d66-95d3-ab2540184a38
Destilao o mosto fermentado (vinho) destilado em uma sequncia

de colunas de destilao, separando a gua do etanol. Esse processo
ocorre basicamente devido s diferenas das temperaturas de ebulio
do etanol e da gua.
2.3 Anlises rotineiras durante o

processamento
As principais anlises feitas durante o processamento encontram-se listadas
abaixo e elencadas no Quadro 2.1.
2.3.1 Lavagem da cana

Na sada das caixas de tratamento de gua, feita a coleta para quantificar
a populao bacteriana na gua de retorno do decantador, medindo o pH
para correlao pH-nvel bacteriano. A gua de lavagem da cana deve manter o pH entre 10 e 11.
Mtodos plaqueamento, bactrias totais, pH.
27
e-Tec Brasil
2.3.2 Moagem
As amostras de caldo so coletadas na sada da primeira unidade de caldo
e na sada da tubulao do caldo misto na moenda, para avaliao da alterao da carga microbiana durante a permanncia no ptio e tambm na
moenda.
Mtodos plaqueamento, bactrias totais, microscopia para bastonetes,
delta pH.
2.3.3 Tratamento trmico (caldo tratado)

A amostra de caldo coletada aps a floculao das impurezas, na sada
do decantador, a fim de se avaliar a eficincia do tratamento trmico no
controle microbiolgico.
Mtodos plaqueamento, bactrias totais.
2.3.4 Resfriamento
A amostra de caldo coletada na tubulao de entrada e sada do trocador
de calor caldo/mosto para avaliao da recontaminao do caldo resfriado
e mosto.
Mtodos plaqueamento, bactrias totais, leveduras totais (sada do trocador de calor).
2.3.5 Preparao do caldo

A amostra coletada nessa fase na tubulao de sada da gua para avaliar
a qualidade microbiolgica da gua usada na diluio do mosto, na entrada
do diluidor do mosto, para avaliar a qualidade microbiolgica do mosto aps
a adio do mel e na alimentao da dorna, para detectar a presena de
contaminantes no mosto.
Mtodos plaqueamento, bactrias totais, leveduras totais.
2.3.6 Fermentao
A amostra pode ser coletada antes da centrifugao para quantificar bactrias e leveduras e avaliar a necessidade da utilizao de produtos para
contribuir no controle microbiolgico.
Mtodos microscopia para bastonetes, viabilidade celular, brotamento,
concentrao celular de leveduras, nvel de floculao.
e-Tec Brasil
28
2.3.7 Tratamento da levedura

A amostra coletada para conhecer a viabilidade celular e a carga microbiana
de contaminantes que entram na fermentao atravs do p-de-cuba. Nos
processos de batelada, a coleta feita no momento de envio para a dorna e
no processo contnuo, na penltima caixa.
Mtodos microscopia para bastonetes, viabilidade celular, brotamento,
concentrao celular de leveduras.
p-de-cuba
Suspenso de clulas de
leveduras obtidas aps a
centrifugao do vinho.
Quadro 2.1: Anlises microbiolgicas

Pontos de amostragem
Anlise de rotina
Anlise
Frequncia
Anlise complementar
1. Lavagem da cana
Plaqueamento
Bactrias totais
pH
2 vezes/semana
2 vezes/semana
Leveduras totais
2. Moagem
Plaqueamento
Bactrias totais
Microscopia p/ bastonetes
Delta pH
2 vezes/semana
2 vezes/semana
1 vez/dia
1 vez/dia
Bactrias formadoras de cido

Bactrias formadoras de goma
Leveduras totais
3. Tratamento trmico
Plaqueamento
Bactrias totais
1 vez/dia
1 vez/dia
4. Resfriamento
Plaqueamento
Bactrias totais
Leveduras totais
1 vez/dia
1 vez/dia
1 vez/dia
5.1. gua de diluio
Plaqueamento
Bactrias totais
2 vezes/semana
2 vezes/semana
5.2. Mel
Plaqueamento
Bactrias totais
Leveduras totais
2 vezes/semana
2 vezes/semana
2 vezes/semana
5.3. Mosto
Plaqueamento
Bactrias totais
Leveduras totais
1 vez/dia
1 vez/dia
1 vez/dia
Viabilidade celular
Brotamento
Concentr. celular leveduras
Nvel de floculao
25% dornas
processadas/dia
Viabilidade celular
Brotamento
Concentr. celular leveduras
10% cubas tratadas/dia
5. Preparao do caldo
6. Fermentao
7. Tratamento do fermento
1 vez/dia
gua de diluio
gua utilizada para diluir
a suspenso de clulas
de leveduras obtida por
centrifugao.
Delta pH
Bactrias totais
Bactrias formadoras de cido
Bactrias formadoras de goma
Leveduras totais
Colorao de Gram
Fonte: Adaptado de Faria, 2005
29
e-Tec Brasil
Resumo
Nessa aula, vimos as principais etapas do processamento da cana-de-acar,
relacionadas produo de acar e de lcool. A partir desse conhecimento,
entendemos como a microbiologia pode ser aplicada nas diferentes etapas
dos processos de produo de acar e lcool, por meio da utilizao de
anlises rotineiras no decorrer do processamento. Assim, compreendemos a
importncia da microbiologia para a produo de acar e lcool, atravs do
controle e monitoramento desde a matria-prima at o produto final.
1. Faa um fluxograma da produo de acar e lcool.
2. Fale sobre a importncia da microbiologia aplicada produo de acar
e lcool.
3. Cite trs etapas de produo em que podem ser feitas anlises microbiolgicas e descreva seus objetivos.
e-Tec Brasil
30
Aula 3 Microrganismos relevantes

em processos industriais de
produo de acar e lcool
Objetivos
Apresentar os microrganismos presentes nos processos de produo
de lcool.
Identificar os principais contaminantes dos processos fermentativos.
Apresentar o uso de antibiticos e bactericidas na fermentao.
3.1 Leveduras Saccharomyces

Durante os processos fermentativos em usina sucroalcooleira, comum
a presena de microrganismos, que so habitantes naturais do caldo. Em
processos industriais nas usinas de acar e lcool, as leveduras do gnero
Saccharomyces tem sido amplamente utilizadas, por se tratarem de microrganismos que apresentam os principais atributos desejveis para uma cepa
de uso industrial, como: rpida transformao de acares em lcool, atividade celular em ambiente cido e alta tolerncia s condies drsticas
(produto formado, osmotolerncia e grandes variaes de temperatura).
Devido a essas caractersticas, as leveduras tm larga aplicao na indstria
de biotecnologia, sendo utilizadas tambm na produo de bebidas, indstria de panificao, enzimas, entre outros.
O processo fermentativo nas indstrias geralmente inicia-se com a introduo de uma determinada levedura, previamente selecionada para a conduo de toda a produo, mais comumente a Saccharomyces cerevisiae.
Os teores alcolicos nas dornas de fermentao, em condies normais de
processo, no permitem a sobrevivncia de linhagens no Saccharomyces.
Mas ao longo do processo elas podem ser substitudas por microrganismos
contaminantes, como bactrias e leveduras selvagens, gerando perdas na
transformao final do substrato em lcool.
Aula 3 - Microrganismos relevantes em processos industriais de produo de acar e lcool
31
e-Tec Brasil
Figura 3.1: Levedura Saccharomyces cerevisiae

Fonte: http://visualsunlimited.photoshelter.com
3.2 Microrganismos contaminantes

3.2.1 Leveduras selvagens
Cabrini; Gallo (1999) apud Camolez; Mutton (2005), definiram levedura

contaminante como qualquer levedura presente no processo fermentativo
que no seja aquela selecionada para a conduo da produo de lcool,
que atuam prejudicando a fermentao, causando problemas operacionais
e aumentando o tempo de fermentao.
A cana-de-acar utilizada como matria-prima nas usinas sucroalcoolei3
4
ras, segundo estudos, contm inicialmente nveis de 10 a 10 de fungos
por grama de planta. Embora essas leveduras sejam habitantes naturais do
caldo, entre elas esto leveduras que no apresentam caractersticas favorveis sua permanncia no ambiente hostil das dornas. Elas so eliminadas
naturalmente e na maioria das vezes no acarretam danos ao processo.
No entanto, as leveduras utilizadas como inculo no incio da fermentao podem ser completamente substitudas por leveduras contaminantes
no decorrer da safra, tambm chamadas de leveduras selvagens. Isso causa
srios prejuzos como a queda no rendimento, maior tempo de fermentao
no processo, problemas operacionais, formao de espumas pelo aumento
e-Tec Brasil
32
da viscosidade, etc. Contudo, alguns contaminantes podem apresentar

efeito contrrio, com bom desempenho fermentativo, podendo ser selecionados para atuarem como as leveduras do processo numa safra posterior.
Caso uma levedura isolada no final da safra seja diferente do inculo introduzido
no incio, deve-se analisar seus aspectos bioqumicos e microbiolgicos e verificar as caractersticas que permitiram seu predomnio sobre outras populaes.
3.2.2 Leveduras floculantes

Na fermentao alcolica industrial ocorre outro fenmeno importante
envolvendo as leveduras, conhecido como floculao, que um mecanismo
natural e reversvel de agregao de clulas. Esse fenmeno pode ser induzido por vrios fatores, como agentes qumicos, microbiolgicos e fatores
genticos inerentes prpria clula.
As leveduras floculantes so consideradas como contaminantes do processo,
pois causam sedimentao das clulas de leveduras nas dornas, levando a grandes dificuldades na fase de centrifugao, com perdas excessivas de fermento.
O mecanismo exato da floculao ainda no conhecido, mas sabe-se que o
meio de cultivo interfere no processo. Em anaerobiose, a floculao inibida
e em aerobiose, induzida.
Atravs de microscopia eletrnica, sabe-se que as clulas floculantes apresentam superfcie fimbriada ou ciliada e as no floculantes, relativamente lisa.
3.2.3 Bactrias contaminantes

Um processo de fermentao considerado sadio trabalha com nveis de bac5
trias nunca menores que 10 clulas/ml. Assim como as leveduras nativas,
essas bactrias so provenientes da matria-prima. Por meio de tcnicas
adequadas de controle tanto da matria-prima, como da gua de lavagem
e extrao possvel obter um caldo misto com nmero de contaminantes
7
inferiores a 10 UFC/ml e cuja faixa de pH esteja em 5,5. Como j vimos,
se esses cuidados no forem observados, o nvel de contaminantes pode
aumentar drasticamente.
Um dos maiores problemas causados pela contaminao bacteriana o consumo do acar existente (sacarose) por esses microrganismos, gerando perdas na transformao final em lcool e promovendo a formao de cidos
orgnicos, que ocasionam perda de acar e intoxicao das leveduras. As
33
UFC
Unidades Formadoras de
Colnia, que corresponde ao
nmero de clulas viveis.
e-Tec Brasil
bactrias contaminantes presentes no mosto ou nas dornas podem causar

fermentaes secundrias, que levam a metablitos que inibem a atividade
das leveduras, como os cidos, entre eles o actico, o frmico e o ltico.
As bactrias contaminantes alm de serem capazes de competir com a levedura do processo, tm que apresentar caractersticas que lhes permitam crescer em condies de altos teores alcolicos e alta acidez. Entre as espcies
de bactrias contaminantes nos processos fermentativos as predominantes
so as Gram-positivas, dos gneros Bacillus, Lactobacillus e Leuconostoc. Em
determinadas concentraes, essas bactrias levam a uma significativa queda
no rendimento alcolico. O gnero Leuconostoc tem um papel importante
como contaminante, principalmente na produo do acar. Essa bactria
utiliza o acar do caldo para a produo de goma, prejudicando a produo.
Algumas bactrias contaminantes do gnero Lactobacillus podem provocar
a floculao de leveduras, como, por exemplo, Lactobacillus fermentum,
levando a srios problemas operacionais. Isso acontece provavelmente
devido presena de uma capa proteica de natureza gelatinosa sobre as
bactrias, que possibilitam sua fixao nas clulas de leveduras. Segundo
Rosales (1989), apud Angelis (2010), em seu estudo identificou 222 linhagens
que foram isoladas na fermentao alcolica, assim distribudas: Grampositivas (75,68%) e Gram-negativas (24,32%). Entre as Gram-positivas
esto bastonetes (76,78%): Lactobacillus fermentum, L. brevis, L. canfusus,
L. plantarum, entre outros; Bacillus subtilis, B. coagulans, B. megaterium,
B. firmus; e Sporolactobacilluscocos sp; e cocos (23,21%): Leuconostoc,
Micrococos e Staphylococcus. Entre as Gram-negativas esto Acetobacter,
Xantobacter, Pseudomonas, Acinetobacter e Enterobacter.
Figura 3.2: Leveduras sadias (do lado direito) e leveduras com bactrias contaminantes
(do lado esquerdo)
Fonte: http://microbio-vocesabia.blogspot.com/2009_12_01_archive.html
e-Tec Brasil
34
3.3 Antibiticos e bactericidas

Como j vimos, o controle de contaminaes microbianas em processos fermentativos de suma importncia, visto que a presena de contaminantes
durante a fermentao causam uma srie de problemas, interferindo na produo, rendimento e produtividade.
Dentre as principais substncias conhecidas para a desinfeco do mosto de
fermentao esto antisspticos, como cido sulfrico, compostos fenlicos, compostos clorados, quaternrio de amnio, aldedos, e os antibiticos.
Estes ltimos, alm do emprego teraputico, tem sido utilizados com sucesso
em indstrias de fermentao na inibio do crescimento de bactrias, sem,
no entanto, interferir na atuao das leveduras. Entre os antibiticos mais
utilizados esto penicilina, virginiamicina, tetraciclina, cloranfenicol, alm de
outros como Kamoran HJ, Kamoran WP e Corstan.
antissptico
Produto que promove a
desinfeco em tecidos vivos
seja inibindo ou matando os
microrganismos.
Os antibiticos podem ser definidos como agentes quimioterpicos, obtidos

sinteticamente ou a partir de metablitos de microrganismos, capazes de
matar ou inibir o crescimento dos mesmos. Podem ser bactericidas, quando
provocam a morte das bactrias, ou bacteriostticos, quando apenas inibem
seu crescimento. A concentrao inibitria mnima (CIM) a menor concentrao capaz de inibir o crescimento do microrganismo.
Um dos fatores de maior limitao da utilizao dessas substncias na indstria est na seletividade adquirida pelas bactrias, que podem se tornar resistentes e menos sensveis sua ao. Devido a isso, deve se buscar o uso
racional dos antibiticos, selecionando o tipo e a dosagem mais adequada
para cada populao de bactrias.
Para evitar a resistncia adquirida por bactrias a determinados antibiticos
podem ser feitos em laboratrio, testes para detectar a sensibilidade das
bactrias aos antimicrobianos. Por meio dessas avaliaes possvel escolher
quais so os mais adequados para serem aplicados na indstria sucroalcooleira. Mas isso ns estudaremos mais adiante.
Antisspticos e antibiticos
No Brasil, no usual a esterilizao do mosto para produo de lcool.
Logo, o mosto apresenta uma populao natural que compete com a levedura pelo substrato, diminuindo o rendimento alcolico. Quando se faz a
clarificao do caldo por aquecimento, h uma reduo dos microrganismos, mas, no uma esterilizao. Aps a clarificao, o mosto resfriado
35
e-Tec Brasil
e colocado em dornas sem cuidados para manter o ambiente livre de microrganismos. Os antisspticos e antibiticos so utilizados para o controle da
contaminao, criando ambiente favorvel ao desenvolvimento das leveduras. O cido sulfrico que se adiciona aos mostos o antissptico mais utilizado. Os bactericidas so empregados, em muitos casos, preventivamente.
Os antibiticos, especialmente penicilinas, devido ao preo mais elevado, so
aplicados em algumas usinas, de maneira corretiva. A penicilina um bom
inibidor de contaminaes, devido s suas propriedades bacteriostticas. Ela
um bom inibidor de contaminaes, com emprego de 500 a 1000 U.I. por
litro de mosto, normalmente implicando em aumento de rendimento em
lcool. Cada processo apresenta necessidades especficas, existem tambm
culturas e hbitos diferenciados, que definem o uso, ou no de determinado
produto. Segundo Lima et al. (2001), antisspticos (exceto o cido sulfrico)
tm uso restrito, pois existe possibilidade de deixar resduos nos destilados.
Observaes
O uso do processo Melle-Boinot, com tratamento cido do fermento, centrfugas eficientes, caldo tratado termicamente, alm de resfriamento mais
eficiente de dornas leva a uma substancial reduo na relao contaminante/
levedura. Nestas condies, embora possa haver acidente de fermentao,
difcil em termos tcnicos e econmicos, justificar o uso continuado de
antibiticos.
Leveduras < 108 cel/mL e contaminantes > 106, pode-se usar antibitico.
Fonte: http://www.scribd.com/doc/22805555/Unidade-VII-Fermentacao-Alcoolica
Resumo
Vimos nesta aula os microrganismos que so comuns ao processo fermentativo, como as leveduras do gnero Saccharomyces. Aprendemos sobre os
principais contaminantes envolvidos, entre os quais temos leveduras selvagens e bactrias. Vimos que a presena desses contaminantes durante a
fermentao bastante prejudicial ao processo, j que eles interferem na
produo, rendimento e produtividade. Diante desse problema, aprendemos
que o uso de antibiticos e bactericidas tem se mostrado uma alternativa
eficiente para o tratamento das infeces na fermentao.
e-Tec Brasil
36
1. Quais so os microrganismos geralmente introduzidos em usinas de produo de lcool para iniciar o processo fermentativo? Quais so as vantagens apresentadas por esses microrganismos?
2. O que so microrganismos contaminantes?
3. Cite os principais microrganismos contaminantes e as consequncias
para o processo fermentativo.
4. Como podem ser combatidos os microrganismos contaminantes?
37
e-Tec Brasil
Aula 4 Meios de cultura

Objetivos
Definir meios de cultivo e apresentar noes dos principais tipos
existentes.
Caracterizar os diferentes meios de cultura e a finalidade de cada um.
Apresentar o preparo de meios de cultivo importantes utilizados
nos processos industriais de produo de lcool e suas aplicaes.
4.1 Classificao dos meios de cultura

O estudo de bactrias e leveduras exige o prvio isolamento e identificao
dos mesmos, e para tanto, so utilizados diversos meios de cultura diferentes.
O cultivo de microrganismos, em condies laboratoriais, se d pela utilizao de meios de cultura. Esses podem ser definidos como o conjunto de
nutrientes necessrios para haver multiplicao ou manuteno dos microrganismos. Existe uma grande variedade de procedimentos e preparaes
nutricionais utilizadas para induzir tal crescimento, de acordo com as exigncias nutritivas e das condies fsicas requeridas pelos diversos tipos de
fungos e bactrias. Devido s grandes variaes das necessidades nutritivas
dos microrganismos, os meios de cultura so bastante diferentes em sua
composio. Quanto ao estado fsico, podem ser:
Lquidos so desprovidos de gar.
Slidos apresentam em sua composio de 1,5 a 2,5% de gar.
Semi-slidos apresentam em sua composio at 1% de gar.
De acordo com a sua composio e os objetivos a que se destinam, os meios
de cultura podem ainda ser classificados em:
Aula 4 - Meios de cultura
39
gar
Um polissacardeo extrado de
algas, responsvel pelo aspecto
gelatinoso do meio slido. O
gar mais usado que a
gelatina, pois, alm de no ser
atacado pela grande maioria dos
microrganismos, no liquefeito
em temperaturas normalmente
usadas para o crescimento dos
microrganismos (em torno de 30
a 35C).
e-Tec Brasil
Basal s possui os nutrientes bsicos para o crescimento dos microrganismos em geral.

De enriquecimento suplementado com nutrientes especficos para
o microrganismo que se deseja pesquisar. Alm disso, pode apresentar
agentes inibidores de determinados microrganismos, mas no permite o
seu isolamento, pois um meio lquido.
Seletivo possui agentes inibidores de determinados microrganismos.
Permite a identificao e isolamento, pois um meio slido (permite a
visualizao de UFCs).
Diferencial permite a diferenciao de uma espcie e outra pelo aspecto macroscpico de seu crescimento, como cor, textura, halo de hemlise, etc.
Para saber mais sobre meios de

cultura, acesse:
http://www.e-escola.pt/topico.
asp?id=312
Sinttico ou quimicamente definido so aqueles fabricados em laboratrio, cuja composio qumica pode ser absolutamente conhecida,
at mesmo em relao aos micronutrientes.
Complexo quando a composio no pode ser quimicamente conhecida, os meios de cultura so chamados complexos.
De transporte so aqueles utilizados para o armazenamento e manuteno temporria de determinado material, cuja principal funo
manter a viabilidade dos possveis microrganismos presentes.
Inoculao a transferncia de um determinado nmero de microrganismos
para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam e permitam a
sua identificao. A inoculao em diferentes meios envolve vrias tcnicas
de semeadura.
Assista as animaes e saiba

mais sobre tcnicas asspticas
de inoculao de microrganismos
e obteno de culturas puras em:
http://www.e-escola.pt/pagina_
popup.asp?id=913
asp?id=310
e-Tec Brasil
As tcnicas de semeadura so o mtodo pelo qual se transfere inculos de

um meio de cultura ou material a ser analisado para um outro meio de
cultura. Para garantir que apenas o microrganismo desejado seja semeado,
so utilizadas as tcnicas asspticas (procedimentos que devem ser adotados
visando a no contaminao de materiais, meios e culturas, para obteno
de culturas puras).
40
Para a contagem de bactrias em geral, vrios meios de cultivos podem ser

utilizados, como: gar-nutriente, dextrose-triptona gar, gar-leite desnatado, gar-suco de tomate, MRS-gar, etc. J para a contagem de leveduras,
os meios mais comumente utilizados so: extrato de levedura-peptona-dextrose-gar, extrato de malte e gar-batata-dextrose. A maior parte dos meios
de cultura est disponvel comercialmente na forma desidratada e para seu
uso, faz-se a dissoluo em gua e esterilizao.
Os meios de cultura diferenciais ou seletivos para isolamento e quantificao
de populaes de leveduras contaminantes baseiam-se em caractersticas
fisiolgicas comuns s leveduras selvagens, mas ausentes em linhagens iniciadoras do processo da fermentao. Dentre essas, destacam-se as nutricionais (variaes nas fontes de carbono, nitrognio e nos fatores de crescimento) e resistncia a certos compostos como antibiticos e corantes.
Entretanto, um nico meio no totalmente satisfatrio para a avaliao de
todas as leveduras presentes, sendo, portanto necessrio o emprego de vrios
tipos de meios quando se pretende detectar a maioria das leveduras presentes.
4.2 Preparo de meios de cultivo

Apresentaremos aqui uma breve noo dos meios de cultura mais utilizados
para anlises microbiolgicas em processos fermentativos e o seu preparo.
Na contagem de bactrias totais, recomenda-se a utilizao de meio de cultivo base de extrato de levedura triptoma-dextrose-gar (Tabela 4.1).
Tabela 4.1: Extrato de levedura triptona-dextrose-gar (PCA Plate Count Agar)
Extrato de levedura
2,5 g
Triptona
5,0 g
Dextrose
1,0 g
gar
15,0 g
gua destilada
1000 ml
Fonte: Amorin, 2000
Na contagem de leveduras totais, o meio WLN (Tabela 4.2) um dos meios

de cultivo mais indicados, porm importante considerar que os ingredientes assinalados com asterisco devem ser incorporados ao meio na forma de
solues previamente preparadas.
41
e-Tec Brasil
Tabela 4.2: WLN (WL Nutrient Medium)

Extrato de levedura
0,4 g
Casena hidrolisada
0,5 g
Glicose
5,0 g
Fosfato monopotssico*
55,0 mg
Cloreto de potssio*
42,5 mg
Cloreto de clcio*
12,5 mg
Sulfato de magnsio*
12,5 mg
Cloreto frrico*
0,25 g
Sulfato de mangans*
0,25 g
Verde de bromocresol
2,2 mg
cido nalidxico*
5,0 mg
gar
2,0 g
Ampicilina*
5,0 mg
gua destilada q.s.q.
100 ml
Fonte: Ceccato-Antonini, 2004
Para a enumerao e o isolamento de leveduras resistentes cicloheximida,

recomenda-se o meio de cultivo WLD (WL Differential Agar) que obtido
por adio do agente antifngico cicloheximida, na forma de soluo, ao
meio WLN, para uma concentrao final de 5 ppm.
Para a enumerao e o isolamento de bactrias produtoras de cido (Pour
Plate) recomenda-se o meio de cultivo para Lactobacillus (Tabela 4.3).
Tabela 4.3: Meio para Lactobacillus MRS (seg. Man. Rogosa y Sharpe)
modificado
Peptona universal
10,0 g
Extrato de carne
5,0 g
Extrato de levedura
5,0 g
D glucose
20,0 g
Di-potssio hidrogenado fosfato
2,0 g
Polioxietilensorbitan monooleato (Tween 80)
1,0 g
Acetato sdio
5,0 g
Sulfato magnsio
0,1 g
Sulfato mangans
0,05 g
gar
12,0 g
gua destilada
1000 ml
Fonte: Mello, 2004
Para a enumerao e o isolamento de bactrias produtoras de goma (por

superfcie), recomenda-se o meio de cultivo para Leuconostoc (Tabela 4.4).
e-Tec Brasil
42
Tabela 4.4: Meio para Leuconostoc (Mayeux e Colmer, 1961)

Extrato de levedura
20,0 g
Proteose-peptona
5,0 g
Dextrose
10,0 g
Fosfato de potssio monobsico
2,0 g
gar
15,0 g
gua destilada
1000 ml
Fonte: Amorim, 2000
Para a enumerao e o isolamento de leveduras no pertencente ao gnero

Saccharomyces, recomenda-se o meio de cultivo de Lisina (Tabela 4.5).
Tabela 4.5: Meio de Lisina
Bacto yeast carbon base
1,17 mg
Lisina
0,10 g
gar
2,0 g
cido nalidxico
5,0 mg
Ampicilina
5,0 mg
100 ml
Observao
Os antibiticos sero incorporados ao meio na forma de solues.
Para a enumerao e o isolamento de leveduras selvagens do gnero
Saccharomyces, recomenda-se o meio de cultivo LWYN (Tabela 4.6).
Tabela 4.6: LWYN (Lin Wild Yeast Medium)
Extrato de malte
0,20 g
Extrato de levedura
0,40 g
Peptona
0,20 g
Glicose
1,00 g
Fosfato de potssio bibsico
0,10 g
Cloreto de amnio
0,05 g
gar
2,00 g
Violeta cristal*
0,6 mg
Mistura fucsina-sulfito
0,01 g
cido nalidxico*
5,0 mg
Ampicilina*
5,0 mg
100 ml
43
e-Tec Brasil
Observao
Os ingredientes assinalados com asterisco sero incorporados ao meio na
forma de solues. A mistura fucsina-sulfito composta de 1 parte, em peso,
de dextrina, 4 partes de fucsina bsica e 25 partes de sulfito de sdio anidro.
Para a enumerao e o isolamento de bactrias recomenda-se o meio de
cultivo gar nutriente (Tabela 4.7).
Tabela 4.7: gar nutriente
Peptona
5g
Extrato de carne
3g
Cloreto de sdio
1g
gar
20 g
1000 ml
Para a contagem de bactrias totais na fermentao (Pour Plate) recomenda-se o meio de cultura MSS (Tabela 4.8).
Tabela 4.8: MSS (meio de melao-sacarose-extrato de levedura)
Melao
50,0 g
Sacarose
75,0 g
Peptona
1,0 g
Extrato de levedura
1,0 g
K2HPO4
1,0 g
9(NH4)2SO4
1,0 g
Agar
15,0 g
gua destilada
1000 ml
Fonte: Mello, 2004
Importante
Todos os meios de cultura devem ser esterilizados em autoclave a 120C por
20 minutos, a 1 atm.
e-Tec Brasil
44
Resumo
Nessa aula, aprendemos sobre meios de cultura. Vimos que estes podem
apresentar uma grande variao, quanto ao estado fsico e quanto sua
composio, de acordo com a necessidade dos microrganismos e os objetivos a que se destinam. Para se obter resultados seguros e eficientes quando
se trabalha com meios de cultura importante observar tcnicas asspticas
de inoculao e semeadura. Por fim, estudamos o preparo de meios de cultivo importantes utilizados nos processos industriais de produo de lcool e
suas respectivas aplicaes.
1. O que so meios de cultivo?
2. Quanto ao estado fsico, como os meios de cultura podem ser divididos?
3. Quanto composio e aos objetivos a que se destinam, cite trs exemplos de meios de cultura.
4. Preencha as lacunas de acordo com o meio de cultivo adequado:
a) Meio de Lisina.
b) PCA Plate Count Agar.
c) Meio para Leuconostoc.
d) WLN.
(__) Meio de cultivo para isolamento de leveduras no pertencentes ao
gnero Saccharomyces.
(__) Meio de cultivo para contagem de leveduras totais.
(__) Meio de cultivo para bactrias produtoras de goma (por superfcie).
(__) Meio de cultivo utilizado na contagem de bactrias totais.
45
e-Tec Brasil
Aula 5 Tcnicas de colorao e de

contagem microbiolgica
Objetivos
Conhecer as principais tcnicas de colorao de microrganismos.
Conhecer a tcnica de colorao de Gram e sua aplicao.
Conhecer as tcnicas bsicas de contagem microbiolgica.
5.1 Tcnicas de colorao de microrganismos

A observao de microrganismos apresenta alguns fatores limitantes, como
o fato de possurem tamanhos reduzidos e serem praticamente incolores.
Por isso, a maioria dos microrganismos para serem visualizados ao microscpio ptico devem ser previamente corados. Antes disso, o microrganismo
deve ser fixado lmina, realizando-se a secagem por simples exposio ao
ar e, em seguida, rpida passagem da lmina pela chama do bico de Bunsen.
Os corantes podem ser cidos ou bsicos. A clula bacteriana atrai corantes
bsicos. Os corantes bsicos mais comuns so: cristal violeta, azul de metileno, fucsina e safranina.
Quanto aos tipos de colorao temos:
a) Coloraes simples promovem a colorao indistinta das bactrias,
facilitando a visualizao da forma das clulas bacterianas. Exemplo: colorao com azul de metileno.
b) Coloraes diferenciais as clulas bacterianas so expostas a alguns
corantes, em uma determinada sequncia, interagindo diferentemente
com as estruturas presentes nas diferentes bactrias, permitindo a diferenciao de grupos bacterianos. Exemplo: colorao de Gram; colorao de Ziehl-Neelsen (BAAR).
Aula 5 - Tcnicas de colorao e de contagem microbiolgica
47
e-Tec Brasil
c) Coloraes especiais so aquelas utilizadas para corar e identificar partes

ou estruturas especficas das bactrias, como: esporo, cpsula, flagelo, grnulos, e outras estruturas. Exemplo: na colorao de Fontana-Tribondeau
emprega-se o espessamento de bactrias espiraladas com prata.
5.1.1 Colorao de Gram

Para saber mais sobre tcnicas
de colorao Gram, acesse:
http://www.biomedicina3l.
com/2009/08/coloracao-degram.html
Para saber mais sobre contagem
de clulas totais pela cmara de
Neubauer, acesse:
asp?id=235&ordem=2
A colorao de Gram um mtodo muito utilizado na identificao de bactrias, separando-as em dois grandes grupos: bactrias Gram-positivas (+) e
bactrias Gram-negativas (-). Estas podem ser diferenciadas por variaes na
estrutura da parede celular. Assim a parede celular de bactrias ditas Gram
(+) formada por um camada espessa de peptidoglicano, enquanto que a
parede celular de bactrias Gram (-) formada por uma camada fina de peptidoglicano, rodeada por uma camada externa de lipopolissacardeo e protena. um mtodo de colorao diferencial, baseado nas diferenas de permeabilidade destas membranas aos reagentes qumicos. Nessa tcnica so
utilizados um corante primrio (cristal violeta), um contracorante (safranina)
e uma soluo de lugol, denominada de mordente, pois se combina com
o cristal-violeta para formar um composto colorido insolvel. O mordente
intensifica a cor por ser capaz de aumentar a afinidade do corante com a
molcula alvo. Aps a formao do complexo cristal-violeta-lugol feita a
descolorizao com lcool. Em seguida, aplica-se o contracorante safranina.
As clulas que resistem descolorizao e retm o complexo cristal-violetalugol, apresentam-se coradas de azul-violeta forte e so chamadas Grampositivas (+). Aquelas que se descolorizam pela perda do complexo, aceitam o
corante safranina e ficam vermelhas, so as denominadas Gram-negativas (-).
Figura 5.1: Mtodo de colorao Gram

Fonte: Adaptado de http://pathmicro.med.sc.edu/fox/gram-st.jpg
e-Tec Brasil
48
5.2 Tcnicas bsicas de contagem

microbiolgica
Para acompanhar o crescimento de uma populao microbiana e poder
quantific-la podem ser utilizadas algumas tcnicas de contagem de microrganismos. A contagem de microrganismos em uma determinada amostra
pode ser realizada por meio de diferentes mtodos.
a) Contagem direta ou microscpica tcnica de contagem utilizada
para quantificar o nmero total de clulas em uma populao de microrganismos. A vantagem desse mtodo a rapidez, no entanto no permite a diferenciao de clulas vivas e mortas. Alm disso, s possvel
contar partculas que estejam em valores superiores a 104/ml, enquanto
a contagem em placas pode avaliar nmeros bem inferiores (at 30/
ml). Pode ser feita atravs de cmaras de contagem por observao em
microscpio ou ainda por contagem eletrnica.
b) Contagem de microrganismos viveis em placa tcnica de contagem por meio da semeadura de bactrias e/ou leveduras em placas
(Pour Plate ou superfcie), para estimar o nmero de clulas viveis,
isto , capazes de se reproduzir, em um meio de cultura adequado. Cada
colnia crescida numa placa corresponde a uma unidade formadora de
colnia (UFC) proveniente do material.
Devido grande variao do nmero de microrganismos em uma amostra,
a sua contagem torna-se muitas vezes impossvel. Para reduzir o nmero de
clulas na amostra e possibilitar a contagem so usadas tcnicas de diluio
(Figura 5.2). Para uma maior preciso da anlise somente devero ser contadas as placas com nmero de colnias entre 30 e 300.
49
e-Tec Brasil
Assista a animao e saiba mais

sobre a tcnica de contagem
de viveis utilizando o mtodo
das diluies sucessivas em:
asp?id=235&ordem=3
Figura 5.2: Tcnica de contagem em placa com diluio

Fonte: CTISM
e-Tec Brasil
50
c) Semeadura em profundidade ou Pour Plate depois de preparadas as diluies, estas so inoculadas em quantidades de 0,1 ou 1,0 ml
em placas de Petri estreis, utilizando-se duas placas para cada diluio.
Aps colocar o material (amostra em estudo) na placa, agrega-se de 10
a 15 ml do meio de cultura fundido e resfriado a temperatura de 45C,
agitando-se em movimentos rotativos. As placas assim preparadas devem ser incubadas a temperatura e condies recomendadas, devendo
ser colocadas em posio invertida na estufa. Aps incubao realizar a
contagem, utilizando contador de colnias.
d) Semeadura em superfcie aps preparar as placas com meio de cultura (15 ml) e uma vez preparadas as diluies escolhidas semeia-se 0,1 ml
de cada uma das diluies, utilizando-se tambm duas placas por cada
diluio. Distribuir toda alquota semeada com uma ala de Drigalski.
Levar incubao nas mesmas condies descritas acima.
Figura 5.3: Ala de Drigalski

Fonte: http://www.seelen-care.dk/drigalski-spatel-glas.aspx
A seguir veja o Quadro 5.1 contendo as regras para interpretar a contagem

de colnias:
51
e-Tec Brasil
Quadro 5.1: Normas para contagem de colnias

Interpretao
Exemplo
Clculo
Reporte
1. Duas placas da mesma

diluio apresentam entre
30 e 300 colnias.
Diluio 10
Placa 1 = 180
Placa 2 = 140
Mdia aritmtica
X = 160
Contagem standard
em placa:
16 x 103
2. Em uma mesma diluio

uma placa apresenta entre
30 e 300 colnias e outra
< 30 ou > 300. Contar as
duas placas.
Diluio 10-2
Placa 1 = 70
Placa 2 = 26
Mdia aritmtica
X = 48
Contagem standard
em placa:
48 x102
a) X Dil. 10-3 = 35
X Dil. 10-2 = 250
Relao 10-3/10-2
35000/25000 =
Se < que 2, tomar a
mdia
Contagem standard
em placa:
30 x 103
b) X Dil. 10 = 38
X Dil. 10-2 = 150
Relao 10-3/10-2
38000/15000 =
Se > que 2, tomar o
nmero maior
Contagem standard
em placa:
15 x 103
4. No tem colnias nas

placas da suspenso mais
concentrada.
Diluio 10-1
Placa 1 = < 1
Placa 2 = < 1
X=1
Contagem estimada
em placa:
< 1 x 101
5. Duas placas da diluio

mais alta apresentam
mais de 300 colnias.
Dividir as placas de forma
radial (2, 4, 8) e contar o
nmero de colnias por
seco.
a) Diluio 10-3
Placa 1 = 180 em 1/4
Placa 2 = 160 em 1/4
Mdia aritmtica
180 X 4 = 720
160 X 4 = 640
X = 680
Contagem estimada
em placa:
68 x 104
b) mais de 200 em 1/8
> 200 em 8 = 1600
Contagem estimada
em placa:
> 16 x 105
Diluio 10-2
Placa 1 (metade) =
60 X 2
Placa 2 = 180
Mdia aritmtica
X = 150
Presena de colnias
disseminadas:
15 x 103
3. As placas de 2 diluies
consecutivas apresentam
entre 30 e 300 colnias.
Contar as 4 placas.
6. Presena de colnias
disseminadas em uma
rea menor que a metade
da placa. Contar a outra
metade.
-2
-3
Resumo
Estudamos nessa aula sobre as tcnicas de colorao de microrganismos,
que so utilizadas com o propsito de visualiz-los e identificar as suas propriedades. Vimos os principais tipos de colorao existentes, dando nfase
colorao de Gram e sua aplicao. Aprendemos ainda algumas tcnicas de contagem de microrganismos, frequentemente empregadas para
acompanhar e quantificar o crescimento de populaes microbianas, como
a contagem direta e a contagem em placas.
e-Tec Brasil
52
1. Quais os tipos de colorao existentes?
2. Para qual finalidade a colorao de Gram utilizada?
3. Descreva resumidamente a tcnica de colorao de Gram.
4. Aps ter acessado o texto sobre contagem direta ao microscpio, discorra sobre as limitaes desse mtodo.
5. Qual o objetivo de proceder s diluies sucessivas na tcnica de contagem de viveis?
53
e-Tec Brasil
Aula 6 Mtodos microbiolgicos

aplicados produo de lcool
Objetivos
Conhecer as principais tcnicas de monitoramento microbiolgico no processo industrial de produo de lcool, seus objetivos e
aplicaes.
Apresentar os principais testes de deteco de bactrias e leveduras contaminantes, testes de sensibilidade de bactrias a antimicrobianos, caracterizao de Bacillus e Lactobacillus, entre outros
procedimentos.
6.1 Leveduras
6.1.1 Determinao da viabilidade celular,

concentrao celular e brotamento em
leveduras
Viabilidade celular indica a porcentagem de leveduras vivas em relao
ao total de leveduras.
Concentrao celular nmero de leveduras vivas por ml da amostra.
Brotamento porcentagem de leveduras vivas que esto se multiplicando.
At o momento, no se conhece um mtodo absoluto para determinao da
viabilidade celular de uma populao de clulas de levedura, cujos resultados
possam ser considerados totalmente seguros. Entretanto, mtodos baseados
no plaqueamento ou contagem direta tm sido utilizados para estimar a
proporo de clulas viveis em uma cultura ou processo fermentativo. Os
mtodos de contagem direta so rpidos e simples e permitem, simultaneamente, a observao da morfologia celular.
A tolerncia da levedura ao seu produto de fermentao, o etanol, bastante
significante em relao eficincia de produo de lcool em fermentaes
Aula 6 - Mtodos microbiolgicos aplicados produo de lcool
55
e-Tec Brasil
em escala industrial. A presena de lcoois superiores (n-butanol, isoamlico),

cidos graxos e seus steres mesmo em baixas concentraes, juntamente
com o etanol, intoxicam a clula da levedura levando-a morte e consequentemente diminuindo a viabilidade celular. Portanto, a determinao
da viabilidade celular um aspecto de grande importncia no controle da
fermentao alcolica, pois pode indicar se o desempenho do processo ser
satisfatrio ou no. Quanto maior esse nmero, melhor ser o desempenho.
Os mtodos mais empregados na determinao da viabilidade celular nos
processos de produo de levedura (fermento prensado) e fermentao
alcolica (lcool) so a colorao das clulas da levedura com azul de metileno ou eritrosina e o cultivo por plaqueamento.
6.1.1.1 Tcnica de colorao com azul de metileno ou

eritrosina
A tcnica de colorao com azul de metileno consiste em se misturar partes
iguais da suspenso de levedura (amostra), adequadamente diluda, e da
soluo corante (azul de metileno). As clulas com alta atividade fisiolgica
no se colorem, enquanto as clulas inativas (mortas) apresentam-se coloridas de azul. A tcnica de colorao com eritrosina a mesma, entretanto,
nesse caso, as clulas no viveis colorem-se de rosa intenso. A porcentagem ou o nmero de clulas viveis determinado transferindo-se com uma
pipeta de Pasteur a amostra para a cmara de Neubauer.
Figura 6.1: Determinao da viabilidade celular de leveduras com azul de metileno

e-Tec Brasil
56
Objetivo determinar a viabilidade celular, o brotamento e a populao de

leveduras.
Material cmara de Neubauer, pipeta de Pasteur, pipetas graduadas de
1ml, tubos de ensaio, agitador para tubos, lamnulas (24 x 24), microscpio.
Reagentes azul de metileno ou eritrosina, soluo tampo, gua destilada
esterilizada.
Procedimento fazer a diluio da amostra, se necessrio, em um tubo de
ensaio (1:10, 1:15, 1:20, 1:40) conforme o caso especfico de cada unidade.
Misturar partes iguais de amostra e soluo corante, homogeneizando a
mistura em agitador de tubos. Em seguida, preparar a cmara de Neubauer,
fixando a lamnula adequada e com auxlio da pipeta de Pasteur, transferir
um pequeno volume da amostra preparada. Levar ao microscpio ptico e
com a objetiva de 40x, fazer a contagem das clulas coradas, clulas no
coradas e brotos. Contar 10 quadrculos de 2 colunas, de preferncia, a
segunda e a quarta. Considerar todas as clulas que esto no interior deles
e as que esto at 2/3 para dentro. A diluio feita de modo que se tenha
de 40 a 50 clulas por quadrculo.
Observao considerar como broto as clulas menores que a metade do
tamanho da clula me.
Clculos
Viabilidade (%) = (nmero de clulas no coradas (vivas) / nmero total de
clulas) x 100
N total de clulas/ml = n clulas nos 10 campos x 2,5 x diluio x 100
ou
N total de clulas/ml = n clulas nos 100 retculos x 4 x diluio x 100
Brotamento por reposio (%) = (n brotos no corados / n total de clulas
no coradas) x 100
57
e-Tec Brasil
6.1.1.2 Plaqueamento por profundidade (Pour Plate) e

diluio em srie
A semeadura em placas ou plaqueamento revela o nmero de clulas de
leveduras capazes de se multiplicarem e formarem colnias em meios de
cultivo apropriados e sob condies de incubao adequadas. Cada colnia
desenvolvida supe-se ter sido originada a partir de uma unidade vivel, a
qual pode ser uma clula ou mais. O resultado depende da capacidade do
organismo se desenvolver nas condies dos meios de cultivo. Como consequncia, essa tcnica d uma estimativa da populao da amostra, j que
somente as clulas viveis sero quantificadas.
Como para uma maior preciso da anlise somente devero ser contadas
as placas com nmero de colnias entre 30 e 300, uma diluio da amostra
dever ser feita antes de se proceder a sua mistura com o meio de cultura.
Objetivo avaliar o nmero de microrganismos, usando-se meios de cultivo.
Material placas de Petri, tubos de ensaio, pipetas graduadas (1 ml), suporte
para tubos, ala de Drigalsky, agitador para tubos, contador de colnias,
estufa, banho-maria, termmetro, bico de Bunsen.
Reagentes gua de diluio, meios de cultivo especficos.
Procedimento coletar 1 ml da amostra (suspenso de clulas) e transferir
para um tubo de cultura com 9 ml de gua ou soluo salina esterilizada
(diluio 1:10 ou 10-1). Homogeneizar em agitador de tubos. Em seguida,
pipetar 1 ml da diluio anterior para outro tubo com 9 ml de gua ou
soluo salina esterilizada, obtendo-se uma diluio 1:100 ou 10-2. Diluies
maiores podem ser obtidas tomando-se 1 ml de cada diluio sucessiva e
colocando em tubos com 9 ml de gua ou soluo salina, at se atingir a
diluio desejada. Aps a diluio mais conveniente, fazer a semeadura em
placas de Petri, pipetando 1 ml e adicionando-se o meio de cultivo adequado liquefeito e resfriado a uma temperatura de 45-46C. Agitar a placa
com movimentos horizontais (para direita e para esquerda) para distribuir
as clulas com uniformidade (plaqueamento em profundidade). Semear no
mnimo 2 placas de cada diluio e escolher 3 diluies. Incubar a 32C por
24-48 horas.
Alternativamente, pode-se proceder ao plaqueamento em superfcie. Inicialmente colocar o meio de cultura (WLN) nas placas de Petri, esperar a solidifi-
e-Tec Brasil
58
cao e a seguir, pipetar 0,1 ml espalhando o inculo com auxlio da ala de

Drigalsky (plaqueamento em superfcie).
Fazer a contagem de cada placa e para estimar o nmero de colnias, escolher as placas que apresentem de 30 a 300 colnias. Calcular a mdia das
colnias das duas placas e multiplicar pelo fator de diluio para se obter o
nmero de colnias. Se for utilizado o plaqueamento em superfcie, multiplicar por 10.
Clculo N de colnias na placa x ndice de diluio da amostra = n de
UFCs de leveduras/ml
A contagem deve ser expressa em nmero de unidades formadoras de colnias por mililitro ou grama de amostra (UFC/mL ou UFC/g) e o resultado
expresso em apenas dois dgitos (Exemplo: 0,0 x 10x).
6.1.2 Meios seletivos para deteco de leveduras

selvagens
A diferenciao entre a levedura alcolica (processo) e a levedura contaminante (selvagem) pode ser detectada pela utilizao de meios seletivos ou
diferenciais.
Como j vimos anteriormente, os meios de cultura diferenciais ou seletivos
podem ser usados para isolamento e quantificao de populaes de leveduras contaminantes e baseiam-se em caractersticas fisiolgicas comuns s
leveduras selvagens, mas ausentes em linhagens iniciadoras do processo de
fermentao, ou seja, o meio empregado permite somente o desenvolvimento da levedura contaminante. Entretanto, um nico meio no permite a
avaliao de todas as leveduras presentes, j que todos apresentam variaes.
De modo geral, os meios seletivos ou diferenciais podem ser classificados em:
meios para deteco de leveduras contaminantes no Saccharomyces (WLD,
LWYN, meio de lisina) e meios para deteco de leveduras contaminantes
Saccharomyces (LWYN).
Procedimento coletar as amostras em frascos estreis e homogeneizar
cuidadosamente, transferindo 10 ml das amostras para tubos de centrfuga
estreis, assepticamente. Centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos. Descartar
os sobrenadantes, adicionando-se em seguida soluo salina estril para ressuspenso das clulas. Centrifugar as amostras novamente, desprezando-se
os sobrenadantes e ressuspendendo-se as clulas a um volume final de 10
59
e-Tec Brasil
ml com soluo salina estril. Aps a recomposio do volume inicial, fazer

a diluio em srie das amostras. Utilizar o plaqueamento em duplicata para
duas diluies, de cada amostra, em cada um dos meios a serem analisados:
WLN diluies 10-7 e 10-8.
WLD plaqueamento direto e 10-1.
Lisina gar plaqueamento direto e 10-1.
LWYN plaqueamento direto e 10-1.
Utilizar a tcnica de espalhamento de 0,1 ml da suspenso de clulas em
superfcie e incubar as placas a 28C por 72 horas. Realizar as contagens das
colnias.
6.2 Bactrias
6.2.1 Contagem direta ao microscpio ptico

Essa tcnica mais adequada para a contagem de bastonetes, embora
outros tipos de bactrias (cocos) possam ser contados. Pode ser aplicado
na contagem de bastonetes em amostras de caldos primrio e misto, vinho
(em fermentao ou no final de fermentao) e levedo tratado ou no. um
mtodo rpido, de preciso relativa, sendo mais seguro e preciso quando o
nmero de bastonetes/ml da amostra est entre 106 e 107.
Objetivo avaliar a contaminao em amostras de caldos primria e mista,
vinho (em fermentao ou no final de fermentao) e levedo tratado ou no,
por meio da contagem de bastonetes.
Material pipetas graduadas (1 ml, 0,1 ml); lminas (26 x 76 mm); lamnulas (22 x 22 mm ou 20 x 20 mm); tubos de ensaio; agitador para tubos;
microscpio.
Reagentes azul de metileno; sulfato azul de nilo.
Procedimento a amostra de caldo deve ser filtrada em algodo para
eliminar as impurezas slidas. J a amostra da dorna utilizada da forma
e-Tec Brasil
60
como coletada. As amostras de vinho e de levedo devem ser previamente

diludas para que a visualizao ao microscpio no apresente mais que 3
a 5 bastonetes por campo. Misturar em tubo de ensaio partes iguais de
corante azul de metileno/sulfato azul de nilo e da amostra a ser analisada e
homogeneiz-los em agitador para tubos. Transferir 0,003 ml dessa mistura
para uma lmina de vidro, colocando sobre essa uma lamnula, sem formar
bolhas. Aps o preparo da lmina, observar ao microscpio ptico com a
objetiva de imerso (100x) e fazer a contagem dos bastonetes no corados
(vivos). As clulas viveis aparecero incolores e as no viveis coloridas de
azul intenso. O nmero mnimo de campos a serem contados depende da
amostra analisada, variando de 50 a 100. Exemplos:
Caldo primrio e misto = 70 campos.
Caldo clarificado e mosto = 100 campos.
Vinho e levedo tratado = 50 campos.
Figura 6.2: Contagem direta de bastonetes viveis e no viveis

Fonte: CTISM
Clculo N bastonetes/ml = FM x 1 / volume da amostra x M x D

Onde:

FM = fator do microscpio (rea preparao da lamnula / rea do

campo do microscpio)
M = total de bactrias vivas / n campos contados
D = diluio usada
61
e-Tec Brasil
6.2.2 Plaqueamento e diluio em srie

Para saber mais sobre a tcnica,
acesse:
asp?id=306&ordem=5
O mtodo de contagem de bactrias por plaqueamento o mesmo usado

para as leveduras. Pode ser utilizado para qualquer amostra, como: mosto,
vinho, leite de leveduras turbinado e tratado (concentrado de leveduras
obtido aps centrifugao), gua, etc., modificando-se apenas as diluies,
que variam de acordo com o material analisado e seu ndice de contaminao.
6.2.3 Colorao de Gram

Objetivo diferenciar bactrias tanto de suspenses lquidas como de colnias de cultivos slidos, por meio de reaes tinturiais da parede celular.
Procedimento preparo da lmina
Amostra lquida com a ala de platina, espalhar a suspenso em exame numa lmina limpa e seca. Deixar secar e fixar por aquecimento.
Deixar esfriar.
Cultivo slido colocar uma gota de gua sobre uma lmina de vidro.
Com a ala de platina, retirar uma pequena poro da colnia em cultura
slida e emulsion-la na gota, para obter uma suspenso uniforme. Espalhar at obter um esfregao fino. Deixar secar em temperatura ambiente,
no levando diretamente chama, para no modificar a morfologia dos
microrganismos.
Antes de corar, deixar que a lmina esfrie completamente.
Colorao cobrir o filme fixado com o corante cristal-violeta, deixando
agir por 2 minutos e depois lav-lo para retirar o excesso. Em seguida cobrir
o esfregao com soluo de iodo (lugol), que atuar como o mordente, deixando agir por mais 1 minuto e lavando-o. Neste momento, ambas as bactrias Gram-positivas e Gram-negativas adquirem cor prpura. A lmina
lavada sucessivamente com lcool a 95% ou com uma soluo de lcool-acetona, at que a soluo escorra da lmina sem nenhuma colorao, pois
estes atuam como descolorantes. Lavar em gua corrente. Fazer uma contracolorao com safranina, por 1 minuto, lavando-a em seguida. Deixar a
lmina secar e examin-la ao microscpio. As bactrias Gram-positivas retm
o corante prpuro, mesmo aps a lavagem com lcool, apresentando-se
coloridas de azul-violeta intenso. J as bactrias Gram-negativas aparecem
na cor vermelha, pois retm o contracorante safranina.
e-Tec Brasil
62
Observao
Essa tcnica no se aplica a microrganismos que sofreram danos fsicos
na membrana (ao do calor).
As clulas jovens tm maior afinidade pelos corantes, por isso recomendvel utilizar cultivos de 18 a 24 horas para obteno de melhores
resultados.
6.2.4 Caracterizao de Bacillus e Lactobacillus

Esses dois gneros de bactrias podem ser diferenciados por meio de
alguns testes, como: colorao de Gram, deteco de esporos, motilidade
e catalase. Antes de proced-los necessrio o isolamento da cultura. Para
isso, verter o meio de cultivo com inibidor de leveduras em placas de Petri,
levando estufa 35C por 48 horas. Isolar os diferentes tipos de colnia,
transferindo-as com agulha para meio de cultivo lquido. Incubar em estufa
por 24 horas e esfriar novamente, incubando em seguida por 24-48 horas.
Se for observado s um tipo de colnia, o microrganismo est isolado; se
no, proceder nova purificao.
6.2.4.1 Tcnica de colorao para identificao de esporos

De maneira geral, as bactrias dos gneros Bacillus e Clostridium so capazes
de formar estruturas de parede espessa, denominadas esporos ou endosporos, que lhes conferem extrema resistncia situaes adversas, podendo
sobreviver por longos perodos de tempo. Quando encontram-se em condies favorveis, esses esporos germinam, dando origem a uma nova clula.
O processo fermentativo pode ser bastante prejudicado pela presena dessas formas resistentes, que podem germinar, aumentando sensivelmente a
carga bacteriana, comprometendo toda a produo.
A deteco de esporos um mtodo de controle importante dentro da indstria sucroalcooleira. Pode ser feita por meio de cultivo em placas, depois de
germinadas, ou por contagem direta ao microscpio. A tcnica de colorao
pode ser feita para diferenciar os esporos das clulas vegetativas.
A colorao feita em esfregao preparado da mesma forma que na tcnica
de Gram, adicionando sobre a lmina de vidro gotas de soluo verde malaquita 5%. Deixar colorir por 1 minuto e aquecer para emisso de vapores
(no entrar em ebulio). Lavar e contracorar com safranina 0,5%. Lavar
63
e-Tec Brasil
novamente e deixar secar. Observar ao microscpio. As clulas vegetativas

so visualizadas em vermelho e os esporos em verde.
Figura 6.3: Colorao e identificao de endosporos

Fonte: http://microbiologiabrasil.blogspot.com/2008_12_01_archive.html
6.2.4.2 Teste de motilidade

Nesse teste podem ser utilizadas dois tipos de lminas: convencional ou com
concavidade para gota pendente. Ser descrito o mtodo com lmina convencional.
Colocar sobre a lmina uma gota de gua e transferir com auxlio de uma
agulha, uma poro da colnia do microrganismo, homogeneizando-a com
a gua. Cobrir com uma lamnula e observar ao microscpio, com objetiva
de imerso (100x). Se o microrganismo apresentar movimento em vrias
direes, ele tem motilidade.
6.2.4.3 Teste de catalase

Adicionar sobre a colnia do microrganismo uma gota de gua oxigenada a
3%. Se a cultura apresentar a enzima catalase, haver formao de efervescncia pela reao de converso da gua oxigenada em gua + O2.
e-Tec Brasil
64
Figura 6.4: Teste de catalase positivo

Fonte: http://randstarteam.blogspot.com/
6.2.4.4 Interpretao dos resultados

Bacillus so caracterizados por bastonetes Gram-positivos, presena de
esporos, clulas vegetativas com motilidade e presena de catalase.
Lactobacillus bastonetes Gram-positivos, sem esporos, clulas vegetativas
sem motilidade e ausncia de catalase.
6.3 Dextrana em caldo

Dextranas so polmeros de glicose, produzidos a partir de sacarose principalmente por bactrias do gnero Leuconostoc.
A penetrao de microrganismos no colmo, atravs de rachaduras, contamina a cana formando dextranas, cuja presena afeta a qualidade do acar
e a eficincia industrial. Ocorre perda de sacarose, aumento da viscosidade
do caldo e dificuldade de filtrao no processo industrial.
65
e-Tec Brasil
Objetivo obteno de um parmetro a ser usado na avaliao da qualidade da matria-prima.

Material pipetas (1 ml,10 ml, 25 ml); bquer (100 ml); bales volumtricos
(25 ml e 100 ml); tubos de ensaio; funil com filtro de vidro sintetizado (3D4);
espectrofotmetro; bureta (5 ml); centrfuga; tubos de centrfuga; papel de
filtro; banho-maria.
Reagentes dextrana; cido tricloroactico a 10%; etanol absoluto; etanol
a 80%; NaOH 2,5N (saturada com Na2SO4); reagente alcalino cprico; H2SO4
(2N); fenol 5%; H2SO4 concentrado.
Procedimento transferir 1 ml de soluo de NaOH (2,5N) (saturada com
Na2SO4) para tubo de centrfuga. Adicionar 5 ml de soluo problema. Adicionar 1 ml do reagente alcalino cprico - soluo de trabalho. Deixar em
gua fervente por 5 minutos. Esfriar. Centrifugar a 5.000 rpm por 20 minutos. Desprezar o sobrenadante. Adicionar 7 ml da soluo de lavagem, suspender e agitar o precipitado. Centrifugar novamente. Desprezar o sobrenadante, inverter os tubos e deixar cinco minutos gotejando. Dissolver o
precipitado com 2 ml de H2SO4 (2N) e transferir para balo de 25 ml. Lavar
com mais 2 ml de H2SO4 (2N) e depois com gua at 25 ml. Agitar. Transferir
2 ml para tubos de ensaios padronizados. Adicionar 1 ml de soluo de fenol
5%. Adicionar 5 ml de H2SO4 concentrado, devendo ser colocado rapidamente e no centro da soluo. Usar bureta com ponta raspada. Colocar os
tubos em banho-maria fervente durante 2 minutos. Esfriar. Fazer a leitura a
485 nm (filtro 50).
Observao usar 2 ml de padro de trabalho e 2 ml de gua destilada
como prova em branco.
Preparo do padro de trabalho deixar a dextrana, no mnimo, uma
semana em dessecador a vcuo. Pesar uma quantidade de dextrana que
contenha 250 mg de dextrana pura e dissolver em gua at 100 ml (soluo
estoque). Diluir 10 ml a 250 ml com gua destilada obtendo-se o padro de
trabalho que deve conter 0,02 mg/ml.
Clculo ppm de dextrana = 400 x (La-Lb)/(Lp-Lb)
Onde: La = leitura da amostra

Lb = leitura do branco

Lp = leitura do padro
e-Tec Brasil
66
6.4 Delta pH
Objetivo determinao da atividade microbiana (produo de cidos) em
caldos e mosto.
Material bquer de 250 ml; proveta de 100 ml; banho-maria ou estufa;
bureta; pHmetro.
Reagentes NaOH (1N); H3PO4 (1N).
Procedimento coletar amostra de caldo (primrio, misto, mosto) e filtrar,
se necessrio. Transferir 100 ml para um bquer e ajustar o pH para 5,5
(pH inicial, com NaOH (1N) ou H3PO4 (1N)). Incubar a 37C por 4 horas em
banho-maria ou estufa. Determinar o pH aps incubao (pH final).
Clculo Delta pH = pH inicial - pH final
6.5 Acidez sulfrica

Objetivo determinar a acidez em uma amostra de caldo e mosto.
Material bquer de 100 ml; bureta de 10 ml; pipeta volumtrica de 20 ml;
proveta de 50 ml; pHmetro.
Reagentes NaOH (1N).
Procedimento transferir 20 ml da amostra para um bquer de 100 ml.
Adicionar 50 ml de gua destilada. Titular com NaOH (0,1N) at pH 8,5.
Clculo Acidez = volume gasto de NaOH x fator 0,245 (g/L)
6.6 Nvel de floculao

Objetivo avaliar o nvel de floculao em vinho bruto.
Material proveta (100, 500 ou 1000 ml).
Procedimento coletar uma amostra do vinho na dorna, antes de centrifugar. Agitar para liberao de CO2. Colocar a amostra na proveta. Anotar o
volume do sobrenadante aps 15 minutos.
Expressar os resultados em % de floculao.
67
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6.7 Teste de sensibilidade de bactrias a

antimicrobianos
A avaliao de antimicrobianos utilizados na indstria alcooleira pode ser
feita atravs de algumas metodologias diferentes. Em nosso estudo apresentaremos um mtodo que se baseia na variao da acidez do meio e outro
pela determinao da variao da absorbncia, determinada por espectrofotometria.
6.7.1 Teste de variao da acidez

6.7.1.1 Preparo das solues-estoque
a) Soluo-estoque actidiona (inibidor de leveduras) pesar 0,1 g de
actidiona e dissolver em 100 ml de gua destilada.
b) Soluo-estoque de HJ pesar 0,01g de HJ, solubilizar em algumas
gotas de lcool e dissolver em 100 ml de gua destilada.
c) Soluo-estoque de virginiamicina pesar 0,01 g de virginiamicina, solubilizar em algumas gotas de lcool, dissolver em 100 ml de gua destilada.
d) Soluo-estoque de penicilina pesar 0,01 g de penicilina e dissolver
em 100 ml de gua destilada.
6.7.1.2 Procedimento
Preparar 4 Erlenmeyers de 250 ml, da seguinte forma:
a) Erlenmeyer 1 Testemunha colocar 70 ml de mosto de alimentao
+ 30 ml de vinho bruto + 1 ml da soluo-estoque de actidiona.
b) Erlenmeyer 2 Tratamento HJ 3 ppm (HJ) colocar 70 ml de mosto
de alimentao + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da soluo-estoque de
actidiona + 3 ml da soluo-estoque de HJ (= 3 ppm).
c) Erlenmeyer 3 Tratamento virginiamicina 3 ppm (V) colocar 70 ml
de mosto de alimentao + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da soluo-estoque de actidiona + 3 ml da soluo-estoque de virginiamicina (= 3 ppm).
d) Erlenmeyer 4 Tratamento penicilina (5 ppm) (P) colocar 70 ml de
mosto de alimentao + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da soluo-estoque e
de actidiona + 5 ml da soluo-estoque de penicilina (= 5 ppm).
e-Tec Brasil
68
Assim, temos:
Figura 6.5: Teste de variao de acidez

Fonte: CTISM
Em seguida, retirar 20 ml de cada Erlenmeyer para determinar a acidez inicial e, imediatamente incub-los em estufa a 35C por, aproximadamente,
6 horas. Aps esse perodo, retirar os Erlenmeyers da estufa e novamente
determinar a acidez (acidez final).
6.7.1.3 Determinao da acidez

Determinar a acidez sulfrica das 4 amostras (acidez inicial).
Procedimento utilizar 20 ml da amostra + 50 ml de gua destilada, ferver
por 2 minutos, e titular com NaOH 0,1N, at pH = 8,5. Anotar o volume
gasto para cada amostra.
Clculo Acidez (g H2SO4) = Volume de NaOH gasto x 0,245 x fator do NaOH
6.7.1.4 Interpretao dos resultados

Calcular a variao da acidez (acidez final acidez inicial) para as 4 amostras. A
amostra que apresentar a menor variao da acidez provavelmente corresponder ao antibitico mais recomendado para ser dosado na fermentao.
No exemplo da Tabela 6.1, o HJ foi o mais indicado, seguido da virginiamicina, e por ltimo, a penicilina.
69
e-Tec Brasil
Tabela 6.1: Variao de acidez das amostras

T
HJ (3 ppm)
V (3 ppm)
P (5 ppm)
Acidez inicial
0,82
0,84
0,84
0,83
Acidez final
1,31
0,88
0,91
0,98
Variao da acidez
0,49
0,04
0,07
0,15
Fonte: Amorim, 2000
6.7.2 absorbncia
Material e equipamentos tubos de ensaio com tampa rosquevel;
suporte para tubos de ensaio; pipetas esterilizadas de 2 ml e 10 ml; bquer;
estufa de esterilizao; estufa incubadora; autoclave ou similar; aquecedor
com agitao; espectrofotmetro.
Meio de cultivo YEPD.
Reagentes e produtos a serem testados actdiona 10 ppm; KAMORAN;
KAMORAN WP; CORSTAN; HJ GOLD; SPECTRAN 100E; TOP MIX; VIP-QR.
Preparo do inculo adicionar a um tubo contendo 9 ml de meio de cultivo YEPD esterilizado, 1 ml da amostra (vinho bruto coletado das dornas) a
ser testada. Incub-la por 24 horas a 35C.
Observao manter o bico de Bunsen aceso sobre a bancada de trabalho,
por 30 minutos antes do incio do teste e durante o mesmo.
Procedimento adicionar assepticamente 2 gotas de soluo de actidiona a
10 ppm (inibidor de leveduras) em tubos de ensaio contendo 9,7 ml de meio
de cultivo YEPD esterilizado. Utilizar 2 tubos (A e B) para cada concentrao
de cada antibitico a ser testado, um tubo para prova em branco e outro para
calibrao do aparelho. Identificar os tubos. Adicionar nos tubos A e prova em
branco 0,3 ml do inculo obtido anteriormente. Os tubos B para calibrao
no sero inoculados. Dosar os produtos a serem testados nos tubos identificados como A e B. Agitar os tubos. Efetuar a leitura inicial da absorbncia,
de todos os tubos, a 520 nm em espectofotmetro imediatamente aps a
dosagem dos produtos, usando para calibrao do aparelho o tubo reservado
para tal (YEPD esterilizado). Incubar os tubos a 35C por 6 horas. Efetuar a
leitura final de todos os tubos nas mesmas condies em que a leitura inicial
foi obtida.
e-Tec Brasil
70
Resultado absorbncia = absorbncia final (tubo Ax) absorbncia inicial (tubo Ax).
O produto que, comparativamente e nas mesmas condies de teste, apresentar a menor absorbncia, ser considerado o mais eficiente frente aos
contaminantes testados.
Observao o absorbncia obtido pelas leituras dos tubos B (sem inculo) deve ser o mais prximo de zero possvel. Se isso no ocorrer, deve-se
recorrer a outra metodologia para o teste, pois a interferncia dos prprios
produtos testados nos valores de absorbncia invalida o teste.
Resumo
Nessa aula, conhecemos as principais tcnicas de monitoramento microbiolgico empregadas no processo industrial de produo de lcool. Entre elas,
aprendemos mtodos aplicados ao controle da viabilidade celular, concentrao celular e brotamento em leveduras, identificao de bactrias e de
leveduras contaminantes, com seus objetivos e procedimentos especficos,
alm da caracterizao de Bacillus e Lactobacillus, contaminantes de grande
incidncia nos processos de produo. Vimos tambm testes de sensibilidade de bactrias a antimicrobianos, que so teis para evitar a resistncia
adquirida por bactrias a determinados antibiticos, possibilitando o uso
racional desses medicamentos na indstria sucroalcooleira.
1. Defina viabilidade celular, brotamento e concentrao de leveduras.
2. Com base nos dados abaixo, calcule a viabilidade celular, a porcentagem
de brotamento e a populao de leveduras:
Total de clulas vivas = 500
Total de clulas mortas = 50
Total de brotamentos vivos = 30
Diluio = 1:20
71
e-Tec Brasil
3. Explique por que a determinao da viabilidade celular um parmetro

importante para o controle do processo fermentativo.
4. Quais as tcnicas utilizadas para determinar a viabilidade celular?
5. Considerando-se a tcnica de Pour Plate, determine o nmero de clulas de levedura/ml (expresse em UFC/ml):
Diluio = 1/10.000
N colnias = 32
6. Como possvel fazer a deteco de leveduras selvagens? Explique.
7. Calcule o n bastonetes/ml da seguinte amostra:
N campos = 60
Diluio da amostra = 1:2
FM = 14017,9
Volume da amostra = 0,002 ml
N bastonetes contados = 263
8. A tcnica da colorao de Gram no pode ser feita em microrganismos
que tiveram suas membranas danificadas fisicamente. Explique por qu.
9. Aps a realizao dos testes de colorao de Gram, deteco de esporos,
motilidade e catalase para proceder caracterizao dos gneros Bacillus
e Lactobacillus, como essas bactrias podem ser diferenciadas?
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72
Aula 7 Microbiologia do acar

Objetivos
Conhecer os principais microrganismos contaminantes do acar,
suas caractersticas e importncia.
Conhecer as principais tcnicas de anlises de bactrias, leveduras
e bolores em acar.
Apresentar os padres microbiolgicos nacionais e internacionais
para qualidade do acar.
7.1 A importncia da microbiologia do acar

O acar produzido pelas usinas deve seguir padres microbiolgicos de
qualidade que permitam seu consumo de forma segura em bebidas, alimentos enlatados, doces, etc., a fim de no causar no s prejuzos econmicos,
mas principalmente os relacionados sade de seus consumidores.
Dentre os microrganismos presentes no ambiente de fabricao dos acares esto bactrias, fungos e leveduras, cujo monitoramento de grande
importncia para a manuteno da qualidade do produto. Os fatores que
contribuem para a ocorrncia de microrganismos nas indstrias do acar
resultam, na sua quase totalidade, do baixo nmero de medidas de qualidade e da ignorncia ou inobservncia das normas bsicas dos procedimentos de manipulao dos alimentos, como a aplicao das boas prticas de
fabricao (BPF), que so imprescindveis para produo de alimentos microbiologicamente seguros. As medidas de qualidade devem ser implantadas
em todas as etapas de processamento do acar, a fim de minimizar os problemas e proporcionar a produo de produtos que atendam aos padres
internacionais de qualidade.
Aula 7 - Microbiologia do acar
73
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7.2 Principais microrganismos relacionados

ao processo de fabricao do acar
7.2.1 Mesfilos aerbios totais
As espcies mais frequentemente encontradas em alimentos so provenientes do solo. Crescem em temperaturas entre 20 e 40C, em meio com pH
5,0 a 9,0. So bastonetes Gram-positivos, aerbios e anaerbios facultativos. So representados especialmente por bactrias do gnero Bacillus.
Todas as espcies desse gnero produzem esporos em meios aerbios, o
que lhes confere resistncia s condies adversas (antibiticos, extremos de
temperatura, etc.).
7.2.2 Bolores e leveduras

So microrganismos amplamente distribudos no meio ambiente, e se desenvolvem em meios menos favorveis ao desenvolvimento bacteriano, como
baixos valores de pH, altas concentraes de sal ou de acar, baixa temperatura de armazenagem, presena de antibiticos e exposio irradiao.
Podem causar deteriorao em alimentos, alterar o sabor, causar perda de
odores, provocarem descolorao da superfcie dos alimentos e levar produo de metablitos txicos.
A cana e o solo so as principais vias de entrada destes microrganismos na
indstria.
7.2.3 Esporos termfilos produtores de flat-sour

(acidez plana)
As bactrias produtoras de flat-sour so consideradas termfilas obrigatrias porque se desenvolvem bem entre 55 a 65C e seus esporos possuem
extrema resistncia a elevadas temperaturas. So difceis de serem destrudos no alimento ou na indstria de processamento. Elas promovem a acidificao dos produtos, por meio da reduo do pH, sem haver produo de
gs. So responsveis pela deteriorao de alimentos enlatados. Esta deteriorao chamada de flat-sour (acidez plana), j que este microrganismo
praticamente no produz gs, no provocando alteraes nas embalagens.
So bactrias encontradas no solo.
e-Tec Brasil
74
7.2.4 Esporos termfilos produtores de H2S

(bactrias de deteriorao sulfdrica)
So bactrias que promovem deteriorao em alimentos enlatados de baixa
acidez, como milho, ervilha, cogumelo, tornando os alimentos enegrecidos,
com odor caracterstico de sulfeto de hidrognio (semelhante a ovo podre),
sem mostrar, no entanto, sinais de estufamento. Estas bactrias podem contaminar o acar, se a temperatura de aquecimento (no processo de fabricao de acar cristal) no for suficiente para a inativao dos esporos. So
encontradas no solo.
7.2.5 Esporos termfilos produtores de gs

(no produtores de H2S)
So microrganismos anaerbios obrigatrios, no produtores de H2S. Apresentam intensa produo de cido e gs, sendo altamente sacarolticos, e
seus esporos tm elevada resistncia ao calor. A espcie mais importante
Clostridium thermosaccharolyticum. Essas bactrias no so produtoras
de toxinas ou infeces, diferentemente de algumas bactrias pertencentes
ao gnero Clostridium spp, que produzem poderosas neurotoxinas, como
C. tetani e C. botulinum, sendo consideradas patognicas e de grande
importncia na sade pblica. As bactrias produtoras de gs, no entanto,
causam deteriorao nos alimentos como acar, farinha, cereais, produtos
enlatados, etc. So encontradas no solo.
7.2.6 Coliformes totais e fecais

So enterobactrias, frequentemente encontrados no trato intestinal de animais, como Escherichia coli, e algumas espcies so encontradas em vegetais, como Enterobacter aerogenes. Crescem em vrios substratos e utilizam
carboidratos ou outros compostos orgnicos como fonte de energia. So
capazes de produzir quantidades considerveis de cidos e gs a partir de
acares, como a lactose. Causam sabores e odores desagradveis nos alimentos, tornando-os imprprios para o consumo humano. So considerados como indicadores de contaminao fecal e no se admite a sua presena
em alimentos.
75
e-Tec Brasil
Figura 7.1: Escherichia coli

Fonte: http://archive.microbelibrary.org/asmonly/details.asp?id=2038
7.2.7 Salmonellas
So enterobactrias, Gram-negativas, no esporuladas. Tambm fazem
parte das enterobactrias patognicas, causadoras de problemas gastrointestionais para o homem e animais. A via direta de entrada so os alimentos
e as amostras de acar que apresentam esse microrganismo, estando fora
dos padres microbiolgicos.
e-Tec Brasil
76
Figura 7.2: Salmonellas

Fonte: http://www.solabia.fr/solabia/produitsdiagnostic.nsf/sw_prod/8af14c118957deb2c12574c90031dbbd?opendocu
ment&lg=en&
7.2.8 Bacillus cereus

So bactrias Gram-positivas, cuja faixa de pH para crescimento est entre
4,9 e 9,3. So produtoras de toxinas, que podem levar a dois tipos de intoxicaes, causando dores abdominais, diarria intensa, nuseas moderadas
e raramente vmitos na forma clssica e na segunda forma, nusea aguda
seguida de vmito. So amplamente distribudas, podendo ser encontradas
no solo, poeira e gua.
77
e-Tec Brasil
Figura 7.3: Bacillus cereus

Fonte: http://archive.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccimages/articleimages/atlas-bld/bacillus%20cereus%20fig2.jpg
7.2.9 Staphilococcus aureus

So bactrias Gram-positivas, encontrados em cavidades nasais, garganta
e trato intestinal. Sua presena em alimentos indica manuseio inadequado,
com contaminao a partir da pele, boca e fossas nasais dos manipuladores,
bem como limpeza e sanitizao inadequada dos materiais e equipamentos.
Algumas cepas so produtoras de toxinas, causando intoxicaes alimentares. Os sintomas da contaminao por S. aureus mais comuns incluem
nuseas, vmitos, dores abdominais e diarria.
e-Tec Brasil
78
Figura 7.4: Staphilococcus aureus

Fonte: http://archive.microbelibrary.org/asmonly/details_print.asp?id=2040&lang=
7.3 Anlises microbiolgicas

As amostras devem ser as mais representativas possveis do lote a ser analisado. Deve-se coletar diariamente 50 g de acar para compor amostras
semanais ou mensais, acondicionando em frascos esterilizados. Para a execuo das anlises pesar 20 g de acar, de cada amostra, em Erlenmyer de
250 ml, previamente estril. Adicionar 100 ml de gua destilada e esterilizada. Agitar at a completa dissoluo do acar.
7.3.1 Contagem de bactrias mesfilas totais

(aerbias)
Retirar 5 ml da amostra preparada, distribuindo-as em 5 placas de Petri. Em
seguida, adicionar o meio de cultura glicose-triptona-gar. Aps homogeneizar e solidificar, proceder incubao das placas de Petri por 72 horas a
30C. Aps esse perodo, realizar as contagens das colnias produtoras de
cido, expressando o resultado total em UFC de mesfilos/g de acar.
79
e-Tec Brasil
Figura 7.5: Colnias de bactrias mesfilas aerbias

Fonte: Godoy, 2005
Figura 7.6: Colnias de bactrias mesfilas aerbias

Fonte: http://www.airelimpioilimitado.net/page/lema.html
e-Tec Brasil
80
7.3.2 Contagem de bolores e leveduras

Seguindo o mesmo procedimento anterior, distribuir volumes de 5 ml da
amostra em 5 placas de Petri e sobre as mesmas adicionar o meio de cultivo
BDA (Batata-Dextrose-gar), acidificado com pH 3,5. Aps homogeneizar e
solidificar, incubar por um perodo de 4 a 5 dias a 30C. Em seguida, realizar
as contagens de colnias de leveduras e de bolores e expressar os resultados
UFC de leveduras e bolores/g de acar.
Figura 7.7: Colnias de leveduras e bolores

Fonte: Godoy, 2005
7.3.3 Bactrias termfilas esporuladas

As amostras para contagem de bactrias termfilas esporuladas devem ser
submetidas primeiramente a choque trmico, levando-as ebulio por 5
minutos e em seguida resfriando com gua.
7.3.3.1 Contagem de esporos de bactrias termfilas

anaerbias totais e flat-sour (acidez plana)
Aps o choque trmico, distribuir 2 ml da amostra em cada uma das 5 placas de Petri. Em seguida adicionar o meio de cultura (glicose-triptona-gar),
homogeneizar, solidificar e incubar em estufa temperatura de 55C por 48
horas. As colnias de bactrias produtoras de flat-sour so circundadas
por um halo amarelo, que pode desaparecer aps a retirada das placas da
estufa. Por isso, proceder a contagem logo aps a retirada e expressar o
resultado em nmero de esporos termfilos flat-sour por 10 gramas de
acar, multiplicando o total por 5.
81
e-Tec Brasil
Figura 7.8: Colnias de bactrias produtoras de flat-sour

Fonte: Godoy, 2005

anaerbias produtoras de gs

(no produtores de H2S)
Aps choque trmico, distribuir 20 ml em 6 tubos de ensaios (3,3 ml/tubo)
contendo 20 ml do meio de fgado (Liver Broth) aquecidos a 55C. Vedar
os tubos com uma camada de parafina, mergulhando os tubos em gua
para solidificar. Incub-los em anaerobiose a 55C por 72 horas. Aps esse
perodo, realizar as contagens dos tubos positivos, isto , aqueles que apresentarem deslocamento da parafina para cima, indicando o crescimento das
bactrias termfilas presentes. Os resultados desse teste so apenas qualitativos, no podendo ser expressos em nmeros.
e-Tec Brasil
82
Figura 7.9: Termfilos anaerbios produtores de gs (no produtores de H2S)

Fonte: Godoy, 2005

anaerbias produtoras de H2S
Para a determinao de esporos anaerbios termfilos produtores de cido
sulfrico, distribuir 20 ml da amostra, submetida ao choque trmico, em 6
tubos de ensaio (3,3 ml/tubo) contendo o meio gar-sulfito, previamente
exaustados, ou seja, aquecidos a 55C. Colocar a amostra de 3,3 ml abaixo
da superfcie do meio, agitar suavemente, em seguida, evitando-se a introduo de ar. Aps solidificar, incubar os tubos a 55C por 48 horas. As colnias de deteriorao sulfdrica so negras. Realizar as contagens nos 6 tubos
e expressar o resultado como nmero de esporos por 10 gramas de acar.
83
e-Tec Brasil
Figura 7.10: Termfilos anaerbios produtores de H2S

Fonte: Godoy, 2005
7.3.4 Contagem de coliformes totais e fecais

Dissolver 10 g de acar em 90 ml de gua destilada esterilizada. Preparar
9 tubos de ensaio com 10 ml do meio de caldo lactosado em cada tubo,
com tubo de Durhan: 3 (grandes) em concentrao dupla e 6 (mdios) com
concentrao simples. Autoclavar 121C por 15 minutos. Em seguida, nos
tubos com concentrao dupla inocular 10 ml da amostra, nos 3 primeiros
de concentrao simples 1 ml e nos 3 ltimos 0,1 ml. Aps 48 horas de incubao temperatura de 37C, proceder o teste confirmativo nos tubos que
apresentarem resultados positivos (presena de gases no tubo de Durhan).
Com a ala de platina, repicar cada tubo positivo para tubos com 5 ml de
caldo Verde Brilhante 2% e tubos com 5 ml de meio EC. Incubar o meio
Verde Brilhante 2% por 24-48 horas temperatura de 37C, enquanto o
EC por 24 horas temperatura de 45C. O meio de cultura Verde Brilhante
2% usado como teste confirmativo para presena de coliformes totais e o
meio EC para bactrias do grupo dos coliformes fecais (Escherichia coli). Se
ocorrer produo de gs (fermentao), indica presena de coliformes totais
e fecais, respectivamente.
e-Tec Brasil
84
7.4 Padres internacionais para o controle

microbiolgico do acar
Veja na Tabela 7.1 os padres internacionais exigidos para controle microbiolgico do acar.
Tabela 7.1: Controle microbiolgico do acar
Termfilas
Exigido por
Mesfilas
Leveduras e
bolores
Flat-sour
H2S (+)
H2S (-)
Salmonella
sp
National
Canners
Association
50 UFC/g
50 UFC/g
50 esp/10 g
5 esp/10 g
< 65% dos

tubos (+)
ausente/
25 g
Natinal
Soft-Drinks
Association
200 UFC/10 g
10 UFC/10 g
ICUMSA
200 UFC/10g
20 UFC/10 g
50 esp/10 g
5 esp/10 g
< 65% dos

tubos (+)
Coca-Cola
Internacional
200 UFC/10 g
10 UFC/10 g
Fonte: Amorim, 2000
Resumo
Vimos nesta aula sobre os principais microrganismos contaminantes do
acar. Entre eles esto bactrias, fungos e leveduras, cujo monitoramento
e deteco so de grande importncia para a manuteno da qualidade
do produto. As medidas de qualidade devem ser implantadas em todas as
etapas de processamento do acar, a fim de minimizar os problemas e proporcionar a fabricao de produtos que atendam aos padres internacionais
de qualidade. Para isso aprendemos as principais caractersticas dos contaminantes e as anlises microbiolgicas respectivas para o devido controle.
1. Preencha as lacunas de acordo com as caractersticas dos principais contaminantes do acar:
a) Bactrias de deteriorao sulfdrica.
b) Termfilas produtoras de gs.
c) Bactrias produtoras flat-sour.
85
e-Tec Brasil
d) Salmonellas.
e) Staphilococcus aureus.
f) Mesfilos aerbios totais.
( ) Elas promovem a acidificao dos produtos, por meio da reduo do pH,
sem haver produo de gs.
( ) So enterobactrias, Gram-negativas, no esporuladas. Tambm fazem
parte das enterobactrias patognicas.
( ) So bastonetes Gram-positivos, esporulados aerbios e anaerbios facultativos, representados especialmente por bactrias do gnero Bacillus.
( ) Bactrias Gram-positivas, encontrados em cavidades nasais, garganta e
trato intestinal.
( ) So bactrias que promovem deteriorao em alimentos enlatados de
baixa acidez, com odor caracterstico semelhante a ovo podre.
( ) A espcie mais importante Clostridium thermosaccharolyticum.
2. Por que deve ser feito o controle microbiolgico do acar?
3. Como podem ser caracterizadas as colnias de bactrias produtoras de
flat-sour?
4. Na contagem de esporos de bactrias no produtoras de H2S, qual a funo da parafina? Explique.
e-Tec Brasil
86
Referncias
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e-Tec Brasil
88
Currculo do professor-autor
Darlene Ana de Paula Vieira Professora do Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia de Gois IFGois, atuando na rea biolgica.
Formada em biologia pela Pontifcia Universidade Catlica de Gois (1998),
com mestrado em Biologia pela Universidade Federal de Gois (2006). Acumulou experincia profissional de mais de 14 anos na rea de educao,
iniciou as suas atividades profissionais em 1994, como professora da rede
estadual de educao.
Nayara Cludia de Assuno Queiroz Fernandes atua como Tcnica em
Laboratrio de Cincias no Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia de Gois. Possui graduao em Farmcia pela Universidade Federal
de Gois (2005), com especializao em Cincias Biolgicas pelas Faculdades Integradas de Jacarepagu (2009). Acumulou experincia profissional
na rea de Farmcia Clnica, com aperfeioamento em Farmacologia Clnica
pelo Instituto de Ensino Ethosfharma (2006).
89
e-Tec Brasil

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Microbiologia Aplicada

Darlene Ana de Paula Vieira

Presidncia da Repblica Federativa do Brasil

Comisso de Acompanhamento e Validao

Ficha catalogrfica elaborada por Maria Aparecida Rodrigues de Souza

Apresentao e-Tec Brasil

Saiba mais: oferece novas informaes que enriquecem o

Aula 1 Tcnicas bsicas utilizadas em microbiologia

1.2 Materiais e equipamentos usados em laboratrio de microbiologia

Aula 2 Importncia da microbiologia no processo de produo 23

Aula 3 Microrganismos relevantes em processos industriais de

3.3 Antibiticos e bactericidas

Aula 4 Meios de cultura

Aula 5 Tcnicas de colorao e de contagem microbiolgica 47

Aula 6 Mtodos microbiolgicos aplicados produo de lcool 55

6.5 Acidez sulfrica

6.6 Nvel de floculao

6.7 Teste de sensibilidade de bactrias a antimicrobianos

Aula 7 Microbiologia do acar

7.2 Principais microrganismos relacionados ao processo de fabricao do acar

7.4 Padres internacionais para o controle microbiolgico do

Compreender a importncia das

Apresentar noes do processo de

Apresentar os microrganismos presentes

Definir meios de cultivo e apresentar

Conhecer as principais tcnicas de

Conhecer as principais tcnicas de

Conhecer os principais microrganismos

Aula 1 Tcnicas bsicas utilizadas em

1.1 Normas de segurana e de conduta em

Aula 1 - Tcnicas bsicas utilizadas em microbiologia

d) Usar obrigatoriamente jaleco no laboratrio, abotoado ou fechado, de

1.2 Materiais e equipamentos usados em

Aula 1 - Tcnicas bsicas utilizadas em microbiologia

e canho. A parte ptica (Figura 1.1) constituda por fonte de iluminao,

Figura 1.1: Partes do microscpio ptico

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Figura 1.2: Lmina hematimtrica ou cmara de Neubauer

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1.3 Tcnicas de esterilizao e desinfeco

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1.3.1 Calor seco

1.3.2 Calor mido

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Em condies ideais, o laboratrio deve ser isolado, ou ento o trabalho

Aula 1 - Tcnicas bsicas utilizadas em microbiologia

importante para o desenvolvimento de um bom trabalho no laboratrio,

Aula 2 Importncia da microbiologia

2.1 Microbiologia na indstria de acar e

Aula 2 - Importncia da microbiologia no processo de produo

O laboratrio de microbiologia dentro da usina de acar e lcool tem,

2.2 Etapas do processamento industrial da

Figura 2.1: Fluxograma de produo de acar e lcool

2.2.1 Produo do acar

Aula 2 - Importncia da microbiologia no processo de produo

Centrifugao a massa cozida segue s centrfugas para a separao

2.2.2 Produo do etanol

Resfriamento processo que visa adequar o caldo tratado ao processo

Assista ao vdeo Acar e lcool

Destilao o mosto fermentado (vinho) destilado em uma sequncia

2.3 Anlises rotineiras durante o

2.3.1 Lavagem da cana