PRACTICA NO 2 EXTRACCION DE ADN

1. INTRODUCCION
Las caractersticas de un organismo estn especificadas en su informacin
gentica, la cual est representada como una secuencia de cidos nucleicos,
donde la suma total de esta secuencia es lo que conforma su genoma.
Quizs de los procedimientos en biologa molecular, el ms bsico es la
purificacin de cidos nucleicos, en la forma de ADN o ARN. Por lo tanto se
requieren mtodos seguros para la separacin de estos componentes de las
clulas. Para lograr esto, se utilizan diversos mtodos de extraccin dependiendo
del tipo de tejido a emplear, fresco, seco o congelado.

2. OBJETIVOS

Identificar las etapas indispensables en los protocolos de extraccin de

ADN
Comparar varias tcnicas de extraccin de ADN
Realizar un procedimiento modelo para la obtencin de ADN

3. MARCO TEORICO
El primer paso en cualquier protocolo de separacin es el rompimiento del material
inicial, ya sea de origen viral, bacteriano, vegetal o animal. El mtodo utilizado
para romper la clula debe ser tan leve como sea posible con el fin de causar el
menor dao posible al ADN. La lisis celular se puede hacer por accin mecnica,
pulverizando el tejido con hielo seco o nitrgeno lquido, tambin se puede utilizar
la degradacin enzimtica de la pared celular (si est presente) y lisis con
detergentes de las membranas celulares. Seguido al rompimiento celular la
mayora de mtodos involucran una desproteinizacin, lo cual se lleva a cabo con
un solvente orgnico, seguido de una precipitacin con isopropanol o etanol y
posterior solubilizacin con agua o tampn.
Existen diferentes tcnicas para la extraccin del ADN, aunque todas conservan el
uso de los mismos principios y fundamentos.

Para obtener ADN a partir de leucocitos totales (obtenidos de sangre perifrica),

clulas en cultivo, tejidos animales, vegetales, levaduras y bacterias; se usa
generalmente una tcnica de cuatro pasos secuenciales:

El primer paso consiste en la lisis de las clulas y los ncleos.

Luego, la separacin del ADN a partir de sangre total involucra la lisis de
eritrocitos, seguida por una lisis de leucocitos y de sus ncleos.
Las protenas celulares son entonces removidas por un paso de
precipitacin salina, y
Finalmente el ADN genmico es concentrado por precipitacin con
isopropanol.

El ADN purificado por medio de este proceso, est listo para ser utilizado en
diferentes aplicaciones, las cuales involucran: amplificaciones (PCR), digestin
con endonucleasas de restriccin, Southern blot y Dot blot.
Existen otras tcnicas que permiten la obtencin de ADN genmico a partir de
muestras slidas y lquidas, que permiten la separacin simple, rpida, segura y
eficiente del ADN. Esta separacin se basa en la utilizacin del isotiocianato de
guanidina, como solucin de lisis celular, lo cual permite una precipitacin
selectiva del ADN con etanol y solubilizacin en agua o en 8 mM de NaOH. Este
procedimiento se puede realizar en 30 minutos, recobrando un 70% a un 100% del
ADN.

PRE- LABORATORIO
Diferentes mtodos y tecnologas estn disponibles en el mercado para realizar el
aislamiento de DNA genmico. En trminos generales la separacin del DNA de
los componentes celulares puede ser dividida en cuatro etapas:
a.
b.
c.
d.

Disrupcin o alteracin de la membrana

Lisis
Remocin de protenas y contaminantes
Recuperacin del DNA

Teniendo en cuenta el enunciado anterior responda:

Los pasos a y b son combinados. Se emplea un buffer de lisis que contiene
principalmente EDTA y SDS. Cul es la funcin de estos dos reactivos
dentro de este contexto?
Qu tipo de enzima se emplea para realizar la remocin de protenas?

La recuperacin del DNA se puede realizar mediante diferentes mtodos,

los ms comunes son: Salting-Out, extraccin orgnica con fenolcloroformo, gradientes de densidad de cloruro de cesio, mtodos basados
en slica-gel o resina quelante (Chelex). Diga cul es el principio de cada
uno de ellos?
3. MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos vacutainer con anticoagulante EDTA, heparina o citrato para obtencin de

sangre total (5 ml por mesa)
Tubos Falcon de 15 mL y Eppendorf estriles de 1.5 mL
Micro pipetas
Puntas estriles
Vortex
Centrifuga con rotor para tubos de 15 mL y Micro centrifuga para viales de 1.5 mL
Guantes
Agua desionizada estril
Bao de agua a 37 C
Isopropanol
Etanol 70%
Cloruro de amonio
Bicarbonato de potasio
EDTA
SDS
Acetato de amonio
Kit de extraccin de ADN para procariotes.
4. PREPARACION DE REACTIVOS
Se utilizaran kit comerciales segn disponibilidad en el laboratorio Central para
extraccin de ADN a partir de sangre perifrica y a partir de cultivo celular.
Tambin se puede utilizar el protocolo salting out preparando los siguientes
reactivos:
Buffer de lisis de glbulos rojos (100 mL):
0.83 g de Cloruro de Amonio
0.1 g de Bicarbonato de Potasio
0.2 mL de EDTA 0.5 M pH 8.0
80 mL de agua destilada estril
Mezclar en un erlenmeyer con magneto hasta homogenizacin completa.
Completar a 100 ml con agua destilada estril.
Autoclavar .
Almacenar a 4C.

 Buffer de lisis celular (100 ml):

5 ml de EDTA 0.5 M pH 8.0
20 ml de SDS 10%
60 ml de agua destilada estril
Mezclar cuidadosamente (evitando la formacin de espuma) en un erlenmeyer
hasta homogenizacin completa.
Completar a 100 ml en una probeta con agua destilada estril.
No Autoclavar.
Almacenar a temperatura ambiente
Solucin precipitante de protenas (50 ml):
38,54 g de Acetato de Amonio
10 ml de agua destilada estril
Mezclar en un erlenmeyer usando magneto hasta completa homogenizacin.
Puede requerir calentamiento ligero.
Completar a 50 ml con agua destilada estril.
Autoclavar
Almacenar a 4C.
Solucin de rehidratacin 10 ml
TE (Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM)
Preparar TRIS 1 M pH 8.0 100ml
PM 121.1g
EDTA 0.5 M pH 8.0 100ml
Y a partir de estos hacer la mezcla TE y dilucin correspondientes

6. PROCEDIMIENTO

TECNICA PROBE EXTRACCION DE ADN

Si se requiere utilizar volmenes pequeos de muestra seguir el protocolo

descrito en el anexo Master pure DNA purificacin Kit for Blood. Si no es
ese el caso realizar el siguiente protocolo:

1. En un tubo de 15 mL, medir 8 mL de buffer de lisis de glbulos rojos y sobre

este adicionar con una pipeta de transferencia plstica 2 mL de sangre

total. Mezclar muy bien y con mucha suavidad hasta lograr una completa
homogenizacin.
2. Agitar fuertemente durante 7 minutos a temperatura ambiente.
3. Centrifugar a 3000 R.P.M. durante 8 minutos (no frenar la centrifuga).
4. Descartar el sobrenadante y conservar el pellet.
5. Mezclar vigorosamente el pellet (vortex) en el lquido residual.
6. Adicionar 2.5 ml de buffer de lisis celular y mezclar varias veces, hasta
homogenizar. Dejar al menos 20 minutos a temperatura ambiente. (En este
paso se puede suspender el procedimiento, incluso hasta el da siguiente,
dejando los tubos a 4C).
7. Adicionar 800 l de solucin precipitante de protenas. Mezclar fuerte, hasta
observar grumos de las protenas precipitadas.
8. Centrifugar a 4000 R.P.M. durante 10 minutos, sin freno. (se recomienda
repetir este paso con la precaucin de conservar el sobrenadante y
descartar el precipitado).
9. Verter todo el sobrenadante sobre un tubo de 15 mL que contenga 2,4 mL
de isopropanol fro (alcohol isoproplico), dejar en reposo al menos unos 5
minutos.
10. Mezclar cuidadosamente por inversin hasta precipitar el ADN.
11. Envolver el ADN en una pipeta y pasarlo rpidamente por etanol al 70%
fro, dejar secar a temperatura ambiente y resuspender finalmente en
buffer TE (Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM) de 50-500 l, dependiendo de la
cantidad de ADN recuperado. Nota: El ADN se puede recuperar tomndolo
con pipeta Pasteur y centrifugando a 10.000 rpm por 5 min y lavar con 200
l etanol al 70%.
7. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

Qu procedimientos se requieren en la extraccin de ADN en clulas

procariotas?
En qu consiste el efecto caotrpico del isotiocianato de guanidina?
Consulte otras tcnicas o kit de extraccin de ADN y explique el
fundamento de tres de estas, especificando el uso de los reactivos claves
Qu conclusiones saca al comparar las diferentes tcnicas o kit de
extraccin de ADN?

5. BIBLIOGRAFA
-

Catlogos y fichas tcnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene,

Promega, Biorad, Biologend, Bioline, etc.

David, L.G. Dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular

biology. Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986

Perbal, B. A practical guide to molecular cloning. 2nd edition John Wiley 6

Sons, 1988
Sambrook, J. et al. 1989 Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2nd
edition, Col Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Catlogos de los Kit de Promega, Corpogen, Dnazol y Probes

9. AUTOEVALUACION.
NUMERO DE
LA PRACTICA

LOGRO
(Objetivos
cumplidos)
SI
NO

FORTALEZAS

DEBILIDADES

SUGERENCIAS
A
CADA
DEBILIDAD

ANEXO COMPLEMENTARIO A LA PRCTICA No. 2: EXTRACCIN DE ADN

PROTOCOLO PARA AISLAMIENTO DE ADN PROCARIOTICO

Este procedimiento se usa para el aislamiento de ADN genmico a partir de

bacterias grampositivas y gramnegativas. El ADN obtenido es apto para estudios
de PCR, RFLPs, RAPDs, etc.
Para la extraccin del ADN genmico, las bacterias son lisadas a 80C en
presencia de un detergente inico. La pared de bacterias grampositivas es
debilitada previamente con lisozima. Enseguida se remueven las protenas
contaminantes por medio de una alta concentracin salina y finalmente se
recupera el ADN genmico de alta calidad a partir de 1 ml de cultivo bacteriano,
con la ventaja de no utilizar solventes orgnicos txicos.
La lisozima se debe almacenar a -20C. El tampn de lisis usualmente forma un
precipitado al ser almacenado a 4C, se debe calentar por unos minutos a 37C en
bao de mara hasta que desaparezca el precipitado por completo.

MATERIALES Y REACTIVOS

Isopropanol. Grado biologa molecular a analtico

Etanol al 70%. Preparado a partir de etanol absoluto grado reactivo
Hielo
Micro centrifuga
Bao de calentamiento a 37C
Bao de calentamiento a 80C
Vortex
Tubos eppendorf de 1,5 ml para Micro centrifuga
Micro pipetas
Puntas para micro pipeta


1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.

PROCEDIMIENTO
Transferir 1 ml de cultivo bacteriano (de aproximadamente 16 horas) a un
tubo Eppendorf.
Centrifugar a 12000 RPM durante 5 minutos.
Desechar el sobrenadante y aadir 1 ml de solucin de lavado.
Centrifugar a 12000 RPM durante 1 minuto.
Desechar el sobrenadante dejando un volumen de 20 l aproximadamente.
Para bacterias gramnegativas continuar con el paso No. 12. Para bacterias
grampositivas seguir con el paso No. 7.
Agregar 480 l de EDTA 50 mM. Resuspenda muy bien.
Aadir 60 l de lisozima (10mg/ml). Mezclar suavemente.
Incubar a 37C durante 1 hora.
Centrifugar a 12000 RPM durante 2 minutos.
Desechar el sobrenadante dejando un volumen de 20 l aproximadamente.
Resuspender muy bien las clulas con el vortex.
Agregar 500 l de solucin de lisis. Mezclar suavemente por inversin.
Incubar a 80C por 5 minutos.
Dejar enfriar a temperatura ambiente y luego aadir 3 l de RNasa. Mezclar
por inversin 2 a 5 veces. El paso 15 y 16 se omitir en esta practica.
Incubar a 37C por 1 hora.
Dejar enfriar a temperatura ambiente y luego aadir 500 l de la solucin
de precipitacin de protenas (de alta concentracin salina).
Mezclar muy bien con el vortex durante 20 segundos.
Incubar en hielo por 5 minutos.
Centrifugar a 14000 RPM durante 10 minutos.
Transferir 1 ml del sobrenadante a un tubo Eppendorf nuevo, teniendo
cuidado de no tocar el precipitado.
Aadir 600 l de isopropanol. Mezclar muy bien por inversin.
Centrifugar a 14000 RPM por 5 minutos.
Desechar el sobrenadante.
Lavar 2 veces con 250 l de etanol al 70%. Centrifugar cada vez a 14000
RPM por 2 minutos.
Desechar el sobrenadante y dejar secar al aire durante 20 minutos.
Resuspender el ADN en una cantidad adecuada (50-100 l) de solucin de
resuspensin (TE).