Procesarea gi prezentarea Ag-nului Mult& vreme s-a crezut c& atat limfocitele B cat si limfocitele T recunosc Ag-nul in forma sa nativa, desi exista totusi perceptia cd cele dowd tipuri de limfocite utilizeaz mecanisme diferite pentru interactiunea cu Ag-nul. in 1974, Peter Doherty si Rolf Zinkernagel (Nobel in 1996) imunizeaz3 goareci cu LCMV (lymphocytic choriomeningitis virus) si constati cA limfocitele Te sunt capabile si ucida celulele infectate provenind de la acelagi soarece, dar nu si de la un soarece diferit. Astfel, a apirut notiunea de restrictie MHC. Gell si Benacerraf demonstraserd cu multi vreme in uma ci un RI. primar umoral gi celular poate fi indus de o proteind in forma sa nativa, un R.1. secundar in anticorpi (mediat de limfocitele B) poate fi indus doar de Ag native, in timp ce un RI. celular (mediat de limfocitele T) poate fi indus fie de Ag-nul nativ, fie de cel denaturat. Rezultatele au fost privite ca o enigma si semnificatia lor n-a fost infeleasd pand in 1980, Ziegler si Unanue demonstreaz3 ci activarea limfocitelor Th de citre proteine bacteriene poate fi impiedicati prin tratarea cu formaldchidi a APC-urilor inainte de expunerea la Ag. Daca ins APC-urilor li se permite ingestia antigenelor si abia dupa 1-3 ore sunt fixate cu paraformaldehida, atunci activarea limfocitelor Th poate avea loc. Townsend identifica proteinele virusului gripal recunoscute de catre limfocitele Te. in mod oarecum surprinzitor constati cd, cel mai adesea, peptidele recunoscute apartin mai degraba proteinelor matriceale si nucleocapsidei deat celor, mult mai expuse, ale anvelopei. De vreme ce majoritatea celulelor din organism au pe suprafati fie molecule MHC I sau MHC Il, care pot prezenta peptide limfocitelor T, toate ar trebui denumite celule prezentatoare de Ag. Prin conventie insé, aceasti denumire revine doar celulelor care posed molecula MHC II si prezinti Ag-nul limfocitelor Th, (LyT CD4+), in timp ce acele celule care prezintdi un Ag in cupa MHC I limfocitelor Te (LyT CD8+) sunt denumite celule tinta, Ag-nele intracelulare (endogene) gi cele extracelulare (exogene) sunt diferite din punct de vedere al mecanismelor imune puse in migcare. Astfel, Ag-nele extracelulare sunt eliminate in ‘mod eficient de c&tre anticorpi, in timp ce cele intracelulare sunt eliminate cel mai eficient de catre limfocitele Te. Pentru a media astfel de rispunsuri, sistemul imun utilizeaz’ dowd cai diferite de procesare si prezentare a Ag-nului. Modalitatea prin care un antigen penetreaz& intr-o celula si procesarea ulterioard pe care 0 sufera vor fi determinante pentru asocierea cu molecule MHC I sau II. Ag-nele endogene sunt procesate in citaso! si prezentate pe membrana in cupa moleculelor MHC I; Ag-nele exogene sunt procesate in calea endociticd si prezentate pe membrand in cupa moleculelor MAC TI. Infelegerea acestor fenomene a aparut ca urmare a studierii fiziologiei celulare, a manierei in care proteinele normale sau anormale se misca in interiorul celulei. ' Astizi exist ins& dovezi experimentale care atesti existenta unor clone atipice, cross-fuunctionale: linii de celuleT citotoxice CD4+ MHC Il restrctate si linit de celule T helper CD8+ MHC I restrictate.10 Nu se stie cu exactitate de ce proteinele nu sunt degradate pana la nivel de aa, probabil pentru ci fie 8 vor fi incarcate in cupa MHC, fie, pur si simplu, sunt mai rezistente. Citokinele din micromediu pot avea o actiune reglatorie asupra pH-ului compartimentului lizozomal si astfel asupra actiunii enzimelor, dupa cum si metoda de capturare a antigenului (receptor pentru manoza, receptor Fc, BCR, macropinocitoza, fagocitoza) poate influenta localizarea si progresia peptidelor antigenice. Mecanismul prin care un Ag se misc de la un compartiment la altul n-a fost ine& demonstrat cu claritate, existind sugestii potrivit carora lisosomii precoce se migc& spre interior pentru a deveni endosomi tardivi si apoi lisosomi, in timp ce alfii au sugerat existenta unor mii vezicule care sa transporte proteinele de la un compartiment al complexului Golgi la altul. Eventual, compartimentele endocitice, sau portiuni ale acestora, se intore la periferia celulei, acolo unde fuzioneazi cu membrana plasmaticd, in aceasti manieri putind fi reciclati receptorii celulari. Heroes ho t2e fro ™— angen Hnore Lanturile ct si ale MHC I, sintetizate la nivel ribosomal si introduse apoi in reticul, par si aiba gi cle nevoie initial de calnexina, un chaperon care si le protejeze cat timp aceste lanturi ‘si se poati plia si si poati forma cupa, De vreme ce APC-urile exprima atat MHC I cat gi MHC I, trebuie si existe un mecanism care si prevind incdrcarea aceluiasi set de peptide antigenice de citre MHC II ca si moleculele MHC I. Acest mecanism este reprezentat de fapt de un lant, denumit i (CD74) (invariant), care ocup3 cupa MHC I, prevenind inedrcarea peptidelor derivate din citosol si transportate de catre TAP. Trei perechi de molecule o: $i B se asociazi cu un trimer li preasamblat. Totodati, lantul Ii actioneaza si ca un chaperon, parand s& fie implicat gi in plierea corectd a lanturilor 0. si B, iegirea moleculei din RER gi orientarea consecutiva a MHC If din refeaua trans-Golgi catre calea endociticd de procesare (in compartimentul numit MIC, MHC class II compartments), ca urmare a existenfei unor semnale de sortare la nivelul cozii citoplasmatice. in cadrul caii endocitice, complexele se misca de la nivelul endosomilor precoce, la nivelul celor tardivi si apoi citre lisosomi. Pe masurd ce activitatea proteolitica creste, lantul i este in cele din urma degradat, iar in cup nu mai rimine decat un peptid scurt denumit CLIP (classi II — associated invariant chain peptide). CLIP ocupa fizic cupa, ceea ce va preveni o legare prematur a vreunui peptid Ag-nic, dar si degradarea MHC II. inert dee alesis expr da HE, dindose ge compet enevoma pt na Ns \\osterce viens © moleculd MHC II non-clasic’, HLA-DM, joacd un rol foarte important in inlaturarea CLIP, catalizind schimbul dintre CLIP si un peptid antigenic. Reactia dintre HLA-DM si CLIP poate fi inhibati de prezenta HLA-DO (exprimat doar in celulele B si in celulele epiteliale timice), care se leagi la HLA-DM gi blocheazi astfel schimbul. Initial s-a crezut cf dati fiind invaribilitatea lantului fi, legarea CLIP la cupa MHC I nu se fiicea intr-o manierd stabila si tocmai aceasta instabilitate era cea care facilita inlocuirea sa cu12 un alt peptid. Astizi, ca urmare a izolarii complexului HLA-DR3 ~ CLIP dintr-o linie celular incapabild si exprime HLA-DM, stim c& legarea CLIP se face in aceeasi maniera ca si un peptid Ag-nic adevarat Ca si in cazul MHC |, prezenta unui peptid in cupa MHC II se dovedeste imperios necesari pentru stabilitatea molecule’, Odati peptidul legat, complexul este transportat 1a suprafaa celulei, acolo unde pH-u! neutru permite obfinerea unei forme compacte, stabile. Peptidul este Jegat atat de puternic incdt, in conditii fiziologice, peptidul Ag-nic nu mai poate fi inlocuit. Interactiunea MHC I -peptid Moleculele MHC I prezinta peptide endogene, derivate din calea endogent. Peptidele sunt prezentate limfocitelor Te. . Fiecare tip de MHC 1 (A, B sau C) leagi un set unic de peptide. in plus, fiecare variant alelicd de moleculé MHC I leagi un set diferit de peptide. Pe suprafata unei celule nucleate se gisesc aproximativ 10° copii ale fiecdrui tip de molecul’ MHC I. Astfel, pe suprafata unei celule pot fi prezentate simultan un numar foarte mare de peptide diferite. Complexele MHC-peptid au fost izolate de pe suprafata celulelor, purificate si apoi denaturate pentru ca peptidul si fie eliberat. O celula normala prezinta peptide self derivate din proteine intracelulare: citocrom c, proteine ribosomale etc. Celulele infectate prezinti (de ex.) peptide virale. S-a demonstrat c& doud variante alelice ale aceleiagi molecule MHC 1 pot prezenta mai mult de 2000 de peptide diferite gi fiecare dintre ele este prezentat cu o freeventi intre 100 si 4000 de copii pe celula. Un limfocit Te poate fi activat de 100 de complexe MHC Vpeptid. Peptidele prezentate de MHC I au lungimi cuprinse intre 8 si 10 aa (cel mai freevent 9) si contin anumite secvente necesare pentru legarea la cup. Acesti aa sunt denumiti reziduuri ancora. Lanturile laterale ale reziduurilor ancora intr in buzunarele cupei. Ancorele sunt formate din reziduuri_hi it in). Majoritatea ancorelor sunt situate la capitul C-terminal, dar existd si la capaitul N terminal. Studiile de cristalografie au aritat c& peptidul se leagi la cele doud capete in cup’, dar c& la mijloc se curbeazi si ia contact cu TCR. Interactiunea MHC II — peptid MHC I prezinté peptide exogene, derivate din calea endocitic’ de procesare, pentru limfocitele Th. ‘Majoritatea peptidelor asociate cu MHC II sunt derivate din proteine membranare sau proteine asociate veziculelor ciii endocitice. Proteinele membranare sunt intemalizate prin fagocitoza sau endocitozi. Alte peptide sunt derivate din digestia lantului invariant. ‘Au fost efectuate studii similare ca in cazul MHC I; complexele MHC I ~ peptid au fost inkiturate de pe suprafata celulei, denaturate si peptidul izolat. Peptidele prezentate de MHC Il au lungimi cuprinse intre 13-18 aa, deci mai lungi decat cele din MHC I(9 aa). Cupa de legare a MHC I este deschisi la amandonii capetele, astfel ca peptidele prezentate pot s& atime peste cele doud margini — de aceea MHC II poate prezenta peptide mai lungi in conditiile in care lungimea cupei este comparabilé cu cea a MHC I. Capacitatea unui peptid de a se putea lega la cupa MHC II este dat de cei 13 aa centrali, chiar daca peptidul este mai lung. Peptidele prezentate de MHC II nu stau la fel de ridicate pe podeaua cupei, asa cum stau cele din MHC I.13 Peptidele prezentate in MHC Il, chiar dacd prezinta motive conservate, nu prezintd aa ancoré la capete; in schimb, se formeazi legituri de hidrogen intre aa centrali ai peptidului si cup. Punctele majore de contact sunt confinute intr-o secventi de 7-10 aa, care prezinté aa aromatici_ sau hidrofobi la capatul N-terminal si 3 aa hidrofobi suplimentari in mijloc gi la capatul C-terminal. 30% din peptidele din cupa MHC II prezinta prolind in pozitia 2 si alte proline la capatul C- terminal. Incapacitatea de a raspunde la un Ag Pe suprafata unei singure celule pot fi expuse circa 6 tipuri de molecule diferite de MHC I gi 10-20 de MHC IJ. Pentru ca un Ag sa genereze un raspuns al limfocitelor T, cel putin un peptid rezultat in urma procesirii trebuie si se lege la una dintre aceste molecule MHC. Un peptid. care nu se leaga la 0 moleculi MHC nu poate activa un rispuns al limfocitelor T. ‘Astfel, este posibil ca unii indivizi si poati rispunde fat de un anumit peptid, iar alti indivizi, distincti din punct de vedere al setului de gene si molecule MHC, s& nu poatd raspunde. Daca un intreg antigen nu conduce la generarea macar a unui peptid capabil si se lege la o moleculd MHC, acel individ nu va declansa un R.I. fata de acel particular Ag. Un astfel de comportament a fost descris la anumite speci de soareci, ca rispuns la anumiti polimeri sintetici de aa care contin un numér foarte limitat de epitopi. in general, incapacitatea de a rispunde fat de un patogen natural este rar, deoarece patogenii contin epitopi multipli. Prezentarea unor Ag bacteriene non-peptidice Moleculele MHC sunt capabile si prezinte exclusiv peptide limfocitelor T. Totusi, este dovedit faptul c& S.L recunoaste si Ag neproteice. Experimente efectuate cu Mycobacterium tuberculosis ne-au ajutat sa infelegem maniera prin care lipide si glicolipide sunt prezentate de catre membri ai familiei CD1. Familia CD1 este formata din molecule care nu sunt codate de gene de la nivelul MHC si formeazi un sistem de prezentare a antigenului complet distinct fafd de MHC-urile clasice de clas I sau II si chiar moleculele MHC-like. Pana in prezent, sunt descrise 5 gene CD1 nepolimorfice la om (CD1a, CD1b, CDIc, CD1d, CDle) si doi homologi la rozitoare. Produsii proteici ai acestor gene au fost clasificati in doud grupe, pe baza strueturii $i distributiei tisulare. Grupul I de proteine CDI (CD1a, b si ¢ uman) este exprimat din abundenti la nivelul unor celule prezentatoare de antigen profesionale cum ar fi celulele Langerhans, celulele dendritice din ganglionii limfatici, celulele B din zona manta si monocitele activate. Grupul II de proteine CD1 (CD1d uman si CDId1 si Cd1d2 murine) este exprimat la nivele crescute la nivelul epiteliului intestinal. Moleculele din familia CD1 au o structura similar cu cea a MHC I, find formate dintr-un_ lant B2 microglobulind, asociat cu un lant greu de tip &. Identitatea de structura a moleculelor CDI ou cele ale MHC I clasice este scdzuté. Astfel, domeniul 03 al CDI seaman’ mai degraba cu cel al 82 microglobulinei decat cu cel 03 al MHC I. Nu exist practic homologie de secventi la nivelul domeniului at! si este extrem de limitat la nivelul domeniului 02. Desi considerata ca o molecula MHC-like, homologia cu domeniul 03 arata ca CDI este la fel de indepartat de MHC I ca si de MHC II. S-a aritat c8 CDIb actioneaz’ ca un element de restrictie in prezentarea de lipide (acid micolic), componente ale peretelui bacterian al M. tuberculosis. Alte studii au revelat14 prezentarea de citre CDI de glicolipide (lipoarabinomanan) derivate din M. leprae. Spre deosebire de peptidele prezentate de citre moleculele MHC I clasice, prezentarea acestor antigene este independenta de TAP-1 si TAP-2 si nu e sensibila nici la cloroquind, (sugerind c& mu apare nici necesitatea unei acidificdri endosomale), demonstrindu-se astfel ci procesarea antigenelor destinate CD1 este diferitd fata de cea utilizati de MHC I (celulele ‘TAP deficiente sunt capabile s4 prezinte antigene asociate CD1). in ciuda localizarii CDI la nivel endosomal, prezentarea apare independent de HLA-DM. Practic, este vorba de o treia astfel de cale, un sistem distinct, prezentind etape intracelulare distincte, necesitnd molecule distinete, capabild si prezinte antigene neproteice limfocitelor T. a cor pid Antigen | ‘Souree Qaeiioas 81D Ganghoise GY cuca sal s! coca ou§ ‘Glucose e 1320) Mycobactea monermssiaies ——Ga_O. ° a a eos) Myeebacaria 3 Ca1d exgakotey! Marine sponge ceramideAntigene endogene — Calea citosolica Calea prin care antigenele endogene sunt degradate in vederea prezentairii in cupa MHC I este in fapt aceeasi utilizati de c&tre celula pentru turn-over-ul normal al proteinelor celulare. in celulele eukariote, nivelul de proteine este reglat foarte atent. Fiecare protein produsi va fi de asemenea degradata intr-un anumit ritm, masurat prin ceea ce denumim half-life (perioada de injumitatire). Unele proteine, cum ar fi factorii de transcriptie, ciclinele, anumite enzime metabolice, au perioade injumétitire foarte scurte. Proteinele care nu s-au pliat complet, moleculele incomplete, anormale sunt, de asemenea, degradate foarte repede. Toate aceste proteine intracelulare sunt degradate rapid in peptide scurte cu ajutorul unui sistem proteolitic Citosolic prezent in toate celulele. Cu ajutorul unei enzime, proteinelor destinate proteolizei li se atageazi covalent la gruparile NH; ale catenelor laterale de lizind polimeri ale unui mic peptid (76 aa), denumit ubiguitina. Se crede c& enzimele de ubiquitinare sunt capabile si identifice 0 serie de modificari post-translationale, cum ar fi fosforilari, defosforilari, glicozilari, Conjugatele proteind-poli-ubiquitina pot fi astfel degradate cu ajutorul unui organit non- lizozomal, cu functie de proteazi multifunctionala, denumit proteasom. Proteasomii sunt complexe de cca 700 kDa, formate din multiple subunitati, care posed activitati catalitice multiple. Existi 2 tipuri de proteasomi: ,house-keeping” sau standard (datorita prezentei sale {in orice celula si datorita functiei sale) si imunoproteasomi. Ambele tipuri de proteasomi au in mijlocul lor un ,,miez” comun (denumit si 20S). Foor & at PPp recor: A =D Mf, ok Sven GL, » mm ne f = eeteene 2552 aN he SIS Acesta este alcatuit ca o particula cilindricd format din patru unitii inelare, delimitand un canal inter cu un diametru de 10-50 A. Inelele de la bazai si de la varf, sunt compuse din cate 7 subunitati tip a, in timp ce inelele din mijloc sunt compuse din cate 7 subunitati B. Aceste subunititi sunt codate de gene distincte si au seevente de aa distincte. Subunitatile @ ale proteasomului mentin forma miezului, in timp 3 dintre subunitatile 8 (BI, B2 si B5) reprezinta componentele catalitice active. Subunititile P sunt structurate astfel incat situsurile active enzimatic sunt situate la fata interna a cilindrului, Proteasomul poate cliva legaturi peptidice dintre 2 sau 3 combinatii de aa (consensus peptide motifs) in cadrul unui proces ATP- dependent, iar degradarea complexelor proteind-ubiquitin’ se produce in interiorul proteasomului, prevenindu-se astfel liza altor proteine in interiorul citoplasmei.Proteasomul standard (denumit si 26S) este format din proteasonmul 20S, la care se adauga 2 copii ale structurii denumite complex reglator 19S”. Acesta confine aproximativ 20 de proteine diferite, inclusiv 6 ATPaze (implicate in recunoasterea ubiquitinei) si enzime implicate in desfacerea (unfolding) si translocarea proteinclor. Peptidele care rezulta prin actiunea proteasomului standard variaza in lungime intre 3-22 aa, un procent de cca. 20% dintre peptidele rezultate avand o medie de 8-10 aa, adecvati cupei MHC I. Dovezile experimentale arati ci si sistemul imun utilizeazi aceasta cale de degradare a proteinelor antigenice pentru a produce peptide mici destinate prezentérii in MHC L. Expunerea celulelor Ia citokine pro-inflamatorii precum IFNy si TNF pare si modifice proteasomul, Cele 3 unitati/situsuri catalitice B ale proteasomului standard sunt inlocuite de subunititile LMP2 si LMP7 (codate de genele situate in complexul MHC) si MECL-1 (codata in afara complexului MHC). Unitatea reglatorie 19S a proteasomului standard este inlocuit cu un complex reglator distinct (11S sau PA28), care se dovedeste esential pentru incorporarea LMP-2, LMP-7 si MECL-1. Faptul ca si expresia acestor unitii este stimulatd de IFNy si TNF arati ca in timpul unui rspuns imun impotriva unui patogen este favorizatd asamblarea imunoproteasomilor. Astfel de proteasomi sunt capabili si hidrolizeze legiturile peptidice consecutive reziduurilor bazice si/sau hidrofobe, dar ubiquitinarea proteinelor nu ‘mai este necesari. Nu intimplitor, peptidele care se leagi la MHC I se termina aproape exclusiv cu reziduuri hidrofobice sau bazice. Deoarece proteasomii imuni cliveazi preferential anumite secvente, aceasta ajutd la selectarea peptidelor care vor fi incdircate in fiecare aleli MHC I. *Proteasomul imun este capabil sa cliveze proteine nou sintetizate, unele inainte ca translatia siise fi incheiat. CLASS I REGION CLASS Ill REGION ? 1 i a ME RTT TL ee aa 08 G08 it i eo caassinecion : = pyPeptidele rezultate ca urmare a actiunii proteasomului trebuie insi transportate in reticulul endoplasmatic, acolo unde moleculele MHC sunt asamblate. Experimentele lui Townsend au demonstrat rolul critic al peptidului pentru stabilizarea moleculelor de MHC I si astfel pentru exprimarea ei pe suprafata celulei. Transportul peptidelor in RER este asigurat de TAP (transporters associated with antigen processing), un heterodimer format din TAP 1 si TAP 2. in plus fat de multiplele lor segmente transmembranare, fiecare din cele doua prezinta un domeniu hidrofobic, despre care se crede ef stribate membrana si patrunde in lumenul RER si un domeniu citosolic care leagi ATP-ul. TAP 1 si2 apartin unei familii de molecule (ATP-binding cassete proteins) gisite in membrana multor celule (inclusiv bacterii) si mediazi transportul ATP-depedent de aa, zaharui, ioni, peptide. Astfel, peptidele generate in citosol de cétre proteasom sunt translocate de citre TAP in RER printr-un proces care necesita hidroliza ATP. TAP prezinta cea mai mare afinitate pentru peptide formate din 8-13 aa, ceea ce reprezintd de altfel si lungimea optim’ a peptidului care ar putea fi prezentat de catre MHC I. De asemenea, TAP pare si favorizeze peptide cu aa carboxi-terminali bazici sau hidrofobi, ancorele preferate ale MHC P°, Peptidele rezultate din procesare si care trebuie transportate in reticul nu se gisesc insi libere fn citosol, ci sunt chaperonate de citre proteine de soc termic hsp70, hsp90 si hsp110. Proteinele de soc termic sunt inalt conservate in toate organismele si reprezinté un subgrup dintr-un grup mai larg denumit ,.proteine de stress”. Expresia hsp creste dramatic in celule ca urmare a stress-ului, cum ar fi cresterea bruscd a temperaturii, transformarea malign sau raspunsul inflamator. in contextul prezentérii antigenice, hsp70, hsp90 si hsp110 transport peptidele de la nivelul proteasomului catre partea citosolicd a TAP, in timp ce molecule chaperon rezidente in ER (gp96, grp170, BiP) preiau peptidele transportate si le leaga la partea din ER a TAP. Transferul de la proteasom la TAP nu necesita energie, dar transportul eptidelor in ER se face cu consum energetic. S-a estimat ci TAP poate transloca mai mult de 20 000 de peptide/min/celulé si astfel furnizeazi suficiente peptide moleculelor MHC I nascente, care sunt produse la 0 rat de 10-100/min. Genele TAP 1 si TAP 2 sunt adjacente celor care codeazi pentru LMP 2 si 7, in cadrul complexului genic MHC. Atat genele TAP cat si LMP sunt polimorfice (prezinti o serie de variante alelice), ceea ce ar putea explica, printre altele, susceptibilitatea diferiti a unor indivizi de a rispunde diferit fata de diferite antigene endogene. ? Moleculele TAP au ,preferinge” dpdv al anumitor tipuri de aa, la nivelul anumitor pozitii. Unele dintre aceste preferinte sunt specifice speciei. Astfel, TAP de goarece se leaga la peptide cu reziduuri aromatice sau alifatice la capatul C terminalchao Ca gi alte proteine, lanturile 0 si 2 microglobulina ale MHC I sunt sintetizate la nivel ribosomal (in polisomii situati de-a lungul membranei RER) si apoi translocate in reticul. ‘Molecula complet de MHC I necesitd nu doar aceste lanturi, pliate si asamblate corect, ci si prezenta peptidului din cupa, Asamblarea acestor componente intr-o moleculi stabild, care s& poati partisi RER, are loc in cdteva etape care implica participarea unor chaperoni moleculari, care vor facilita plierea polipeptidelor. Primul astfel de chaperon care intra in actiune este calnexina, 0 proteini de 88 de kDa, rezident al membranei reticulului endoplasmatic. Calnexina se asociaz cu grupurile glico7il ale lanfurilor ct libere, promovaind plierea acestuia si formarea legiturilor disulfidice. Totodati, calnexina coordoneaz asocierea lanfului fr.G (care este sintetizat si exprimat in mod sincron cu lanful a). La om, cand lantul B2 microglobulind se leagi la lantul a, calnexina este eliberata si inlocuité cu un al doilea chaperon, calreticulina (un omolog solubil al calnexinei). in plus fata de acesti chaperoni, molecula MHC I este asociaté cu 0 oxidoreductaza thiol-dependenté numita ErpS7 (endoplasmic reticulum protein 57), care catalizeazd formarea si desfacerea legiturilor disulfidice. O alti moleculi denumita tapasina (TAP-associated protein), va fi de asemenea asociati acestui complex. Tapasina este o glicoproteind transmembranard de 48 kDa, membri a superfamiliei imunoglobulinelor, bogata in prolin’. Domeniul transmembranar hidrofobie confine un reziduu de liziné care interactioneaz& cu transportorul TAP. Ca gi in cazul altor gene ce codeaza pentru molecule implicate in procesarea antigenului, expresia genei pentru tapasina’ poate fi indusa de catre IFNy. De vreme ce moleculele de tapasina prezinta situsuri de legare distincte pentru lantul a al MHC gi TAP, se crede ci tapasina functioneazi ca 0 * Gena pentru tapasina umana este localizata in afara complexului MHC uman, dar doar la 500 de kb de genele care codeaza pentru TAP.punte intre MHC si TAP, ajutand la stabilizarea moleculei MHC I intr-o conformatie adecvata pentru incdrcarea unui peptid’, Asocierea fizic& a heterodimerului format din lanful ot si B2 microglobulind cu proteina TAP faciliteazd capturarea peptidului inainte ca acesta si fie expus mediului din interiorul RER. Peptidele care nu sunt capturate astfel de citre MHC T sunt rapid degradate. Un heterodimer TAP este legat de 4 molecule de tapasind (si astfel la 4 molecule MHC I, complexate cu calreticulind si Erp57), ceea ce face si creased sansa ca peptidul si poatd fi legat micar la cupa unei molecule MHC I. Tapasina ar mai putea avea rolul de a refine in reticul acele molecule MHC I care au fost inedrcate incorect sau suboptimal. Consecinta a legirii peptidului, MHC I devine stabild gi se poate disocia de chaperoni, poate iegi din RER si, via complexul Golgi, se indreaptd spre suprafata celulara. Antigene exogene — Calea endocitics APC ~ celule prezentatoare de antigen: in aveasti categorie functional sunt incluse celule diverse, aparent foarte diferite intre ele, Caracteristica lor comuna este aceea cd prezinté pe suprafata lor molecula MHC Il. Implicit, aceste celule sunt capabile si proceseze Ag-nul pe calea endocitica, si-I prezinte limfocitelor Th, dar, mai mult decat atat, cle trebuie, de asemenea, si fie capabile s& furnizeze acestor limfocite si un semnal denumit co-stimulator. Doar un numa limitat de celule pot functiona ca celule prezentatoare de antigen (APC) profesionale, datorita expresiei de MHC II si de molecule co-stimulatorii, celule care sunt astfel capabile si activeze ficient limfocitele Th. Celulele prezentatoare de antigen profesionale includ celulele dendritice (DC), limfocitele B si monocitele/macrofagele. Aceste celule difera intre ele din punct de vedere al mecanismului de preluare a Ag-nului, al expresiei constitutive de MHC II ¢i al activititii co-stimulatorii. O serie de alte celule pot fi stimulate astfel incdt si exprime tranzitoriu MHC Il, de obicei in cursul unui rispuns inflamator: fibroblaste dermice, celule gliale (SNC), celule pancreatice beta, celule epiteliale timice, celule epiteliale tiroidiene, dar si alte celule epiteliale, celule endoteliale sau mezenchimale. Aceste celule sunt capabile si actioneze ca APC-uri neprofesionale, pentru o perioada limitata de timp; incapacitatea lor de a oferi semnale co-stimulatoare face ca rolul acestor celule in activarea limfocitelor T si fie limitat. Pe baza expresiei a diversi markeri, a functiei si a localizirii lor in organism, au fost identificate multiple subseturi de celule dendritice (atat la om cat gi la goarece). Mai bine caracterizate, DC murine pot fi impartite astfel: - DC timice - DC conventionale (denumite si interdigitate) — identificate in splina si ganglioni: A. derivate din sange (splina nu are vase de singe si receptioneazii doar astfel de DC) a) CD8+: odati stimulate, produc cantititi crescute de IL-12, induc diferentierea de limfocite Th1 gi determini proliferarea limfocitelor Te b) CD4#: se giisesc in special in zona marginal’ a splinei, ©) CD4- CD8+ se gisesc mai ales in gel. B. derivate din tesut (care sunt prezente in ganglionii limfatici si alte organe limfoide secundare gi timus): a) celule Langerhans (LC): se gasesc in epiderm; contin granule Birbeck (tubuli citoplasmatici cu aspect striat, legati de membrana plasmatic4, care contin leetine ce pot functiona in procesul de endocitoza). “ Functia tapasinei este similard celei a moleculei HLA-DM+b) DC interstitiale: care se gisesc in aproape toate tesuturile periferice non-limfoide. - DC plasmacitoide: exprima B220 (marker de celula B), au continut crescut de RE, exprima CD4 si/sau CD8, IL-3R. Sunt localizate preferential in singe si ganglionii limfatici. La stimularea cu produsi ai patogenilor secreta IFNa si IFNB. *La om, DC conventionale derivate din singe gi din tesuturi sunt denumite celule DCI, iar cele plasmacitoide sunt denumite DC2. aero Ta Conner rena non ce erp pedan De asemenea, DC pot fi impartite in DC mature gi imature. Precursorii diferitelor subseturi ‘migreaza in sange si insémanteaza tesuturi limfoide si non-limfoide. sect Fan © Ch Potbowm DNA =P Nar celdebie Dh LPS SPDC imature sintetizeazi MHC II si o parte este transportati la suprafata celulard, dar aceste molecule sunt apoi rapid intemnalizate si intoarse in compartimentul intracelular. Majoritatea moleculelor MHC II sintetizate sunt directionate catre endolizozomi si retinute in sistemul endocitic. Desi numarul de molecule MHC II prezente pe suprafata este mic, in schimb exist o multime de receptori responsabili pentru procesul de endocitozi. ‘Unii dintre acesti receptori nu vor mai fi reciclati dupa procesul de endocitozai (FeyR IN), altii vor elibera antigenul la pH-ul acid din compartimentul endosomal si vor avea posibilitatea de ase intoarce intacti pe suprafata celulara (receptorul pentru manoza) DC mature. proprietate cheie a DC este capacitatea lor de a migra, proces controlat de un ansamblu de de receptori pentru citokine si molecule de adeziune. Prin intermediul unor molecule ea E- cadherina, DC imature reactioneaz cu diverse celule din tesuturi non-limfoide si astfel DC imature au o disitributie foarte larga. De aici, pot rispunde rapid la chemokine si migreazi la situsul infectiei sau inflamatiei, unde vor prelua antigenul. Produsi virali, bacterieni si citokine vor determina DC imature si inceapa procesul de maturare. Chiar si moleculele MHC I contribuie la procesul de semnalizare. Celulele dendritice astfel incércate vor migra ulterior din fesuturile non-limfoide si vor pitrunde in circulatia sanguini sau limfaticd, indreptindu-se citre splind si ganglioni. Subpopulatiile de DC imature localizate strategic sub stratul epitelial intestinal captureaz antigenul, iar DC mature il vor transporta apoi catre plicile Peyer sau ganglionii mezenterici. Contactul cu celulele apoptotice nu poate induce maturarea DC, spre deosebire de contactul cu celulele necrotice. Astfel, tipul de moarte celulard asociata cu dezvoltarea normala nu produce un réspuns imun, in timp ce un alt tip de moarte celulara justificd acest rispuns, In cazul celulclor tumorale, acestea elibereaz cantitati importante de proteine de goc termic, a cliror expresie este indus sub influenta stress-ului. Odati. stabilite in localizirile lor limfoide, DC continua si se matureze, pierzindu-si capacitatea de a mai endocita, dar céstigd capacitatea de a stimula limfocitele Th. Se produce © scdere a intemalizarii moleculelor MHC II si o modificare a traficului intracelular al moleculelor MHC Il, cea ce conduce la o crestere a expresiei MHC II de suprafatd de 5-20 de ori. DC mature sunt cele mai eficiente in activarea celulelor T naive din urmatoarele motive: = expresie crescutd de molecule MHC II De-Sien ~ exprim’ B-SIGN (DC-specific ICAM-3 grabbing non-integrin), care recunoaste reziduurile de manozi gi se crede cd promoveaza adeziunea initiala cu limfocitele Th naive = exprima nivele foarte sciizute de acid sialic, ceea ce conduce la scdderea fortelor de respingere naturale dintre celule ~ _ expresie crescuti de molecule de adeziune expresie de molecule co-stimulatorii, cum ar fi B7-2 si CD40L Odati ce se realizeacd activarea limfocitelor T, DC vor mai juca un rol gi in diferenfierea ulterioard a acestora. Interactiunea cu DCI conduce la diferentierea in efectori de tip Th1 producator de IFNy si IL-2. Interactiunea cu DC2 va conduce la diferentierea in efectori de tip ‘Th, producator de IL-4 si IL-10 Monocitele/Macrofagele trebuie intai activate prin fagocitoza microorganismelor inainte s& oat exprima MHC II sau molecule co-stimulatorii, Macrofagele actioneazi ca APC-uri mai degraba pentru celulele T efector (activate) sau cu memorie. Limfocitele Th activate secret IFNy, care activeazi macrofagele si determina cresterea expresiei de MHC Il, inclusiv pe macrofagele gi DC din vecinitate.Limfocitele B exprima MHC II in mod constitutiv, dar trebuie inti activate pentru a putea exprima si moleculele co-stimulatorii. Reprezinti un APC foarte interesant si eficient, deoarece va recunoaste si interaliza antigenul cu ajutorul BCR, chiar si cand antigenul se sgiseste in concentratii foarte mici (de 100-10 000 de ori mai scdzute decat cele necesare pentru activarea receptorilor endocitici). Limfocitele B cu memorie exprima o cantitate mai mare de molecule co-stimulatorii decat cele naive si sunt capabile sa determine o activare eficienta a limfocitelor T. Limfocitele B nu servesc ca APC-uri in raspunsurile imune umorale primare. Odatii ce un Ag este internalizat, acesta va fi degradat in peptide ta nivelul compartimentelor ce apartin cai endocitice de procesare. Calea endociticd pare si implice trei compartimente cu pH progresiv tot mai acidic: 1. - endosomii precoce (early endosomes), cu un pH de 6.0 ~ 6.5 2. endosomii tardivi (late endosomes) sau endolisosomi, cu un pH de 5.0 ~ 6.0 3. lisosomi, cu un pH de 4.5 ~ 5.0 Ag-nul intemalizat se mica de la nivelul endosomilor precoce catre cei tardivi si, in final, c&tre lisosomi, intilnind in acest fel enzime hidrolitice si un pH din ce in ce mai sedzut in fiecare compartiment, Lisosomii, de exemplu, contin o colectie unict de mai mult de 40 de hidrolaze acid- dependente, inclusiv proteaze, nucleaze, glicozidaze, lipaze, fosfolipaze si fosfataze. in interiorul compartimentelor cali endocitice, Ag-nul este degradat in oligopeptide de circa 13- 18 reziduuri, care sunt ideale ca lungime pentru cupa MHC II. Deoarece enzimele hidrolitice au o activitate optima la un pH scizut, procesarea antigenului poate fi impiedicata de orice agent chimic care creste pH-ul acestor compartimente (cloroquina) sau de inhibitor de proteaze (leupeptina). Actiunea acestor enzime este favorizata prin desfacerea legaturilor disulfidice ale moleculelor de Ag cu ajutorul GILT (IFNy-inducible lysosomal thiol reductase), o enzima lizozomala care isi pastreaza activitatea si la un pH scazut.