Curs 3 - Imunitatea ne-specifica (innascuta) Imunitatea innascuta (non-specifica, naturala), care din punct de vedere filogenetic este mai veche decat imunitatea adaptativa (specifica), se refera la toate elementele pe care organismul le poseda inca ,de la nastere” si consta dintr-o serie de factori care sunt relativ non-specifici, sau, altfel spus, sunt operationali aproape impotriva oricarel Substante/particule care ameninta organismul. SI ne-specific nu este afectat de un contact anterior cu antigenul. Aceste elemente trebuie sa reprezinte prima linie de aparare impotriva antigenelor. Mai mult decat atat, obtinerea unui raspuns imun optim din partea SI specific va necesita si participarea SI ne-specific. In plus, SI innascut va influenta tipul de raspuns imun adaptativ, in functie de tipul de antigen cu care ia contact. Bariere anatomice si fiziologice impotriva infectiilor Modalitatea cea mai simpla de a evita o infectie este aceea de a impiedica penetrarea patogenului respectiv in organism. In acest scop, intervin o serie de bariere anatomice si fiziologice, intermalizarea antigenului si procesele inflamatoril. Barierele anatomice cuprind elementele structurale (cum ar fi pielea si mucoasele) care impiedica in mod fizic patrunderea antigenelor. Barierele fiziologice se refera la actiunea diferitelor structuri ale organismului (de ex. miscarea cililor de la nivelul tractulul respirator superior) sau a unor substante produse de tesuturi (de ex. actiunea de spalare a lacrimilor) in scopul de a sustine barierele anatomice. Aceste doua bariere coopereaza pentru a asigura prima linie de aparare. La vertebrate, prima bariera anatomica impotriva infectillor este pielea, un organ foarte intins, care la om poate atinge greutatea de 5kg. Atunci cand este intacta, pielea furnizeaza 0 suprafata dura, care este in general dificil de penetrat de catre microorganisme. Pielea este compusa din 3 straturi: epiderm, derm si hipoderm. Celulelede la suprafata epidermulul sunt celule moarte, pline de keratina, care le face astfel impermeabile la apa. In plus, epidermul nu are vase de sange si beneficiaza de un turn- over foarte rapid. Dermul contine insa toate vasele de sange necesare pentru a sustine epidermul. La nivelul dermului se gasesc si glandele sebacee, care produc sebum, 0 secretie uleioasa cu un pH cuprins intre 3 si 5. Productia de sebum confera aciditate de aproximativ 5,5, ceea ce creaza un mediu defavorabil dezvoltarii majoritatii microbilor. Hipodermul aduce cu sine o bariera suplimentara de grasime pe care patogenii trebuie sa o traverseze pentru a accede in tesuturile subjacente. Suprafetele exterioare ale tractului gastro-intestinal, respirator sau urogenital sunt acoperite de un epiteliu mucos. In mod similar, ochiul este acoperit de 0 membrana denumita conjunctiva, care protejeaza suprafata expusa a ochiului, dar lasa sa treaca lumina. Aceste suprafete sunt in mod suplimentar aparate prin actiunea de spalare a unor diverse secretii, care includ mucusul, saliva sau lacrimile. Apararea mecanica este asigurata de miscarea oscilatorie a cililor de la nivelul suprafetei celulelor epiteliale. Tusea si stranutul expulzeaza bacteriile acoperite in mucus, 0 secretie a epiteliilor mucoase. Odata ce patogenul a penetrat insa in organism, urmatoarea linie de aparare consta dintr-o serie de celule (care distrug micro-organismul, fie prin ucidere intracelulara, fie prin ucidere extracelulara) si o serie de molecule, cum ar fi sistemul complement, interferonit sau proteinele de faza acuta. Un patogen care reuseste totusi sa penetreze prin aceste bariere, va fi confruntat cu un mediu fiziologic ostil: 0 temperatura corporala prea inalta, un pH prea acid al stomacului, © presiune crescuta @ oxigenului la nivelul alveolelor pulmonare. In afara de rolul de spalare, lichidele organismului pot contine si substante cu actiune antibacteriana sau antivirala. Lizozimul care se gaseste in lacrimi, dar si in alte secretii mucoase, este oenzima care hidrolizeaza un component uzual al peretilor bacterieni. Neutrofilele elibereaza peptide antimicrobiene denumite defensine, Ca raspuns la infectia bacteriana, keratinocitele si epiteliul intestinal initiaza productia de peptide antimicrobiene, care apol blocheaza replicarea bacteriana. Infectia cu virusuri induce formarea unei alte familli de factori solubili, denumiti interferoni (IFN). Sunt molecule solubile sintetizate de celule si care actioneaza asupra celulelor ce poseda receptori specific. Se descriu doua tipuri de interferoni. Tipul I cuprinde doua grupe distincte. Primul grup, Aumit interferon-a (IFN-a), este 0 familie de aproximativ 20 de polipeptide inrudite structural, sintetizate in special de leucocite. Cel de-al doilea grup, numit interferon-B (IFN-B) cuprinde produsul unei singure gene, sintetizat in special de fibroblasti. Multe tipuri celulare poseda capacitatea de a sintetiza interferoni de tipul I, ca raspuns la infectia virala. Eliberati in spatiul extracelular, interferonii interactioneaza cu celulele din jurul celei infectate, la nivelul carora activeaza niste mecanisme ce vor interfera cu replicarea virala, in acest fel protejand aceste celule si facandu-le non-infectabile. Pe langa activitatea anti-virala, interferonii de tipul I stimuleaza potentialul litic al celulelor NK, stimuleaza capacitatea de prezentare a antigenului de catre APC-uri, prin amplificarea expresiei moleculelor MHC si au efect antiproliferativ. Tipul I de interferoni sau tipul imun, este reprezentat de IFN-y, sintetizat de limfocitele T activate si de celulele NK. Ca functii, mentionam 1. activator al fagocitelor; 2. amplifica expresia moleculelor MHC; 3. rol in diferentierea limfocitelor T efector (diferentiere functionala); 4, actioneaza asupra limfocitelor B, producand switch (comutare) de clasa; 5, stimuleaza activitatea celulelor NK. © alta bariera fiziologica impotriva infectie! cu patogeni este reprezentata de miliardele de bacteril comensale si fungi care sunt cantonate la nivelul cavitatii bucale, sistemului digestiv sau suprafetei pielii. Acesti microbi benefici organismului alcatuiesc flora” normala, care are un rol protectiv impotriva patogenilor, prin competitia pentru nutrienti, activarea celulelor sistemului imun sau secretia de molecule (colicine) care se dovedesc in mod selectiv toxice. Imunitatea nespecifica nu tine cont de tipul antigenului (de specificitatea sa) si intra in actiune rapid, intr-un timp remarcabil de scurt. Internalizarea antigenelor Exista trei procese distincte care sunt responsabile pentru _internalizarea macromoleculelor si celulelor si apoi distrugerea lor intracelulara si eliminare. Macropinocitoza este procesul prin care 0 celula poate internaliza lichid extracelular cu formarea unei vezicule in jurul unui volum (adesea semnificativ) de fluid. Aceste vezicule, denumite macropinosomi, au dimensiuni cuprinse intre 0,2 si 0,5 um. Numarul de macromolecule straine care intra in vezicule depinde de concentratia acestora. Procesul asigura o maniera eficienta dar nespecifica de ,testare” a mediului extracelular. Endocitoza este procesul prin care macromoleculele prezente in lichidul extracelular sunt internalizate ca urmare a interactiunil acestora cu receptori de pe suprafata celulelor endocitice. Legarea macromoleculelor la astfel de receptori declanseaza polimerizarea clathrinei, un component proteic al retelei de microtubuli, localizat la partea intracitoplasmatica a membranei. Invaginarea membranei tapetata cu clathrina (clathrin coated pits) conduce la internalizarea complexului receptor-ligand si la formarea unei vezicule cu dimensiuni cuprinse intre 0,15 si 0,45 um. Veziculele tapetate cu clathrina sunt mult mai uniforme decat cele formate prin macropinocitoza. Trebuie subliniat insa ca preluarea materialului strain prin macropinocitoza si endocitoza conduce nu doar la sechestrarea intracelulara a antigenelor, ci decianseaza si procesarea acestora, ceea ce va conduce ulterior la activarea limfocitelor T.Macropinocytatic Clathrin-coated vesicle vesicle Fagocitoza este procesul de ingestie a unor particule straine cu diametre mai mari de 0,5 um. Fagocitoza este initiata atunci cand multipli receptori de suprafata se leaga secvential la liganzi de pe suprafata particulei, mecanism denumit de ,fermoar”. Aceste interactiuni dintre receptori si liganzi induc, la zona de internalizare, la polimerizarea actinel, 0 proteina a scheletului celular. Membrana plasmatica este apoi invaginata printr- un mecanism bazat pe actina si se ajunge la formarea in jurul materialului internalizat 2 unei vezicule de dimensiuni mari, denumita fagosom. ° e o ° Pathogen Prageoye GODaca o anumita particula va fi ingerata prin endocitoza sau fagocitoza depinde de semnalele emise de domenii specifice ale cozilor intracitoplasmatice ale receptorilor membranari. Anumiti receptori transmit semnale catre citoscheletul de actina (si determina fagocitoza), altii transmit semnale catre sistemul de microtubuli si induc endocitoza. Particulele care nu exprima molecule pe care receptorii de pe suprafata fagocitului sa le lege, nu pot fi fagocitate. Daca insa aceste particule ajung sa fie tapetate cu molecule produse de catre organism, denumite opsonine (de ex. anticorpii), atunci vor putea fi si ele internalizate. La toate acestea se adauga si un set de molecule denumite generic ,de adeziune", dintre ‘care _mentionam integrinele, molecule care sunt indispensabile pentru interactiunea celula-celula sau celula-matrice extracelulara. In plus, trebuie mentionat ca multe microorganisme elibereaza substante care atrag fagocitele, proces numit chemotactism. Calea endocitica Macropinosomil si veziculele tapetate cu clathrina intra in calea endocitica de procesare, de-a lungul retelei de microtubuli. Diferitele componente membranare ale sistemului endocitic fuzioneaza constant unele cu altele, amestecandu-si diferite portiuni ale continutului lor, intr-un proces care conduce la scaderea progresiva a pH-ului acestor componente endocitice. Recycled receptors Degraded material released in exccytc vesicle * Dagraded materiat released In exocytlc vesicle Pe de alta parte, veziculele care contin proteine hidrolitice si alte molecule necesare pentru ucidere si digestie se desprind de complexul Golgi si fuzioneaza cu compartimentele endocitice, modificand suplimentar micromediul intern al acestora. Vezicula tapetata cu clathrina, utilizata pentru capturarea macromoleculelor, fuzioneaza cu primul compartiment al sistemului endocitic, endosomul precoce. Acesta are un pH acid moderat (~6,5), care permite disocierea receptorilor de pe molecula internalizata.Receptorii sunt apoi colectati de o extensie tubulara a endosomului si reciclati catre suprafata. Macromoleculele raman in interiorul celulei, in asa numitul endosom tardiv, ‘are va fuziona cu alti endosomi, dar si cu vezicule derivate din aparatul Golgi, cea ce va conduce la scaderea suplimentara a pH-ului si la declansarea digestiel macromoleculelor, Degradarea completa va apare insa doar atunci cand endosomii fuzioneaza cu lisosomii si formeaza endolisosomil. Acestia au un pH de ~5 si contin un set impresionant de enzime (proteaze, lipaze, nucleaze) ce vor fi capabile sa degradeze macromoleculele la componentii fundamentali: aminoacizi, acizi grasi, nucleotide. La sfarsitul procesulul, produsii de digestie sunt colectati in vezicule exocitice, care se desprind din endolisosomi. Calea fagocitica Fagosomil evolueaza intr-o maniera asemanatoare. Dupa internalizarea particulei, actina este depolimerizata si fagosomil vor utiliza sistemul microtubulilor pentru a evolua catre stadiul de endosom precoce, tardiv si apoi fagolisosom. Acest proces de maturare implica o serie de evenimente de fuziune si desprindere cu diferite vezicule derivate din aparatul Golgi, vacuole intracelulare si granule, compartimente endosomale si lisosomi. Toate aceste evenimente sunt facilitate de annexina, care se leaga de fosfolipidele membranare. Amestecul continutului tuturor acestor vezicule conduce la scaderea pH-ului cel putin la 5. In cazul cand particula internalizata este de ex. un microb, acesta trebuie mai intai ucis inainte de a fi digerat. Patogenii dezvolta insa si mecanisme de evaziune: supravietuiesc in interiorul veziculelor, evadeaza din interiorul acestora (Listeria monocytogenes), sau impledica fuziunea fagosomilor cu alte vezicule (Mycobacterium tuberculosis). Mecanismele de distructie intracelulara sunt reprezentate de enzimele lizozomale (mecanisme oxigen-independente), oxidarea letala a lipidelor si proteinelor bacteriene (mecanisme oxigen-dependente) si eliberarea de oxid nitric.1. Mecanismele oxigen independente sunt importante in special in acele tesuturi unde presiunea oxigenului este scazuta si arderile respiratorii nu pot avea loc. Diferitele enzime continute in granule intra in actiune in functie de pH-ul pe care il prezinta fagolizozomul. Consumarea de ioni de hidrogen in reactiile oxigen-dependente conduce la usoara crestere a pH-ului, cea ce permite intrarea in actiune a unei familii de proteine cationice cunoscute sub numele de defensine (GM-3,5-4 kDa, continand 29-35 de aa), bogate in arginina si cisteina, ajungand la concentratii remarcabile in fagolizozom, de pana la 20- 100 mg/ml. Fiecare astfel de peptid, care contine 6 cisteine invariante, formeaza o molecula circulara, stabilizata prin legaturi disulfidice intramoleculare. La fel ca si colicinele bacteriene, au o structura amfipatica ce le permite insertia in membrana microbiana si formarea de canale jonice reglate de voltaj, destabilizatoare pentru bacterie. Aceste peptide antibiotice, la o concentratie de 10-100 ug/ml, actioneaza ca adevarati dezinfectanti impotriva unui spectru larg de bacterii Gram-pozitive si negative, fungi si o serie de virusuri cu anvelopa. De asemenea, trebuie mentionat ca multe exprima 0 selectivitate remarcabila, facand diferenta fata de celulele self in functie de continutul in lipide. Este absolut surprinzator dpdv al simplitatii mecanismului de distinctie self/non-self cat de bine reuseste sa discrimineze o gama foarte mare de bacteri. La pH neutru, intra in actiune proteinaze neutre (catepsina G), care actioneaza atat direct asupra membranei bacteriene, cat si prin transferul unei proteine BP1, care determina cresterea permeabilitatii bacteriene. La un pH scazut, lizozimul si lactoferina constitule factorii bactericizi si bacteriostatici cel mai importanti care pot functiona in conditil de anaerobioza. In sfarsit, microorganismele sunt ucise de catre enzime hidrolitice. 2. Mecanismele oxigen-dependente sunt deciansate in momentul fagocitozei, cand se produce o crestere dramatica a activitatii suntului hexoz-monofosfatilor, care va genera astfel NADPH (nicotinamid-adenine-dinucleotide-phosphate): Glucoza + NADP — NADPH + pentoz-fosfat NADPH + 0; - NADP* + .0,° (superoxid anion)" Reactia este catalizata de o NADPH-oxidaza, prezenta in fagocite. Aceasta enzima este formata din 5 subunitati, care sunt asamblate in cursul activarii celulei, pe parcursul procesului de fagocitoza propriu-zis, sau de catre peptidele cu activitate chemotactica. Procesul de activare implica fosforilarea p47-phox si migrarea p47-phox si p67 phox din citosol catre membrana celulara, unde se asociaza cu citocromul bess. Odata subunitatile asamblate, reactia descrisa mai sus este catalizata si arderile respiratorii incep. Electronii trec de la NADPH la 0 flavoproteina membranara (care contine FAD) ~ flavin adenine nucleotide) a citocromului bsss, care are un potential redox foarte scazut (-245 mV), ceea ce ji permite sa reduca oxigenul molecular direct la anion superoxid. NADP+ produs accelereaza suntul pentoz monofosfatilor, 0 cale metabolica ce converteste sucroza la pentoza si CO, si care elibereaza energie extrem de necesara celulei. Cele doua molecule de anion superoxid interactioneaza spontan (dismutare) sau sub influenta unei enzime numita superoxid dismutaza pentru a genera o molecula de apa oxigenata. 2.02 + 2H" —+ (superoxid dismutaza/dismutare spontana) H.02 + 'O, (oxigen singlet) 102 + H202 + .OH + OH’ + '0, 202 +CI' —» (mieloperoxidaza) H,0 + OCI Anionul superoxid, apa oxigenata,O, singlet si radicalil hidroxil constituie agenti microbicizi foarte puternici. Mai mult decat atat, combinatia de apa oxigenata, mieloperoxidaza si ioni de halogen constituie un sistem de halogenare capabil sa ucida atat bacterli cat si virusuri. ' Punetul semnifia prezenta unui electron nepereche.20, 20; 2°02 20, cs a ae / * f Ce £ be a Ml, he Hy VAG, "i 2) ey, oo NADPH a ya NADPH a NADP*\_67__/NADP+ Cand macrofagele sunt activate prin intermediul unor compusi ai peretelui bacterian, cum ar fi lipopolizaharidul (LPS) sau, in cazul micobacteriilor, prin MOP (muramyl dipeptide), la care se adauga IFNy produs de limfocitele T helper, incep sa exprime nivele crescute de NOS (nitric oxide synthetase), 0 enzima care oxideaza L-arginina pentru a produce citrulina si oxid nitric (NO) - un gaz. L-arginina + 0, + NADPH — NO + L-citrulina +NADP Oxidul nitric are o activitate antimicrobiala foarte puternica. Alti oxizi de azot reactivi sunt NO», NOs, NOs, etc. Acestia formeaza complexe cu enzime care contin fier si inhiba astfel metabolismul oxidativ al bacterillor sau parazitilor ingerati. NO se poate de asemenea combina cu anionul superoxid pentru a da nastere ONOO’ - anion peroxinitrit. Acesta este descompus si se vor forma radicali hidroxil: ONOO’ + Ht OH + NO, De remarcat ca NO derivat din macrofage poate inhiba sinteza ADN a limfocitelor si a celulelor tumorale. PMN-urile provin din aceeasi celula hematopoietica (stem) ca si celelalte elemente figurate ale sangelui, fac parte din grupul de celule albe sau leucocite, reprezentand majoritatea lor (60-70%). Sunt celule circulante, non-divizibile, cu viata scurta, de aproximativ 2-5 zile, Sunt capabile sa migreze in tesuturi, strabatand membrana bazala a vaselor sanguine, fenomen activ numit diapedeza. Exprima pe membrana o serie de molecule, printre care receptori pentru componente ale sistemului complement (C3b, iC3b), molecule de adeziune inter-celulara (LFA-1 ~ leukocyte function associated -1), receptori pentru componentele matricii extracelulare (ex. receptor pentru laminina, fibronectina). Citoplasma contine granule (lizozomi), bogate in enzime (lizozim, mieloperoxidaza, catepsina G, proteine cationice, hidrolaze, etc). Macrofagele sunt celule larg raspandite in organism, care, impreuna cu_monocitele, formeaza “sistemul fagocitelor mononucleare”, descris de Metchnicoff in 1883. Deriva din promonociti, precursori medulari ce patrund in curentul sanguin si devin monocite. Acestea raman in circulatie un numar limitat de ore (la om aproximativ 72 de ore), dupa care migreaza in tesuturi, unde se diferentiaza in macrofage rezidente. In functie de localizare, macrofagele poarta denumiri diferite: ~ histiocite in tesutul conjunctiv; ~ _ macrofage alveolare la nivel pulmonar; ~ celule Kupffer in ficat; = celule mesangiale in glomeruli renali;- microglii in tesutul nervos; - _ osteoclaste in tesutul osos, etc. Macrofagele sunt celule cu viata lunga, capabile de migrare, desi sunt considerate celule tisulare, fixe. Citoplasma este bogata in lizozomi care contin numeroase enzime necesare cideril si digestiei materialului fagocitat. Spre deosebire de PMN-uri, macrofagele mai au © functie esentiala pentru functionarea sistemului imun. Ele sunt capabile sa proceseze antigenul si sa-| prezinte limfocitului T, contribuind la activarea acestula. Fac parte dintr- © categorie functionala de celule, numite celule prezentatoare de antigen (APC), din care ‘mai fac parte limfocitele B, celule dendritice, celule Langerhans, etc. Trfarimaton and fer Tae onion 1L8,TNF Let Elartave,colagenaee, Prostaglandins and iuktines hyaluroriiase Complement actors Fob stmulting ting factors ‘actors Prsteltactating factor Ancioponesis actors Shemeatiatarts tomb . , Theperaiereniain / \ ‘rnp acon 10-» m2 Lo ra liam . ae 7 [Iie y ounce 2(actate mscopnage Risgeno.nBe tno, | -~ oxygen noe | ™ ean —— oem oe Scioteratte | Frasaanae——] | re cen Toy eae incites rene ome fora NO, THF Inflamatia ca raspuns la infectie sau leziuni Inflamatia este un complex de evenimente celulare si moleculare care apar ca raspuns atat la atacul patogenilor cat si la leziunile tisulare si poate fi declansata inclusiv de catre citokinele secretate de catre celulele apararii nespecifice. Reprezinta astfel atat 0 faza secundara cat si tertiara a raspunsului imun. Evenimentele care caracterizeaza un proces inflamator sunt vasodilatatia, cresterea permeabilitatil peretelui vascular si cresterea influxului de leucocite. Etapele initiale ale inflamatiel reprezinta incercarea organismului de a controla patogenul in_mod nespecific. Celulele self alterate elibereaza molecule care atrag leucocitele (chemotactism), principalii efectori fiind macrofagele si neutrofilele. In stadille tardive ale inflamatiei, celulele sistemului imun specific secreta factori chemotactici pentru limfocitele efector si amplifica raspunsul inflamator. Inflamatia poate fi initiata in mai multe feluri, de catre diversi factori. Unll pot actiona local, direct, asa cum e cazul kininelor. Acestea reprezinta o familie de peptide mici, care circula intr-o forma inactiva in sange. Pot fi activate de catre enzime eliberate de catre celulele lezate sau de enzime ale sistemului de coagulare si transformate in mediatori potenti (de ex. bradikinina si kalidina) care determina vasodilatatie, cresterea permeabilitatii vasculare, contractia musculaturii netede si durere, Macrofagele activate vor secreta TNF (tumor necrosis factor) si IL-6 (Interleukina 6), care vor actiona asupra hepatocitelor, iar acestea vor raspunde secretand proteine de faza acuta. Proteinele de faza acuta. Se numesc asa, pentru ca, in cursul unui proces inflamator acut, sinteza lor se intensifica si concentratia lor creste foarte rapid si la niveleimpresionante fata de normal. Exemple: proteina C reactiva (CRP), fibrinogenul, ceruloplasmina, serum-amiloid A, c1-antitripsina, @2-macroglobulina, Sinteza lor este stimulata de unii produsi bacterieni (endotoxine) sau de citokine pro-inflamatoare (IL-1, IL-6) ce actioneaza asupra ficatului, sursa majora a acestor proteine. Proteina C reactiva functioneaza ca opsonina, stimuland fagocitoza bacteriilor pe membrana carora se depune sau activeaza sistemul complement conducand la distrugerea microbului.. Un alt set de mediatori foarte puternici este reprezentat de leucotriene si prostanglandine, care sunt obtinute prin metabolizarea fosfolipidelor membranare pe calea lipooxigenazelor. Inflamatia implica modificari ale pattern-ului de migrare al leucocitelor. Extravazarea este amplificata, lucru posibil atat ca urmare a eliberarii de factori chemotactici, cat mai ales stimularii aparitiei de molecule de adeziune, responsabile pentru procesul de diapedeza. Cresterea permeabilitatii vasculare mai are ca efect si trecerea in tesut a unor enzime apartinand sistemelor de coagulare si fibrinoliza, care vor incepe sa depoziteze fibrina, pentru a forma un cheag si a incepe procesele de reparare tisulara. In procesul inflamator vor interveni si alte celule, denumite auxiliare, printre care trombocitele si mastocitele. ‘Trombocitele sunt necesare pentru definitivarea procesului de vindecare tisulara. Mastocitul Precursorii mastocitelor, care se formeaza in maduva osoasa prin hematopoieza, sunt eliberati in torentul circulator ca celule nediferentiate. Aceste celule nu se vor diferentia pana cand nu vor parasi circulatia sanguina si nu vor intra in tesuturi. Mastocitele pot fi gasite intr-o gama larga de tesuturi, incluzand pielea, tesuturile conjunctive ale unor diferite organe, epiteliul mucos al tracturilor respirator, genito-urina sau digestiv. In functie de distributia tisulara, se impart in MMC (mucosal mast cells) si CTMC (connective tissue mast cells). Pe suprafata lor se gasesc receptori de mare afinitate pentru IgE, capabili sa lege molecule de IgE libere (care nu apartin unui complex antigen-anticorp). Ulterior, cand IgE de pe suprafata mastocitului (fixate prin FcR I) leaga antigenul, mastocitele se activeaza. Alte modalitati de activare a mastocitului sunt reprezentate de fragmentele mici de clivaj ale sistemului complement, denumite anafilatoxine si de kinine. Este indusa © scadere dramatica a cAMP, cu cresterea permeabilitatii membranelor in care sunt implicate diverse sisteme enzimatice: fosfodiesteraza, protein-kinaza C, fosfatidil inositol, precum si Ca**, Mg*, K*. Consecinta este ca granulele care contin factorii pre-formati fuzioneaza_cu membrana celulara si continutul granulelor (factorii pre-formati) este deversat. Sunt eliberate astfel din granulele lor factori precum heparina (un inhibitor al coagularit) si amine vasoactive (histamina, 5 hidroxi-triptamina etc.) cu rol in cresterea permeabilitatii vasculare si vasodilatatie. Echivalentul circulant este reprezentat de bazofil. Ca si mastocitele, aceste celule prezinta un numar mare de granule citoplasmatice care contin un numar foarte mare de factori dintre cei mai diversi. Mastocitele, impreuna cu bazofilele joaca un rol major in dezvoltarea reactillor alergice.Eozinofilul Polimorfonuclearele eozinofile au o capacitate limitata de a fagocita, find mai mult implicate in uciderea extracelulara a unor paraziti cum ar fi helmintii. Prezinta granule distincte care se marcheaza intens cu coloranti acizi si care au un aspect caracteristic in microscopia electronica. In mijlocul granulelor se gaseste MBP (major basic protein), iar in matricea granulelor se gasesc ECP (eosinophilic cationic protein) si EPO (eosinophilic peroxidase). Mai exista si o serie de alte enzime cum ar fi arilsulfataza B, fosfolipaza C, histaminaza, END (eosinophilic neurotoxin). Eozinofilele prezinta pe suprafata receptori pentru complement si, in urma activarii isi activeaza arderile respiratorii care vor conduce la producerea de metaboliti activi ai oxigenului. In plus fata de toate acestea, in granulele eozinofilului se gasesc si proteine capabile sa determine perforarea membranei, intr-o maniera asemanatoare compusului C9 al complementului sau perforinelor produse de limfocitele Tc sau NK. Majoritatea helmintilor pot activa calea alternativa a complementului, dar desi rezistente la atacul compusului C9 al _sistemului complement, tapetarea lor cu fragmente ale complementului cum ar fi C3b permite aderenta eozinofilelor, care se activeaza si elibereaza MBP, dar mai ales proteine cationice care vor distruge membrana parazitului. [Factor pre-formati ‘Retiune. Proteina bazica majors Citotoxiea, reste eliberares de histamine, neutralizeaza heparina teina cationica a eozinofilelor Citotoxica Neurotoxina derivata din eozinofle Citotoxica Peroxidaze eozinoflelor Tnactiveaza leucoirienele, genereaza radicali lberl al ‘oxigenuiu! cu actiune citotoxi ie Fosfataze, elastaze, colagenaze T Factori nou-sintetizat ‘eveotiena Ca Par | 15 HETE (acd 15 hidroxiconatewranoi) Prostaglandina DZ “romboxan 62 Bronhodoatrite, vesoconatritie Prostagiandine FZ0 Bronhoconstrictie, vasoconstricie, creste secreta de mucus Speci reacive de oxigen totoxceae Phenotyplcaly similar to NK call, ‘Collar processes: Denarisccat 6 few raceme ears [2 Ane Smooth endoplasmie @ Lytle granules ®&_ Mitochondria ra © rare GB coamane Ty Tynes40-15 um; 2-6 distinct nuclear abu % 14-16 um; 2-3 nuclear lobes; ‘abundant cytoplasrn: large, ‘coarse granules; many ribosomes ‘and mitochonddla; abundance of slycogen 12-17 ym; 2-3 nuclear lobes; eee Sysaed ad mat granules: ‘extensive smooth reticulum; few mitochondria Mast cell ‘95-160 pm; regularly shaped tule, ebundant eyeples fine granules 1.8-3.5 um; non-ucleated; ‘eytoplasm e ‘granular - 7.2m: non-nucleated: no organellesHf-ului Strategiile ST nespecific de recunoastere a non: SI nespecific utilizeaza 3 strategii de recunoastere imuna: = recunoasterea non-self-ului (microbian): recunoasterea de structuri moleculare care sunt caracteristice (unice) doar microorganismelor si care nu sunt produse de catre gazda; ~ recunoasterea de structuri eliberate de catre celulele self alterate = recunoasterea missing self-ului": recunoasterea de structuri_ moleculare ‘exprimate doar de catre celulele normale, neinfectate ale gazdei. Aceste structuri nu sunt produse de catre microorganisme si sunt recunoscute de catre receptorii inhibitori sau proteine care inhiba activarea mecanismelor efectorii ale imunitatii innascute. Exista diferente multiple intre metabolismul celulelor prokariote si eukariote, ca si al protozoarelor si organismelor multicelulare. Unele cai sunt unice pentru metabolismul microbian si joaca functii fiziologice esentiale si ca urmare sunt regasite in toate microorganismele dintr-o anumita clasa. Produsii acestor cai metabolice, ca si produsii anumitor gene sunt denumiti PAMP (pathogen associated molecular patterns) si reprezinta tinte ale recunoasterii SI nespecific, Receptorii care recunosc astfel de molecule sunt denumiti PRR (pattern recognition receptor) si sunt exprimati de catre diferite tipuri celulare (macrofage, neutrofile, NK etc). Cele mai cunoscute exemple de PAMP: LPS-ul bacteriilor Gram negative ~ Acidul lipoteichoic (LTA) al bacteriilor Gram pozitive - Peptidoglicani ~ _Lipoproteine generate prin palmitilarea cisteinelor N-terminale ale multor proteine din peretele bacterian = Lipoarabinomanan micobacterian - ARN dublu catenar produs de majoritatea virusurilor in timpul ciclului infectios = Beglucani si manani gasiti in fungi PAMP-urile produse de speci diferite de patogeni pot fi diferite dpdv al detalillor de structura chimica, dar au intotdeauna acelasi pattern molecular. Desi PAMP-urile nu sunt inrudite structural intre ele, au o serie de caracteristici in comun: = sunt produse de microbi, dar niciodata de organismul uman - PAMP-urile sunt invariabile intre patogenii dintr-o anumita clasa: astfel, un numar itat de PRR pot face fata unui numar mare de microbi - PAMP-urile indeplinesc adesea functii fiziologice pentru patogenul respectiv, ceea ce inseamna ca pierderea sau mutatiile acestor molecule se vor dovedi letale pentru supravietuirea bacteriei_ sau cel putin dezavantajoase _ pentru microorganism. In acest fel, evitarea recunoasterii PAMP-urilor prin mutatii sau prin pierderea expresiel, in scopul evitarii recunoasterii SI nespecific nu este practic posibila pentru microorganisme De mentionat ca PAMP-urile sunt produse atat de patogeni cat si de comensali, ceea ce inseamna ca SI nespecific nu poate distinge intre microorganisme patogene si cele n Patogene. Mecanismele prin care SI nespecific nu distruge microorganismele comensale Au sunt inca pe deplin intelese. Sun incriminate citokine anti-inflamatorii sau compartimentalizarea. PRR ‘Au fost sistematizati in 3 clase functionale: 1. PRR care semnalizeaza prezenta infectiei. Pot fi exprimati pe suprafata celulelor sau intracelular. Legarea PAMP conduce la activarea de cai de semnalizare pro- inflamatorii (NFkB, Jun N terminal kinase - JNK, p38MAP kinaza). Activarea de catre PRR a acestor cai de semnalizare, care sunt conservate in timpul evolutiel, conduce la activarea unui numar mare de gene. Urmatoarele categorii de produsesunt induse de catre PRR: a) proteine care au efect antimicrobial direct (de ex. B defensina 2); b) citokine inflamatorii si chemokine: TNF-a, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 care induc reactil fiziologice multiple necesare pentru optimizarea conditillor de combatere a infectiilor; c) produsi care controleaza activarea raspunsurilor imune adaptative: MHC II, CD80, CD86; d) nitric oxid sintetaza, care induce productia de compusi activi ai azotului la nivelul macrofagelor. De asemenea, celulele dendritice imature activate prin intermediul acestor receptori vor incepe sa se matureze si sa migreze cu antigenul catre ganglionii limfatici. Cel mai cunoscuti receptori din aceasta clasa sunt receptorii Toll-like. 2. PRR fagocitici sau endocitici (scavenger), care, odata ce leaga PAMP (0 varietate foarte larga de liganzi lipidici in acest caz), mediaza preluarea patogenului de catre cella, Se gasesc pe macrofage, celule dendritice, _neutrofile. Microorganismele fagocitate sunt introduse in compartimentul endosomal, unde sunt ucise de catre mecanisme efectorii caracteristice fagocitelor. In APC-url, internalizarea este urmata de procesare si prezentare de catre moleculele MHC. PRR din aceasta categorie includ receptorul pentru manoza al macrofagului (MR) si MARCO - macrophage receptor with collagenous structure. In plus fata de clearance-ul microbian, functia acestor receptori la vertebrate pare sa fie aceea de a facilita recunoasterea leziunilor tisulare si fagocitarea debris-urilor celulare ale gazdei. Altfe! spus, formele lipidice non-self apar nu doar la nivelul patogenilor ci si la nivelul celulelor alterate ale gazdelor, celulelor apoptotice sau celulelor senescent. In toate aceste cazuri, celulele au suferit modificari la nivel membranar si fosfolipide interne sunt acum expuse. Au fost identificate 3 clase de receptori scavenger: A, B si C 3. PRR secretati. Acesti receptori au 3 categorii de functil: = activeaza sistemul complement = opsonizeaza microbii - functioneaza ca molecule accesorii pentru recunoasterea PAMP de catre receptor! transmembranari ca TLR. Unii PRR secretati sunt produsi de catre macrofage si celulele epiteliale in tesuturi. Majoritatea sunt insa secretati de catre ficat si ajung in ser (proteine de faza acuta): MBL (mannan binding lectin), PGPR (peptidoglycan recognition proteins). a) Colectine: proteine efector solubile care au de asemenea proprietatea de a recunoaste pattern-uri moleculare. Au doua tipuri de domenii fuzionate: unul caracteristic moleculelor de colagen si un alt domeniu globular multimeric lectinic, de unde si numele de colectine. Ex. Proteina surfactant A si D de la nivel pulmonar, MBL (mannose binding protein) seric. Colectinele recunosc si leaga preferential structuri glucidice care sunt organizate in pattern-uri caracteristice la nivelul suprafetelor microbiene. b) Proteine de faza acuta: 0 sursa principala de proteine de faza acuta este reprezentata de hepatocitele stimulate de catre citokine. Unele dintre proteinele de faza acuta, de ex. proteina C reactiva, se leaga la o varietate de bacterii si fungi, la nivelul unor componenti ai peretelui patogenului, componenti care sunt absenti de la nivelul celulelor gazdei. Odata ce se leaga la suprafata patogenului, aceste molecule pot activa sistemul complement. c) Unii autori includ in aceasta categorie si anticorpii ,naturali”, molecule care sunt secretate de catre un subgrup particular de limfocite B (B1, CD5+, fara sa fie nevoie de o stimulare antigenica externa. Majoritatea anticorpilor naturali sunt IgM. Spre deosebire de anticorpii produsi in maniera uzuala, anticorpii naturali nu ‘sunt strict specifici, ci polipsecifici, datorita reactivitatii incrucisate pe care o manifesta, d) Proteinele NOD (nucleotide binding oligomerization domain) sunt inrudite natural cu TLR ca urmare a prezentei unor domenii bogate in leucina. NOD1 si NOD2 se leaga insa intracitoplasmatic la patogeni intracelulari, recunoscand structuri derivate din peptidoglicani pe care nu le leaga TLR.Toll-like receptors Reprezinta o familie de receptori transmembranari caracterizati prin motive de leucin: portiunea extracelulara si un domeniu intracelular care are homologie cu cel al familiei IL-1R (domeniu TIR: Toll/IL-1R). Sunt cunoscuti cel putin 11 TLR la mamifere. Atat la soareci cat si la om, TLR sunt exprimati pe un numar mare de leucocite, dar si alte tipuri celulare. In general, monocitele, macrofagele si neutrofilele prezinta cea mai inalta expresie, iar nivele mai reduse pot fi intalnite la nivelul celulelor dendritice (DC) imature, NK si a unor subseturi de limfocite 8 si T. Nu se stie daca TLR pot recunoaste moleculele asociate cu paraziti multicelular, dar se ie de ex. ca TLR2 poate lega ancora GPI (Glycosyl Phosphatidylinositol) utilizata de multe molecule pentru a se atasa la suprafata Tripanosoma cruzi. Unii TLR pot recunoaste mai mult de un ligand, iar acesti liganzi pot fi foarte diferiti. Unii TLR utilizeaza molecule accesorii pentru recunoasterea ligandulul. Unii TLR trebuie sa se asocieze, iar aceasta asociere va determina legarea unor anumiti liganzi. Lipoproteins LPS (Granrnegative) Flagellin CpG DNA Lipoarabinomannan Taxol (Plant) —2® yuu LPS Leptospira) ——_F protein (RS virus) | " LPS (P. gingivalis) hsp60 (Host) PGN (Gram-positive) Fibronectin (Host) Zymosan (Yeast) | GPLanchor (I. cruzi) TLR4: este exprimat de multe tipuri celulare: macrofage, celule dendritice, neutrofile, mastocite, limfocite B, celule endoteliale, celule musculare. Recunoaste lipopolizaharidul (LPS) de pe suprafata bacteriilor Gram negative. Mecanismul de recunostere este complex si necesita mai multe molecule accesorii. LPS se leaga la LBP (LPS-binding protein) - 0 proteina serica care leaga monomerii de LPS si ii transfera la CD14, CD14 este 0 proteina de pe suprafata macrofagelor si a celulelor dendritice, legata la GPI. De asemenea, TLR4 leaga proteina accesorle MD-2, necesara si ea pentru recunoasterea LPs. TLR2 + TLR6 si TLR2 + TLRI leaga: - peptidoglicani - lipoproteine - lipoarabinomanan = zymozan TLR3 ~ recunoaste ARN viral dublu catenar TLRS - flagelina TLR7 si TLR8 ~ ARN viral monocatenar TLRS ~ dinucleotide CpG (citozina legata la guanina) nemetilate ale ADN ‘TLR10 ~ pare sa alba o functie inrudita cu a lui TLR9 TLR11 ~ receptor orfan