VERONICA DINU EUGEN TRUTIA Profesor dr. Profesor dr. ELENA POPA-CRISTEA. AURORA POPESCU Profesor dr. Profesor dr. doc. BIOCHIMIE MEDICALA mic tratat SM EDITURA MEDICALA Bucuresti, 1998[Coperta de: ADRIAN CONSTANTINESCU. .»Toate drepturiteedivoriate epartin i exclusivitate Editurit Medicale, Publicatia este mared tnregistratd a Editurit Medicale, fiind protejait integral de legistatia interna si internagionalé, Orice valorificare a conginutulul tn afara limitelor acestor legi si a permisiuniieditorilor este inserzisi si pasibilé de pedeapsd. Acest lucru este valabil pentru orice reproducere — integralit sau partiali, indiferent de mijloace (multipliciri, traduceri, microfil- ‘dir, transerieri pe dischete etc). Tehnoredactare computeriatis TOP GAL SRL ISBN 973-39-0299.3,Prefata in domeniulsiingelor biologice progresele tehnologiel moderne au permis extinderea si aprofundarea studiilor referitoare ta diversi constiwenti celwlari sau subcelwar Totodatd, uilizarea metodelor moderne de investigayie siingificd in domeni au evidentiat $4 noi roturi sau mecanisme de actiune - mai mult sau mai pusin complexe ~ ale unor asemenea constituenti. Datorita acestor fapte, insusi obiecnul de studi al biochimiei ~ in general - sal biochimiei medicale - tn particular - si-au largtt sau g'au aprofundat continutul propriu. De asemenea, fn ceea ce priveste obiectul biockinitel medicale, investigatiite moderne de cercetare au relevat not si multiple implicatit - din ce In ce mai siranse - pe care le are aceasta disciplina cu diverse alte discipline medicale (genetica, fitologta, fisiopatologia, farmacologia, medicina internd etc.) Se injelege ca in asemenea conditit se impunea intocmirea unui now tratat pensru studinl biochimiei medicale care sd cuprinda tatr-un tot util atdt unele cunostinge clasice cat si noile achizitt ale cercetarilor moderne, precum si evidentierea relatillor existente intre procesele biochimice si funciile fiziologice - normale sau patologice - studiate de alte discipline, considerate strict - medicale, In mod deosebit aparea necesar sé fie elevate mecanismele moleculare care siau 1a baza declansdrié unor boli in vederea realizarli tuturor acesior deziderate s-a elaborat lucrarea de fata care ‘cuprinde: studiul proteinetor, studiul enzimelor, transferul de informatie, hormonil si mecanismele de reglare metabolica, energetica biochimica, marile metabolisme, echilibrul acido-bacic, matricea exiracelulara si nofiuni de biochimia nudritiet. Pe lingd caracterul didactic care face ca lucrarea sf poatd fi uilizatd de studengi pentru tnsusirea bnvdjamantulul de biochimie, adresabilitatea acestet biochimti medivale este mai larga, considerdnd-o folositoare atdt medicilor cat st biologitor; in special, celor care-si desfasoard activitatea profesionald in laboratoare clinice. In dorina realizarii unui text usor de urmdtrit si retinut, lucrarea este insogita de ‘material iustrativ bogat cuprinzand numeroase scheme, tabele si tablouri sinoptice. Referitor 1a bibliografia care a stat la baza elaborari ei trebuie subliniat faptui ca desi ea a fost vastd, sau mentionat aici publicatiile mai recente $i mai importante, prezentandu-se deci o bibliografie selectiva AutoriiCuprins Cap. 1 Froteinel Structurd generata. (Prof. De. Elena Popa-Cristea) 1 Aminoaciai 12 Pepiele U3, Protiele : 121" Sct prima prot. 182 Organizre spajalis moleclloy pote ‘Staci sedan poinln Strctrs tna spate Strctry cinemas proteins 133 Propratii genemle le prin. 134 Gasitctes protein 35 Proteioele pasate Serimaltunina Invanoplobulincis eto a eoaglie ibvnogcaa 135 Homoproteinc 137 eonectincte Cap. I, Enaimele. Prof. Dr E. Taga) TLL tntoducers, sees , M2 Seiderea de clire enrime a ncisiel de acti caualiel a enzimelon U3 Specifcisten enziaior UIT Specifietate de race. 1132 Shecifistate do saat 11333 Specticate sereochinic, UA Strvetiea enzinlon MA. Aspecte xenenie. | 142 Engine ov stracaesprossicd | 1143 Easiae or ervtusl heteroprte. ILS Sistem (complexe) mubienzinti, 16 lasenime - U7 Central setv gi ance TX Cinetica ensinatics. : 1LS.1 Expeitnarea viteei reactor easinatice. AUivitten enneion 82 Viteza inal a realoecozinatiee, F 1183 Indluengspit-uui gi emperatai asupra avi envinclor T1844 Influenjaconcentaietenzim. TESS Inflenjs concentrate substestuli, Beuaia Michaelis-Menten. M86 Determinares experimental Ryy Seuaificaiaseestel constant. Conta etait, Ke 18.7 Besujia Linewesver Bork, 5 1838 Inia acivisitensimeloe ic ioe. Gc 1B ry 2 cf FY as 0 6 a 5 2 3 if a “s 6 6 6 » n 2B RB % 1B 7 8 8 a is %0 °2 2119, Replaeabiosintat 9 activi easnete. i191 Anect pene 11923 Relarea ean eine {19.3 Replies sos atv catch. U19id Reglare alent a fncit hemoglobin 11953 Roplaes coven 3 ac enanelo 1110 Localizves lorecsald a crane ILI Enainete paeosis 1112 Chsifcsren denies eco. (Cap. HL. Vitamine 31 coenzime. Prof. De. doc. Aurora Pesce} Lt Generale ML2 Chyiicars visitor 113 Vitaninele hidrosolabe i voir ir coenatinaien. M131 Complesal B ‘Vaan B, amiss) i cocina tminpiatostat Vitamin By (ibellavint) x coenzele fav Vitamina PP (nacia) gi coensimelenicuinarsidice. Vitamina B,(piridonina) yi coonaimele derivate ‘Aci pantotenic gh ewenbima A, Blowing gi oll ei Coenimatc, ‘Vitamiat By (ctancobalanina) yi ela ef coeneimati, Aciul folic eoenziele dria 132 Viumina € acid ascorbic). MLA Vitanipels paso, TL Vieanina A reine. h42 Vismina Doss Lt Vining ka Viti (Cap, IV, Adal nucle (Pro De: Veronica Dino), 1N.1Intocere N22 Sct chink air aie V2.1 Brace sunave din store acallor able 1¥22 Nocteoise i eteotde din tors actor wii 1.23 Nucleotide naturale bes V2 Analg! stctra psor aot i miler 1V25 Sinatanscovaleolt»scgior uch 126 Camis Tato cine nestor al ‘enatraen 9 hates ABN Rivrales aetior aude 1a’quial devonrivonclet VS Strasura coves a ABW. : 1¥32 Confonnofia motel de ADRS pu ve saves {33 Omaizarce nara gee I poss suc 2% attr genous cuca 123 Bioinens ADN (epicaes)- ices Ja procacns Reflcwes Is Socio. Sines de ADN pe mani de ARK. V4 Atal ancl Tih Tipo de ARN, “ARN mesagoe (ARN) [ARN de tater AUC, AARN sinozomal (ARN). AARN nvcler dee! dns wanes Aaa ma de ABN Gio) Transeriote ls Euan Innit a wana 13 rec op psec’ ae niclior de AR, Exciviaintonor din tnseripce par Molten posta ulfinae IVa Bisiates ARN pe maid de ARRCap. V. Blosinteza protenclor(traduceren mesaju Vel Coda genetic. ¥2 Blosnters proteincor, : 2 Prelucetn postiadieee we malacuiorpotie Ye Rega oni price. ‘V5 Ltn ale molcslelor de ADN i separate seein, tai ‘VSI Reparte pin excne sna : V52 Repararea prin evenaree len 33 Mia Expr erotics mai. CClonatea genelon me 7 Choarea goosor in viva (Fetioiog ADN recogni ‘141. Seenaial= clon geneor sieves ADN recom 3712, Expamaen fens infonmai copies in ADN vec 72 Clonaresgencov in Vio (Reatia polimeraies Ts la) 73 Aplin le clontn gene iDetrminaesseevenetnusesicior te eipensdctd) fhe muse ante ‘eon de trostr Sot ‘enetie). (Pot. Dr. Veroica Dino), ¥. v, v, vi Cap. VI, Bnergetica blochlmied, @rof, Dt. E-trai) Tiago me V3 Sine trmotiunic.Fanli de aarp inno AA a tc VLE Cate de sitet ATP i vv, a Cap. VHL. Metabolism glucidelor, (Prot: Dr. Verouies Dia)... 204 Vila Chimis glucidelr : 204 VILL? Monorail el 5 235 ‘Stereoizomeria monveahardeior : _ 2s Structure eiclie ale monozaharidlor, : A 5 08 “Amsinozshren IS 403 Denosizanarn, u so Proprieie fiice 4 chimice ale inoneaaacdsin. ans YViLL2 Olipozsbarvee : 408 VIL Polzahartde HO | ‘ViL2 Digest aber glucdelor, I a2 | ViL211 Dette enzimatce In digest yi absori guido‘. us Vil3 Gaile de metabolizare a glocoze. = a6 VMAX Giicolia (Secventa Embden-Meyamnot Pana). us ‘Bilal cacrgeic a licliai : 2 VIL32 Decarboniiea ochlativa tpiuvaiauis |. > 29 ‘VU133 Cielul acvalor icssboxle (Cell Kesh) 333 Ciel Krvbs = cae wnibalict F 85 Bilan energetic al ane slacoii or TN SlsVid Ale efi de metsbotizar a slucom Vili Cale peniozofostatior ce pean ar EF Dette tn: cnt pte ae pon i ‘vita’? Cale aed a ere ms VILS Glaceneogens, ‘ViLSi1 Roplare alostaicd a gluconeogencze. i152 Rela: hontonl a acomsopom ius Metabalsnal licogenclu 'Vil61 Degradrenshicogena Reglare plicogenoize ‘Vu.62 Biosintesa plicogenalsi (Gicogenogenera). | KReglarea glicogenogencze ‘VIL63 Alert entimatice in metaboismal glicogenitul VIL Meaboismol galacozs. ILE Metabolism frac VIL9 Glicoprteiele ees. VIL9.1 Biosintea alicoproteincion ii92 Snes lg cpio ‘Vu.t0 Piosoalicani : Cap. VIN, Metaboisutlpidelor. of: Dr. lens Popa-Ceistesh coeeesees 394 VEIL Chim ipidelor. Se : cose $84 ‘WULLLT Asis eae EEN a VIULL2 Actaris (Glicridls so grisile nasi) aeeettr 387 VL. Retell (Geral fra) 3 339 ‘Ai Tosa 389 Fesfsicolinele Gein) 200 Fosftlistanolinl : fon Fosltiisennsle (en-tfiie. 402 Fontan Ga ois, i 402 Paamalogenle 404 Fostaudigterti DUS 04 VIL Sfngolipdete : : do ‘Slingomicinel. : SEEN Saas ‘Geosinglipiel. 2 LIT fos urns Comer se 2.0200) : ao VL Ue ein. aor rence ao * aoe a0 as Vtl2 Digest absorb lipideor : VIL Metabolism sciedor grag es NON an ‘VINL3-1 Degradarca oxida’ 4 avsilor gr Onidarea sctitor grag (Ciclal nat aps iui Lyne, a8 Bonus sar ft Sentara a1 a2 (Oridare chor grain pono VIU32 Catogenecs 5 \VUI3.3 Biasinezs cil gag ‘Biosineaa eidal pam Elonpatea aszlor gra. 5 Bosintzaaciilor gayi nestor == ‘VIS Metabolfemal lev, ‘INS Metaboliemal naciiglicsrtior ‘VINLS:1 Hidolia ta liceroio, ViIL3.2 Biowineza taciglicerolitor. LVIILS Metabolism! gliceolosolpidelor. VIILT Metabotismalsfingolipidelo VIIL8 Meabolismal colesterohu : ‘VISIT Digestia yi absorbpa colesicrluul VIN82 Biosinteza coleterails : VUIL83 Catablisna)eolesteroluii VIL Lipidele plasmatice VIO Analiza lipides plasmic, VIIL92 Chilomicroni ssVIL Lipopreseinele ev densiate mick (LDL, Bl poproteine). IIL Lipoproceinele co dentate mare (ADE, eclipopreceine). UILOG Acti grag ber (AGL, scat graginecsteniie) ‘Vi97 Dispel ‘VI.10 Ficosante. VILI0.1 Blosintexseicosinoizio ‘¥INL10.2 Catabelismal peostaglandielor 27 YVIILIO'3 Acne biologic ale eicosanizion (Cap. IX. Metabotismal protelnelor sal annuacizlor. Prof. De, BX fatroducer. DC Starea dame poicinelo. Banu anus BG Digest prtincior lint yaoi nici, iia rte endapee, 124 Fondul de aminoacla. Aminoacta esa IK Caan wine desist yi Sl nog. IXS.1 Aspect generale, 1X52 Dezaminarea oxidativi a aminonczlor ji anspor union C53 Diowntens ce DCS Rela fine csi ureogenoti i ich senior iearboniic. ESS Boi cauzate de defecte in metabolizares amoaiacul, 1.6 Catabolism aminoacilon wilzares eeeletclo de carbon, TX61 Aspect generale 1DC62 Alaina treonina,slicins, seria, estina (i ltina) ro Segre la ald pirvie. | C63 Aminin, poling, bstidins,glutamina aedulglotamic se degradeso8 In acid eeetogtae, [D644 Aspagina i aeidal sparc we dagradcn ia onatoseetat” | [DCG tzoleucing,valos yi mlionins ae degredouss la scsinl-COoA, 1RC.86 Leucinn i lizna e degradeazt lo acid ueoioactic va acetal. CoA, 1567 Trpuotsnul se degrades I aceliCoA alain [C68 Fenlaanion gi ror se degradeazd ta acid fumavic gt acid acetoacaic 169 Bali caunate de defect th uiljatesacheltal de eatbon a amioaeizlor i Blsiens anne tei TK Aspecte zener 1X72 Ca parcalare de biosnis, 1%.8 Fonmarea din aninoaczi a unor comps ce fant speeaizae. DX.61 Compusi rez prin deearbotiaressminesczion C82 Biosinteza gluational, DCR Sintraa ereatne. Relajia crating = creatifosat. Creatnia, DCB Coripuyi de wconjuene” a aminoseiaior Cap. X. Metabotismal hemoprotenelor. (Profs, -Tria) XL Aspecte chime. 2 Bionintea her YET Elapele bsinere, | X22 Keaharea biosinteas emul 23 Powe, X.3-Caiaboismul iin YLT Brae inal X52 uilabinomre, vinden Ho ei, anor, ee bile XC83 Euaple finale a X35 Hipebtimbineni Tryin Cap. XL. Metabolism nuctootdelor purnice prince (Prof: De Blebs Pops-Cristes. X11 Metabo wucteotidelor pier X11 Bosnian de novo «leila ncaa I Bionntena AMP si GM, site aucleelr es igi fost wera. Bisitezn desocibonecleldelo, Retlava biowntsae de novo purl XL Ineo toe pir X113 Cabell purglor [SUL Batelogia metbolsmttal piston ‘st m a 6 6 9 419 09 far 90 93 eu euX12 Metabolism nacleotielorpisiidinies urine tt a Fe Go. om ot Br an ae ees : : a ‘aise Soe IRs SaagAn 22 ee : e aE A ace oe rae aie ee x gies oe ‘XILS.1 Hor al parti Wee ee 4 BEIT Sica hi a va OS Seas iemaaare “ ee SESS Oe er & 28 Scar ets 28 Sg woe i : et ace SS58 Hormonii hipofizari glicoproteci a a HT @0 XUL11'9 Hormonit neu chipolizan & ul42 Epis team peal 250g} SI15 Ehdortne : as ROLL Ft ei 33 L141 Fula EO peru grow factor : 635 SUL43 Fonte For (Hwa pow aco : Soe 6 XUL143 Fumi POGE (lacket derived grow factor). «2002202. 2 686 XUL144 Familie TGF B (Transforming grow far aes a XULI45 Factont de eresereinsainclke (GF, emstomeding) EI 6a XiL146 NGF (Nee grow factor. eae rly XIL1427 Familia CSP {Colony stimalaing factor). BUI 9. RITES Eten (Etopenn ning no : 0 XU1149 Intedeakinele GE : eae XUL34.10Ineroronit ONE), eas XILI4.11 Oncogencle yi canola erent clare. es Cap. XITL Apa. Procesee hidrvetcetroitie sf elilbeulaeldostazi. (Prof. Dr. dos. Auror Popescu) XIIL Ineoduoer . 6a RIN Cojtel psi ape i on : 63 SHA Beibal spel fn organ, : 67 XMLS.1 Necesal line de ap SII aie KIL Pendens de apa : Soy os XiI13.3 Exoosul dt apt aon ST oa XM Brooceaite neo-chinie ae pet. CUE En ei ADEA Stn praca marie : ol ee SIL42 Lagstura de hidropen 9 asoiee molecule : Dg 10%A.4.3 Cio spect clara de vaporzare, UL Caaare de top, poncal de toi pont de ters SULaS Ape ordain hs rose inci 1 noes se rl oi a pc SUS Kev slaty pl. XLS. Spect de aca abs i ie ithe Headsets ‘Yli.61 Silene tanpon aida hiarbooat. 3.63 Satemal tampon a fos Ae} Seca ign a pri XiLe4 Sitemal mpen al bomogtobioet ILS Coopenrea pman-erit Cap, XIV. Matelea estracelulard (Prof. de. oe, Aurora Popesca} XIV1 Consttvenyi cic af matrce!extmeelulare, ‘NIV-71 Prec. YIV.L2 Glicoainingticani i pasieahicaal Giccraminogiat Pantie hislogioe ale proteaglicanior i licvaninc pliner: Biosuncon gi degeadare prteoglcanlr, IY. Rolal mathe! extacealare Ta eysul mocdopencze IV3 Modified consttuenlor natsoat exacetlre. XAV.S1 ModifeSri fa fone do Vast XIV.3 Colagenozee, XIV.53 Une mealies calaive dnd XIV'34 Macopolzanardozele ‘Cap. XV. Nofiuni de nuteite (Prof, Dr doe. Aurora Popes). VA Katou 53 Necesaral nuit ‘V2.1 Chel de energie ‘Mabotismal boa Ereccle wnnosenetie Chet egies den Se elvis a depo. sever Sega 5 Conipoaii envi jel abner XV Pencpie native V9 Ghucse 333 Lida 5353 Bronte V3.4 Viemiels KV353 Minerale KVMs Sobmanjele score hie V5 Fite smear wee Nes “i 4 Procipelle prose aineare ‘Vi Wels atsenare de ogi inal apts si produel acai ue. Came. Pestle xvid Pret nite de abe was Corealele. apie: XV.43 Ae prodise ainda ‘rodusele zalacoase Uae Condiment XVAE Allmenie bogs Ya ainosei excel XV Renaniare ner pap aatev nce npn prdas aii. 2xV'5 Couanboya nail pistarea S58,Cap. L PROTEINELE. STRUCTURA GENERALA Proteinele sunt constituenti chimici ai organismelor vii cu cel mai inalt grad de complexitate, de variate moleculark gi care prezinté specifictate de specie, de organ. Denumirea lor deriv’ de la cuviintul grevese .proteias" care inseamin de prim rang, cel dintti". Protencle_ sunt ubsanie masromolssulae de-pae-nalioenidich. La consria proteinelor participa woacizi fundamental, aceiasi la toate vieluitoarele, de la. i_simpli_bact 18 la om. Prin legare in lanfuri polipeptidice variate ca jungime si succesiune a uniii{ifor se poate objine un numar nesfirsit de combinagii, Cu toat multiplicitatea posibilitijilor de combinare a aminoacizilor in lanturi polipeptidice, 1a_un_anumit_organism nu se realizeazi decit anumite.seevente, acelea care sunt specificate de materialul genetic, de ADN parental, Proteinele sunt macromolecule informafionale, cu secvenfe_specifice ninoacizi, sunt expresia epigeneticd a genomului celular, Proteincle indeplinesc funcfii fundamentale, specifice organismelor vii (Tabelul 11): Tabet B. Exemple de proteine st funefil indeplinite de acestea Proving Fania ‘Colagenul Principala proteind a jesututilor conjunctive Histooa Proteins nuclear asociatl ea ADN Spectina rotsnd eritocitara cu rol in menfinerea forme eclulare “Armilaza Enzimd, paricipé la digesia amidonulut Pepsina Evin, parcips la digesia proteineior Glicogen sintaza nein, parc la sinteza glicogenlui Taciat dehidrogenaa TBnzim, catalizeae oxidarea lactatula la pirovat Aetna Proicind contactlé din magchi ‘Miorina Proveind contract dia magehi Tsui Tiormon pancreatic hipoglicemiant Hormonul de eregere Honnon tipotizar Serumalbumina Protein plasmatice, anspor jon, vitemie, honnont Hemoglobina “Transport oxigen i sstemol circulator “Transferina “Transports oni de Her a plasma Feritina Forma de depozitare a feral Giocroni “Transport electron Trunoglobatinele “Anlicorpl care fixeatl i imobilizearl agenil bactereni Tibsinogenal Proving plasmatied cu rol Sn coagularea singelal - Proteinele au un ro structural major, ele consttuie material din care sunt consiuite toate siructutile celulare, membrane, organite celulare ca si materialul interceluzr al Jesuturilor gi organelor, Proteinele exist intr-o varietate molecular’ foarte mare si cle asigurti diversitatea si specificitat 13+ Proteinele. exercitiactiuni cataitice, determindnd varietatea nesférsitt de: reactii biochimice si specificul transformarilor chimice dn organismele vii. ~ Proteinele contractile sunt instrumentele :u ajutorul c&rora organismele vii Indepinese activtatea contact i locomotoare. amine, oxigen, dioxid de carbon. - Proteinele’ au sarcina de a apira organismul impotriva unot corpi_strtini, ‘macromolecule, virusuri, bacterii, Reactiile imunologice sunt mediate de o clast de proteine specializate - imunogiobulinele, L1. AMINOACIZIL Unitajile constituente ale proteinelor sunt aminoacizii, care prin legatura peptidic& ‘inure gruparea aminict a unei molecule si gruparea carboxil a altei molecule dau nastere TLROSTMGHECHE peatiee, Esa 20 arniomclapretcnogent specicay pin coal genetic, prezenti in toate organismele vii, de la cele mai simple pnd la om (Tabelul 1.2). Altituri'de acesti 20 aminoacizi fundamentali, in proteine se mai intdlnesc alti cdtiva, care rezultd, de fapt, prin modific’si chimice ale acestora dup’ tncorporare in lanfurile ppolipeptidice (do ex. hidroxiprolina, hidonilizina et). Totodati, se mai intlnesc si unit aminoacid cu ate func, ca omitina,cirulina (Tabeld 1.3). ‘Aminoacizii natural au formula general: B—GH— coos NH, ei sunt c-aminoacizi. Face excepfie unul din cei 20 de aminoacizi,prolina, care, are 0. functie aminic& secundard,_ Diversitatea aminoscizifor naturali este datt de natura tui R care poate fi 0 catend hhidrocarbonaté alifaticd sau aromatic, un heterocicla sau R poate s& cuprindd o functie adijionala. + Aminoactzit alifatict-(Pard gruptti functionale th R). Gicocolal sa glicina: GH, — COOH NH, Alanna: oH, — cH — coo th Valina: cH, — CH— cH — COOH ba, he Leucina: oH, — CH CH, — cH— cooH oh Teoleucina: CH, — tt — Ge — Gt SO0H CH, NH, 4a(S] aa uy , "aN HO 12] aumomaaustounien poy] tupnon ooo —H}— 1b "ho — "ho 1. a) oot stoxtmearounse- PPY| 1000 — HO — "HO — HO — *HO| SN “HO als mPR.CORHEE» PEN ree 009 ~ ¥ — Hb — HN, vil aw ousdsdaguen py eer 1000 ~ 4b — "Ho or 69 onaswouie poy] cement) soon 000 — 1} s e € t t eo co imag. | paierseo ors nos pone norma. poamonas paso cr mean rodoupjoad soyzprouae ingap 16 agIMPANS,‘UN HSI arcane suoxdaxdon-f-ommme-p pry) PUI) 000 — Hb — | *HN "HN HO. fe| om ee ee "HN HO! | me onion env pov _ 1000 — th ab] ji te 0 ay omioxioudopur<-ounne-n proy| jendy | OS aa at fi HN \ a a 1000 = th — 10 ££ ) 7 HoO9 —y ) og ‘paxoq9-o-wIpHONE pioy | ‘puroad] L_ gs v £ 1 (oaomurwes) Z1 peaa w=$ sn wy WS!) ay emu sounutpend-g-ounun-D poy sumary| Wooo — #}—tHo — "Ho — tH} HN “HN xlé] wa ayouesounnepar9 pv] eon] 000 — 1b — "ho "Ho — "Ho — "Hb HN a] a umn opauet-coen roy onmno| 009 — Hb — "to — 0 — oon 2 (4 "4 a aa ouenifoune poy] sama pry Hoos ~ #3. — "Ho — "Ho — 200H aN nQ2i] wv auponsopaun-goumen poy] guy 009 — Hb — "Ho — oon or a aw ee 11000 ~ Hb —"wo — 9008 aN wt consensnowsommn ny] _eemonen| __Hooo—Hb "Ho —"Ho—s—‘ho v £ c T (zonwgnuo>) Z7 2901stozuaqoune-t poy HO —"H'O — NH orange pay-cuue-n poy euuDsOWOR, HOOD — CHNJHO — HO — “HO — OH ouungonst-oute-n poy ustSowoH, Hoo9 — CHNIHO —"Ho —"Ho — SH ommuDyesomUEp-g'2 PY wuntig, HOO — FHNIHO — CHO) — NTH mepatesoupuive-g-oumuse-» poy sei | HOO ~ FHNIHO —"CHO) — HN — 09 ~ NH 1 apauurct orugsaqouNeg py HOO ~ "Ho — "HO ~ 09 —"HO— NH Loreoponiomay, vk poy vaya 1 Hooo — "Ho —*Ho —"Ho — NTH amordoudoaue-d pray wumety = HoO9 — "Ho ~"Ho— NTH 1 automa mn aagumuog preanaonas pmo Ermey, mofouayoudon yovouuyAminoacizii aromatici (fir geuptiri functionale in R). reotmnee on net coon 1 Ni, Aminoacizii heterociclici. Histidina cuprinde heterociclul pentagonal cu doi atomi de sat, imidazol Oo ott ; Triptofanul cuprinde nuclewl heterociclic al indotutui oo I a cH, — G— COOH O art ql Inde ‘Triptotan Prolina cuprinde o grupare aminicd secundard, situatd intz-un cicl derivat din pirol: O ou N 8 q gin peti Aminoacisii cu grupari hidrosilice. Serina si treonina curpind in R functii alcool: Gre pri coon Oy — PH — GH ~ COOH OK NH, OH NH Serina Treonina Tirozina posed o funcjie-adijional’ fenol: w<_) CH. GH — CoH NH, 19Aminoacisit cu sulf (ioaminoacizit). Cisteina cuprinde functia tiol (R= —~ SH) gi melonna tunic oter R= = 8 — BY Gi, gr — COOH chy 8 — oh, — OF, — GH — COOH du tn, th Catia ti Aminoacizi dicarboxilici. Acidul aspastic si acidul glutamic sunt acizi monoaminodicar- boxilici, iar asparagina gi glutamina sunt amidele lor: HoOC — cH, — GH COOH #000 — 04, — oF GH — COOH NH NH cial panic cial game HyNloo — oH, — GH = COOH H4Noc — oH, — cH,— G8 — COOH NH Ny sparging tain Aminoacisit diaminici, Lizina are ca funcfie adionatd o grupare aminic& primar’: HN — CH,— CH, — OH, — GH, — GH — COOH Ny ye Ne Arginina cuprinde o grupare guanidi derivati din guaniding, H.N— Ni I NH HN — G1 — CH, Oh GH, = CH— COOH NH NH. Arnis Proprietaitefizice ale aminoacisilor. Toft aminoacizii sunt substante solide, cu puncte de topire rdicate, mai mari de 200” si se descompun inainte de ase topi. Aminoacizi se dizolv’, intr-o miisurd mai mare sau mai mic, in api, dar sunt grew solubili in ‘solventii nepolari cc eter, clorofarm, benzen, Sunt usor slubili h solu dilate de acii si baze. Ieomeria opticé a aminoacisilor. Toti aminoaciai, cu excepfia glicocolula, posed un centru chiralic (un carbon asimetrc) care este Cyt R- oe —ccon NH,Tzoleucina si teonina au un carbon asimetrc aditional, stomul Cy. Formulele de configurajie ale enantiomerilor unui aminoacid oarecare, reprezentate in sistemul D-L. in care substanja de refering este aldehida glicerict dexirogita sunt: Goo ook Hm GaN HN G—H R R D— aminoacid L— aminoacid fin structura proteinelor nu se intlnesc dectt L-aminoacizi. Aminoacizii din se-ia D ‘apar numai ocazional, in special la unele microorganisme si totdeauna au roluri specifice. Propristile acidobazice ale aninoacizilor. Aminoaciziicuprind 0 grupare — NH, bazict $i una — COOH acid’ gi intre aceste dou funcyii poate avea loc transferul de protoné: oot coo" RacnS ee RH , wis in pr wf) Daioritt interacjiunilor electronice posibile intre cele dou funcfii invecinate, cchilibrul reacliei este deplasat aproape in totaitate spre dreapta, practic aminoacizii (monoaminomonocarboxilici), in cristale ca si in solufie, exist numai sub form’ de ‘aunfioni (ioni bipolar). Structura bipolar a aminoacizilor este susfinut& de numeroase fapte. Prin_miisuritori de distanje interatomice s-a gisit ct in gruparea carboxil, distanjele C-O sunt egale (1,26 A), ele corespund ionului carboxilat, unde are Toc conjugarea mp: De asemenea, moleculele aminoacizilor, neutre in ansamblu, au momente de dipol foarte mari, cuprind sarcini electrice mari si de semn contrar in regiuni diferite ale moleculei, {oni bipolar ai aminoaciaiior rimdn tn continuare ainfoij, ei au aft caracter acid, cf si ccaracter bazic, Functia acid actual a unui aminoacid (moncaminomonocazboxilici este ‘gruparea aminicd protonattt, — NH,*, acidul conjugat al gruptirii aminice, — NH: = NA! === NH, eH acid asa 2Funcjia bazict @ unui aminoacid este ionul carboxitat — COO™, baa conjugatt a ‘grupirit carboxil baat sad Unii aminoacizi ca: lizina, acidul glutamic, acidul aspartic, cuprind fn radicalul de Ia Cy gruptri acide sau bazice adijionale, Pentru inceput in examinarea comportanii aminoacizilor ca acizi c ‘monoaminomono- carboxilici (aminoaciz Pentru caracterizarea aciditi i zicityi aminoaczilr se folosesc exponentii de aciditatc, pK, (OK, = — log K,), Funcfia carboxil este caracterizat prin pKq-coont iar functia aminicd Drintr-an pKa.nt,*, La unit aminoaciz se adaugl oa tia masime pK, corespunzztoare funcict acide adifionale, ‘in Tabelul I se dau valorile pK ale celor 20 de aminoacizi natural Din examinarea datelor din Tabelul 14 se remarci, in primul rand, faptul c& functia — COOH este un acid mai putemic (pK » 2) tecit grupwea similar a acizilor carboxilici oarecari (pK pentru acidul acetic este 4.75). Aciditatea grupait — NH, este edusa (pK = 9-10), dar intrece towusi bazicitatea — COO™. Din aceasti cauz’, in apa puri, gruparea — NH,° doneaz% mai mulfi protoni dect accept ionul — COO Solujiile apoase ale aminoacizilor sunt slab acide, Tabel 1. ‘Valorile pK sl pl ste amineactztior ‘Amincacid PKa-coon Kano PK pl es) 1. Glicocal 7234 9.60 2 Alsnin 235 9.68 3. Valing 232 982 4 Leveing 236 9.60 5. leleucing 236 9.68 6. Fenilalaning 133 913 7. Prolin 199) 1080 8. Taipiotan 238 938 9: Sern 221 ous 10. Tyeonina 23 1043 11, Troan 230 91 10.97 12) Cisteing wn 10,78 833, 13. Metionina 228 921 14. Asparaging 202 i 15, Gluuaming 207 ais 16. Acié aspartic 208 gig2 3.86 17. Acid glatamic 21g 967 45, 18, Histiding i 317 6.00 19. Lind 218 895, 10.33 20. Arginind 217 90s | 1248 2le aid i az pe cre fe cuprinde pote reactions cu x i cu acizi, acceptind protoni. incircarea electricd a unui aminoacid dopinde de pHT-ul solufiei. Dac un aminoacid se afld ints-o solufie puternic acid (PHT = 0-1) grapirile acceptoare de protoni sunt protonate in totalitate, La titrarea acestuia cu ‘© baz tare (HO}) protonii sunt eliberafi in ordines descrescdtoare a acidilafiifunctiilor acide. Au loc reacfile: B A -i H — COOH > pi co0" NAY Ni, Jn. 11 este preven cura de ive aie, a newaii fneilor — COOH s NH sls de NOOH. ak it Layfh-cne? ref oer cooy : : / se | tL 7 é arr Moc ty: 969 7 | 7 bette : | 238 1 $88 | | | I { v0} [tsi -oHeH- coo? 7o FF 30 Eohivelenfi HO™ Fig, 11. — Curba de trare a alaninel, Din ecuafia Henderson-Hasselhalch: (Bazi) PHL DK, + og EE 2Brezultt cl la un pH egal cu pKa.coon (2.35) exist egalitaten HN — CH(CH,) — COOH - HN — SH(CH,) — COO~ iar la pH = pKa-nn,* ©.69) egalitatea: H,N — CH(CH,) — COO- = H,N— CH(CH,) — COO™ La un pH egal cu semisuma valorilor pK, sarcina neti a aminoacidului este practic nul, in solufie existind numai ionii bipolari. Acst pH este denumit izoelectric (pl). In Tabelul 14, coloana 5, sunt date valorile pl ale aminoacizilor proteinogeni. Pentry aminoacizii neutri, punctele izoelectrice sunt situate la valori de aproximativ 6, pH pain inferior pH-ului fiziologic, La pH = pI solubilitatea aminoacizilor este minim Comportarea aminoacisilor cu grupari acide si bazice adifionale. Un numir de 5 uminoacizi din cei 20 cuprind in radicalul R de ta C, grupaii acide sau bazice: acidul aspartic, acidul glutamic, lizina, arginina 3i histidina, Funcjia fenol din tirozind gi cea tioalcool din cisteint sunt acizi foarte slabi care ta pH-ul fiziologic se ionizeaza intr-o -mvisuri neglijabili, La acesti aminoacizi se.adaugd o 2onstanta pK suplimentard (Tabelul 14), Fen acid aspanic i eluamic acidatea aco fun este mai mic deci a grupului carboxilic de la C,, are 0 tirie comparahilti cu a acizilor monocarboxilici alifatici (pK = 3,86 la acid aspartic gi 4.25 la acid glutamic), nu se mai simte influenja grupirii aminice'vecine. ‘Formele acidului aspartic, in raport cu pH-ul soluiiei tn care se afl, pot fi deduse, ca si in cazul aminoacizilor neutri, prin protonare maximal’ si apoi adiugare teptatti de za: {uncfile acide vor eeda protoni in ordinea descrescitoare a tiriei lor: = om va a fe Be ae Beane te Bln ote Blane oe bee (Fy (0) oO (2) psu izoelectric al acestor aminoaci este dat de semisuma valorlo pK ale functor ‘care genereaz’ ionul fra sarcing neti. Pentru acidul aspartic si acidul glutamic, punciele lor izoelectrice sunt situate Ia valori net acide (2,97 gi, respectiv 3.2), Lizina este un aminoacid bazic cu o funoje aminict in R, Formeie lizinei in raport cu variagiile de pH ale medivlui sunt: Hy — NH Gre Na qo Gren (Ha (ps ra (hae re (Pde won EA coo CEL Gein, CER Gok ee ine ce Re (2) (+ (9) ie) pH-ul izoelectric al lizinei este situat la valorarea 10. 24Arginina are un caracter bazie net prin gruparea guanidini NH NH q +H NH-C—NH, == R W NHC —NH, {on guanidiniam Jonul guanidinium, datorits conjugal x — p poate fi scris: Histidina prezinth caracter bazic prin nucleul heterociclic al imidazolului: ve U Bazicitatea acestei grapiri este mai redust (PK = 6,00) si pl este situat la valori apropiate de pH-ul fiziologic (7,58) Din cele expuse mai inainte Teaulta ci ionizarea aminoacizilor, sarcina electric’ pe care 0 poarti fiecare dintre ef, depinde de pH-ul solu’ in care’ sunt cuprini, Dact finem seama ci in organismele vii aminoacizsi sunt cuprinsi in lanturile polipeptidice ale Brojeinelor este important de examinat comport cd acizi sau baze a restuior Aminoacide -NH — CH(R) — CO -, sarvina electrica pe care 0 poarti aceste resturi Ia PH-ul fiziologic. Resturile aspartil si glutami au in aceste condifé o sarcin& netd (-) pe cAnd resturile lizil, arginil si histidil au sarcina (+): er pe is weed Ve oe ae oe ied —NH—CH—CO—; —NH—CH—CO—; —HN—CH—CO—: —HN— cH—Co— Restul histidil este redat prin dow structuri tautomere: NA 2 i é 8 eon poe ( = | . : : 28Clasificarea aminoacicitor dupa natura radical’ de la Cy In proteine, aminoacizit sunt angaja( in legis pepiidicsprih wruparca amsinica si cea carboxil 8 I NH — CH—co— seit aminoaciaic Cvea ce diferentiaza resturite celor 20 de aminoscizi este natura radicalului de la Cy Natura interacjiunilor ce ye pot stabili inure resiurile aminoacidice depinde de incarcarea electric 1 acestor restur, de caracterul lor polar sau hidrofob, TTinindasse seama de aceste insusiri ale resturilor R de ta C, aminogetsis sunt impanfii in patra grupe aminoacizi cu R bidrofob, nepolar: izoleucina, protina, feniialanina, wiptofanut, metioninay b, aminoacizi cw R polar, dar Riri sarcin& electect: serina, teeonina, tro asparazina, glutaming si glicocolul (R= HW); i cu R inclcat (-) (a pHl-ul Tiziolegic): acidul aspartic, vinoaocizi cu R inedreat (+) (Ia pH-ul Giziologie):lizina, arginn cisteina, cidul glutaani , histidina, Reac(iile chimice rilor. Aminoacizii prezintt diverse reactii chimice Ia care participa atat funchitle amino si carboxil comune tuturor aminonciziler, cit $1 sgruparile prezente tn radicalii de la Cy. Reavtii ale gruparii COOH. Aminoacizii formeazst derivai normali ai acestei functii ester. amnide, anhidride, nitrii. Prin decarboxilare, aminoactzii formeaz’ amine. mull dint ele substanje cu propria fiziologice gi lanmacologice remarcabile (amine biogene): R—CH— COOH ——> R— CH.— NH, + CO, Nay Unele amine, produsi ai reactiei de decarboxilare a aminoacizilor, sunt aritagi mai jos: N Ty CH, — CH, — Ny HOOC — (CH,), — NH, \ H tana scd-yaminobatne (in sina) Gn kid glotanie) Gis OH — NH, HN — (CH), — NH Gre eth NH, OH SH ctanolamin cadaverina iste (Gin seri) (din Hens) Gin eising) Reactii ale grupeirtt -NH,, Prin aceasti funcjie aminoacizii dau numerouse react + condensate cu compusi carbonilici RA 7 ean? O° / Hon, SN pach Nee He COOH COOH \ buza Sch (alii, esting) HR)agent R— cHo nd, ee a cH NCH), IS i CH— NH, set cH NH— co ~ - = on / o-c N\ ° ob I 5 GH — Ne se R—GH—NH—C—OH coo ‘00H ~ oxidare: + HO R—CH—COOH ——» R—CH— COOH ———» A G—COOH I = 2 1 = NHS 1 NH. NH oO ceteacd (a or0asis) ~ inlocuirea gruparit — NH, cu — OF: + HOH a —cH— coor "> a — cH —coon | “WA, 1 NH, oH sehideox-scid Reactii ate funciitor prezente tn radicalul de la Cy Pentru functia tioaleao! din cisteind sunt caracteristice reactiile: + oxidare bland’ sé reversibild la disulfur GH, — SH GH,—S —S — CH, -2H | | 2 GH—NH, === CH—NH, CH—NH, 1 +2H | | COOH coo coo sist~ formare de stirwi cu metale grele, marcapti RSH. AgNO, ———» A— Sag + HNO, + oxidare energic’ la acid cistei: CH.SH CH, — S0,H 1 oxidare | GaN eet, coon C30H acid citeie Serina, treonina si ts rezulttin iroxi formeazA esteri, cu acidul fosforic, zina prin func genera pt 9 Post GH Ne Gx —0~ Poy, coon bun, ss its coon by —q—coor ection wm, sid rosinfostorc Gruparea — NH, de la C, al lizinei confer acestui aminoacid sau restului tizil, posibilitiyi multiple de a interacjiona cu alfi compusi. Condensarea cu funcfii carbonit este una dintre proprietijile cele mai importante ale acestui rest aminoacidic. De asemenea, prin oxidarea gruptirii C, — NH; din ling se obfine alizina: ovidare HIN CH ~ (CH) — GH — COOH —e 0 = HO — (CH)),— GH — COOH NHS NH, lina ina Gruparea carbonil nou format poate participa mai departe Ia alte reactii, 281.2 PEPTIDELE Peptidele sunt combinafii de tip amidic rezultate prin condensarea a dow’ sau mai ‘multe molecule de aminoaciz: i i i i H.N— CH — COOH + H.N— CH — COOH —» H.N— CH —CO—NH—CH— CCH —H,0 inept Peptidele pot rezulta din dou’, trei,n motecule de aminoacizi, Ceea ce raimane dint-un ‘aminoacid dupa angajarea sa in legdtura peptidicd poartt denumirea de rest (reziduu) aminoacidic. Peptidele cuprinzfind mai pufine resturi aminoacide sunt denumite oligopeptide, iar acelea cu un numr mai mare de resturi aminoacidice sunt polipeptide: i f i wo biccot Bion Eicon polipeptié Capetele molecule’ unui peptid sunt diferite, unul are grupare aminict liber, capt: N- terminal, iar cellalt are grupsrea carboxil neangajat, este capatul C-terminal. Resttrile de aminoacizi de la capetele moleculei sunt denumite resturi N-terminale si, respectiv, C-terminale, Inceputul unui peptid este capital N-terminal Denumirile peptidelor se construiesc socotindu-le derivati acitati ai restalui aminoacidie C-terminal, Se citese succesiv radical aminoacizitor incepiind cu capatal N- terminal pan la restul C-terminal, De exempla, tetrapeptidul: Geom, gion pe H.N — CH — CO— NH — CH, ~ CO —.NH— cH ~ GO — NH — GH — COOH Se citeste valil-glicil-seril-alanin, De asemenea, pentru redarea structuri unui peptid, ‘mai mic sau mai mare, se folosese prescurtirile de tei litere sau de o singurt liter& pentra aminoacizi. in acest sistem, tetrapeptidul de mai sus este redat: Val-Gly-Ser-Ala sau VCSA. Cu ajutorul acestor prescurtiti int-un spajiu restrins pot fi redate structurile unor polipeptide foarte tar Daloriti posibilitigii de legare a acelorasi aminoacizi in seevente diferite, peptidele pot prezenta fenomenul de izomerie de structur, de pozitie, Doi aminoacizi diferiti pot da nastere 1a dow dipeptide izomere dap’ cum unul sau altul ocupa pozifia N- sau C- terminal’. De exemplu, dipeptidele izomere leucil-metionin& sau_metionil-leucing. Posibilitjile de izomerie cresc foarte repede oda cu creslerea numfrului de aminoazizi. ‘Trei aminoacizi distincji A, B, C pot da nastere la 6 tripeptide izomere (peptidul cuprinde ciite un rest din fiecare aminoacid). Din patru aminoacizi 24 tetrapeptide, din cinci 120. Un cicosapeptid (cu 20 resturi) in care fiecare din cei 20 de aminoacizi este cuprins o singur datS poate exista sub forma a 2x 10" izomer. Posibilitatea legirii aminoacizilor fn secvenfe nesfirsit de numeroase sti la baza multiplicitiii gi varietijii molecutare a proteinelor. 29in organismete vi se ininese numeroase peptde (oligopeptide sau peptide mai mari) cu fanchi particulare, Unele din aceste peptide ax legtiuri peptidice atipice, cuprinzind resturi aminoacidice modificate, au structuricieice, cuprind D-aminowcizi (Tabelul 15), Tabet 15. Oligopeptide cu tune biologics Benumrea] Stacia Fura fenaion | y--u—ye ay gon edox Bradikinina | Arg—Pro— Pro Gly — Phe —Ser— Pro — Pha — Arg se MAgent ipor Jnictensina | Asp—Arg-—Vat—Tyr—to—His-— Pro —Pho tens, cegon 28 acca seororon aoe seen Hermon [rsi— An | Pro —cl— Hs — Pro— ami ean [Owtoaina | Sys — Tyre Gin— Aan — ya Prom Leo Gy anda | Rormon ° { nourhipotzar s— 8 [Vasopresina [Oys— Tyr Pho Gin—Aan— Gye =P Lou) = Sy aries [Roman neuchpotar —— a) Res Gly N-terminal este angajt in ogra poptdia prin groproa y.COOH b) Resta Gi N-arminl fmeazs amie ntond vest Pro © trminlformearé ani, :} Resturie 'oys si ys formeaza punteosulica; ras Gly C-terminal formeaza ami 1.3 PROTEINELE Protcinele au o sirueturi polipeptidict. Graniga dintre polipeptidele propriu-zise si sprotcine este arbittara. La un anumit grad de complexitate a lanjurtor polipeptidice apar nivele superioare de organizare gi calitii noi neintinite Ia polipeptidele mai mici. Proteincle, altiuri de acizii nucleici, sunt macromolecule ce exist intro varietate foarte mare. Fiecare tip de celul,fiecare individ, fiecare specie posedti un set distinct de proteins, Se esimeazi cd numarul de tipui de proteinedin intreaga lume vie este de 10"°— 10"? si potentalul de diversitate nu este epuizat. Chiar proveinele care indeplinese functii similare la specii diferite sunt entitiyi distincte, cu mase si propriety diferite. Chimia proteinelor este deosebit de complex, ea presupune, mai inti, infelegerea principiilor generale de constructie 2 moleculelor proteice, a modului in care dintr-un ‘numa Fimita de unit structurale se pot forma infinit de multe proteine gi a factorilor care intervin in realizarea organizArii lor spatiale. In al doilea rind, studiu! proteinelor 30necesith abordarea Fectirui tip de protein in parte, siabilirea pentru flecare specie rmoleculari‘a consti chimice, a arhitecturi sta functct (saw functir) pe care fe exer Structura polipeplidicd este apti st asigure proteinelor cele dow’ caractere, diversitate molecular’, pe de o parte, si specificitate de forma, pe de alti parte, Un polipeptid: bok Ro \,\7 NO NS NZ WY i | ‘cuprinde o catendi principal cu o structuri monotond in care se repet grupul de atomi - NH — CH — CO —. Varie‘atea lanjurilor este asiguratd de radicalii R fegafi la C,. Cu ajutorul celor 20 radicali diferii se pot objine combinalii multiple, deosebite prin umarul si secven{a resturilor aminoacide, Lanqurile polipeptidice, unidimensional> si flexibile, se convertesc spontan in edificii cu trei dimensiuni, cu forme caracteristice ‘peniru 0 anumita seevent de aminoacizi ‘Organizarea spatialt a fanjurilor polipeptidice are loc prin interaeyiuni necovalente — legituri de hidrogen, atracfipotare si ionice, interacliuni hidrofobe — la care participa ait grupisile “> C = 0 gi > Ni din eatena polipeptidicd, cit si diversele grupirt ccuprinse in catenele laterale ale lantului. ‘Complexitatea proteinelor a Aleut necesar% introducerea mai multor trepte de organizare structural. denumite structura primar’, sect Jterfiarli. si stmoturd uaternart, Structura primar precizeaz’ mundral i secventa resturilor aminoacidice ‘moleculf, ea redi (otalitatca legiturilor covalente din molecut’ si mai este denumi ‘sinictued Covalent) Strsctura primari corespunde formlcior structurale wanale ale anui compus organic. La moleculele simple astfel de formule definesc in acclasi timp 51 relafille spatiale dintre alomi, La proteine cu Janjuri lungi gi un num foarte mare de atomi sunt posibile numeroase conformatii (aranjamente spatiale rezultate prin rotatia liberi a atomilor sau grupuritor de a:omi in jurul legtturlor simple) si este necesara ierarhizarea nivelelor de organizare spatial’. Siructurile secundare rezullate din inferacfunile grupelor > C=O si > NH din gruptsile peptidice, sunt siructuri ondonate, periodice, ctementul structural case le gencreah previntd el insusi regulartate, Sructura terjiar’ a unui lant potipeptidic Jnalobeazd nivelul de organizare secundar la care se adaugd modal de pliere, impachetare a lantului polipeptidic determinat de interactiunile posibile intre radicalii R de la C,, interactiuni ce depind atat de natura acestor radicali cat gi de relatiile de vecindtate dintre ei. Descrierea organiz’rii spafiale a unui lant polipeptidic prin structura secundac’ gi tertiara este arbitra, cele dow’ nivele structurale se intrepatrund, impreuna ele definese conformatia specific’ a Jangului. Proteinele alcituite din mai multe lanfuri polipeptidice (proteine oligomere) cuprind ‘un nivel cuatermar de organizare, Stuctura cuaternari a unei proteine oljgomere descrie modul in care lanuile polipeptidice individuale, se asociazd, se asambleaza penitu a realiza siructura proteinei date, structura sa funcfional®. 3113.1 STRUCTURA PRIMARA A PROTEINELOR Prima proteint a clei structurl primard a fost stebiliti este insulina (Sanger, 1953), protein mic cu 51 resturi aminoacidice (Fig. 1.2). Dupat aceasta a urmat ribonucleaza Fig. 1.3) cu 124 amincacizi. Numarul proteinelor a ciror structuri primara este cunoscuts depiseste astizi ceva zeci de mii ‘Cunoasterea structurilor primare are 0 importanga deosebitd pentru infelegerca rolurilor proteinelor, ea a deschis orizonturi noi in toate stinfele biologice: ‘a. Prin studii de seevenfalizare s-a stabilit definity cf o_proteind dail are o structurt uni, nu este 0 colecjie de specii moleculare diferite (cum este cazul polimerilor de sintezi); b. Structurile._primare ale proteinelor constituie baza injlegerii la nivel molecular a_ activitatii lor biotogice; °c. Prin compararea structurilor primare a proteinelor care indeplinese functii omoloage ta organisme diferite se poate stabli gradul de varitate structural compatibil’ cu, 0 ‘anumitd funcfie gi aoeste comparatit permit urmarrea itorie? evotutive a proteinei. Dou sau mai multe proteine omoloage pot varia la nivelul structurilor lor primare, Adesea aceste deosebiri rezulti prin inlocuirea unui aminoacid dintro grup cu un cltul aparjinind aceleiasi grupe (de ex. Val cu Leu sau Ang cu Lys). Astfel de substitu sunt denumite conservative. inlocuirea unui aminoacid dintr-o anume pozijie cu altul aparjinind altei grupe (substitujie nonconservativali poate altera intr-o mare: misurl functia proteinei; 4, Secvenga aminoacizilor into protei ADN si expresia acestui mesaj: ¢. Studiile de seevenfalizare au dus la descoperirea unor specii de proteine anormale (proteine mutante) ca expresie a unor modificiri la nivelul genomuluis aceste proteine normale se pot manifesta sub forma unor boli (boli moleculare). £, Sccvenfializarea unui num’r din ce in ce mai mare de proteine a scos in eviden|& fenomenul de polimortism molecular. © protein eu o anumitt Functie, 1a 0 aceiagi specie, poate exista sub forme moleculare diferite. este vetiga intre mesajul genetic inscris in $ s* : : e Fig. L2 — Structura primaréa insulinet 32NOOK con 6) nqPooveee: 2888—,” & Fig. L3 — Structue primara a ribonucleazei 13.2. ORGANIZAREA SPATIALA A MOLECULELOR PROTEICE Fiecare proteing, fiecare lan polipeptidic are o structura tridimensional specificd care este reprodust cu fidelitate de milioane si milioane de ori in cursul viefii organismului si de-a lungul gencrajilor, Forma specifici a unei molecule proteice este determinati de structura sa primar, unicl pentru fiecare tip de proteina, Aranjamentul spatial unic pe ‘care un lan} polipeptidic 11 adoptt intr-o solutie este impus de constringeri termodina- mice, este rezultanta tuturor interactiunilor necovalente care se pot stabili in cuprnsul moteculei astfel ca nivelul siu energetic si fie minim. Aceste interactiuni necovalence de energie joasa (1-7 kcal/mol sau 4-29 kJ/mol), au energii de activare mici, se stabilese cu viteze foarte mari gi nu necesita intervengia mor catalizatori. Ble devin eficiente numai prin insumarea efectelor unui numir foarte mare de legituri ‘Legtturile necovalente care se manifesta in canal moteculelor protece, ca sila alte citegorii de biomolecule, sunt legdturle de hidrogen, legiturile polare si interafiunile hidrofobe, 33Legitura de hidrogen se manifest ca 0 valent auxiliary’ a hidrozenutui cmd acesta este legat covalent la un atom puternic electronegatir (O sau N): 8 b+ — x———— Y donor de hidrogen acceptor de hidrogon Atomul de hidrogen, polarizat pozitiv este atras de atomul electronegativ al altei molecule, Astfel, egitura de hidrogen se manifest, tn principal, cao fort electrostatic’. Punjile de hidrogen se stabilesc dupat direct privilgiate. Direcfia cea mai favorabita, cea care duce fa interacfiunea cea mai pulemiicd, corespunde colinearitiiicelor tei atomis X,H gi ¥. Totus, cdnd aceasti dispozitie nu se poate realiza sunt posibile si aranjamente nelineare ale atomilor. fn afara de api, unde fiecare moleculd este angajat’ simultan in patru legituri de hiidrogen, la dout participa ca donor gi la dowd ca acceptor de hidrogen, asociafile intermoleculare prin punfi de hidrogen se intalnese la multi alfi compusi, in stare pur sau in solufii apoase. Legiturile de hidrogen intse- sau intermoleculare intalnite la proteine si alte biomolecule sunt: e —O-H=O-H : O-H~-0«0 1 | »~ ~ Zz DH Inieracjiunile electrostatice, polare, se stabilesc inte grupai cu sarcini electrice opuse. Aceste interactiuni pot fi: ~ asociatiiinire perechi de ioni, legituri saline (de ex. inire un rest Arg gi unul Glu); ~ inferactiunea dinire o grupare cu sarcin’ + sau cu 0 grupare polar Rr sarcin - interactiuni intre grupdiri polare fs sacing. Proteinele cuprind-un numir mare de aminoacizi cu R polar, fri sarcini, si interaetiunile dinire acestia sunt un factor important pentru stabilizarea structurilor de ordin superior ale proteinelor. Totodati, in interiorul moleculei proteice, unde accesul apei este interzis, se realizeaz’ un mediu dielectric, care ‘avorizea7i interactiunite polare. Interacjiunile hidrofobe sunt acele forfe care fac ca moleculele sau grupirile nepotare i se asocieze in agregarte gi si reducd la minimum contactul lor cu apa. Acest fenomen este datorat, in primul rind,, factorilor entropici; entropia apei scade cind © moleculd nepolara vine in contact cu apa si, respectiv, entropia apei creste dact aceasta molecula este exclust din api. 34Interactiunite hidrofobe sunt factorii cei mai importanti care determina conformayi unei molecule proteice prin insumarea unui foarte mate numir de contacte nepelare. Dintre cei 20 aminoacizi proteinogeni, sapte posed R cu caracter hidrofob. unite disulfurice — $ — $ — care se pot stabi intre dowd resturi Cys, desi sunt Jegituri covalente, an un rot determinant pentru. conformafia proteinei. Realizarea unci unfi — $ — $ — necesitt aducerea a doul resturi Cys in poziii potrivte care se realizeaz’ prin forte necovalente. Fiecare specie proteici este un unicat in ceea ce priveste structura primaa si conformafia, Din studiul conformatiflor unui numer de protcine se pot formula prine pile aenerale care guverneaza organizarea spatial a tuturor moleculelor proteice. Cele dou, elemente structurale ale unei proteine, axul catenei polipeptidice gi cele 20 de tipuri de radicali legati la C, care se pot gisithtr-o muititudine de relait reciproce contribuie Ia realizarea structurii secundare si terfiare a proteinelor: R, a, | ia t —NH—CH—CO—NH—CH—Co—NH—cH—co~ Structura secundaré a proteinelor Pauling si colab.incepdnd din aml 1930 au inireprins stu sistematice, prin cristalograie, curve X, de misurarea distanfelor interatomice, a unghiurilor 6 legtturi din aminoaci, din peptide. Sa stabilt chin gruparea peptic’ are loc 0 conjugare mp legitura —NH — CO — capi un caracter paral de Iegitur dubld,rotgia bert in jurul acesteilegsturi find asfet ‘mpiedicalh. Atomii C, vor sdopta poz figide faft de planul leghturii duble, In pepridele naturale se intllneste numa configurafia trans, mai stabil decat aceea cis (Fig. 14), Fig. L4— Configuraja trans a unei legaturi pepticice 35Lanjul peptidic tsi plstreazai Mexibilitatea prin rotagia liberd in jurul legaturilor: R, oF, 1 Wo —cH—NH— gi —c—cH— (© altt insuyire a gruparit peptidice este capacitaea grupei > NH de a forma o lepnturt de hidrogen cu un grup > C=O apartirdind altei grupari peptidice: SS NoH- ono DS NSHe One Conjugarea — p a grupairit peptidice accentueaza aceast insusire {Un lant potipeptidc, in solute, ar putea atopiao iafnitae de conformatit prin rota in jurul legiturior — CHR) NE si — CHR) — CO— , Uncle din aceste conformaii vor fi mai stabile dacd permit realiarea de puni de hidrogen intr gruparile peptide. Plecdnd de ka principiul c&aranjamental cel mai stabil este acela in care se realizeazi cel mai mare numér de pungi de hidrogen, Pauling si Corey (1951) au postulat dou structur secundare pentu lnjrile poipeptiicec-elicea si structura BO structura elicoidal’, distinct de cea descrist de Pauling, este intitnita la colagen, proteina major a matricei extracelulare, care are 0 compodifie aminoacidicx particular. Siructura de elice alfa, Lanjul polipeptiic se rtsuceste (la nivelul legiturilor simple) pentru ca grupirile 0 = C <7 si SNH sit devind adiacente stereochimic pentru a forma punti de hidrogen. Se objine astfel o structuri repetitivi elicoidala ia care toate unitate se aflt in raporturi spafiale identice cu unitatile vecine, O grupare “> NH formeazt punte de hideogen cu gruparea > CO aparyindnd colui de-al patrulea rest aminoacidic din seevenfa Lineara. in acest fel, toate grupele > CO si > NH sunt unite prin pungi de hidrogen (Fig. 1.5). ‘Stercochimia gruptcii peptidice, unghiurile de leg’turi, distanfele interatomice, colinearitatea puntlor de hidrogen, apartenenga aminoaczilor la aceeasi serie optic (seria L) determina o anumit’ geomettie a alice - cu fiecare rest aminoacidie se avansea pe vericalt, eu 147 A; ~ pasul elicei, distanga intze doulk puncte echivalente pe verticala este de 5.21 A si cuprinde 3.6 resturi aminoacidice; ~ diqunetrlelice, diametnul supraeje cilindrice in care se alld atomii C,, este de 10.1 A: ~ sensul rsuciriilangului polipepiidic este de la stinga la dreapta (clice dreapt2);Fig. LS — Structura secundar de «-elice a unui lant polipeptidie (dupa Linus Pauling) - radicalii R ai tuturor aminoacizilor sunt orientati spre exteriorul elicei, configuratia atomilor C,, este aceeasi pentru tofi aminoaci = toate grupirite “> NH si >>C =O formeazA punti de hidrogen, Un lan} polipeptidic sub forma de o-etice are forma unui bastonas cu diametrul de 10,1 A. Pentru 300 resturi aminoacidice lungimea acestui bastonag este de 450 A. 37Structura c-eligoialt a lanjurilor polipeptidice pestulatt de Pauling si Corey a fost gisita, in proporfie mai mare sau mai mic, ka diverse proteine (Tabelul 1.6) Tabelul 16 Confinutul In elico-alfa al unor proteine (evaluat prin motoda dispersiei activitatt optice) Proteina % elce alfa Miogiobind 70 Insulin 98 Ovatbuming ai Serumalbumina (poving) 46 Popsina at Ribonuctoaz’i 16 Chimotripsina 16 LLungimea si repartizarea segmentelor de c-elice in cuprinsul molecule este diferité de lao protein la alta, in funcyie de distributia factorilarstabilizatori si destabilizatori at elicei in structura primari, Resturile prolil, prin geometria lor particulard, impiedici risucirea elicoidalA a lanqurilor polipeptidice. La nivetul unui rest Pro, Janjul se indoaie cu un unghi de 130°, Resturile glicil, ipsite de catena lateral, confert lanturilor polipeptidice flexibititate siadesea la nivelul resturilor Gly structora secundara o este intrerupt,Lanful schimbdndu- si uyor ditectia, Resturite de valind, izoleucin’, weonin’, prin radicalii voluminosi de la C, determina © stinjenire steric dact aceste R ajung adiacente in etice, Serina, prin capacitatea de a forma punti de hidrogen prin gruparea alcooticl destabilizeaz clicea. Resturile de cisteina cind formexza pungi disulfurice leagi covatent, rigid, porfuni ale lanqului polipeptidie gi in vecindtatea acestor regiuni rtsucirea elicoidalé nu mai poate aves lo. Structura socundard ose intGineste in diverse proporfi att fa proteine fibrilare ct si la proteine globulare. O proteint fibrilari cu siructui secundari o in proporsic de aproape 100% este keralina, proteindi abundent’ tn pr, piele, unghii, Este alestuits din lanuri polipeptidice lungi, cu structura de ccelice, asociate efile dout si superincolicite, Prin asocierea acesior dimeri se realizeazi fibrile si fibre rezistente. in aceste fibrile, anuparile R pot intecacjiona prin valenfe secundare in cele mai bune condiiuni In plus, structura superelicoidala este stabilizatd si prin punt disulfurice intercatenare, keratins ‘avnd un confinut ridicat in cist Miogtobina si hetroglobina au un procent mare (70°%) de structurd secundart ot, fn aceste eazuri, segmentele de ovelice sunt scurte, ele sunt intrerupte de porfiuni 38rneclicoidale, La nivelul acestora din urmé, lanjul polipeptidic tsi schimba directia sub diverse unghiuri, permifand realizarea unei structuri compact. ‘Un alt motiv structural fntnit la proteine cu un procent mare de structurd securdarit ‘ozconstt in asocierea paraleli a unui numer de segmente de G-elice, Acest motiv structural pulindu-se repeta de mai multe ori in cuprinsul moleculei proteice. Structura BO alts structurti secundaria lanfurilor polipeptidice in care se realisear potenfiatal maxim de legare prin punji de hidrogen a gruphrilor —>C=O $i SNH este structura B sau structura in foaie plisat. In acest caz puntile de hidrogen sant intercatenare, lanfutile polipeptidice se agea7a fn foi. Cea mai stabil interactiune se ‘obfine dact lanfurile evolueaz’ unul de ta capitul N-terminal spre cel C-terminal si celalt in sens invers (structura cu tanturi antiparalele, Fig. 1.6). — riers i, A oe" sygtye aeed = sage ggty é getty — thy yey $ bytes _ 4 ° : ° ber iy Fig. 1. — Structura secundara cu lanturipolipeptidice antiparalele 39Datoritd rigiditati legaturié peptidice gi coplanarit§ii grupalui | | — CH — NH — CO — CH — se realizeazi structuri asemiindtoare unei foi plisate. Radicalii R sunt orienta, alternativ, de 0 parte gi de ata Structura secundara in foaie plisat8 este intlnitd i proporte de aproape 100 % in proteina din matase,fibroina. Lanfurile polipeptidice antiparalele sunt intinse si asociate prin legituri de hidrogen, dand nastere unet foi plisate, Aceste foi se ageazd in straturi, inte straturi se stabilesc mumeroase legituri intre grupatile R, care proemineazt de 0 Parte si de alta afiectei foi, Datoritt une structs primare speciale, cu multe resturi Gly si Ala alternante, distanjele dintre foi sunt mici (3,5 A gi 5.7 A alternativ). Aceasta structurd confera fibroinci rezistenfl la intindere gi flexbiltae Structurite B sunt motive structurale intiite frecveat in proteine globulare. Cel mai simplu element de structurd B consti dintr-un lan} polipeptidic indoit asupra lui insusi Gare realizeaza doud segmente antiparalele, denumit B-turn ow oR ° ONS 9 PN ON i ° # ° i I N. ©. 1 oO RH wv De asemenea, mai multe catene polipeptidice, de regulA 6 dar si mai multe, pot adopta siructurdi B cu foi plisate, Domeniite structurale ale imunoglobulinelor si ale proteinelor din aceeagi superfamilie cuprind un motiv structural majoritar B. jelor Structura terfiard a prot Acest nivel de organizare inglobeazdstructura secundar gi defineste raporuriledintre segmentele de o-clice gi structura be a de f impacto a lanqului polipeptidic. Factorii determinanfi ai, structurié terjiare ai_unei (eraciunile necovalente intre_ rails Rd eC, Be caesi efi egnicu scr eer sau Bich Sunl.cupringi in segmente neorganizate. La nivelul de organizare terjiar molecula proteic’ dobaindeste forma sa specific’. 40Jntre' diversi radicali ai aminoaci necovalente: uni de hidrogen intre radicalii cu (RRIpNETACHOTTE} (ain resturi sevil, reomil), [Fenotice| (din resturi tirozil) famidicd (din resturi glutaminil gi asparaginil): jor se pot stabili_ urmatoa wele tipuri de legtturi = Jeghur ionice [STR] tne paca ow savlndnegoivl. Gin reste ii, agin, Wf infetactiuni polare inire ruicalii polar fairl sarcinis | | NH NH | | cH — cH, — coo~ HyN— (GH), — CH | | co co | | asparil tal ~ inieractiuni_hidrofobe_intre resturile aminoacizilor nepolari ca valin’, leucind, izoleucin’, fenilatanina, alanint Ni He Na | \ | chon, cH oH I i co nef I I alana valt Resturite cisteinil din multe proteine formeaza\ legituridisulfurice care Feaga covalent rogiuni mai depirtate ale lanjurilor potipeptidice. Poviiile acestor legituri depind si de {otalitatea factorilor care asiguri conformatia nativi a profeinei. Ribonucleaza (104 resturi aminoacidice) cuprinde patru pungi disulfurice intre resturile CyS-CySyu. C¥Sie-C¥Sos, CySerCySi $1 CySorCySqq. Din multitudinea de combinafii posible, intre cele 8 resturi cisteinl, in profeina nativa se realizeazd una singurt (Fig), 41Un lant polipeptidic adopts, in misura in care th permite structura sa primar’, configurajii de o-elice si de structurd B si prin pliere, impachetarea fangului cau si satisfack si afinitile radicalilor R, Rezultanta tuturor acestor interactiuni determin’ conformatia moleculei proteice. Aceasti conformatie este de fapt un compromis — nu se pot realiza toate legiturile de hidrogen posible, nu toate porfiunile nepolare ajung s& fie inconjurate de un mediu pur hidrofob, nu orice grupare (—) ajunge la vecinatatea tuneia (+), dar este compromisul cel mai favorabil din gunct de vedere energetic, cel mai stabil, Factorul ultim care determina conformafia unei proteine este structura sa primar’, Informayia geneticd tradusa in secvenfe de aminoacizi, prin jocul forfelorfizico-chimice, se transforma spontan in edificiétridimensionale spec fice. Prima protein’ a cre sructur tridimensional a fost stabil in cele mai mici detalii, precizindu-se pozijia in spajiu a tuturor atomilor component este mioglobina (Kendrew gi cola, 1957). figTabinajeste o potent abundent i muschi, in. special la. mamifeele cufund’ioare (balen’, cagalof) avind rolul de rezervor tisular de oxigen. Este 0 proteind Cuprinzind aproximativ 150 aminoacizi (mioglobina din rugchiul de casalot 153) sio grupare neproteich denumitt hem, In Fig. 17. se ara schematic conformafia moieculei de mioglobint. Fig. L7 — Stuctura teriaré a mioglobinel 42Fig. 8 — Structura tonjiara a lanquul B al hemoglabinel Jn mioglobind 75% din lanjul polpeptidic formeazs o-elice, Coprinde 8 segmente elicoidale (Genumite A, B, ... H) cuprinzand intre 7 (segmentul D) si 24 resturh aminoacidice (sezmentuLH). Regiunile elicoidale sunt separate de segmente neclicoidale, Ja nivelul cirora Jangul polipeptidic isi schimba direcgia, In patru puncte de terminare a elicelor se afl’ ‘pinlita? In celelalte regiuni intreruperca risucirii_elicoidale este determinati de alji factori, Prin aceste schimbiri ale directiei lanqului_polipeptidic, molecula devine extrem de compacts (45 x 35 x 25 A), (erin ‘numai fminoacizi cu R nepola} cu excepiia a dout restuiT Ristidil angajale in lewarea ‘gtupicii hem, Resturile teonil gi tirozil au gruparile hidroxilice orientate superficial, pe ind porfiunile nepolare ale acestor aminoacizi sunt ingropate in interior. Suprafaja externa moleculei cuprinde toate resturile polare si cu sarcin’ electric, presirate printre radicali nepolari. Conformatia lanturilor polipeptidice din hemoglobin’ este asemainitoare cu cea a mioglobinei (Perutz, 1959) (Fig.8) 43In prezent, sunt cunoscute structurile terjiare ale multcr proteine, Proteinele solubile, citoplasmatice sau acelea prezente in plasm’ sau in lich dele interstijale sunt proteine ‘elobulare care au etalate pe suprafafai gruptirle polare si pe acelea care pooart sarcini elecirice, Radicalii nepotari sunt orientafi in interiorul moleculei. Forma sferica sau elipsoidali a moleculei depinde de raportul dintre numvirul resturilor aminoacidice cu R incireat si numérul resturilor cu R hiidrofob. O valoare mai mare a raportului (0,9-1,4) favorizew24 adoptarea unei forme mai alungite. © prciein’ cu un raport numair R inchtcal/numir K hidrofob mic (0,3-0,6) adopt o form’ sfervidala, resturile nepolare, hidrofobe se acomodeaz’ mai usor in centrul unei structuri globulare decat al uneia cilindrice, La proteinele membranare inglobate tn stratul dublu lipidic, repartizarea resturilor aminoacidice polare gi nepolare este inversd. Partea exterioara a molecule, in contact cu lipidele membranare, cuprinde radicalii hidrofobi. La unele proteine, in interior molecule’ se defimiteaza canale ciptusite cu resturi aminoacidice polare si inciircate electric (canale ionice). Organizarea pe domenii a proteinetor. in anit din uni a fost descris un alt nivel intermediar de organizare structural a proteinelor, organizare domeniall sau suprastruc- tur secundart. Acest nivel de organizare este innit mai ales la proteinele mai mari. Un domeniu al unei proteine multidomeniale corespunde unei porfiuni continue tn structura primard a lantului polipeptidic care este impachetat intro entitate functional $i are o organizare proprie secundsra si terjiara. Domenie sunt separate tntre ele prin porgiunt de lan} mai putin organizat, flexibil, ceea ce asigurd posibilitatea deplasirii unui domeniy in raport cu altul (dinamica domeniilor), Retail dintre demenii sunt deosebit de variate, zoncle de contact, de interactiune pot fi mai reduse scu mai intinse, De asemenea, dimensiunile domeniilor structurale variaza intre limite largi, de ta cAteva zeci de resturi aminoacidice, la sute (cel mult 400), Organizarea domeniala a proteinelor se intiineste la multe proteine si domeniile structurale s-au dovedit a fi unitii fundamentale ale evolujei si diversifictrii proteinetor. (ea unor proteine analoage (exercith funcfi similare) sau/si omoloage (deriva dintr-un acelagi strimos) s-a g&sitcX aceste proteine cuprind unul sax mai multe domenii structurale aproape identice, Acest fapt denoti c8 odati ct prin procesul de evolutie s-a sinventat proteings apt si indeplinease& optim 0 anumiti funefie, patternul structural al acesteia a fost conservat si repetat ori de cite ori a fost necesar, Diversificarea si ‘complexificarea proteinelor s-a ftcut prin combing ale scestor motive structurale. Jn natura exist numeroase enzime, diverse ca origire gi activitate catalitic’, care utilizeazd ca substrat un nucleotid (ca NAD, FAD, AMP). Toate aceste enzime cuprind un domeniu structural de aproximativ 70 resturi aminoacitice cu o regiune specific de legare a nucleotidului, 44Proteinele care regieazi transcrierea ADN si exprimarca informaei genetice au capacittea dea se lega de ADN dublu elicoidal, In structura acestor proteine a fost recunoscutit existenta cAtorva motive structurale (femoar cu leucing, deget cu zinc, motiv oP) care prin forma si . Celetatte specii de hemoglobin’ cuprind in locul lanfurilor B, lanjuri. 8. € + Hb A, = @ B; Fiecare protomer este tegat de clte 0 grupare fem si activitatea de transport a oxigenului se manifest: numai la nivelul tetramerului Lanjul 0: cuprinde 141 resturi aminoacidice, iar cel B, 146 resturi, Structurile tefiane ale avestor lanjuri sunt similare cu ale mioglobinei, ca care are similitudini gi de compozitie aminoacidict In Fig, 19 este ariath structura cuaternara a hemoglobinei, Un lant c@ este asociat de cele dow lanjuri B prin zone de contact diferite a, B, si ct, Bs Contactete intre protomeriidentici «gio: sunt foarté reduse, Contactul eB este cel m intins in spatiu, sunt implicate 34 resturi aminoacidice si aduce in contact 110 atomi, Forfa principal de legare sunt interactiunile hidrofobe. Al doilea contact, oj B, mai restrins aduce in vecingtate 80 atomi aparjindnd fa 19 resturi aminoacidice. Datoriti acestui contact mai slab, Hemoglobina se disociaz’ in condifiuni favorable, mai inti dimeri $i apoi sunt eliberafi protomeri: 02 By S22 Of E204 28, 46Fig. 9 — Structura custernara ‘a hemoglobinel. Regiunte accidale sunt reprezentate prin cline 1.3.3, PROPRIETATI GENERALE ALE PROTEINELOR Solubititatea, Proteinele fibrilare sunt insoluble in apa, pe cand cele globulare prezinta ‘grade diferite de solubilitate, Aceasti insugire este datoratd repartizirii pe suprafafa ‘moleculelor de resturi aminoacidice cu sarini electrice gi a acelora care cuprind grup poare, Solubilitatea in api a proteinelor este puternic influenfatti de pH-ul mediului prin modificarea inctrciri electrice a proteinei, De asemenea, diverse stiruri ale metalelor ugoare — NaCl, MgCl,, Na,SO,, (NH,),S0, -, influenfeazi considerabil sotubilitatea proteinelor. La concentrafii mici ele au un efect favorabil. De exemplu, proteinele din clasa globulinelor sunt greu solubile in ap pura, ele se dizolv’ usor numai in-soluji saline diluate, La concentrafii foarte mari, strurile amintte scad solubilitatea proteinelor pnd ta precipitarea lor din solutit (salifiere). Albumainele si globulinele se deosebese dupe usuringa cu care sunt precipitate de cate sulfatul de amoniu. Globulinele precipiti cand solupile care le cuprind sunt aproximativ semisaturate in (NH,),SO,, pe cind albuminele ‘precipita Ja concentrajii mai mari de 75% saturajie, Precipitarea fracfionati a proteinelor din solujie prin adugarea treptati de (NH,),SO, este 0 metod cu largi utilizari pentru separarea proteinelor din medii biologice complexe. Proprietajile electrochimice. Proteinele sunt amfoliji macromoleculari, cuprind un ‘numair mai mare sau mai mic de gruptiri acide gi bazice, Contribusia cea mai important o.au resturile glutamil, asp arginl si histidil, Resturile aminoacidice C-terminal si N-terminal au 0 contribujie redust, cu atat mai redust cu et lanjul polipeptidic este ‘mai lung. La pH-ul fiziologic toate acesie funefii acide sau bazice sunt ionizate complet (restul histidil este ionizat aproximativ 50%), proteina apare ca un poliamfolit 47.Proprietile electrochimice ale proteinelor sunt concretizate prin pH-ul izoelectric (pl), H-ul solugiei in care proteina apare cu o sarcini electricd nul, numarul grupisilor (+) este egal cu acela al grupirilor (—) ‘Valoarea pla nei proteine depinde de compozitia sa amincacidicd, de predominenga res- turilor acide, a acelora bazice. © proteind cu pl > 7 cuprinds un exces de lizin si/sau anginina, © proteinit cu pl <7 cuprinde 0 proporie mare de aminoacizi dicarboxilici (Tabelul 18) La pH-ul izoelectric solubilitatea, mobilitatea proteinei in cdmpuri electrice este ima, La pH-uri depaiate de pl o proteind ate o incitedturd neta (+) sau (—~) y iy , 7 we we / \ coon N coor WN co0- protan a protein ia protein a me neal rel Sub formt de anioni sau cationi, proteinele migreazal in cmpuri electrice, proprietate care st la baza metodelor electroforetice de separare a proteinelor din amestecuri, Tabeiul 18. pH-utile izoetectrice (pl) ale unor proteine Proteina pl ‘Saimin 72.10 Histon’ 10,80 Serumalbumina 490 Miozina 5,20 Fibrinogen 5,50 ps Tireoglobulina 458 Uzozim 11,00 Mioglobina 699 Hemogiabina 707 Citocrom & 920 Insuling 5,35 Papsina = 1,00 Denaturarea proteinelor. Conformatiile native ale proteinelor globulare, rezultate prin impachetarea specifick a lanjurilor polipeptidice si asocierea subunitatilor in proteinele oligomere sunt extrem de fragile, ele sunt usor perturbate sub acfiunea unei multitudini de agenti care afecteaza interacfiunile: necovaiente din cuprinsul moleculei. Modificarea conformafiei native a uni proteine poartt denumirea de denaturare si agenfii care 0 provoact sunt agenti denaturanfi, Structurite de ondin superior ale unei proteine — secundara, terfiard, cuaternars — sunt asigurate de legituri necovalente de energie joast si agengit denaturangi pun in joc forte de intensitate mict care nu afecteaz’ legiturile 48covalente, In cursul denaturirii unei proteine nu sunt rupte legiturile peptidice, nu se libereazi aminoaciz, Denaturarea proteinelor este provocatt de agengi foarte dieriti: = temperatura de 50-60? denatureaz cele mai multe proteine globulare; pujine prot 4e ex. ribonucleaza, suport pentru scurt timp temperaturi de 100° fii a se denatua; = radiapile cu frecveng’ mare, ultravolete, X.Y: - pHL-urile extreme, acide saw bavice denatureaz’ majortateu proteinelor; + ureea si guanidina, tn concentrayii mari denatareaz, reversibil, majoritaea proteinelor soluble; ~ agentiitensioactivi (surfactani), ~ solventii organici. Actiunea denaturanti a ureei si guanidinei, compusi cu o capacitate foarte mare de a contracta legituri de hidrogen, demonstreazd rolul acestor interacfiuni ta slabilizarea conformafiei unei proteine. Actiunea acestor agenti este usor reversibilty dupa ‘ndepirtarea ureei sau a guanidine, legiturile de hidrogen se reconstituie in cuprinsul moleculei.proteice in acelasi numir si in accleasi pozifii ca in proteina natva, Denaturaréa proteinelor sub actiunea agentilor tensioactivi saw a solvengilor organi demonstreazat rolul interactiunilor hidrofobe in realizarea conformatiei native a anei proteine, Acizii si bazele modifica inetrcareaelectricd a unor gupir, schimba raporturile de vecinatate inte sarcinile + gi - de pe suprafaja molecule 13.4, CLASIFICAREA PROTEINELOR Sistematizarea proteinelor, compusi de 0 varietate molecular si functional’ extraordinar de mare, este deosebit de grea, orice incercare este arbitrar’ bazdindu-se pe lunele trisituri ale proteinelor gi ignordindu-le pe altel. prima impatire foarte generald a proteinelor este ace solubile gi in genere proteine intracelulare si protcine| fibrilare) insotul proteine extracelulare, cu roluri de susfinere. Un all criteriu de clasficare a proteinelor este prezenfa say absenga in molecul’ a nei grupati chimice distincte.de lanjul potipeptidic, den: mitajerupaire prosieticzy Pe aceasta bazi, proteinele sunt clasificate in{proieine” mpl alcatuite num inoactal gi ‘oiijugale,(heteroproteine),alc’tuite dinir-o protein’ (apaprok 6 grupare prosteticd. Dupti natura grupiri prostetice se deoschesc urmitoarele clase de protein in proteinefalobula .yor , de regul (POH) legat {)[Fosfoproteine} grupatea prostetic’ este constituita din/restul fost esteric la grupairi hidroxilice ale resturiloriseil,ireonil sau tirozil) Unele proteine cuprind permanent_resturi_fosioril “(de ex. caxsina}, pe cind alicle oscileaza intre forme fosforilate gi defosforilate (proteine interconvertibile). Schimbarea_ gradului de fosforilare a unei proteine, face parte dintr-un mecanism general de reglare a funcfillor proteinelor (vezi capitolele enzime, hormoni). 492 NGticaproieine| proteine ce cuprind fc de Inn{ul polipeptidic. (Proteinele din- membrana_plast aie cele ca care. captuse diverse caviti sunt bosate in restur glcidice, Un numtrredus de glucie este prezent ina in mai toate proteinele. Seipaprareinere sum asociagii inte proteine (apolipoproteine) si una sau mai muke amps elie apt. ‘Asovierle predominant necovalente sunt totusi suficfent de ttt, structurale de sing, sttitoaze. in ne (cilemnicroni, ¢ — si B— lipoprotein) uiteteiee buglichu dé \Gzomoproteineté sunt proteine cotorate din cauza grupaei prosteticepe.care o cuprin Subclasa icioproveinslag, proteine a ciror grupare prosttict este Mem! cuprinde 2! emoglobina. si mioglobing, protee_runsportue de.oxigen, citron proteine) * cli. Capi dept ge prose sce et eB) (cibolavina). Flavoproicinele funcfioneaza ca transporter deshidrogen. © aceeasi proteint! poate cuprinde mai multe tipuri de gruplri prostetice, insumind caracterele mai multor clase de proteine conjugate, fosfo- si glicoproteine, glico- si metaloproteine ete. Un alt mod de a sistematiza studiul proteinctor este acela dup funetile pe care te indeplinese, proteine enzimatice, proteine contractile, protcine hormonale, proteine de transport etc., sau dupi origine in groteine plasmatice, proteine eritrocitare, proteine hepatice etc. fn toate capitolele urmittoare ale acestei ctf, proteinele apar ca figuri centrale prin vvavietaten for structuralti gi multitadinea de funcfii pe care le indeplinesc, catalizatori, hormoni, anticompi, proteine structurale, contractile et. Metabolismul proteinelor, sintezi si degradate. este tratat in Cap. V unde se prezint& mecanismele moleculare de legare a aminoacizilor fn suecesiuni dictate de informayia 50genelici cuprinst in ADN i in Cap. IX care cuprinde caile de biosintezt ji de catabolizare a aminoacizilor. fn subcapitolul urmitor sunt prezentate cfteva grupe de proteine, care evidenyiazt relafile structurt-fanctie, 13.5, PROTEINELE PLASMATICE, Plasma cuprinde o canitate mare de proteine (-~7,5 ght 5 deo mare diversitate (Tabelal 1.9). Prima fractionare a proteinelor serice s-a Ricut prin salifiere (salting-out) cu sulat de amoniu sia dus la objinerea fractiunii globulinelor care precipita la concentra saline mai joase (in jurul valorilor de semisaturafie) si a albuminetor (precipita ta saturarea solujiei in sare). Folosindu-se metode cu putere de rezolutie din ce in ce mai mare, bazate pe diversele insusiri ale proteinelor, s-a putut individualiza in plasma un rumtir foarte mare de proteine ( > 300). Metoda curent pentru. separarea proteineior plasmatice (sau scrice) utilizcti in laboratoarele de biochimie medicala este electroforeza, Se ulilizeazd suporturi solide (hirtie, yel de agaroza, get de acetat de celuloza) gi pH-ul de Iucru este 8,6. La acest pH toate componentele proteice sunt incircate negativ gi migreaza spre anod. Pe electrofo- rogram’, dupiicolorare, proteinele apar ca benzi colorate, Prin masurarea densitijit optice a clectroforegramei, fiecare band dun maxim de absorbjie (Fig. 1.10). Prin electroforeza serului, in condigiile aminiite mai sus, se objin cinei fracfiuni: serumalbumina, c,- 04-, 8 - si y-globuline F10-—Eleceoforegrama saul urn (oH 86). Se separ crc acum: aburina, a, ‘az, Br si glabuineSerumalbumina are mobilitatea electroforetic& cea mai mare. Serumalbumina constituie © fractiune omogen’, pe cind fracfiunile globulinice, cuprinde fiecare mai multe componente individuale (Tabelul 1.9). Tabolut 19 Protoine plasmatice (tabel selectiv) Proteina Canemgial co pl The Freaiburina 20-40 B44 47 wah ‘Albumin 13500-4000 458 care Fraciunea o,: -Antiprotesza 78-200 55 4 az {antivipsina) 4,-Glicoproteing 50-150 ” ar Sz {orosamuccia) Apolipoprotein A 170-325 200 : -Fetoproteina 0,003 68 : : Fraojunea og: Haptoglobina 30-215 85 4a az eMacroglebulina 125-410 800 54 52 ‘Ceruloplasmina 20-50 160 44 4gz Frachunea 6 ‘Transterina 200-350 7 87 2 Apolipoproteina B 60-155, 000 : - Gy 10-40 208 7 : Fibrinogen 200-400 340 55 282 ics 70-150 180 : : Be-Microglobutina 0,1.0.2 118 : Fracjuneay: go 525-1650 160 paz IgA 40-300 170 : ez ght 25.310 800 : 82 Protelna reactiva © Og 120 62 Serumalowmina. Este cea mat abundenti protein’ plasmatica (3.5 — 5,5. g/dl) reprezentind jumatate din proteinemia totaki. O cantiate aproximativ egal eu cea din plasm se aff in spatiile extracelulare, Serumalbumina are masa molecular’ de 69 kD si este alcituitt dintr-un lant ppolipeptidic cu 585 resturi aminoacidice, Este o proteinai multidomenialt, Forma generat ‘4 moleculei este elipsoidald, Are pl ~ 5, la pH = 7.4, poart& un numair mare de sarcini negative, Este sintotizatt in ficat (12g) iin plasma, are un timp de injure de 15-19 zie,Prin concentrajia sa mofeculard mare, serumalbumina este componentul care rispunde de 75-80% din presiunea osmoticd @ plasmei, avand rolul de a menjine apa in compartimentul intravascular Serumalbumina are proprietaten de a lega, mai mult sau mai pafin specific, diversi componenfi plasmatici, indeplinind funetia de transportor al acestora, Serumalbumina leagd compusi hidrofobi, insotubili in api, ca bilirubina, acizi grasi liberi, vitamine liposotubite. Serumalbumina este transportor plasmatic pentru unit hormoni steroizi, penta hormoni tiroidieni, Serumalbumina leagi cationi, Ca, Cu™. De asemenca, serumalbumina este un yehicul pentru multe medicamente: aspiring, sulfonamide, penicilina etc, Imunogtobulinele. Inunoglobulinele (anticorpit) sunt proteine cu roluri de apirare {mpottiva microorganisinelor —bacteri, virusori, parazigi — care invadeaz’ organism. Sunt proieine solubile, se af majoritar in plasma si reprezint& elementele de recunoas- tere ale sistemului imun umoral. Imunoglobulinele sunt sintetizate ca un rispuns specific {a patrunderea in organism a unui microorganism sau a unui compus macromolecular (proteind, polizaharid) strdin (nonself). Agentii sirkini capabili sti dectangeze sinteza de anticorpi sunt denumigi antigene (imunogeni). Un anticorp se combind cu antigenul specific formand un complex antigen-anticorp (complex imun) care blocheazA antigenul si totodatd inifiacd procese care distrug agentul patogen, fagocitoza, activarea complemen- ‘ului (eispuns imun), Antigenele, microorganisme sau macromolecule, cuprind pe suprafata lor un mozaic de grupiri chimice, fiecare dintre acestea putdnd declansa sinteza unui anticorp specific. © grupare chimica sau un ansamblu de gruptiri care poate declanga sinteza unui anticorp se numeste determinant antigenic. La o proteind, un determinant antigenic este reclizat de céteva resturi aminoacidice. Mioglobina, 0 proteins cu aproximativ 150 resturi aminoacidice posed cinci determinanti antigenici. Numeirul determinantilor antigenici pe 0 celuli bacteriand este foarie mare, Organismul uman este capabil si recunoasca orice fel de determinant antigenic si si sintetizeze anticompi specific. Se estimeaz’ ci un adult sintetizeazd in jur de un de specii moleculare de imunogiobutine, Imunoglobulinele sunt sintetizate de plasmocite, celule care provin prin diferent.erea si proliferarea limfocitelor. Fiecare celuli si clona celulara respectiva sintetizeaza\ un singur tip de imunoglobuline, capabile si recunoasct un singur determinant antigenic. O celula bacteriand sau 0 ‘macromoleculd proteic& cuprinzind numerosi deferminanti antigenici stimuleaza diverse celule limfoide B ceea ce duce la sinteza unei populatiiheterogene de imunoglobuline, lion 33_anticompi policlonali. Prin tehnici de laborator se pot obtine clone cel fiecare molecule identice de imunoglobuline (anticorpi monoclonal Exist mai multe clase de imunoglobuline (Ig) cu fimofii si distribugitdiferite: Tg, IgD, IgE, IgG, IgM. Clasa IgG cuprinde mai multe subtipuri: (eG, ... leG.). Imunoglobulinele M (IgM) se gAsesc in principal in plasma, in concentrafii mici, sunt simtetizate ca rispuns la primul contact al organismului cu antigenul. Sunt deosebit de cficiente in activarea celulelor fagocitante gi in activarea complementului. Imunoglobalinele G (1gG) consttuie fracjiunea majori a imunoglobulinelor plasmatice (70-80%). Se gisesc, de asemenea, sin lichidele interstate, Sunt sintetizate in cantitate ‘mare Ia al doilea contact cu antigennl. Activeazti complemental si celulele fagocitare. Pot traversa placenta Imunoglobulinele A (IgA) se gisesc in concentrafii mici in plasma si in secrepiile ‘macoase din intestin, ptiman, lactimi, saliva, colostra, IgA constituie prima Tinie de apirare impottiva invaziilor cu agenti patogeni, Nu activeazti complementul. Imunoglobulinele E (gE) sunt recunoscute ca fiind responsabile de unele manifestari ale rispunsurilor alergice. Se afli fixate pe leucocite bazofile plasmatice si pe mastocitele din perefii vaselor gi dupa interactia cu antigenele celulare activate mediazd rispunsurile alergice (secre de histamin’, uncori serotonin). Imunoglobulinele D ([gD) sunt prezente in plasma in cele mai se cunoaste exact ce funcie specific’ au, are care si product ici concentrafit; nu Structura imunoglobulinelor, Diversitatea moleculsri a Tg (aproximativ 10° specti moleculare) se realizeazi in cadrul unci scheme structurale unice (Fig. 1.11), Sunt tetrameri cu formula molecular H,L,. Lanjurile H (de la heavy, grew) cuprind aproximativ 440 resturi aminoacidice (446 pentru tanguite H din IgG) si au mase de 53- 75 kD. Langurile L (de la light, usor) cuprind aproximativ 220 resturi aminoacidice (214 la IgG) gi au mase de 23 kD, Lanjurile H sunt diferite de ta 0 clas® ta alta, lanquri ka IgG, p la IgM, oF la IgA. ¢ la LQB si 6 a TgD. Langurile L, la toate clasele sunt fie langari ‘fie k. Unele imunogiobuline apar sub forma de oligcmeri ai structurii de bazs, dimeri (ig) sau pentameri (1M) (Fig.1.12). Structura generali a unei molecule de imunoglobulind este ardtat% schematic in Fig.L.11, Molecula are forma literei Y. Lanfurile L si H se asociaza incepand cu capetele lor N-terminale si formeazi brafele literei Y. Cele dow jumitiji C-terminale ale lanfurilor H_alettuiese coada moleculei. Imunogiobulinele cuprind componente oligozaharidice legate N-glicozidic. inire lanjuri gi interlany exist numeroase pinfi disulfurice,Fig, 112 - Structura pentamerica @ imunoglobulinelor M (IgM) Funcfile inunoglobulinelor. Functia principal’ a unei imunoglobuline saw antiorp (Ac) este aceea de a recunoaste si de a se combina cu antigenul sau determinantul antigenic (Ag), formand complexul Ag-Ac: Ags Ac we AgsAc © molecult tetramerics de Ig este bivalent’, cuprinde dow situsuri de legare, cu aceeasi specificitae, alcdtwite din capetele N-terminale ale lanjurilor H si L. Inferacfiunile dintre Ac si Ag sunt necovalente, interacfiuni hidrofobe, polare, pungi de hidrogen si se bazeaz pe complementaritatea chimic& si stericd dintre determinantul antigenic si situsul de legare al Ig. Acest gen de interactiune are un grad foarte inalt de specifiitale, afinityile antigenetor pentru anticorpii specfici sunt foarte mari (k pentru ‘complexele Ag-Ac au valori de 10*-10"° M) factorii determinangi ai acestor interactiuni sunt vitezele de difuziune, fiecare inialnire dintre Ag si Ac este eficace. Fixarea Ag la Ac si forimarea complexelor Ag-Ac este urmatti de evenimente care vor duce la omoriirea microorganismului invadator, Is distrugerea antigenului, Aceste funcfi 35cefectoare sunt comune pentru 0 clas’ de imunoglobuline. Complexele Ag:Ac formate de citre IgM gi IgG sunt apte sa interactioneze cu receplori de pe macrofage si neutrofile, inijiind chemotactism, fagocitoza, eliberare de mediator citotoxicitate, De asemenea, complexele Ag:Ac inijiaz’ evenimente care activeaz sistemul complementului, culminaind cu formarea unui complex litic (sau MAC, membrane attack complex) care formeazat pori in membrana celulei int si determina liza celulei. Aceste funcfii efectoare sunt localizate in segmentele N-terminale ale lanfuritor H. Organizarea multidomeniald a imunoglobulinelor, Cercetarea imunoglobulinelor cu metode din ce in ce mai perfectionate a dus la stabilitea de-analogii structurale fntre diversele porfiuni ale lanjuritor L. si H, Segmente cu lungimi de aproximativ 110 resturi aminoacidice, dout in languri L si 4 tn tanjuri H, prezintt analogii la nivelul stracturilor ‘primare si al organizarii lor secundare si terfiare, alcatuind domenii structurale. Un astfel de domeniu este alcituit din dow’ foi plisate cu languri antiparalele cu structurd B. intre foi, radicalii nepolari determina interactiuni hidrofob: putemice si o punte disulfuric’, realizeazi o legatur’ covalent interstrat, impachetareaspecifict a unui astfel de domeniu bistrat cu foi antiparalele, este intlnith si ta alte proteine (immunoglobulin fold) eceptorut celulelor 7, complexele majore de histocompatibilitate (MHC clasa I si clasa TD, coea ce pledeaztt pentru originea lor genetic& comund Fig.1.13). © moleculd de Ig este alcituiti din 12 astfel de domenii, Un domeniu dintr-un fang este asociat cu un domeniu din alt lan, astel incdt intreaga motecul& apare ca fiind alcttuiti din sase module globulare (Fig.1.14) Stulile de seevengializae ale lanjurior L si H din popalafit omogene, individuale de Ig av aritat ca segmentele 1-108 pentru lanfurile L gi 1-125 pentru lanfurile H diferé de Ja o moleculd la alta, sunt domenii variabile V, si Vy. Colelalte segmente au structuri primare aproape identice pentru fiecare clas de Ig, sunt regiuni constante C, si Cy. Regiunea constant a lanturilor L corespunde unui singur domeniu C,, Regiunea C, cuprinde trei domenii constante Cy, Cys, Cys (la IgG {In structura cuatemart a unei Ig, domeniile V, si V, formeazi situsurile de legate a antigenului, ceea ce permite, in raport cu structura yrimard a V, si V,, realizarea de centre de legare cu specificitii diferite, Variabilitaea acestor domenii nu este inst aceeasi pe toati lungimea lanfului, Lanurile L cuprind trei zone si lanfurile H patru zone cu un grad de variabilitate mai mare, zone hipervariabile. Resturile aminoacidice corespunzitoare acestor zone cipusesc niga nepolard unde este fixat determinantul antigenic, Regiunea Cy, cuprinde situsurte efectoare care mediaza funciile comune intregii clase ‘de imunoglobuline, Funcfia de activare complementului este domeniul Cy. receptorii pentru macrofage si neutrofile sunt localizati pe Cys. Organizarea structural a imunoglobulinelor arati modul in care pe o schemd structural comund sunt constituite milioane de molecle, diferte prin situsurile de legare a antigenelor. 56i D ad Oi TR GAGS Fig. L13 — ProtsneInrude stucural sl gonatio cu Imunoglobnee 1. Gomplex major de histocompatbitte casa | (MHC 1) E Gomplos majr de Hstcompattets ease (MHC I) 5 Receptor ceuleor 4p ancora in membrane calor) Fig. 14 — Stustura mulidomenial ‘nel imunogebuine Factor’ ai coagularit (fivrinogenal). Coagularea sngelui reprezintd un mecanisrs de aptirare pentru a impiedica hemoragiile, Este 0 component a hemostazei care mai implick gi alte fenomene: vasoconstricjic, activarea si aderarea trombocitelor Ia locul Jeziunii vasculare. Formarea chiagutui (trombus) are loc prin transformarea fibrinogenalui, protein plasmatict solubili, in fibrint, insolubila, care formeaz o rejea in care sunt inglobate trombocite si hematii, Coagularea este un proces care se autoregleazst, tienjindndu-se un echilibru foarte fin inte hemoragie si tromboz,La coagulare participa foarte multi componenji plasmatici saw tisulari, Uni’ dintre acesti factor! ai coagutirii sunt desemnati cu cifre romane, de ta Ela XIII (factoral VI nu exist), Acestifactori exist Tnr-o Form’ activ’ si una inactivt (II gi I,). Unii factor (XI, XI, IX, VIL, X, 1) in forma lor inactivat sunt zimogeni (proenzime) iar in cea activi sunt enzime proteolitice de inaltd specificitate, Ionii Ca indispensabili coagulirii sunt Iactorul IV. Factorii V si VII nu sunt enzime, ei participh ca fuctori auxiliari (cofactori) ‘in procesul de activare a unor componenti ai coagultri. Factorut T este fibrinogenul si factovul L, fibrina. Factorul XIII, este o encima cu actvitate transamidazic’. Factorul I], trombomodulind sau factorul tisular este produs de endoteliul vascular (Tabelul I.10), Tabelu 10 Factoril coagulérit Factor] Oenamie wzuala | FONGTIE 1 Fibrinogen Froteind plasmatioa soUbia, 4 Fibrin Fotmeaza agregate fare. 7 Provombina ‘Aativaté de un complex format dns X,, Vy, Ca hy Trembina ‘Transforms orinogent in fina, aeiveaza: Xi, Vi, Vil i Factor isular, | Factor aux la aativarea factorior XV. ‘romborroduina w oF Vv Proaccelenna | Asivat de wombing, vy Cofactor fa activareaa Ii de cdtre X,. vi Proconverina | Acllvat de li, + Ga™ vil Impreund cu Ill activeazé X la X. Vil] Factor ‘Raval de Ty, anthemofiie vit, Cofactor al actverd X de cate IX, ™ Factor Christmas | Actvat de Xi, gi Ga my Activeaza X la X, (impreund cu Vill, gi Ca), x Factor ‘Aavat pe cuprafata plachetelor de cAtre complexul Ca SwattPrower | + Vil, + 1X, (calea inrinseca) sau de catre Vil, asistat de factorul tsular(calea extinsacd x Activeaza protrombina x ‘atv do Xl, Xi, Activeara, impround ou Cat, 1X la a XIT__| Factor Hageman | Activat do kallveind Xi, Se leaga de poretole vasului lezat, Xi | Factor stabilize | Activat do trombing tor al fibre! xill, Stabitzeazé florina prin lagaturi tncrucigate 58Protrombina, factorii VIL, IX si X sunt proteine care cuprind in segmentele N- terminale resturi de acid -carboxiglutamic (Gla), Aceste resturi aminoncidice se formeazst Inur-un proces post-traducjional la care partcips ca intermediar, vitamina coo- ~ooc coo" | NZ cH, cH t 1 1CH, vik cH, 1 1 HN CH~co— —HN—CH—co— rest Giu rest Gla Proteinele cu resturi Gla au 0 mare capacitate de a Tega ionii Ca™, Initierea procesului de congulare este urmati de activarea tn cascada factorilor de coagulare, semnatul inifial fiind puternic amplificat, Exista dout cai de inijiere a acestei cascade, calea intrinsecd (aparent cu participare de factori exclusiv sanguini) si calea extrinsect, la care participa si factori de origine tisular’, Ambele cai conduc la activarea protrombinei in trombina, aceasta din wrmd transforma fibrinogenul in fibrin’. Agregatele de trombina sub actiunea factorului XIII, (activat de trombind) sunt legate incruciset $i devin insolubile (Fig.1.15). Cales intrinsecd Calea extrinseca Xe Vis 2 Factor a" vile a xa x Xe x lle ca?” Protrombing (tl) Trombihd fl) Mills Fibrinogen Fibrin Fibrin (solubita) {insolubila) Fig. 15 — Etapa finala a coaguléri sangelul 59{in cele ce wrmeggat sunt descrise unele aspecte biochirvice, moleculare, ale coaguli Fibrinogenul are un rol central tn coagulare. Este o proteina plasmatica cu masa ‘molecular’ de 340 KD. Concentrajia sa plasmatica este de 200-400 mg/dl (2-3% din proteinemia totalg). Este un hexamer alcatuit din tei tipuri de lanfuri: Aa (610 aminoacizi), BB (461 aminoacizi) si-y (411 aminoacis). Formula si molecular este (Aa BB 9). Molecula este alangiti (460 A), prezentind tei zone slobulare, dow’ periferice si una central (Fig,.16). Lanfurile BB si y cuprind oligozaharide legate N-glicozidic. Fibrinogenul cuprinde multe (17) purfi disulfurice. Segmentele N-terminale A si B din langurile Aa: si BB, fibrinopeptide, cuprind multe resturi Glu si Asp, segmental B mai cuprinde si resturi de tirozin& sulfatat 1 NH GH—on-€- 0-207 co ! Aceastt compozitie amino: ick confer fibrinopeptidelor sarcini (—), ‘Trimerul Ao. BB 7 se formeaza prin asocierea paraleli a celor tre lanjusi gi doi trimer se asociazt prin capetele lor N-terminale, fibrinopeptidele ap2irind ca proeminente ale ‘nodului central. Nodulul central are o sarcind nett negativa (-8) ca $i nodulii periferii. Repulsiile electrostatice intre moleculele de fibrinogen previn agregarea lor si proteina ‘este menginuta in solu Inigierea coagulirii determina activarea in cascada a factorilor coagultitit care culmi ‘neazai cu activarea protrombinei la trombind, Protrombina (Eactorul 1) este sintetizata in ficat. Cuprinde un lant polipeptidic cu $82 aminoacizi in segmentul N-terminal cuprinde resturi Gla, formate int-un proces dependent de prezenya vitaminei K. Fibrinogen Tombing KR Fibrinopeptice A ai B ae 2504 Fibring Fig. 16 — Schema structural a fbrinogenul ga forine ‘A S18: frinopeptidele A si B: a3: siusutle de interactune dire molecule de firins‘Sub actiunea factorului X,, 0 proteazi, sunt scindate cAteva legituri peptidice si protrombina este transformat% in trombind. In aceast transformare se pierde segmental N-terminal care cuprinde resturile Gla, Trombina este aleatuiti din dows tani polipeptidice, A(49 aminoaca’) $i B(259 aminoacizi), reunite print-o punte disulfurich. ‘Trombina are activitate proteoltict, sub actiunea ei asupra fibrinogenului sunt ‘ndepirtate Gibrinopeptidele A si B, fibrina rezultaté avand formula molecular’ (0. BY. Prin ‘ndeprtareafibrinopeptidclor, nodulal central capa sarcint +5, Totodat sunt demascare centre de legare pentru regiuni ale nodulilor periferici, Moleculele de fibrin’ se asociazt Jongitudinal gi lateral formand fibre cu o periodicitate de 230 A, jumdtate din lungimea unei molecule de fibrin. FigJ.16) ‘Agregatele de fibrin& formate numai prin interactiuni necovalente sunt fragile (chiag rmoale). Asupra acestora acfioneaz’ factoral XIII, factor stabilizator al fibrinei, encima cu actvitate transamidazicd, leaga incrucisatrestur lizil si ghutaminil: NH Ne | 1 xi, GA (OHM + HCOOH) GH NA, 60 60. 1 1 \ \ * * a Go go ‘Aceste legtitur interlanjuri fac ca polimerii de fibring st devind insolubili si rezstrt jin rejeana de fibrin’ se incorporeact trombocite gi hematii diind nagtere chiagulul. Coagularea este un proces rapid care trebuie si réimdn& localizat ta locul teziunii vasculare si chiagul urmeazi st fie distrus, dizolvat cat mai rapid (fibrinoliza). Pe lingé diluarea in torentul circulator a factorilor activi ai coagulirii, captarea selectiva si catabolizarea lor hepatic’, plasma cuprinde componenfi care intervin prompt pentru a ‘topa procesul. Actiunea trombinei este ‘intrerupti: prin intermediul unei proteine plasmatice (prezenti in fracfiunea electroforetick 0), denumit& antitrombina, care se combina stoichiometric cu ombina si fi anuleazs actvitatea proteolitick. De asemenca, ,-macroglobulina are 0 aefiune similar’. Un alt mecanism de intrerupere a cascadei coagulrii cuprinde protcina plasmaticd, Proteina C, care intervine prin inhibarea factorilor IX, si X,- Proteina C este activatt de trombin’ in asociagie cu o glicoprotein din endoteliul vascular, trombomodulina aFibrinoliza. Plasina cuprinds si componentii necesari dezagregisii si dizolvirii chiagului, Acestia rimdn inactivi pana cind se impure intrarea lor in actiune, Etapa final a fibrinolize’ este catalizatt de plasmin’, enzima proteolitics, care transform fibrina in fragmente solubile. Plasina provine dintr-un precursor plasmatic inactiv, plasminogen, care este incorporat in refeaua de fibrind, El este activat de 0 proteazs eliberatt de endotetiul vascular, factorul tisular activator al plasminogenului, 1.3.6, HEMOPROTEINELE, Acest grup de proteine conjugate cuprinde mioglobina si hemoglobina, transportori de oxigen, citocromii, transportori de electroni, membri ai lanfului respirator mitocondrial si ai accluia situat in reticulul endoplasmic hepatic, diverse oxidaze si peroxidaze. Gruparea prosteticd a acestor proteine este hemul, Varietatea hemoproteinelor rezulti prin unele diferenge in structura hemului sau pentru aceiasi grupare hem pot rezulta ‘entittji distincte in raport cu natura apoproteinei si a wodului de asociere cu hemul, Hemoglobina (Hb) si mioglobina (Mb) cuprind aceeasi grupare hem, alcatuitt din protoporfirina si Fe". Porfirinele sunt compusi cu o structura macrociclie&, tetrapirolic’, {in procesul de biosintezd a hemului apar ca intermediari naturali uroporfirina, coproporfi rina si protoporfirina, Fiecare din aceste porfirine deriva dints-un precursor porfirinogenic. Nucleele fundamentale macrociclice ale porfirinogenilor si ale porfirinelor sist: porfinogenul si porfina. oe ; [= =< | Le < |] Lar Lal LI | | Portinogen Portina Porfirinogenii si porfrinele poart in pozifile 1-8 umatorii substituenyi uroporfirinogenul si uroporfirina: 1,3,5,8 -grupari_ = — CH, — COOH 2.4.6.7 — CH, — CH, — COOH coproporfirinogenul gi coproporfirina 1,8,5,8 -grupai = CH, 2.4,6,7, — CH, — cH, — cooprotoporfirinogenul si protoporfirina: 4,3,6,8 -gruparl = —CH,(M) 24 . — CH= CH, (vin, V) 67 — CH, — CH, — COOH (P) Formula protoporfirinei este: Porfirinele cuprind © stucturt macrocielick foarte stabil cu caracter aromatic. Delocalizarea electronilor determin’ agezarea tuturor atomilortntr-un singur plan, Atom de hidrogen din macrocicha sunt eliberaji ca protoni, sarcinile — sunt delocalizatc. Protoporfirina (spre deosebire de uroporfirin’ si de coproporfirind) are proprietatea de 1 Tega cootdinativ un ion de Fe" formind hemul, Fonul de fer are capacitatea dea coordina 6 liganzi (are cifre de coordinatie 6), Asocierea Fe™ la protoporfiring se face prin cei patru aiomi de azot ai porfirinei gi alfi doi liganzi extemni, de regul’ furnizait de supa din protein’: Mioglobina este 0 hemoproteint care funcjioneazi ca transportor tisular de O;, prin legarea reversibild a dioxigenului Mb +O, = Mb,Partea proteied, globina, este alettuiti dintr-un singur kanj polipeptidie (cu 153 resturi_aminoscidice) impachetat intr-o globuki compact. Cuprinde © grupare hem fixati intr-un buzunar, ciptusit cu resturi aminoncidice hidrofobe. Legarea hemului la slobing este diferits dupa starea sa oxigenati sau deoxigenati, tn forma deoxigena- 1, ligandul extem X este reprezentat de_un rest His din langul polipeptidic His proximal) si pozitia Y de coordinare a Fe este vacastit, In forma oxigenati, pozijia Y este ooupati de dioxigen, care la randul lui contracteazi o a doua legaturi ccoordinativa slaba cu un alt rest His (His distal): Ms proxind/, | M3 sto. Acest gen de asociere dintre hem si protein’ face posibili oxigenarea reversibila a mioglobinei, fri modificarea valenei ferulu. Hemoglobina este o proteind tetrameric’, forma principal din singele adultului are formula moleculara 0,8,. Fiecare lan a sfB este asocint cu cite o grupare hem, Locurile de legare a hemului Sunt situate I nivelul contactelor cc /. Asocierea dintre hem si fiecare lang protomeric se face in. mod similar cu asocierea hemlui la mioglobind. Resturile His proximal sunt 87 csi 93 B iar restrle His distal sunt 58 csi 3 Oxigenarea reversibilii a hemoglobinei este descrist printr-un sir de react oO O, o Oy Hb si HOO, =E Ho(O), =E Hb(O,), = Hb(O.). Oxigenarea maximal a hemoglobinei corespunde fixisi a patru molecule de dioxigen, Cinetica oxigentirii hemoglobinei este diferitt de cea a mioglobinei, structura ‘cuatemari permite functionarea unor mecanisme foarte eliciente de reghare (vezi Cap.ID, ‘Totodat, hemogiobina, pe ing transport de oxigen are si funcyia de wansportor de protoni si de dioxid de carbon. Citocromii sunt hemoproteine care transport electroni, prin schimbares reversibill a valenjei feruluiz cite Se cit Fe* eFig. L17 — Hemul citocromulul & Citoctomii mitocondriali (a, a), b, ¢, c) acfioneat secvential, electronié tree de Ia ‘un component la altul, in final find acceptagi de dioxigen: 4c Fe +0, —__. 4a Fe + 20% 20% + AH 21.0 Citocromul c, cel mai bine studiat, cuprinde un lant polipeptidic cu 104 resturi aminoacidice si 0 grupare hem, Asocierea dintre hem si proteina este diferitt de cea {nnd Ia hemoglobind sau mioglobin’. Ligandul X este reprezentat de. un rest His (48) si pozitia Y este permanent ocupatti cu un rest Met (80). Gruparile vinil sunt legate covalent la resturile Cys (Fig. 1.17). 1.3.7, FIBRONECTINELE Fibronectinele alcttuiesc o familie de proteine extracelulare adezive. Ele au roluri :majore in interacjiunile dinue celule gi membrane bazale saw dintre diversi componengi ‘ai matricei extracelulare gi celule. Aceste procese sunt cruciale pentru determinarea caracterului migrator sau stafionar a] celulelor. Fibronectinele au roluri importante in embriogence’, in menginerea integriitii fesuturilor, in hemostaz, determina migrarea celulelor canceroase. Fibronectinele sunt proteine dimerice, protomerii A si B au mase de aproximativ 250 KD si ‘prezint& o inaltt omologie structural. in dimer capetele C-terminale ale lanjurilor A si B ‘sunt reunite prin dou punti disulfurice (Fig.1.18). Dimerul este 0 molecult alurgita (600 A/25 A). Protomerii A si B sunt organizaji in mai multe domenii structurale, fiecare domeniu fiind caracterizat prin capacitatea sa distinct de a se lega la alli componenti.\ BMC 7 s / Fig.148 » Stuctura multidomenlala a floronectinel plasmatice entra fibronectina au fost descrise mai multe izoforme (12), specificare genetic. dinire acestea este fibronectina din plasma, Aceasta este sintelizald in ficat, jesut in care mu se mai exprimit nici o alt gend a fibronectinei. Alte izoforme ale fibronec- tinei sunt sintetizate de diverse ale tipuri celulare. Cea produst de fibroblasti este prinue cca mai malt studiatd si mai bine cunoscutl fibroncctind, Fibronectinele dup’ sinter’ intracelulard sunt secretate in matricea extracclulars locala unde funchiones: 2, Toate esuturile cuprind fibronectin, Fibronectinele au capacitatea de a stabililegtturi cw alle profeine, astfel se realizenaat © ofea de interactiuni care conecteaz’ proteine extacelukue (colagen, faminin’, vitronectina) 5% mucopolizaharide (proteoglicani) cu receptor! membrana Gintezrine) gi cu proteine intracclulare care aletuiese citoscheketul (actin, ecactinin’, vinculin’), © molecuki de fibronectin’ posed’ mai multe domenii structarale prin intermediul efrora inieractioneazi cu componenfii enumerati mai sus. Aw fost identificate domeniile de Jegare la colagen, heparin, fibrin?, actin ca gi domeniul de interactiune eu 0 celuki Inferactiunea dine fibronectin (Gbroncctina plasmic si celule are loc prin intermedi unui domenia de aproximatiy 75 KD sitwat in jumaiatea C-terminal a lanjuitor A gt B Situsul de legare specific cuprinde secvenja Arg —- Gly -—- Asp — Ser (RGDS), Peptide mici de sintez care cuprind acest segment sunt apte 8 adere pe supafaa celulctor. Receplorul celular pentru fibronecting, care recimaagte seevenja RGDS, a fost identifica in toate tipurile de celule. Acost receptor face parte dini-0 familie de Feceptori care recumose si imteracfioneaz’ cu diverse. proteine adezive, familia. integrinelor Integrina specifics pentru fibronectin este o glicoproteind, un heterodimer ot. Tntegrina din plachete (slicoproteina Tl, — Il) este distinct de cea a altor celule Integrina plachetclor, pe Ling’ fibronectin, inteFactioneuz8 si cu fibrinogen, fibrin’, cu factorul von Willebrand Fibronectina plasmaticl’ are un rol deosebit in fortarea cheagului, prin legare de fibring, fibronectina este incorporati in cheag. Prin multifuncjionalitatea sa fibvonectina ‘sigur ancorarea cheagului la celule si pe matricea structural a pereilor vaselor.Cap. I, ENZIMELE 1.1. INTRODUCERE Numérul reacfiilor cunoscute care au loc in organismele vii este de ordinul miilor; cu rire excepfil, aceste reaefii sunt catatiza {in anul 1877 cttalizaiorilor rectitor din_orga “ti s-a atribuit numele de sencime in drojdie); aveastt denumire, alituri de aceea de xt Utilizeaza gi in prezent, Denumirea mai vecke a fost aceca de ,fermenti* (legatt si en de procesole fermentative): pentru enzime individuale s-au utilizat demumiri specifice, ca cde exemphu, .diastaza” (in prezent - amilaza). Locul de, acfiune al celor mai multe enzime este in interiorul celulelor; unecte yalizatori", se aiclioneaz’ inst gi in awa acestora (de exemplu, © serie de enzime din plasma sangaind intre care si cele care asiguri coagularea). Toate enzimele specifice unui tip de cclule ‘sunt sinietizate chiar de acele celule; enzimele care actioneaz’ th at sintetizate doar de anumite tipusi de cetule (hepatice, renale etc.) Enzimele au toate insusirile catalizatorilor utilizati in reacille chimice din tumea nevie, Ele sunt insti superioare acestor catafizatori ia mai multe privinte: 8) Asigurh reucjitlor chimice pe care le catalizeaz’ viteze cu cdteva ondine de prime in plus ) Reacfiile pe celulelor sunt 21 au toc in condi blinde: temperaturk sub 59°C. presiune atmosferied, pH in jurul lui 7: exist, evident, si unele excepfii. Comparativ ccatalizatorii chimict acfioncazdi Ia temperaturi ridicate, presiuni mari gi valori extreme de pit: ©) Au speciticitate fosne mare ceea ce asigur ca in reactille pe care le catabizeacd sh nu se formeze produsi secundar. ‘Multe enzime au Tosusiri neint@nite ka catalizatori chimiei, Foarte importante sunt: 4) Capacitatea de regive a producerii lor in celule si/sau de reglare a activitaii ) Posibilitatea catalizicii unor reactii endergonice prin cuplarea acestora ot react 4 capitolul .Energetica biochimica"). Isioria enzimologiei se intinde pe doul sute de ani, Matile descoperirirealizate pana a mijlocul secolului nosiru au fost rodul gandirii si experientelor individuale ale unor chimigii organivieni, fiziologi, microbiologi, captivati de acest domeniu: Gay-Lussac, Licbig, Berzelius, Kahne, Emil Fischer, Pasteur si alfii, Tolusi, ca gi in multe alte domenii ale biochimiei, abia in ultima jumétate a secolului nostra, prin cercetiti efectuate de grupuri ultraspecializate si cu mijloace telnice din ce in ce mai perfectionate, are le atalizea exergonive (v 6s-a putut ajunge la 0 infelegere profundy a naturii si functionarit enzimetor. Cunostingele de enzimologie sunt extrem de utile in prezent pentru interpretarea multor fenomene din biologia celulard, genetic si alte stinge biologice. Ingineria genetical se bazeazsi aproape exclusiv pe actiunite specifice ale unor enzime. Din punct de vedere medical, enzimologia contribuie astiei in misura hotiratoare la cunoasterea cauztlor a numeroase boli, diagnosticul si urmarirea evolutiei acestora, elaborarea pe baze stinfifice a medicamentelor si multe altel, 1.2. SCADEREA DE CATRE ENZIME A ENERGIEI DE ACTIVARE A REACTILOR. CAPACITATEA CATALITICA A ENZIMELOR Toate reacfite chimice sunt insogite de variagii ale energiei. in reacjile care au loc tn Jumea nevie, variatile de energie se urmtirese in rod curent prin varistia caitdurii (entalpiei); dup cum ele elibereazt sau absorb cildura sunt ,exoterme” respectiv vendoterme. Dac reacfiile an loc in condifii de temperaturi si presiune constanta, pparametrul termodinamic urmirit este altul, respectiv variafia energici libere, notati AG. {n cazul reacfilor care au loc in organismele vii superioare, la care cei doi parametri sunt constangi, se urmireste, de asemenea, variatia energiei interne, Dac AG in cursul este negativa (ceea ce corespunde eliberiirii de energie), reactia este ,exergoni- cit invers, reactia este ,endergonica". in cazul reactiilor exergonice, care constituie obiecul discufiei ce urmezdt, energia ‘medie a moleculelor reactangilor este mai mare decat energia medie a produsilor de reacfie, Deoarece produsii de reactie sunt mai stabi decd reactant, s-ar putea crede cit reactiile in care se elibereazi energie sunt si spontane, Totusi, cu foarte rare exceptii, desfigurarea acestor reacfii este condiionatt de fumicarea unei anumite canitagi de energie; abia dupa ce au fost ,amorsate” ele devin eliberatoare de energie. De exemplu, oxidarea glucozei cu O, este o reacfie in care se elibereaz’ energie; totusi glucoza rezisti contactului permanent cu acest element luni de zile, chiar si ani, dactt reactia nu este declangatt prin furnizarea unei cantitagi de energie Energia funizatt reactiet are rolul de a mari numirul de ciocniri intre reactant, inclusiv a celor eficace: este vorba de ciocniri din care rezult& .complexe de tranzitie™ stiti prin intermedi! clirora au Joc transformarile substratelor in produsi de reactie, ‘Aceastl energie este cunoscuti sub numele de energie de activare™ gi este definitt ca energia necesari pentru ca toate moleculele dintr-un mot de reactant st ating’ starea de tranzitie". Ea se exprima, evident, in Ki/mol sau Keal/ml si este specifica fiecdrei react 8in taborator sau industie, energia de activare necesar’ reacfiilor este furmizatt sub forma de chlduri. Imposibilitatea ca reactile chimice din organismele vii 8 fie influengate de cildurt este compensati de citre enzime, care, asemandtor tuturor caaizatorilor, scad energia de activare, Cu edt un catalizator scade mai mult energin de wtivare a reacfiei pe care 0 catalizeaz’t cu tit el este mai eficace adict asigur’ 0 vitezt mai mare acelei reacti Enzimete scad foarte mult energia de activare in raport cu catalizatorii chimici, Reactia de descompunere a apei oxigenate poate servi ca exemplu in acest sens: 2H,0, ——> 2H,0+0, in absenta catalizatorilor energia de activare are valoarea de 18 Keal/mol; ea este de 11.7 Keal/mol in prezenja catalizatorului de platina coloidala si de numai 2 Kealfmot in prezenja catalazei, enzima cu specificitate absolut pentru aceastreactie (Fig. 1.1). Aga se explicd capacitatea catalitich deosebit de mare a catalazeit o singurti molecul din aceasti enzim’s descompune 5 x 10* molecule de ap’ oxigenati intr-un minut, in conditii optime, Existd gi enzime care asigura viteze de reactie de ordinul 10" - 1¢'* in raport cu reactiile corespunaatoare necatalizate, Scaiderea de citre catalizatori a energie’ de activare este consecinga cursului diferit pe care acestia Ml imprima reactiei. Se stie cf orice reactie catalizati decurge 3i in absenja catalizatorului’ dar cu vitez’ foarte mict. in acest caz substratul (S) se transforma direct in produs de reactie (P). ‘S 8 4 E % | Wares. ariatia energiei S fila libere th reactie~ § S . NS = == Sherea tinalé Destosurares regeiies ——~ Fig. ll. Energia de activare pentru descompunerea apel oxigenate: 2a) f8r& catalizator; b) In prezenta Pt colcidale; c) In prezenta catalzal, 0id este prezent catalizatoru, in cazul reactilor Jin Tumea vie enzima (E), inte aceasta gi substrat se formeazat un complex ES din care apoi rezulta P si se reface E: E+S == ES——» E+P {In conformitate cu cele afimate mai tnainle, energia de activare pentru transformarea Jui $ din ES in P este mult mai mica decat la transformarea directa a lui $ in P. Jn Fig. TLL, este reprezentat si faptot c& intro recctie exergonicd declansat® prin fumizarea energici de activare, se elibereaz’ o cantiate de energie care este suma cnergii de activare + varajia energie tibere specific (diferenfa inte energia medie a reaclantilor sia produsitor Desigar cli in organismele vii, akituri de, reacfile exergonice, au loc numeroase reactii endergonice, Ele sunt posible prin fapinl ch existh enaime specializate, care, pe lang seiderea energie de activare, sigur’ i ransenal energiei tibere necesire de ka rect exeryonie. Destagurare acesor reef este prezentat in capitol ,.Energetica biochimicd 11.3. SPECIFICITATEA ED 'ZIMELOR Inalta specificitate este una dintre caracteristicile fundamentale ale enzimelor Consecinge ale acestei specifictagi deosebite sunt att evitarea formarii de produsi secundari in reaefi, ct si, pe un plan mai general, existenja insigi a editor metabolice (Gn sensul ca succesiunea reactiitor, de exemplu intrun compartiment celular, este impusi de enzimcie existente). Modalitiile de manifestare ale specificitit sunt diverse. Se pot considera totusi tei variante de baz: specificitatea de reacjie, specitictaten de substrat si specicificitatea stereochimi 13.1 SPECIFICITATE DE REACTIE Specificitatea de reactie consti in aceca ef flecare enzimi catalizeazA numai un singur tip particular de reactie (excepliile sunt foarte rare. Tipul particular se ineadreazt {in unul din cele yase tipuri fundamentate de reactit care su loc in lumea vie: oxidoreduce- fe, hidroliza, formare (scindare) de legtturi covatente, izomerizare, formare de legituri covalenie utilizind energia eliberath prin scindarea unor legituri macroergice. Se va vedeu mai departe in acest capitol cd in sistemul actual de clasficare sunt sase clase de ‘enzime, corespunzMor celor sase tipuri fundamentale de reac Ca exemplu de tipuri particulars de reacfi pot fi considerate: ~ hidroliza proteinelor in prezenta proteazctor: ~ fosforlir ale unor compu diversi cu acid fosforie provenit din ATP, is kinazelor: prezenta 70« schimburi de gruplri amino contra gruptti carbonil intre aminoacizi gi cotoseizi, catalizate de transaminaze. © consecin a spocificitii de subset exe cea cl un anumit compe cae peu f transforma fn mai mull produsi de reacfie, nocestl entra ficare transformare o envinatt specifics se ‘exemplifict prin reacfle pe care le suferi bs organism glucazo-6-fosftal (G-6-P): glucozo-6-fostatizomeraza glucozo-¢-fostat — fructozo-6-ostal fostoglucomutaza glucozo-¢-fostat = giucoz0-1-fostat glucozo-6-fostatdehidrogenaza ne glucozo-6-fostat acid-6-fostogluconic glucoze-6-fostataza S——m — glucoza + acid fo- toric gkicoz0-6-fostat + Ho 113.2 SPECIFICITATE DE SUBSTRAT aria mai rest Aceasta consti in mali larg de actiune a fiecitei encinre cu ‘0 anumiti specificitate de reacgie, Ea poate fi + absolut, dacd enzima catalizeaz wn anumit tip de reacfie Ta un singur substrat; = de grup, dact enzima catatizeazti acelasi tip de reactic la douk sau Ia un nanir restrins de substrate; = specificitate larg, dact enzima catalizearat acelasi tip de reactie Ja un namie foarte mare de substrate. Dou’ dintre enzimele cn specificitate absolut sunt anhidraza earbonick gi ure anhidraza carbonic’, 60,4 1,0 E4P Jn prevent, exist numeroase. doveri experimentale, decte sau indirecle, privitoare ta formarea complextlui BS, intr-un numiy redus de cazuri enzima este legati de substrat prin Jeatturi putemice (covalente); asfel de complexe ES siabile au fost izolate gi analizate prin difratia razelor X alte metoe. Complexele in care legtturie dine E. gi S sunt slabe Sau studiat pe ei indirecte: saturn enzima cu substrata s-au objinut modifica in spectrul de absorb, soluhiltate, stabilitate termi etc, Mai now, formuea complexclor BS este sudia\ 8prin metoda marenjului chim ea const in tratarea enzimeor ola cu compusichimic. care reactioncaz’ fn mod specific eu anumite grup (apart unr resturiamsnoacide) lt care se atageuzk prin Lewin putemice (care un se seindez% la hidvoliza enzimel). Dact erzima mascatd nu mai fixeaz $ inseamn’ c& aminoacid {a cares att compusul cin implica in formarea complexului BS, Acest aminoacid poate fi ecunescut dact se hid enaita, in hidrolizat sping si compexul aminoacid ~ compusalchimic. (© observasie important in legiturs cu formarea complexului encimi substrat este 4 Ta anumite enzime indepartarea prin proteoliz a unor portuni din-macromolecutele lor nu afecteazd (sau afecteaz in mict meisuri) activitaten. Aceste dave experimeniale corelate cu ncvea cde regu, substraleste foarte mic‘n rt port cu enzima, au permis formulares conclurei && numai o zond restzinsi din enzim? pa ‘ici la Fxares si transformarea chimich a Ini S; aveastt ond se numeste central ectiv™ 4 enzime. Tot din studi experimental a reat 8 o enim dispane de un Singur cent activ, In centrele active ale enzimelor s-au evidenfiat grupiiri chimice de tip carboxil, arnino, hidroxil i tio: acestea apaitin unor resturi de aminoacizi cu caracter avid sau bazic (glutamic, aspartic, serina, sfozina,cisteina etc), dar si hetrocici, im special al histidine’. Gruparite sy resturte heterocielice apartin de regal unor aminoaciza indeparte( in secvenga (struct primari) a protenel- encima, De exemplu in centr ati al chimotnpsi- pei s-a iantificat sruparea OFT a serine in posijia 195, grupavea carboil a acidulak aspartic 1n pociia 102 si nucleul imidazotic al histidine! in pozija 57. Grapirile acestea sunt karte propia in spay ca usmnare a conformal) spociice a chimotripsinet (Fig. 11.3). Sunt ined polemici in Lega cw ventral activ al envimelor rezultate din generali- zaea unor cavasi paticulare; unit consider’ ch acesta este aledtut dintr-un ,centru de Jegare" si separat.dinty-un «centru cataitic". Alf susfin cB este mai corect considere ef n centeul activ umele grupari sunt implicate in tegarea substratuui, altele uusiguta cataliza propriu-zisd, cle fiind intescalate. In cazut onzimetor heteroprowice. cofactoriéreprezentati de grup prostetice fac parte din central activ: coenzimete ston metalict au povitionare care fe asiguri conluerarea cu central activ. 1H (A) — WH, (8) 1 1 Ser 195 dgr cooH (8) Fig, 1.3. Structura tertiard a chimotripsinel: se evidentiaza resturle Ser-195 si His-57 ‘care Impreuna cu Asp-102 (dispus in apropiere) se atla In cerirul activ 9In Jegituri cu organizarea spatial a centrului activ al enzimelor ¢raportaté. la structura substratulai) s-au elaborat dou’ modele: = Modelul clasic (Emil Fischer) consideri c& potrivirea substratului cu centrul activ al enzimei este analoagi cu potrivirea ,lacit-cheie“. Acest model presupune o rigiditate a structurii enzimei in zona centrului activ ig. 1.4), ~ Modeiul Koshland, numit ,centul activ indus", presupune o flexibilitate a zonei in care aceasta se afl, fn enzima libera central activ este .preformat ceea ce inseamnd cl el are © configuratic spafialt sor diferti de cea necesa! fixtriisubstratului, Substratul induce 0 ‘modificare conformational a zonei centrului activ realizindu-se configuratia optim’ fix 4n Fig, ILS. se red’ una inte reprezentivile simplificate ale modelului Koshland. ‘In cazul unor enzime, formarea complexulii ES in varianta Koshland a fost demonstrat experimental Pe de alti pate, din punet de vedere termadinamic agezarea cea mai potrivith 4 substratulu in raportcu enzima reduce la minimum gradele de liberate in ceea ce priveste ‘ranstatia si rotaia substratului, element ce favorizeaz aingerea uscart a stiri de tranzitie; aceasta este interpretarea datt sciderii energiei de activare in reactile cataizate. de enzime, Specifcitatea stereochimict si mai ales inhibiia competiiva a enzimelor pot fi explicate cu usuringl pe taza modelutui Koshland, Desigur cf fiecare enzima prezint o siructura specifich a centrului activ (cu stirile »preformatt* gi ,indust'). Aceasta nu exclude existenja unor analogit in structurile cenirelor active, cel putin pentru enzime cu funcfie apropiatt. Astfel 0 serie de enzime protcolitice au in centrul activ un rest de serin’; mai mult, in vecinitatea restului de serind variafia resturilor aminoacide este foarte redust (Fig. 11.6). enzima substrat enzima- substrat Aeon Pts Motel cont enzima substrat enzima- substrat Trpsind +Gin-Asp - Gly (Se- Gly - Gly - Pro ~ Chimotripsina :-Mot-Gly - Asp (SB) Gly - Gly - Pro - Trombing Giu- Gly - Asp -[Ser]- Gly - Gly - Pro - Fig, 1.6, Secvenja aminoacizlor In zona centrului activ ‘al unor enzime protealtice asta spropiata 80Fig. IL7. Mecanismet propus pentru scindarea hidroitica catalizaté da chimotrpsina a logaturlor poptidice (detail in tox} Existenja acestor omologii pledeazA pentru faptul ci, cel putin in lini mari, scindarile proteotitice sunt asemanatoare ca mecanism:; situagia este de asteptat s% se ‘intdlneasc& gi pentru alte tipuri de reactii catalizate. ltd constatare reznlta% din studial centrulti activ al multor enzime este c& acesta se aflt in .cavititi" sau ,sanfuri* (crevase); polaritatea redusa sau chiar lipsa polaritii din aceste zone favorizeazit fixarea substratelor. CCunoasterea grupirilor functionale gi a altor detalii structurale ale central activ al tunor enzime a oferit si posibilitatea formulirii unor mecanisme de reactie. in cazul chimotripsinei Fig. 1.7), se presupune ci in lipsa substratului imidazolul restului His-57 interactioneazi prin legtturi de H eu unul dintre atomii de oxigen ai gruparii COOH st& Asp-102 si cu H al grupanii OH a Ser-193. Cand substratul este fixat in eavitatea in care se afld central acti (gi a cirui povifionare este realizath prin diverse interaefi) bidrogenul de la gruparea OH a serinei este transferat ca proton pe azotul restului imidazol; el formeazi acum o legiturd de hidrogen cu azotul gruptsii peptidice a substratului in timp ce O~ a restului de serind atack weleofil atomul de C al grupaci Peptidice a substratului. Prin aceste rearaniri se induc: scindarea heterotic’ a leghturi peptidice: intr-o fax intermediar’, gruparea carbonil a aceste legtturi (cu restul proteic de care este atagatt) se leagt covalent cu serina in timp ce gruparea NHL (de asemenea cu restul si proteic de care este atasata) formeazi legttura de hidrogen cu atomit de ‘azot ai imidazotului. In final, restul proteic de la gruperea OH a serinei este deplasat de pi, restul proteic de la imidazol se desprinde gic; chimiotripsin fg ea stuctura iii ‘Un mecanism detaliats-a formulat pentru reactia eatalzath de lizozim, Centrut activ al fizozimului se prezinti sub forma unei ,despictturi* (gan)) cuprinzdind mai multe rupiri de legare si catalitice (Fig. 1.8). Numarul restuilor de NAM si NAG cuprinse {in central activ este sase. La legare participa resturile de Tep-63, Tep-62, Asp-102, Ala- 107, Arg-114; grupirile carboxil din resturile Glu-3$ si Asp-52 participa la cataliza Esenfial in mecanismul propus este faptul c& in timp ce restul Glu-35 este intt-0 zon’ hidvofoba a tizozimului,e1 nefind ionizat fa pH-ul optim de acfune (pH=5), restut Asp- 52 este intr-o zon’ hidrofi& si deci este ionizat. Din cele cinci legituri glicozidice (1-4) aflate tn centrul activ singura care se scindeazi este cea cuprinsA inte resturile Glu-35 gi Agp-52. Gruparea COOH a Glu-35 cedeaa protonul oxigenului care formeazi legttura glicozidict (1-8) simultan cu scindarea heterolticd a legiturit oxigen - C, a NAM. Restul NAG formeazt astfet gruparea OHf la C, in timp ce C, a restului NAM devine carbocation (Find stabilizat de interactia cu gruparca COO a restului Asp-52). Urmzezi atacul nucleofil a (OH)~ din apt cu formarea grupttii hidroxil la C, a restului NAM; simultan ionul H* din apit formeaza cu geuparea COO a Giu-35 gruparea carboxil neionizath (Fig, 11.9). Reacfiile catalizate de enzimele heteroproteice sunt si mai complexe deoarece apoenzima si cofactorul partcipx simultan la formarea complexului ES si ta cataliz Fig. IL8. Roprezentarea intitivés = contrull activ al lzozimulul (comentariy fn tex}. 22Fig. 1L9, Mecanismul scindatihidoltice a legatulor (1-4) glicozidiee in hoteropolizaharide, catalzati de lizozim. IL8. CINETICA ENZIMATICA, Cinetica ey studiaz’ viteza reactitlor catalizate de enzime in functie de variajia raportului concentratilor enzimei si substratulu ((EJ, (8) sia influenfelor unor factori fizico-chimici cum sunt: temperatura, pH-ul, inhibitor ete Conceptia unanim admist in enzimologic ca formarea din substrat a produsului reactie implica obfigatoriu existenfa complexului enzimma-substrat (ES) redatt prin ecu: E+S == ES——> E4P 2 fost statuatd in primut rnd in Tegiturt cu cinetica reactiilor catalizate de enzime; de aceea, in interpretarea ficciruia dintre aspectele cuprinse in acest subcapitol punctal de plecare il reprezinta chiar aceast ecuae 11.8.1, EXPRIMAREA VITEZE! REACJILOR ENZIMATICE. ACTIVITATEA ENZIMELOR Utitizarea curenta in cinetica enzimatic’ 4 acestor termeni face necesard definires lor. Viteza de reactie se exprim’ prin cantitatea de substrat (ransformatz in produs de seactic (exprimatl in miligrame, mai rar in grame) intro unitate de timp (secunds, min),Pentru enzimele purificate, cérora li se cunoaste masa molecular’ se poate stabili numarul de molecule de substrat transformate de ciire 0 moleculd de enzim® intro secundi, valoare ce reprezintt ,activitatea moleculwit a enzimei. Aceasti miirime, sinonima cu eficienfa cataliticd, este importants pentru c& permite ait comparatii intre diversele enzime cat si a enzimelor in raport cu catalzatorii chimici. Pe de ait parte, pentru enzimele a cisor activitate moleculars este stabilii, pe baza mrdsurtil ccantititii de substrat transformat, de exemplu de cite un omogenat tisulir, se ponte alcula concentratia enzimei (numdrul de molecule) din acel omogenat. In practica biochimict curentt, inclusiv in cadral getermingritor enzimatice in scop de diagnostic (in special in ser), interescaz’ mai putin activitatea absolut’, fiind ins’ importante variatite de activitate; in acest caz este suficient $8 existe o anmumita unitate anbitrari do activitae care st serveasct drept refering. Se ulizeazii urm&toarele uni: unitatea internafionaki, Ul; 0 unitate internationals reprezintX cantitatea de enzim’ ‘cate sigur’ conversia unui pmol de substrat/min in condifii standardizate de pH, temperaturd, prezenta cofactoritor (care sunt stablifi panteu fiecare enzim). ~ Katalul (Kat); un Kat reprezintt acea cantitate de enzim’ care asigurdt transfor. ‘marea unui mol de subsiral/sec (cu. multipla kilokat si submoltipli mkat si pat), Pentru unele enzime se utilizeazt si alte unitati, Astfel pentru oxidoreductazele cu coenzime NAD* (NADH + 1°) sau (NADPH +H’) actvitatea se exprima prin cresterea sau sc&derea extincfiei la 340 nm formele reduse ale enzimelor absorbind aceasth radiagie, i: timp ce formele oxidate nu 0 absorb; 0 anitale enzimatich pentra aceste hidrogenaze-dehidrogenaze reprezinta cresterea sau sciterea cu 0,001 a extincjiei Ia 340 him intr-un minut (cova de 1 cm) Pentru fosfatazele din ser se utilizeazX unitatea Bolansky care reprezint cantitatea de enzima ce formeaza, prin hidroliza esterilor fosforiei, un mg de fosfat anorganic (in conditi standardizate de pH, temperaturl). 118.2. VITEZA INITIALA A REACTIILOR ENZIMATICE ‘Dacé unui substrat aflat in solujie i se adaagi o cantitate de enzima care catalizeaza\ transformarea acelui substrat se corstali ¢& formarea in timp a produsului P are Toc dup’ 0 curb ca cea din Fig. 11.10, Fa are © porjiune rectilints (cu panta constant), apot_ se ‘inclind si in final se aplatizeazit. Esie nevesar ca in mtsuritorile de cinetic’ s% se ia valoarea notati ve, mumiti viteza initial si care reprezint’ viteza reacfiei ‘Pe porjinea rectlinie. Datorita concentra- og z Fiat tied mari a substratuloi corespunzaitoare J i acestei porfiuni, ES se transform numai in E +P (nu gi in E + S). in practic’ se din valoarea \, a fiecirei probe). Proporfionalitatea inte viteza v, si [E] are importante aplicait practice: de exempta, este posibil si se estimeze concentrajia relativa aunei enzime In omogenate ce ukare irk a fi necesar sX se efectueze o purificare prealubill a acesteia, Pe de 0 pate, Ve = KE), iar pe de alt pane v, = (PYt (unde [P] = concentrayia produsului timpul de destigurare al reactei); deci: KfE)=IPM sou (E]= [PPK -t Dach timpul penira studierea reacfei este merou acelasi (deci constant) $i produsul K-te constant (notat K;): in aceste condifi, concentragia in enzim’ este direct proportio all cu cantitatea de produs format (El = [P]K.- “Asemenea miisuritori de concentrafii relative a enzimelor se efectueazi sistemtic in laboratoarete de analize medicale (mai ales asupra singelui) deoarece variaiile sunt corelate cu diferite stiri patotogice, (vezi subcapitolul ,Enzimele in diagnosticul clinic“). 87118.5. INI TA CONCENTRATIET SUBSTRATULUL ECUATIA MICHAELIS-MENT ait miajoritaié encimelor cotulare este constantd tn timp: fe excepyie cavimete numite .inductibile” (veri Reglarea activitti enzimielor”) precum si enzimete Dlasimatice nefunctionale a edvor concentrate crese sab seade in anummite stiri patologice (vei -Relafia enzime - patologie'), fa schimb, eoncentrajia substratelor celor mai multe ‘vie variaaa destul de mult dupa starea metabolicd 4 jesotalui si numerosi ali ctor pena vitezei de veacje de concentraja substratului constiuie aspect cel mai important al einetici envimatice, fv aoestcaz,reprezemtarea grafic a lui v, tn unc de 18] (El, temperatura si pH-ul find constrante} conduce la o cura cu aspect de !iperbott Fig, 1114), Existd gi excepfi enzime pentra care tn toc de hiperbola se obfine > curt sigmoidal (sez! wEnzimele aosterice) Din ana 21y, crete proportional cu cresterea ($] numai pentru vatori imici ale acestein: apo cresteres se face tot mai lent pentru ca dincolo de puncta! #3. cori de mutta eteste (8), viteza reacted mime constant; valoarca constant a vtevel este si valoarea maxim, notath V,,. Explicagia aturei curbei procum sto ecuagie in care v, se exprim’ in funcjie de (S}, $i constant Ky, se daloresA fui Michaelis si Menten In deducerea ecusiei se pleact de o kn completars tn cle mengionate anterior in tegitrd eu aceasté ecuate general se Precizeazi cd tnsformarea ES ——» E + P este de regula irvetsibild dis dow men tive: pe de o parte, este etapa mai lent, pe de all parte. P devine, in eadnal et Imotabolice spevitie,substat penis reactia miloare si devi se consul rapid Lexlott ‘oun reac enzimatce tn care eformarea lui ES din E si Pw poate ft negiisy Saturatie Fig. 1.14, Veriatia vitezel reactei endimatica in functe de concent subetratutl 0 Ky i]Deoareee vitezs inte-0 unitate de timp, reactied eataizatd enzimatic se exprima prin cantitatea de P fornat ar [P] este proportionala cu [ES], se poate serie =k, IES) @ Cantitatea de ES disponibilé pentrs trnsformarea tn E si P este inst dependents, pe «ie 0 pare, de vitera cu eare se formeaz iar. pe dealt parte, de viteza de disaciers in i S; aceste viteze sunt redate prin: dle formare a ui ES = K, IE) £5} a unde (E] reprezint& conceniraia enzimei libere (disponibita i momentul dat pentru fos Ds - viteza de disociere a tui ES vite ks ESI @) face parte dint-o cale metabolica (ES) rlumane practic constant’ (“steady suai [S} gi [P]. Conxigia mafematic’ pentru aceasta 'S sti fic egal cu suma vitezelor de transformare in E si Daca reactia staie™, stare sie ca viteza de formare at Iu P i refacere a lui B + S, devi Ky “TEL 1S} + (K+) IES) ° sa Kk TS 1 Ce Raportul constantelor este fot @ constant’, notatt Ky. deci ky BLS ” ei care poate fi serisa gi sub) Form eg SI ea Deci pentru calcula! pe baza ecustici (7) a i Ky, care are @ deosebitt importan’ in enzimologie, este necesat misurarea direct a lui {E} si [ESI. Aceste determin’ sunt deseori dificile; de aceen se urmareste objinerea unci ccuatii in care Ky st fie coretat cu parametri mai usor msurnbii, In acest seop (E} se exprim prin (= led -(ES) @ unde [Ey] este concentragia total. a enzimei in medi. Substituind pee [E} din (9) in (8) se obgine: ses) - AE TESD 81 10, % care prin rezolvare conduce la: ge - EU a rl 89Substituind aceasta valoare a lui ES in (2), se objine: vpu KES) (12) Ko) Cum s-a aritat, cind concentrafia substratului este mare (caz frecvent in vivo), viteza reactici este V,,, ceea ce presupune particjparea in totais a enzimei la react, deci: Vu * KE] (3) ‘Substituind in (12), se objine: vee van 8 (14) Ke iS) Aceasta este ecuatia Michaclis-Menten sau ecuatia de vitezi a reactiilor enzimatice cu un singur substat, Ea red deci varigia Ini vin fumetie de varitia lui (S): in ecuatie ‘mai apar constanta Ky si Vay, (Care exprima indirect concentrafia enzimei).. ‘Concordanja ecuafei cu aura curbei din Fig, 1114 este exceptional; pentra verificare se dau dows situa: a, Ciind S are concentrafia foarte mic (corespunzitor portiunii O - A pe curbii), valoarea lui la nusnitor poate fi neglijata gi ecuajia (14) devine: Vou (81 ~K 18] ro) adic’ v, este direct proportional cu {S}; , Cand § are concentrajia foarte mare in raport cu Ky (corespunzitor punctului B pe curb’), valoarea acesteia din urma poate fi neglijati, deci: Vu £8] i} (16) adic& v, atinge valoarea maxima, 118.6, DETERMINAREA EXPERIMENTALA A K, SEMNIFICATIA ACESTEI CONSTANTE, CONSTANTA CATALITICA, K., Fiecare enzimfi se caracterizeaza printt-0 valoare particulard a Kye aceastt valoare se determin’ in principi astfel: se prepart o setie de 6-10 probe (intr-o solutie tampon potrivitt) introducdindu-se in toate acceagi cantitate de enzim’ dar realizindu-se un gradient crescitor al substratului. Reactia, declansati in momentul amestectsii enzimei cu substratu, este sath sit se desfagoare un anumit timp (secunde, minute, dup caz) poi este intrecuptt prin adaosul unui inhibitor potrivil, Se misoara tn fiecare probsi cantitatea de produs format; cu aceste date se calculeazA valorile v, care se reprezint grafic in funcjie de [S] crescator, Se objine cura hiperbolicd caracteristica (Fig, 1.14). Porfiunea dreapti paralelt cu abscisa (corespunzatoare saturarii E cu S) se prelungeste and la intersectia cu ordonata; intersect reprezint V,,,. Se ia valoatea Vyay/2, se duce © dreaptt paralelai cu abscisa pind ta intersectia cu curva si de aici se duce o dreapta paraleli cu ordonata pana la intersectia cn abscisa, care este chiar Ky. 90‘Dacit fn ecuafia Michaelis-Menten se substituie ¥, cu Vay/2 se objine succesiv Vows _ Yeo SI 2 Kut lS} S]= Kus tS} Ky= IS] (17) Se trage concluzia: Ky reprezinés acea concentratie a substratului pentru care viteza reacqiei este jumaitate din V,,,5 in consecinf& valorile lui Kye se dau in moliftitr. Semnificajia lui Ky reiese duck se apeleazt 1a formula (6): Ky = (Ke + KOK: considertind K, << K, se obfine Ky = KK si deci .Ky rod capacitatea de disociere a lui ES in E + S"; fn alfitermeni, ea red tiria legaturiiintre E si S in complexul ES, Valorile Iui Ky, pentru diverse enzinie sunt cuprinse intre 10" - 10° molifitru Se conehide: + valorile mici ale Ky, corespand unei legtturi slabe inte E i - valorile mari ale Ky corespund unei legitari puternice intre E si. ‘in cinetica ensimaticn se utilize gio all constant, nota K, care se define ste prin rapertul: Voss 1) “El Ea red numarul de transforméti substrat ~» produs pe care fiecare centru acti Ie catalizeavc\ inte-0 unitate de timp (turnover). Cunoscind valosile si semnificajile lui Ky, si Kay Se poate calcula K/Ky care red& eficienga cataliticd a enzimei (Tabelul 1.2), Tabotul 12 Valotile Ku. Kou $i Kye/Ku le cAtorva enzime In raport cu substratele Enzima Substratih Kell) Kale) Kala Rooticoinesterazs [Acelicolna Jesxt0® | ant" Texto" ‘Anhicraza carbonica | CO, taxi 10x10" eax? ‘Antickaz8 carbonic’ — | HCO; zexto® | 4oxto 1,5x107 Catalaza HO, 25x10? 10x10" 4oxt0? Chimotipsina Estoruetiic al | 44x10" 54x10 texto" Neacet-glcnel Fumaraza Fumarat soxio* | 8x10" 1,6xto* Ureaza Ure asx? | 1,oxt0" 4ox108 9118.7, ECUATIA LINEWEAVER-BURK, fatematie, ecuajia Michaelis-Menten poate fi transformatti in moduri variate. © variant, datorati iui Lineweaver si Burk, este forma reviproca: ariahilele Giind (S) si v,, ecuaia este de forma general y amfic 1, in funcfic de 1fS} se objine o dreapti (Fig. U.15). intersectia drepted cu fordonata corespunde vilorii 1Myq ia panta dreptet fe Kyou BACK Se prelungeste dreapta pling Ia interseetia cu abscisa, se objine valoarea -tiKy Doin punctul de vedere al determintsii experimentale a 1oi Ky $i Vga Feprezentarea tui 1, fn funetie de 1/1$} este avaniajoas’, numairul de probe necesare pentru obfinerea dr (i deci a tui V,,. $i Ky) fiind mult mai mic in compatafe cu nurndnul de probe necesare objinerié hiperboted. Pe de alt& parte, ecoafia lui Lineweaver gi Burk este extrem de utilt in studit de inkibigic a activitgii enzimetor prin compust chimici. Fig. 1.15. Roprezentarea grafic& vatial Lineweaver- Burk, NZIMELOR 1.88, INHIBITIA ACTIVITATH B Activitatea multor enzime este inbibatt de compusi chimici diversi; in sistemele vii asemenea compusi pot fide origine endogentt (de exemplu diferi metaboliti) sau de ‘origine exogen’ (cum sunt agengii toxici sau uncle medicameite). Inhibifia enzimetor poate fi reversibild ireversibilt, aceasta din unm numindu-se si inactivare, In ambele cazuri inhibiforul se Teag’ de enz m8, dar in timp ce in inhibitia ireversibila legatura enzima-inhibitor este putemica (covalent), in inhibigia reversibila legttura este ska 92Un exempt de inhibitie ireversibili este oferit de acjiunea iodacetamidei asugra cenzimelor care an in centrul activ 0 grupare - SH; are loc reactia: Enz—CH,~SH+—CH,—CONH, ——» Enz—CH, SCH, —CONH, + HI — CH, ~ CONH, este complet inactiv (nu poate fixa Complexul Enz — CH = substratul) ‘Tot grupliriie SH din centrete active pot fi blocate si cu acidul paraclormercuribenzoic {n timp ce grupaile hidroxil din centrele active (cum este cazul tripsinei) sunt blocate de inhibiforul di-izopropilftuorofostat. Se cunose doa variante majore de inhibitie reversibit 4) Inhibigia competitive, produst de inhibitori care se Ieag’ tot ta nivelul centrului activ al enzimei, dar prin legdturi slabe, fn cazul prezengei simultane in mediu (sat in Celule) a substratuiui si inhibitorului, intre acestia are loc o competifie penima fixarea pe encima. La 0 capacitate egal de legare fa nivelul centrului activ a substratulu: si inhibitorului, enzima va fixa acesti competitor’ in raport cu concentrapile lor. Inhibitorit ‘competitivi sunt compusi cu structur8 apropiatt de cea a substratulu. Evenimentete care au foe pot fi reprezentate simplifi \ eI {In acest tip de inhibitie, partea din enzima aflatd sub forma complexului EI poate fi ‘ecuperatt dact fn mediu apare un exces de substrat (datortt reversibilithé E +1 + BD). recizarea ci: un nuit compas este inhibitor compeaitiv pentru o enim’ dat se face tn ‘mod simpla; se traseazi dreapta I/v, in functie de 1/fS} pentru prezenta in media a tui E si S i apoi acocasi dreapt pentru prezenja in media 2 E, S gi. bn ulm cav se remarcto pant crescutf a dreptei, intersecia cu ordonata nefiind modiicatt. Valorile intersecfei prelungitit Areptei cu abscisa gi panta dreptei sunt modificae cu coeficiental 1 + {IVK,, mde Ky are semmificajie asemanditoare Ini K,, da pentru eacfia tui E cu T (Fig. 1.16). ele?) “| Fig. 1.16, Reprezentarea graticd a ecuatei Lineweaver-Burk In cazulinhibiisl competitive. Ist 83Prinze numeroasele inhibit competitive cunoscute sint si urmtoarele: Succinat dehidrogenaza, enzima ce catalizeazt transfornarea acidului succinic in acid fumaric, este inhibatt de acizit dicarboxilici malonic, malic si chiar oxalic. cook cooH coc I I | coon on, CH Hon | i i | cooH cH, coon ot i cooH coctt acid succinic acid materi acid aie acid oxalic Un numair de medicamente targ ulizate f5i datorexzt efectele faptului c& sunt inhibitori competitivi, De exemplu, sulfanilamida, cea mai simpla sulfamida, este asemnitoare structural cu. acidul paraaminobenzoic pe care il poate inlocui in cursul sintezei acidului folic de catre bacteri (vezi vitamine si ccenzime); cum acidul folic este indispensabil bacteriitor, acestea mor (la om nu se intimpll acest Iucru deoarece el ia din hhran’tacidul folic) nn <_-coor w-€_ soon Aacid para-aminobenzoic Sulfarilamida in chimicterapia cancerului se utilizeaz analogi structurali ai bazelor purinice. si pirimidinice; ei inhiba sinteza de acizi nucleici impiedicand diviziunea celulara care este ‘malt mai rapid a tumor. b) Inhibitia necompetitiva; in acest caz inhibitorul, a clrui structur poate si difere destul de mult de structura substratului, se leag’ prin legaturi slabe in alt loc decAt central activ al enzimei, Afinitatea pentru substrat a enzimei pare a nu fi modificatt, Exist inst posibilitatea ca o parte din ES cit si EI si formeze complex ESI; transformarea lui $ din acest complex in P este sc¥uti in raport cu transformarea lui S din ES, deci atat v, clit si Via Sunt mai mic. Inhibifia necompetitiva depinde numai de concentraia inhibitorului (Gi de afinitatea enzimei pentru el) deoarece subsiratul in exces mu il poate deplasa pe acesta, E+P t yey E ES| ——» E14? (putin el acd se studiaza cinetica unei asemenea react, reprezentarea 1/v, in functie de 1/{S] | conduce le 0 dreapti a c&rei prelungire intersecteazt abscisa in acelasi punct cu dreapta | obfinuti fara inhibitor (deci Valoarea Ky, nu este modificara); in schimb, sunt modificate | intersecfia cu ordonata si pania (Fig. 11.17). 94Fig. 1.47. Renrezentarea gra- fied a ocuaiet Lineweaver- Eurk fn cazul inhilal necompettive Excmple sunt unele enzime care conjin grupari SH libere in alte pozitii decdt centrul activ. Aceste grupiri pot fixa prin legituri slabe ioni ai unor metale grele cum sunt Ag” si Hg’ care diminut sau chiar anuleaz’ capacitatea enzimelor de a transforroa substratcle in produsi. Aga se explict efectul oteivitor al multor metale grete. IL9 REGLAREA BIOSINTEZEI §1 ACTIVITATH ENZIMELOR 119.1. ASPECTE GENERALE insusici cum sunt capacitatea catalitick deosebitA, specificitatea, inhibarea prin diversi compusi etc, se stidiazd in detaliu urmarind comportarea enzimelor extrase, purificate 5 dizolvace in mediu apos; tn aceste condifi, atunci cfind se studiaza acjiunea unui anmumit factor, de exemphu a unui inhibitor, ceil parametrit cum sunt temperatura, pHt-ul, concentra cxzime si substratlu,prezenjin limitsle necesare a cofatorilor t., se mergin ia valorile dorite (de regula cele optime). Si poniru enzimele care gi desfisoarl actvitatea in organismele vii, o parte dine factor mentionaji se menfn la valori constant sau vafiaxS th limite restrdnss. Apar tousi relaiv frecvent si sini deosebite; nue acestea varaile mari in timp ale concentrlii substratului (de exemplu a glucidelor, ipidelor si proeincor tn tracul digestiv) si acurnalerea pe limite a produgor final a cllor metaboice sunt cele mai frecvente. Se mengine in astel de situa in celole, organe sau organismal intreg o concentragie stafionarX si 0 activitae constant a tuturor enzimelor? Réspunsul Ja aceastlintrebare a venit mai inti din studivl unor provese metabovice la organismete simple (hacterif) la care s-au remarcat, functie de condifile create in ‘mediu, cresleri gi sctderi in limite foarte mari ale cantitiyii unor enzime, sau, in alte cazuri, variafii Insemnate ale activitagii cnzimelor. Aceste variafii cantitative saw 98calitative, vonsituie de fapt modality de regtare care sunt alributal biocataizatorlor Prin intermedi reatilorcatalizate de astfet de enzime (lar $1 prin prezenga sau absent cofactorilo, a inhibitertor ete.) hacterite ist mengin hemcosttzia fn raport et: mediat exiem, Pe bara cunostingelor actual, se poate afirma ch gi in organismele supericare toate procesele care aso baz molecular sunt reglale prin enzime; fa ceste organise datorita specialiari celulelor gi organelor, pe de part, sia funcfci integrate, pe de alt parte, reglajul canitativ say calitatv al enzimelor ta un anumit nivel poate avea cow Ja nivelal organisrnaluiinireg, fo afara condor mengionate (exces sau lips de substrat, exces de prose) se mengioneaza aici e8 aefianea horonilor se xealizea final prin intermediul unor envime de reglaj specializate (veri captolul .Hormoni") Jn cele ce urmeact se prezinskreglarea cantitiii ensimelor-(pe scurt) si cele dow ‘ariante majore de reghre a ativitiiienzimelor: reglarcaalosteried si wezlarea covalent 1.92 REGLAREA CANTITATH ENZIMELOR Cantitatea oricarei proteine din organism, deci gi a exzimelor, rezulel din dinami proceselor de biosinteza si degradare, Viteza de schinb (tumoverul proteinelor) exprimat prin timpul de injumatatire, Ty, este foarte variats (vezi .Metabolismul proteinelor si al aminoacizilor”). Se slie cd proteinele se sintetizeaz’i die uminoacizis pe de alti parte, produsii de degradare ai proteinelor sunt, de asemenea, arrinoacizii, Se poate scrie rela: Aminoaci == Proteine (enzime) K unde K, este o constant yeneralé a procesului de sintez iar K, este 0 constant a procesului de degradare Dependent de valorile celor dou constante generale se disting situaile: K.>K, K,=K, — concentrajie stajionars eral concentrajie crescutt a enzime: K.< Ky concentric sclizut’ a enzimet Majoritatea enzimelor au K, = Ky ele se numese enzime constitutive. Ericimele la care K,> K, se mumese inductibile, cele la care K, < K, se namese represibile. Se face pre- izavea cl inducia sau represia sintezei enzimelor nu au carscier permanent sic kao aceeasi envi india sintezei allemeazt cu epresiaacestea in furctie de necestiile de manent. Inductia sintezei se resirdnge de regul lao singur encima dintr-o cale metabolic& (de ex. inducfia prin subst a 5-aminolevulinatsintetazei, ALAS, in calea biosintezei hemului). Existd situapii de inductie simultand a mai multor enzime: de exemplu, inductia enzimetor hepatice iustrata prin aceea ca la o diet bogat in proteine, in decurs de 1-2 zile sunt sintetizate cantitati mari de enzime din ciile metabolice de degradare ale aminoacizilor si din gluconeogenez’. Schimband dieta in una bogati in glucide, sinteza enzimelor mengionite este represald $i ste indus sinteza enzimelor din calea glicolitich ete. 96Represia sintezei enzimetor se face de reguli prin intermediul sor compusi cu molecukt mich, numigi corepresori; ei actioneazt sub forma de complexe cu pro cine specializate numite aporepresori, Mecanismele inductiet si represiei sintezei enzimelor, bine cunoseute in prezent, Au pot fi infelese decal in contextual mai larg al mecanismului biosintezei proteinelor Soordonat de avizi nuckeci, Aceste aspecte. sunt trate in capitoiul ,Biosinteza proteinelor™. 1L9.3. REGLAREA ALOSTERICA A ACTIVITATI ENZIMELOR {n subcapitolulreferitor la cinetica reactor catalizate de enzime s-a menfionat c& pentru ‘ele dint acestea curba variatici Iai v, tn funcfie de [$} are un aspect sigmoidal (Fig, 1118) Viteza micl a reactiei a inceput urmata de cresterea marcat la concentrafii mai mari ale substratului, sunt rezultatul unor mecanisme particulare de acfiune a enzimelor ce catalizeaza aceste react. Hotirdtoare pentru elucidarea acestor mecanisme au fost cercetiile efectuate de 3, Monod, .P. Changeux si F. Jacob, in anit 60, asupra reglirii activitit unor enzime bbacteriene, S-a constalat de exemply c& in biosinteza L-izcleucinet din L-treonind (care censt din cinci react catalizate de tot alitea enzime), L-izoleucina in exces inhibit itreaga cale ‘metabolic. Nu sunt inst inhale tate enzimete ci doar prima dintre ele, Ltrconin-dchidrazza, a calalizenza transformarea L-treonine! in c-cetobutirat + amoniac (Fig. 1.19), v% ay, = i(S) penta: 1 onda setae o Set pemotep: 2 ena alent ments posse: 5 enaind astro Poga o — I cH GH L-treonin. a cotobutirat ag no-G-n sehidatars thie —+ —+—> > H-C-cHe H-G-NHe cago cooH ' . ceed ene L- izoleuciné Fig. 11.19. Inhibarea activitiii Letreonin-dehidratazei de cttre Lrizoleucina aflatt in exces, a4 Bir ofe coe > oe z id Ele pHs oEty pte. 5 (*) fd) | Fig. 1.20, Modularea activiaiit enzimelor alosterice: (a) inhib int-o cale metabolica linear’; (0) inhibi tn cale metabalicé cu ramiicafi (6) sctivare prin substrat; (¢) feed-forward stimula Studiind si alte chi de biosiniexs, Monod si colaboratorii au fost in misurd st gencralizeze ch produsul final, acumulat peste necesitiile de moment, devine inhibitor al enzimei care catatizeaza prima sau una din primele rescfi ale sirului celor implicate {in biosinteza sa Fig. 1.20.2), in cazul cAilor metabolice cu ramificatit, produsii finali sunt inhibitori ai enzimetor care catalizeazi reactiile de la nivelul ramificafilor; deseori, fiecare dintre produsii finali inhib gi activitatea primei enzime (Fig, 11.20.b). Monod sicolaboratorii au denumit acest tip de inhibijie,inhibigie prin produs final, inhibifie feedback sau retroinhibifi; enzimele inhibate s-au denumit enzime alosterice ir inhibitor, inhibitor alosterici sau modulatori (efectori) negativi. Au fost identificate si enzime alosterice a ctor activitate creste tn prezenta unor compugi care au fost numifi activatori alosterici sau modulatori pozitivi, Asemenea modulatori pot fi substraul (care activeaz prima enzimt) (Fig. 11.20.c), unul dinire intermediari care activeaz3 o enzim’ aflat’ in continuarea cdi metabolice (Ieed-forward stimulare) (Fig. 1.20.0), diferi utilizeazt i activator sau hibito. 98, alji compusi, AtSturi de denumirile deja enumerate se iceea de efectori alosterici tn legatur’ cu totalitatea compusilor cu rolPentru cele mai multe enzime alosterice exist allt modulatori pozitivi cat si negetiv Modulatorit intensificd sau scad activitatea enzimelor ca urmare a fixteii lor pe acestea. Locurile de fixare sunt distincte pentru modulatorii pozitivi gi cei negativ si altele dectt centrul activ. De aici denumirile de enzime alosterice, inhibitori alostrici (allo = alt loc). Exist in prezent mai multe argumente, bazate pe cercetiri experimentale, privind locurile distincte de fixare pe enzime a activatorilor si inhibitorilor de acest tip. Astfl, ‘s-au realizat ,desensibilizir™ ale unor enzime alosterice prin actiuni fizice sau chimice: pHL-uri extreme, enzime proteotitice, ureea, temperaturi scizute sau erescute, unele rodiafi: s-au reatizat astfel de modele experimentale incat s& fie afectate numa Tocurle de legare ale modulatorilor nu si centrul activ. in alte experienge s~a putut proteja centrul activ de acjiunea unor agenti denaturafi prin intermediul modalatorilor. Si alte insuyiri ale enzimetor alosterice, a reactilor catalizate de ele, precum si a conditilor in care se desfigoaré aceste reacfii au importan(& pentru cunoaslerea fie a mecanismului de acfiune, fie a rolului de reglatori a calor metabolice. Intre acestea se citeaz”: = din punct de vedere structural, aproape toate enzimele alosterice sunt oligomer, de reguld cu numer par de monomeri: doi (mai rat), patru, sase ete. + reacfile catalizate de aceste enzime au AG" negativ, sunt deci exergonice gi ‘reversible; ele impriima sensul unic al cailor metabolice din care fac pare; situarea chiar | inceputul cdi metabolice a acestor reacfiiasiguri nu numai un control al intensitiii ci, dar si imposibititatea parcurgerii ei in sens invers, ceea ce se traduce prio ‘cconomicitate maxim’; = compusii chimici cu rol reglator a enzimelor alosterice (efectorii) sunt prezenti permanent (rareori doar intermitent) fa locul de acjiune al acestor enzime; variazt Joar concentrafa lor, ‘Mecanismele (modele) propuse pentru explicarea, cu respectarea datelor experimentale aritate, a aefiuni enzimelor alosterice au fost numeroase, Dintre acestea s-au impus dows ‘modelul concertat (simettic) imaginat de Monod, Wyman si Changeux (modelul MWC) si modelul seevenfial propas de Koshland, Nemethy gi Filmer (modelul KNF). Cele dow’i modele au citeva efemente comune: 4, fiecare monomer al oligomerului are centrul su activ; ’b, monomerii ,coopereazai” in fixarea substratului si deci in desftigurarea proces catalitic, Prin cooperare se injelege ci la fixarea substratului monomeri se influenfexza. De exemplu un monomer care a fixat substratul mareste capacitatea de fixare a acestuia de etre ceilalti monomeri (Cooperare poritiva); fixarea substratului de citre un monomer poate avea ca efect diminuares capacitigi de fixare a lui de citre ceilalji monomeri (cooperate negativa). Cooperate acestea se fac numa prin intermediul centrelor active ale monomerilor (deci centre de acelasi tip); ele sunt de tip homotrop. Dac avem inst ‘in vedere cele aritate antetior $i anume cX enzimele alosterice sunt controlate §: de modulatori (care se leagt in alte pozitii decat substratnl) interactia se face si Ia nivelul locusurilor pe care se leagt modulatorii; astfel de interacyii se numesc de tip heterocop; cele mai multe enzime alosterice sunt de tip mixt, homotrop-heterorop; c. interactiunile intre monomeri in oligomer, ait in cazul efectului homotrop cAt si a celui heterotrop, nu implick modificiri profunde (formare sau rupere de legtturi covalente) ci doar modificiri conformagionale, De aceea reglarea alosteric’ se face cu consum minim de energie. 99)