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1. Introduccin
La etimologa de la palabra cromatografa es curiosa. Por las palabras griegas que la
forman significara: escritura en colores.
El botnico ruso Mikhail S. Tsvet formaliz el uso de la cromatografa en los estudios
cientficos -por el ao 1910-, dio ese nombre a la tcnica y la aplic a la separacin de
los pigmentos naturales que se encuentran en las plantas (conocidos como
carotenoides y clorofilas).
Tsvet empac material adsorbente en una columna de vidrio vertical (de unos cuantos
centmetros de dimetro). Posteriormente, por dicha columna vertical verti una
disolucin que contena la mezcla de pigmentos provenientes de las hojas molidas de
una planta. Pasados unos minutos, el material empacado en la columna haba
adquirido una coloracin diferente por segmentos. Es decir, se haba logrado la
separacin de los pigmentos naturales de la planta. En cada segmento de color
definido haba un pigmento diferente.
Como su nombre indica las tcnicas de separacin sirven para separar componentes de
una muestra.
Desde el punto de vista de la caracterizacin de los materiales, conocer la composicin
de los mismos es imprescindible puesto que las propiedades de los materiales dependen
fundamentalmente, por un lado, de los componentes que lo forman y, por otro, de la
proporcin existente entre ellos.
Otra de las aplicaciones importantes en cromatografa es realizar el seguimiento de una
sntesis que podra ir asociada a la preparacin de un material (una polimerizacin por
ejemplo). A medida que se produce la reaccin en el matraz de reaccin tendremos
productos y reactivos, cuya proporcin ir variando en funcin de la conversin.
Es importante notar que, en general, las tcnicas de separacin slo sirven para eso,
separar, y que no nos dan ninguna otra informacin acerca de la naturaleza de los
componentes separados, de ah que en la mayora de los casos estas tcnicas o mtodos
de separacin vayan acompaados de otros mtodos de anlisis (composicional y/o de
grupos) con el fin de identificar y en algunos casos cuantificar los componentes de la
muestra separados.
En los primeros aos de la Qumica, la mayor parte de los anlisis se realizaban
separando los componentes de inters de una muestra mediante precipitacin,
extraccin o destilacin. Estos mtodos clsicos para la separacin todava se utilizan en
muchos laboratorios. Sin embargo, su grado de aplicacin general est disminuyendo
con el paso del tiempo y estn empezando a ser reemplazados por mtodos de
separacin cromatogrficos.
Muestra
NO
SI
Es soluble?
Es voltil?
NO
Descompone
trmicamente?
NO Forma
plasma?
SI
SI
NO
SI
SI
Cromatografa
Digestin
SI
SI
SI
GAS
Otros
mtodos
NO
DISOLUCIN
SI
NO
NO
j) Soluto
Trmino que se refiere a los componentes de la muestra en la cromatografa de reparto.
k) Disolvente
Trmino que en ocasiones se refiere a la fase estacionaria lquida en la cromatografa de
reparto.
Nota: En la cromatografa lquida, el trmino "disolvente" se ha usado a menudo para la
fase mvil. Este uso no se recomienda.
l) Zona
Regin del lecho cromatogrfico donde se localizan uno o ms componentes de la
muestra. Se puede usar para ello tambin el trmino banda.
m) Cromatograma
Una grfica u otro tipo de presentacin de la respuesta de un detector (la concentracin
de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentracin en
el efluente) frente al volumen de efluente o al tiempo. En la cromatografa plana,
"cromatograma" puede referirse al papel o capa con las zonas separadas.
n) Cromatografiar
Separar por cromatografa.
o) Cromatgrafo
El instrumento empleado para realizar una separacin cromatogrfica.
Kd =
fases es su lmite de exclusin que se define como la masa molecular a partir de la cual
los compuestos pasarn a travs del lecho estacionario sin experimentar retencin.
Molculas pequeas
Molculas grandes
Disolvente
Figura 2.1.- Esquema del proceso de separacin por cromatografa de exclusin por
tamaos.
3.1.4. Cromatografa de Intercambio Inico
La separacin se basa principalmente en la diferente afinidad para el intercambio de
iones de los componentes de la muestra (Figura 2.2). Actualmente, cuando se lleva a
cabo sobre columnas de partculas pequeas y elevada eficiencia, y empleando
habitualmente detectores conductimtricos o espectroscpicos, se denomina
cromatografa de iones (IC).
La cromatografa de intercambio inico se realiza sobre matrices que tienen una carga
neta (positiva en el esquema de la Figura2.2). La carga de la matriz de la columna as
como la carga de las molculas depender del pH del disolvente y de su fuerza inica
(proporcional a la concentracin de iones). En unas condiciones determinadas sern
retenidas en la columna las molculas o especies que tengan una carga complementaria
a la de la matriz del gel (las molculas cargadas negativamente sern retenidas por una
matriz cargada positivamente), siendo eluidas las restantes. Para eluir las molculas
retenidas se puede variar la carga inica del disolvente o su pH de forma que se alcance
el punto isoelctrico de la molculas o especies de inters o el de la matriz,
neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las molculas en la columna.
Especies positivas
+ - +
+
+
+
+ +
+
+
- +
+
+
- +
+
+ +
+
+
Especies negativas
Partculas slidas (matriz)
cargada positivamente
Pared de columna
cromatogrfica
Disolvente
Fase Mvil
Figura 2.3.- Anlisis por desarrollo. Esquema de sistema para hacer cromatografa en
capa fina.
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Fase Mvil
Cromatograma
Sorbente
Placa Porosa
Efluente
Figura 2.4.- Esquema de dispositivo para realizar cromatografa con anlisis por
elucin.
Es la tcnica ms utilizada en casi todas las separaciones cromatogrficas analticas y en
muchas preparativas.
3.2.3. Anlisis frontal (cromatografa frontal)
Procedimiento en el que la muestra (lquida o gasesosa) se alimenta de forma continua
al lecho cromatogrfico. No se utiliza ninguna fase mvil adicional. Se utiliza la
diferencia de afinidad del adsorbente por cada una de las sustancias a separar. Se utiliza
una pequea columna, que se satura sucesivamente por cada una de las sustancias a
separar, emergiendo de ella el primer componente puro hasta que la columna se satura
del segundo componente, momento en el que empezar a emerger ste mezclado con el
primero. El anlisis frontal tiene su principal aplicacin como tcnica preparativa en la
purificacin de sustancias.
Fase Mvil
Con la muestra A+B+C
A+B+
C
A+B
A
Placa Porosa
Efluente
Figura 2.5.-
3.2.4.
Cromatografa Plana
3.4.1.
Tcnicas cromatogrficas
Anlisis Isocrtico
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Cromatografa Bidimensional
En la Figura 2.6 se muestran los parmetros de retencin para el caso de una nica
banda cromatogrfica. Se observa que el tiempo de retencin de la banda puede
dividirse en dos partes: i) el tiempo muerto, tM; ii) y el tiempo transcurrido a partir de
este momento hasta la aparicin del mximo de la banda, tR.
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K'=
t'R t R t M
=
tM
tM
(2.1)
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t
n= R
(2.2)
As, el nmero de platos tericos de una columna puede calcularse utilizando la anchura
de uno de sus picos, normalmente el ltimo que pueda medirse directamente sobre el
cromatograma (Figuras 2.7 y 2.8) utilizando las expresiones:
t
n = 16 R
Wb
(2.3)
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t
n = 5.545 R
Wh
(2.4)
L
n
(2.5)
t 'R 2
=
t ' R1
-
(2.6)
La resolucin, Rs, definida como el cociente de la distancia entre los centros de las
dos bandas y el valor medio de la anchura de las mismas.
Rs =
2t
Wb1 + Wb 2
(2.7)
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Figura 2.9.- Esquema de una columna de gravedad (Figura tomada de: ALBELLA,
J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introduccin a la ciencia
de materiales". C.S.I.C., 1993).
La capacidad de separacin de las columnas de gravedad no es muy grande ya que su
eficacia se encuentra limitada por el tamao de las partculas de la fase estacionaria que
debe ser bastante alto (70-230 mallas ASTM) para permitir un caudal razonable de la
fase mvil. La cantidad de fase estacionaria y el tamao de la columna tambin limitan
su capacidad de separacin. Como norma general, se utilizan de 20 a 30g de fase
estacionaria por gramo de mezcla a separar, pudindose llegar hasta relaciones de 100:1
para separaciones especialmente difciles. La relacin entre el dimetro y la longitud de
la columna es tambin importante, ya que columnas demasiado cortas no
proporcionarn espacio suficiente para lograr la separacin. En general, las relaciones
longitud/dimetro para este tipo de columnas deben oscilar entre 8:1 y 10:1.
Las columnas de gravedad operan normalmente por elucin, y el control del contenido
de la fase eluida se realiza en la prctica recogiendo un gran nmero de pequeas
fracciones que se analizan por medio de alguna otra tcnica, normalmente cromatografa
de capa fina.
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Las fases estacionarias utilizadas normalmente para cromatografa en capa fina son,
almina o gel de slice para cromatografa de adsorcin y, celulosa para cromatografa
de adsorcin o de reparto.
En la cromatografa en capa fina, se utiliza normalmente el anlisis por desarrollo. El
proceso se lleva a cabo en recipientes cerrados, por ascensin del disolvente, debiendo
colocarse en el interior del recipiente cubriendo una de sus paredes una capa de papel de
filtro impregnado en la fase mvil (disolvente) para conseguir una atmsfera saturada en
ella. Una vez desarrollada la placa, la visualizacin de los cromatogramas se realiza,
caso de no tratarse de compuestos coloreados, mediante iluminacin con luz
ultravioleta, si la fase estacionaria lleva un indicador de fluorescencia, o bien mediante
pulverizado de la placa con reveladores de carcter general (yodo, cido sulfrico, etc.)
si se quieren visualizar nicamente compuestos de un tipo determinado.
La cromatografa en capa fina puede utilizarse para separaciones analticas o
preparativas:
i) Aplicaciones analticas. Las muestras se aplican en forma de manchas circulares
sobre uno de los extremos de la placa. Tras el desarrollo, la identificacin de cada
componente de la mezcla se realiza midiendo el desplazamiento relativo de cada
mancha en la placa respecto a un compuesto patrn o al frente del disolvente,
definindose para cada banda sus valores Rx o Rf respectivamente (Figura 2.10)
como:
Rx =
(2.8)
Rf =
(2.9)
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Adecuada sensibilidad
Buena estabilidad y reproducibilidad
Una respuesta lineal para los componentes que se extienda a varios rdenes de
magnitud
Intervalo trmico de trabajo (25 400)C
Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal
Alta fiabilidad y manejo sencillo
Respuesta semejante para todos los componentes
No destructivo
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Simple
Amplio rango dinmico lineal (~ 105)
Respuesta universal (especies orgnicas e inorgnicas)
Carcter no destructivo
Sensibilidad relativamente baja (~ 10-8 g de soluto/ml de gas portador)
c) DETECTOR TERMOINICO
El detector termoinico (TID) es un detector selectivo de los compuestos orgnicos que
contienen fsforo y nitrgeno. En este caso el efluente de la columna se mezcla con
hidrgeno, pasa a travs de una llama y se quema. El gas caliente fluye alrededor de una
bola de silicato de rubidio calentada elctricamente, la cual se mantiene a unos 180 V
con respecto al colector. La bola caliente forma un plasma que alcanza una temperatura
de 600 a 800 C. Lo que ocurre exactamente en el plasma, que hace que se produzcan
inslitamente una gran cantidad de iones a partir de las molculas que contienen fsforo
o nitrgeno, realmente no est bien establecido, pero el resultado es una gran corriente
de iones, la cual se utiliza para la determinacin de compuestos que contienen P y N.
d) DETECTOR DE CAPTURA DE ELECTRONES
El detector de captura de electrones (ECD) opera casi de la misma forma que un
contador proporcional para la medida de radiacin X. En este caso el efluente de la
columna pasa sobre un emisor , como niquel-63 o tritio (adsorbido sobre lmina de
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platino o titanio). Un e- del emisor provoca la ionizacin del gas portador (con
frecuencia N2) y la produccin de una rfaga de e-. De este proceso de ionizacin, en
ausencia de especies orgnicas, resulta una corriente constante entre un par de
electrodos. Sin embargo, la corriente disminuye en presencia de molculas orgnicas
que tiendan a capturar electrones.
Este detector es de respuesta selectiva, siendo sensible a grupos funcionales
electronegativos: halgenos, perxidos, quinonas y grupos nitro. En cambio, no es
sensible a aminas, alcoholes e hidrocarburos.
e) DETECTOR DE EMISIN ATMICA
En este dispositivo el eluyente se introduce en un plasma de helio obtenido con
microondas que se acopla a un espectrmetro de emisin con series de diodos. El
plasma es suficientemente energtico como para atomizar todos los elementos de una
muestra, excitarlos y as obtener sus espectros de emisin caractersticos.
5.1.2. Acoplamiento de la cromatografa de gases con mtodos espectroscpicos
La cromatografa de gases a menudo se combina con otras tcnicas selectivas de anlisis
como la espectroscopia y la electroqumica. Los mtodos de anlisis que resultan se
denominan mtodos acoplados y proporcionan unas potentes herramientas para la
identificacin de los componentes de una mezcla compleja.
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La Figura 2.13 pone de manifiesto que los distintos procedimientos que utilizan la
cromatografa de lquidos tienden a ser complementarios por lo que a sus campos de
aplicacin se refiere. As, para solutos con masas moleculares superiores a 10000, a
menudo se utiliza la cromatografa de exclusin, aunque ahora tambin es posible tratar
estos compuestos con cromatografa de reparto de fase inversa. Para especies inicas de
baja masa molecular, se utiliza con frecuencia la cromatografa de intercambio inico.
Los mtodos de reparto se aplican a las especies polares pero no inicas. Adems, este
procedimiento se utiliza muchas veces para la separacin de los integrantes de una serie
homloga. La cromatografa de adsorcin se elige con frecuencia para separar especies
no polares, ismeros estructurales y grupos de compuestos como, por ejemplo, los
hidrocarburos alifticos de los alcoholes alifticos.
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8.- Bibliografa
1. D.A. Skoog, J.J. Leary, Anlisis Instrumental, McGraw-Hill, Madrid (1996)
2.
H.H. Willard, L.L. Merritt Jr.,J.A. Dean, F.A. Settle Jr., Mtodos
Instrumentales de anlisis, Grupo Editorial Iberoamericana S.A. de C.V.,
Mxico (1991).
Sons (1992).
Cromatografa de gases
http://www.uib.es/depart/dqu/dquo/pau/Cromatograf%92a/chrom10/chrom/GC/concept/
main.htm
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm
http://ciencias.ucv.cl/micro/croma/cro1.htm
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