Practica 11

Test inmunoenzimatico
1) Objetivo
Entender el concepto de test inmunoenzimatico o
enzimoinmunoanalisis
Aplicar la tcnica inmunoenzimatica para determinacin de
anticuerpos contra agentes infecciones como tripanosoma cruzi.
2) Fundamento
El Test ELISA para Chagas III es un ensayo inmunoenzimtico en
fase slida para la deteccin cualitativa de anticuerpos contra T.
cruzi. Se realiza en placas cuyos pocillos han sido activados con
extractos totales de las cepas de T. cruzi Tulahun y Mn (6),
incluyendo antgenos de membrana altamente inmunognicos. El
recubrimiento de los pocillos se realiza mediante una novedosa
tecnologa consistente en la utilizacin de un adhesivo biolgico
que facilita la inmovilizacin de los antgenos y aumenta la
estabilidad de la placa activada (7). Si las muestras analizadas
contienen anticuerpos especficos para T. cruzi, stos formarn un
complejo estable con los antgenos que recubren los pocillos. El
material unido en forma inespecfica ser eliminado por medio del
lavado. Durante la incubacin con el conjugado, los anticuerpos
anti-IgG humanas marcados con peroxidasa se unirn al complejo
formado. Finalmente, en la etapa de incubacin con el sustrato
cromognico, la peroxidasa unida al complejo producir una
coloracin que permitir detectar las muestras reactivas para T.
cruzi. La reaccin enzimtica se detendr por la adicin de cido
sulfrico, midindose luego la intensidad del color en un lector
colorimtrico para placas de ELISA.
3) Procedimiento
1
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2
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3
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4
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5

Antes de comenzar el ensayo, permita que los reactivos alcancen temperatura ambiente.
Diluya la solucin de lavado 25X con agua destilada o desionizada. Si va a utilizar una tira de 8
pocillos, prepare 50 mL de solucin de lavado tomando 2 mL de la solucin 25X y agregando 48
mL de agua. La solucin diluida es estable por dos semanas almacenada a 4C.
Ponga en el soporte los pocillos correspondientes al nmero de muestras a analizar. Incluya dos
pocillos para el control positivo y dos para el control negativo.
Agregue a cada pocillo 200 L de diluyente de muestra.
Agregue 20 L de cada muestra o control. Al agregar las muestras, el diluyente de muestra virar

de color de acuerdo a la Tabla II.

Tabla II: viraje del color del diluyente de muestra.

Tipo de muestra
Sin muestra
Suero o plasma
Color
Violeta
Azul

Advertencia

6.
7.

Control positivo
Turquesa

Control negativo
Verde

: Muestras hemolizadas o turbias alterarn el color final sin afectar el

resultado.
El cambio de color es proporcional al volumen de muestra agregado.
Un viraje de menor intensidad, indicar que se dispens un volumen
inferior o que la muestra no se encuentra en las condiciones
adecuadas.

Selle la placa con el autoadhesivo provisto, para impedir la evaporacin de los reactivos, e incube
por 30 minutos a 37 1C.
Saque el adhesivo y lave la placa. Para sto elimine el contenido y agregue a cada pocillo 350 L
de solucin de
lavado diluida. Elimine la solucin y repita esta operacin 4 veces ms.
Protocolo recomendado para lavador automtico de tiras:
Realice cinco ciclos de lavado dispensando 350 L de la Solucin de Lavado diluida.
Asegrese cuando sea posible que:
a) el pocillo se llene con la Solucin de Lavado.
b)

la Solucin de Lavado no rebalse en ningn momento.

c)
d)

el tiempo de remojo sea 30 segundos.

no quede lquido remanente en los pocillos al final del lavado. Para esto se recomienda, si es
posible, realizar un aspirado cruzado (crosswise) en el ltimo paso.

Nota : siempre mantenga limpio el equipo enjuagando con abundante agua

destilada al final de cada jornada de trabajo.
Realice un mantenimiento peridico de acuerdo a las instrucciones de
su proveedor.

8.

Despus de lavar invierta la placa y golpela suavemente sobre papel absorbente para eliminar
cualquier exceso de lquido en los pocillos. Si la base de los pocillos se moja, limpie con papel
absorbente para evitar la formacin de precipitados que podran interferir con la lectura.

Advertencia : No permita que la placa se seque.

9.

Tome slo el volumen de conjugado que va a utilizar y depostelo en un recipiente limpio. Agregue
100 L de conjugado a cada pocillo.

Advertencia : No pipetee el conjugado directamente del frasco original.

No devuelva el conjugado sobrante al frasco original.

10.
11.
12.
13.

Tome slo el volumen de conjugado que va a utilizar y depostelo en un recipiente limpio. Agregue
100 L de conjugado a cada pocillo.
Lave de manera similar a lo descrito en los puntos 7 y 8.
Agregue 100 L de sustrato a cada pocillo e incube la placa en oscuridad durante 30 minutos a
temperatura ambiente.
Detenga la reaccin agregando 100 L de Solucin de Detencin a cada pocillo.

4) Resultados
5) Conclusin
Logramos entender el concepto del test inmunoenzimatico
aplicando la tcnica Elisa para determinar anticuerpos contra
agentes infecciosos enzimticos
6) Cuestionario
1. Qu aplicacin tiene los test inmunoenzimaticos?
El uso de la tcnica inmunoenzimtica Enzyme- Linked
Immunosorbent Assay (ELISA) est ampliamente difundido
para el diagnstico serolgico de las enfermedades.
El ensayo inmunoenzimtico ELISA se basa en el uso de
antgenos o de anticuerpos marcados con una enzima, de forma
que los conjugados resultantes tengan actividad tanto
inmunolgica como enzimtica pudiendo ser revelada mediante
la adicin de un substrato especfico que, en contacto con la
enzima, producir un color observable a simple vista y
cuantificable por un lector de Densidad ptica.
2. Explique que es la lnea de corte o cut off?
Ley de corte o cut-off: Es la concentracin mnima que debe
tener un elemento en un yacimiento para ser explotable, es
decir, la concentracin que hace posible pagar los costes de su
extraccin, tratamiento y comercializacin. Es un factor que
depende a su vez de otros factores, que pueden no tener nada
que ver con la naturaleza del yacimiento, como por ejemplo
pueden ser su proximidad o lejana a vas de transporte,
avances tecnolgicos en la extraccin, etc.
3. Qu es el western blotting?
El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada
para detectar protenas especficas en una muestra
determinada (una mezcla compleja de protenas, como un

extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan

las protenas atendiendo al criterio que se desee: peso
molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas
posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son
transferidas a una membrana adsorbente (tpicamente de
nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la protena de
inters con anticuerpos especficos contra ella. Finalmente, se
detecta la unin antgeno-anticuerpo por actividad enzimtica,
fluorescencia entre otros mtodos. De esta forma se puede
estudiar la presencia de la protena en el extracto y analizar su
cantidad relativa respecto a otras protenas.
Esta tcnica es hoy en da imprescindible en varios campos de
la biologa, como la biologa molecular, la bioqumica, la
biotecnologa o la inmunologa. Existe toda una industria
especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y
policlonales) contra decenas de miles de protenas diferentes.
El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George
Stark, en la Universidad de Stanford. El nombre (Western,
occidental en ingls) le fue dado por W. Neal Burnette,y
consiste en un juego de palabras con una tcnica anloga pero
que usa DNA, el Southern (sureo) blot, que en este caso debe
su nombre a su descubridor, Edwin Southern. Otras tcnicas
que fueron nombradas siguiendo este criterio son el Northern
blot (en el que se separa e identifica RNA), el Eastern blot, el
Southwestern blot.
4. Qu caractersticas deben tener las enzimas utilizadas
en los ELISAS?
Debe ser econmica y obtenerse con un alto grado de pureza
Elevada actividad especfica
Estable en condiciones de almacenamiento y prueba
Soluble, Sencilla, sensible y medible con gran rapidez
No debe estar presente en el medio analizado
Sustratos inhibidores no deben interferir con el ensayo
No perder actividad cuando se conjuga
Debe conservar la actividad en condiciones de ensayo
5. Qu es el conjugado en el test de Elisa y que
caractersticas debe tener?
Anti-inmunoglobulinas humanas (cabra) conjugada con
peroxidasa

6. Qu caractersticas debe tener un sustrato?

Para el monitoreo serolgico rutinario de bandadas, se sugiere
recolectar al azar al menos 30 ms sueros por bandada a
intervalos estndar de tiempo (cada 4 semanas). Se requieren
procedimientos adecuados de recoleccin de muestras, de
recoleccin de sueros y de almacenamiento de muestras
sricas (4C por hasta 4 das a 20C para periodos ms
largos) con el fin de obtener resultados confiables. Para lograr
una mayor especificidad y para minimizar reacciones posibles
de falsos positivos, deben excluirse de la prueba las muestras
de suero que estn contaminada con bacterias o que estn muy
grasas.
7. Qu ventajas y desventajas ofrecen los test rpidos o
test inmunocromatogrficos?
La inmunocromatografa es una de las tcnicas de
inmunodiagnstico ms modernas cuyas principales ventajas
son la sencillez y rapidez del test. Cada vez son ms las
aplicaciones de esta tcnica, como test de campo debido a que
no es necesario reactivos ni instrumentacin adicional, como en
el campo clnico. Pueden dar falsos negativos o resultar
invlidos.

7) Bibliografa
http://www.bionote.co.kr/File/Upload/2011/04/08/2011-04-08.pdf
http://www.vircell.com/productos/tests_rapidos/?tx_gtkvircell_pi1%5Buid
%5D=82
7&cHash=7fbf8aca497ca5fc07f59e06c674651e
http://www.fundacionio.org/docs/cursos/emergentes_granada_malaria.pdf