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Autor:
Dra. Deysi Marrero Carralero
Coautores:
Ing. Doralvis Colom Rodrguez
Dr. Leonel Rodrguez Rodrguez
Ao 2006
INDICE
1. Introduccin
2. Aislamiento e identificacin de las bacterias ms frecuentes aisladas en el
laboratorio.
3. Identificacin de cocos Grampositivos
4. Identificacin de cocos Gramnegativos
5. Identificacin de Bacilos Gramnegativos
6. Anexos
7. Bibliografa
Introduccin
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION BACTERIANA.
El aislamiento de los microorganismos, presentes en las muestras biolgicas,
suele indicar que se trate del agente causal de la enfermedad infecciosa que
se est investigando y se lleva a cabo, utilizando medios de cultivo slido
contenido en una placa de Petri, siguiendo la tcnica de la siembra por estra
en la superficie.
Los medios de cultivo que se van a usar dependen del tipo de muestra y de los
microorganismos presentes en ella. De esta manera pueden emplearse medios
nutritivos generales, medios selectivos, medios diferenciales o bien medios
enriquecidos. Los medios ms usados en el laboratorio, comprenden el de agar
sangre de carnero 5%, agar MacConkey, agar nutritivo. Otro de los medios de
cultivo recomendados a utilizar con este fin es el agar CLED, se trata de un
medio diferencial que contiene lactosa y un indicador de pH (azul de bromotimol)
que permite observar la fermentacin cida del azcar, por el viraje del indicador
de pH, de color verde a amarillo. Su dficit en electrolitos impide la invasin de
la placa por microorganismos mviles, como son las especies del gnero
Proteus, facilitando as su aislamiento y posterior identificacin.
Para la identificacin de los distintos microorganismos aislados se realizarn
pruebas bioqumicas, fisiolgicas y serolgicas.
Estos procedimientos nos permiten aplicar tcnicas de siembra por estra en el
medio, obtener cultivos puros del microorganismo y luego proceder a la
identificacin de cada uno de los aislados clnicos.
Material.
Asa bacteriolgica, cultivo mixto de bacterias, placas de agar CLED, agar
sangre de carnero 5%, agar MacConkey y agar nutritivo. Dependiendo del
microorganismo a identificar, se necesitarn otros medios de cultivo y reactivos,
que se indican en cada procedimiento.
Procedimiento.
Si despus de efectuar la inoculacin de las muestras obtenemos cultivos mixtos
tenemos que realizar subcultivos, con el objetivo de obtener la bacteria en cultivo
puro. Seleccionamos colonias caractersticas y la inoculamos mediante estras,
en la superficie del medio, como el CLED o de otros medios, como agar sangre
de carnero 5%, agar MacConkey, de acuerdo a cada caso. Posteriormente se
colocan las placas en la incubadora, en posicin invertida a 37 C durante 24-48
horas.
Al cabo de este tiempo, se observarn en las placas los tipos de colonias que
han crecido en la superficie del medio y se anotarn las caractersticas ms
importantes que puedan ser tiles en una identificacin preliminar, en el libro de
trabajo.
Prueba de la catalasa.
Esta prueba detecta la presencia de enzimas catalasa capaces de convertir el
perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora
de los microorganismos aerbicos y anaerbicos facultativos que contienen
citocromo, excluyendo los estreptococos.
Material
Perxido de Hidrgeno 3%, cultivo bacteriano y portaobjetos.
Procedimiento
Tomar de la superficie de una colonia con un aplicador de madera y transferirla a
una lmina portaobjetos, depositar sobre ella una o dos gotas de Perxido de
Hidrgeno al 3%.
Interpretacin
La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida
con desprendimiento de burbujas, la enzima catalasa convierte el perxido de
hidrgeno en agua y oxgeno molecular. Esta prueba se emplea para diferenciar
Prueba PYR.
2. IDENTIFICACIN DE COCOS GRAMNEGATIVOS.
Si tenemos un cultivo que corresponda con cocos Gramnegativos se realizar la
prueba de la catalasa y oxidasa; ambas son positivas en el caso del gnero
Neisseria (Ver Gua para Neisseria) y Moraxella. La identificacin se completara
entonces mediante pruebas bioqumicas, principalmente de fermentacin de
azcares.
Fermentacin de glucosa.
Se aprecia en el cambio a amarillo del indicador de pH (rojo de fenol)
nicamente en la parte inferior del tubo. Esto es debido a la pequea proporcin
de glucosa que existe en el medio (0,1%), que al ser fermentada en el fondo del
tubo, donde existen condiciones de anaerobiosis, produce suficiente cido para
que cambie el indicador, pero no a medida que nos aproximemos a la superficie,
donde las condiciones son ms aerbicas, all la bacteria respira y la produccin
de cido es menor, permaneciendo esa zona de color rojo. Si el microorganismo
sembrado no fermenta la glucosa con produccin de cidos, todo el tubo toma
una coloracin roja. Incluso, una vez que la glucosa ha sido degradada la
bacteria comienza a utilizar los aminocidos, liberndose aminas, que elevan el
pH, por lo que el color rojo puede ser ms intenso.
Fermentacin de lactosa.
Se pone de manifiesto por el cambio a amarillo del indicador, tanto en el fondo
del tubo como en la superficie. La concentracin de lactosa es diez veces mayor
que la de glucosa, con lo que la produccin de cido formado es tan elevada que
hace cambiar el indicador en todo el tubo. El hecho de que la fermentacin de
lactosa enmascare la de la glucosa no tiene importancia, ya que para que una
bacteria fermente lactosa debe ser capaz de fermentar glucosa. Si la bacteria no
es capaz de fermentar la lactosa, una vez que la glucosa ha sido degradada,
como ya se ha comentado, la bacteria comienza a utilizar los aminocidos,
liberndose aminas, que neutralizan la pequea cantidad de cidos presentes en
la porcin inclinada del medio y elevan el pH. Por lo tanto, la zona inclinada del
tubo aparecer de color rojo intenso y el fondo de color amarillo debido a la
fermentacin previa de la glucosa.
Produccin de gas.
La produccin de gas en la fermentacin se manifiesta por la aparicin de
burbujas, rotura o elevacin del agar del fondo del tubo.
Produccin de SH2.
Reduccin de nitratos.
La reduccin de nitratos a nitritos es una caracterstica propia de varios
microorganismos que utilizan nitrato como aceptor final de electrones en la
respiracin anaerbica. Esta prueba es til en la identificacin de
microorganismos pertenecientes a las enterobacterias aunque tambin sirve
para identificar otros microorganismos.
Material
Un tubo con caldo nitratado, cultivo bacteriano, solucin de - naftilamina (A) y
solucin de cido sulfanlico (B).
Procedimiento
Inocular el medio lquido de nitrato con un asa de cultivo puro del
microorganismo, e incubar a 37C durante 18-24 horas. Pasado ese tiempo,
aadir al cultivo 1 ml de solucin de - naftilamina (reactivo A) y un ml de cido
sulfanlico (Reactivo B).
Interpretacin
El desarrollo de una coloracin roja en el medio de cultivo, tras la adicin de los
reactivos, pone de manifiesto la presencia de nitritos y por tanto la prueba de
reduccin de nitratos se considera positiva. Si no se desarrolla color, la prueba
puede considerarse negativa (no se han reducido los nitratos) o bien se han
reducido originando otros compuestos (amonaco, nitrgeno molecular, xido
ntrico u xido nitroso) por lo que la lectura se corresponde con un falso
negativo. En este caso se puede aadir al medio de cultivo una pequea
cantidad de polvo de zinc, que reduce los nitratos del medio a nitritos. El
desarrollo de un color rojo, indica la existencia de nitratos en el medio y confirma
que la reaccin es negativa.
Produccin de indol/movilidad.
El indol es uno de los productos de degradacin del metabolismo del aminocido
triptfano. La presencia de la enzima triptofanasa en la bacteria provoca la
hidrlisis del triptfano y su desaminacin, produciendo indol, cido pirvico y
amonaco.
Material
Medio de cultivo para produccin de indol/movilidad, cultivo bacteriano y reactivo
de Ehrlich.
Procedimiento
Movilidad.
Es otra caracterstica til en la identificacin de los microorganismos. Se puede
llevar a cabo observando el crecimiento en el medio semislido.
Material
Aguja de siembra, medio semislido (agar movilidad/indol), y cultivo bacteriano.
Procedimiento
Sembrar, por picadura, con la aguja de siembra en medio semislido, incubando
a 37C durante 48 horas.
Interpretacin
La baja concentracin de agar de este medio permite que las bacterias se
desplacen, si son mviles. Por ello, observando si el crecimiento est slo en la
picadura o se extiende a los lados de ella, se puede determinar si el
microorganismo es inmvil o mvil.
Citrato.
Algunos microorganismos utilizan el citrato presente en el medio de cultivo como
nica fuente de carbono, esta caracterstica es importante en la identificacin de
microorganismos pertenecientes a las enterobacterias.
Material
Un tubo con medio de Citrato de Simmons y cultivo bacteriano.
Procedimiento
Sembrar en la superficie inclinada del medio e incubar a 37C durante 24-48
horas.
Interpretacin
En caso positivo, el medio de cultivo cambia de color verde a azul. Si el
microorganismo utiliza el citrato como fuente de carbono, tambin utiliza las
sales de amonio como fuente de nitrgeno, con produccin de amonaco, lo que
da lugar a una alcalinizacin del medio. Esto se pone de manifiesto por un viraje
del indicador de pH azul de bromotimol, de verde a azul intenso, a la vez que se
observa crecimiento en la superficie.
Produccin de Ureasa.
La ureasa es una enzima presente en algunos microorganismos como Klebsiella,
Enterobacter y Proteus. Esta enzima es capaz dehidrolisar la urea, con
produccin de dixido de carbono y amonio, lo que causa una alcalinizacin del
medio.
Material
Un tubo con agar urea de Christensen y cultivo bacteriano.
Procedimiento
Inocular el medio de cultivo mediante estra en superficie e incubar a 37C
durante 24 horas.
Interpretacin
Los microorganismos que hidrolizan la urea hacen que el medio de cultivo tome
color fucsia, debido a la alcalinizacin del mismo por produccin de amonio a
partir de la urea, que se pone de manifiesto por un cambio del indicador de pH
(rojo de fenol).
Prueba de Voges-Proskauer.
Consiste en comprobar si el microorganismo estudiado fermenta la glucosa
siguiendo la va butilngliclica, detectando un producto intermedio en la
reaccin que es el acetil-metil-carbinol o acetona.
Material
Un tubo de medio de caldo de RM-VP, cultivo bacteriano, solucin de -naftol e
Hidrxido de Potasio (o Hidrxido de sodio al 40%) .
Procedimiento
Inocular el medio lquido con el cultivo puro del microorganismo e incubar a 37C
durante 24-48 horas. Despus de la incubacin, transferir 1 ml del cultivo a un
tubo estril y se aade 0,6 ml de -naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Es
necesario adicionar los reactivos en ese orden. Agitar el tubo cuidadosamente
para exponer el medio al oxigeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 a 15
minutos.
Interpretacin
El desarrollo de un color rosa en el tubo, transcurridos 10 a15 minutos desde la
adicin de los reactivos, indica que la prueba es positiva, es decir, que la
acetona se ha oxidado pasando a diacetilo. No debe leerse despus de 1 hora,
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ya que los cultivos negativos pueden mostrar un color cobrizo y dar un falso
positivo.
Desaminacin de la fenilalanina.
Esta prueba es til para la diferenciacin inicial de las especies de Proteus y
Providencia de otros bacilos Granmnegativos (Enterobacterias). Slo los
miembros de estos gneros poseen la enzima responsable de la desaminacin
oxidativa de la fenilalanina. La fenilalanina es un aminocido cuya desaminacin
por medio de una desaminasa, da lugar a la formacin de amonaco y de cido
fenilpirvico, el cual puede detectarse por la adicin de un reactivo.
Material
Un tubo de medio agar fenilalanina, cultivo bacteriano y solucin de cloruro
frrico al 10%.
Procedimiento
Sembrar el microorganismo en la superficie del medio agar fenilalanina inclinado
e incubar a 37C durante 24 horas. Transcurrido este tiempo aadir 4 5 gotas
de la solucin de cloruro frrico directamente sobre la superficie del agar, rotar
el tubo para desprender el cultivo de la superficie.
Interpretacin
La prueba se considera positiva cuando aparece una coloracin verde intensa.
Esto se debe a que las bacterias que poseen fenilalanina desaminasa,
transforman el aminocido en cido fenilpirvico, que da reaccin coloreada con
el cloruro frrico.
Descarboxilacin
Arginina).
de
los
aminocidos
(Lisina, Ornitina
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Cubrir ambos tubos con aceite mineral estril (1cm de espesor) e incubar a 35
C por 18 a 24 horas.
Interpretacin
El desarrollo de un color amarillo en el tubo control indica que el organismo es
viable y que el pH del medio ha disminuido lo suficiente como para activar las
descarboxilasas. El retorno al color azul prpura del tubo que contiene el
aminocido indica una reaccin positiva debida a la liberacin de aminas por
descarboxilacin.
Utilizacin de la glucosa
Oxidativa: (Pseudomonas utiliza la glucosa por va oxidativa) (ver Gua para
BNF).
Fermentativa: ( Vibrio por va fermentativa (ver Gua para Vibrionceas).
Incapacidad de utilizar glucosa por las dos vas: es una caracterstica
importante de Alcaligenes, alcaliniza el medio (ver Gua para BNF).
Interpretacin de las pruebas de identificacin de bacilos Gram negativos
fermentadores o no de la glucosa.
Una vez realizadas todas las pruebas determinar el gnero con ayuda de los
flujogramas:
Estafilococos. Flujograma 1
Estreptococo. Flujograma 2
Enterococo. Flujograma 3
Enterobacterias. Flujograma 4
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Sthaphylococcus.
Los estafilococos son cocos grampositivos que se agrupan en racimos. La
especie S. aureus es la de mayor patogenicidad reconocida por su capacidad
de producir enzimas extracelulares y toxinas. La enzima coagulasa permite
diferenciar esta especie del resto de estafilococos de inters mdico, como S.
epidermidis y S. saprophyticus. ( Ver flujograma1).
Especies: Existen 30 especies, las tres de ms importancia clnica son S.
aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus.
Clasificacin:
Staphylococcus coagulasa positiva: Staphylococcus aureus
Staphylococcus coagulasa negativos (SCN):
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus
Staphylococcus haemolyticus
Staphylococcus lugdunensis
Staphylococcus schleiferi
Staphylococcus intermedius
Staphylococcus hycus
Staphylococcus capitis
Caractersticas generales.
Son clulas esfricas (cocos) grampositivas, que se agrupan de forma irregular,
formando racimos de uva. Tambin pueden observarse aislados, en cadenas
cortas y en pares. No son mviles, ni forman esporas. Son anaerobios
facultativos y catalasa positiva.
Cultivo: Crecen bien en los medios no selectivos como agar sangre de carnero,
agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5% a temperatura de 37 C, en 18 a
24 horas, formando colonias redondas, lisas, elevadas, algunas son beta
hemolticas y otras son pigmentadas, con variaciones desde color gris, blanco
hasta amarillo intenso.
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Streptococcus.
Los estreptococos son cocos grampositivos que se disponen en cadenas o
parejas. Al cultivarlos en agar sangre producen una serie de colonias con
diferentes tipos de hemlisis lo que permite unido a su estructura antignica,
sus propiedades fenotpicas y nutricionales establecer una clasificacin. Las
especies de mayor significacin en enfermedad en el hombre son: S pyogenes,
relacionado con faringoamigdalitis, sinusitis, otitis media, fiebre escarlatina,
imptigo, erisipela, celulitis y secuelas tardas, inmunolgicas; S. agalactiae
que produce infecciones neonatales y S. pneumoniae que causa neumona y
meningitis. El grupo viridans con importancia en patologa bucal.
Los estreptococos forman parte de la flora normal y otros se relacionan con
diferentes enfermedades. La identificacin precisa de estas infecciones es
muy importante tanto para erradicarlas como para prevenir sus secuelas. (Ver
flujograma 2).
Clasificacin:
Streptococcus pyogenes (Estreptococo hemoltico del grupo A). Son
hemolticos y susceptibles a la Bacitracina y producen hidrlisis
del1Lpirrolidonil- -naftilamida (PYR positivos).
Streptococcus agalactiae (Estreptococo hemoltico del grupo B). Son
hemolticos y susceptibles a la optoquina, hidrolizan el hipurato de sodio,
factor CAMP positivos y la mayora Bacitracina negativos.
Streptococcus equisimilis (Estreptococo hemoltico del grupo C).
Estreptococo hemoltico del grupo C y G. Son hemolticos, sensibles al
disco de trimethoprim-sulfametoxazol (SXT), resistentes a Bacitracina,
CAMP negativos.
Streptococcus pneumoniae (Neumococo). Son hemolticos, sensibles a
la optoquina, solubles en bilis y en sales biliares.
Streptococcus viridans.son hemolticos.
Caractersticas generales. (Ver flujograma 2)
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Enterococcus.
Los enterococos anteriormente pertenecan a los estreptococos, desde el ao
1984 han sido clasificados dentro del gnero Enterococcus. Constituyen un
numeroso grupo bacteriano que forma parte de la flora normal del intestino del
hombre y de animales, de las vas respiratorias superiores, cavidad oral, tracto
genitourinario. Hoy en da es considerado como un patgeno emergente y se
ha relacionado con infecciones nosocomiales, bacteriemias, infecciones de
heridas quirrgicas y del tracto urinario. (Ver flujograma 3).
Clasificacin:
Enterococcus faecalis. Es la especie tipo.
Enterococcus faecium.
E. avium
E. gallinarum y otros.
Caractersticas generales. (Ver flujograma 3)
Son cocos grampositivos que se disponen de forma irregular, sueltos, en
cadenas o parejas, en medios lquidos. No poseen cpsulas ni forman esporas.
Son inmviles, anaerobios facultativos y catalasa negativa.
Cultivo: Crecen bien en medios como agar sangre de carnero 5%, agar soyatripticasa con sangre de carnero 5% a temperatura de 37 C en 18 a 24 horas,
forman colonias ms grandes que las de estreptococos del grupo A, menos
opacas y a veces blanca brillantes como las de estafilococos, pueden ser, o
hemolticos con excepcin de algunas especies que pueden ser hemolticos.
Pueden crecer a temperaturas entre 10 y 45 C y tolerar hasta 60 C, y a un
pH 9,6. Adems crecen en presencia de 6,5% de cloruro de sodio e hidrolizan
la Bilis-Esculina y producen hidrlisis del L-pirrolidonil- -naftilamida (PYR
positivos). (ver flujograma para clasificar en gnero y especie).
Muestras biolgicas: Pueden ser aislados de sangre para Hemocultivos, LCR,
punta de catter, lesiones de piel y tejidos blandos, orina, exudado vaginal y
vulvar en nias, exudado tico, heridas quirrgicas y otras heridas, lceras.
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Enterobacterias.
Las enterobacterias son bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos,
oxidasa negativos, no esporulados, que fermentan y oxidan la glucosa y
reducen los nitratos a nitritos. Forman parte de la flora normal del intestino del
hombre y de animales y se encuentran ampliamente distribuidos en la
naturaleza. Pueden ser mviles, aunque hay especies inmviles como
Klebsiella y Shigella.
Estas bacterias se
relacionan con infecciones
nosocomiales y de la comunidad, son causa de infecciones intestinales y
extraintestinales como bacteriemias, infecciones de heridas quirrgicas y del
tracto urinario, neumona. (Ver flujograma 4).
Clasificacin: comprende ms de 25 gneros y cada uno est conformado por
una o ms especies bacterianas, de ellas slo unas 25 especies han sido
relacionadas con enfermedad infecciosa en el hombre. Las ms frecuentes en
nuestro medio son:
Salmonella entrica (aqui se encuentran todos los serotipos, ms de 2300).
Shigella (S. dysenteriae, S. sonnei, S. boydii y S. flexneri)
Escherichia coli
Yersinia enterocltica
Hafnia alvei
Citrobacter (C. diversus, C. amalonaticus, C. freundii)
Enterobacter (E. aerogenes, E. agglomerans, E. cloacae)
Proteus (P. mirabilis, P. vulgaris)
Edwarsiella tarda
Klebsiella (K. pneumoniae, K. oxytoca)
Morganella (M. morganii)
Providencia (P. rettgeri, P. stuartii)
Serratia (S. marcescens)
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Haemophilus
Este gnero esta conformado por varias especies, algunas forman parte de la
flora normal de la nasofaringe y otras son patgenas para el hombre y se
caracteriza por su morfologa, es un cocobacilo gramnegativo, pleomrfico,
anaerobio facultativo que requiere para su crecimiento de los factores V (NAD)
y X (hemina) de la sangre. La especie tipo es Haemophilus influenzae que
puede estar en la flora normal del tracto respiratorio superior, pero es patgeno
y responsable de infecciones como otitis media aguda supurada (OMA),
sinusitis, conjuntivitis, meningitis purulenta, celulitis, artritis. Presenta una
cpsula de polisacrido que permite la clasificacin en 6 serotipos: a, b, c, d, e
y f. Es ms frecuente en nios pequeos.
Caractersticas generales.
Su identificacin depende de la necesidad de los factores de crecimiento X y V,
Los que requieren solo de factor V no crecen en agar sangre, por lo que si se
utiliza este medio hay que inocular un microorganismo como el estafilococo y
segrega gran cantidad del factor V, entonces las colonias crecern alrededor de
la estra de ste (fenmeno de satelitismo).
Cultivo: Crecen en los medios agar sangre de carnero 5% (alrededor de la
estra de estafilococo), agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5%, agar
chocolate, Crecen en atmsfera de un 5 a 10% de CO2 y temperatura de 35 a
37 C en 18 a 24 horas. Forman colonias redondas, convexas, pequeas,
iridiscentes y con aspecto de roco sin pigmento y sin hemolisis, con olor
caracterstico. De acuerdo a las reacciones encontradas y siguiendo el
flujograma de trabajo se puede llegar al diagnstico de las especies.
Muestras biolgicas:
Exudados nasofarngeos, sangre, LCR, lquido articular, tico, exudado
conjuntival, La recoleccin de las muestras debe realizarse con cuidado y
enviarse de inmediato al laboratorio.
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Neisserias.
Las Neisserias son cocos gramnegativos que se agrupan en pares
(diplococos), arrionados, aerobios, oxidasa y catalasa positiva, no
esporulados. Forman parte de la flora normal de as vas respiratorias del
hombre. Dentro del gnero Neisseria se encuentran dos especies patgenas:
Clasificacin:
Neisseria meningitidis (Meningococo). Agente causal de meningitis y
septicemia.
Neisseria gonorrhoeae (Gonococo). Agente causal de Blenorragia o
gonorrea, enfermedad de transmisin sexual (ITS).
Caractersticas generales.
Son bacterias muy exigentes, slo se cultivan en medios enriquecidos, en
humedad elevada, atmsfera de un 5 a 10% de CO2 y temperatura de 35 a 37
C en 24 a 72 horas.
Cultivo: Crecen en los medios agar Mueller-Hinton, agar Thayer-Martin, agar
sangre de carnero 5%, agar soya-tripticasa con sangre de carnero 5%, agar
chocolate. Forman colonias mucoides, convexas, elevadas, de aspecto
transparente u opaco, sin pigmento y no son hemolticas. Algunas especies
producen pigmento amarillo verdoso. Los patrones para la diferenciacin en
especies se realiza mediante la fermentacin de carbohidratos. De acuerdo a
las reacciones encontradas y siguiendo el flujograma de trabajo (6) se puede
llegar al diagnstico de las especies.
Muestras biolgicas:
La recoleccin de las muestras debe realizarse con cuidado y enviarse de
inmediato al laboratorio.
Para gonococo: exudados de uretra, endocrvix, faringe, conjuntiva, recto,
lquido sinovial y sangre.
Para meningococo: sangre, LCR, aspirado de petequias, nasofarngeo (en
portadores) y esputo.
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