HPLC

h Performance Liquid Chromatogra

Kelompok KS-05

Kelas A

Hida Salmah Fajriati (051011175)

Mukhlis Bayu Irawan (051011177)
Aisyah Rohmaniyah (051011179)
Reza Devia Larasati (051011227)
Fajar Agung Nur A (051011233)
Oktaviana Eka D (051011235)
Ramadhani Fadiah (051011237)
Hartiningtyas (051011239)

Pengembangan dan validasi

metode HPLC untuk
penentuan simultan dari
rosiglitazone dan
glimepiride dalam bentuk
sediaan gabungan dan
plasma manusia

PENDAHULUAN
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)
adalah teknik kromatografi yang digunakan
untuk memisahkan campuran senyawa
dengan tujuan mengidentifikasi, mengukur
dan memurnikan masing-masing komponen
campuran. Untuk analisis Rosiglitazone dan
Glimepiride dalam bentuk sediaan
gabungan dan plasma manusia digunakan
RP-HPLC. RP-HPLC menggunakan fase
gerak polar dan fase diam non polar.

Roziglitazone

Rosiglitazone (nama dagang Avandia,

GlaxoSmithKline) adalah obat
antidiabetes di kelas thiazolidinedione
obat. Ia bekerja sebagai sensitizer insulin,
dengan mengikat reseptor PPAR dalam
sel-sel lemak dan membuat sel-sel lebih
responsif
terhadap
insulin.
Berat
Molekul
: 393.8877

Glimepiride

Glimepiride diindikasikan untuk

mengobati diabetes mellitus tipe
2, modus kerjanya adalah untuk
meningkatkan produksi insulin
oleh pankreas. Hal ini tidak
digunakan untuk diabetes tipe 1
karena pankreas tidak lagi
mampu
insulin.
Berat memproduksi
Molekul : 490.62

Beberapa tahun terakhir hanya ada

satu metode spektrofotometri yang
telah dilaporkan untuk penentuan atau
analisis Rosiglitazone dan Glimepiride,
tapi metode tersebut memiliki
sensitivitas yang rendah. Oleh karena
itu dilakukan pengembangan
sensitivitas metode HPLC dalam
penentuan Rosiglitazone dan
Glimepiride.

Kondisi dan Optimasi

Kromatograf
Pemilihan kolom
dilakukan percobaan menggunakan berbagai
kolom :
1. Symmetry C18 column (150 mm x 4.6 mm, 5
m particle size) menghasilkan peak yang
simetris dan resolusi tinggi.
2. Zorbax SB-Phenyl column (250 mm x 4.6 mm, 5
m particle size) resolusi rendah
3. Hypurity C8 column (250 mm x 4.6 mm, 5 m
particle size) sensitivitas rendah
Sehingga dipilih kolom pertama.

Komposisi Fase Gerak

Dilakukan modifikasi fase gerak
meliputi jenis dan rasio pelarut organik
yang digunakan, serta pengaruh pH.
Jenis pelarut organik
Pelarut
organik

peak

Metanol

Sangat
kecil dan
lebar

Waktu
retensi

rendah

Etanol

lama

Propanol

lama

Acetonit
ril

tajam

resolusi sensitif
tas

Tidak
terlalu
lama

rendah
rendah

rendah
tajam

 Rasio fase gerak

Dilakukan percobaan fase gerak
dengan berbagai konsentrasi
acetonitril 40-70% v/v.
Waktu retensi ROS dan GLM
rasio acetonitril.

dengan

Dari studi yang dilakukan diperoleh

pemisahan optimum pada rasio 60%
acetonitril.

 Pengaruh pH
Pengaruh pH fase gerak dalam waktu
retensi dan jumlah pelat teoritis untuk
larutan uji diteliti menggunakan fase
gerak dari 0,02 M buffer fosfat dengan
pH berkisar 2,6-6,0. Diketahui bahwa,
peningkatan pH akan meningkatkan
waktu retensi dari masing-masing ROS
dan GLM sampai dengan pH 5,0. Di
luar pH 5, waktu retensi menurun. Dari
grafik diketahui bahwa pada pH 5,0
jumlah pelat teoritis maksimum.

Kondisi HPLC

Metode analisis : LC-10A (Shimadzu, Kyoto, Jepang)

Detektor : detektor UV (SPD-10AV)
auto-injector : SIL-10 AXL
Pompa : LC-10
analisis : 235 nm
Run Time : 8 menit pada laju alir 1 ml menit-1
Elusi : Isokratik
Fase gerak : campuran asetonitril dan 0,02 M dapar
fosfat pH 5
(60: 40, V / V)
Kolom : Simetri C18 (150 mm x 4,6 mm id, 5 pM ukuran
partikel), Waters, Irlandia
Volume injeksi : 30 ml.

EKSPERIMENTAL

Bahan dan Reagen

BAHAN :
- Standar Rosiglitazone Maleat.
- Standar Glimepiride.
- Avandaryl tablet (dalam label
tertulis mengandung 4mg rosiglitazone
maleat dan 2mg glimepiride /tablet)
REAGEN :
- Acetonitril
- Dapar fosfat
Plasma manusia.

Larutan Standard
Timbang 20 mg masing-masing
Rosiglitazone, glimepiride dan nicardipine

Tambahkan metanol ad tanda

(200 g / mL)

Masukkan ke labu ukur 100 ml

LINIERITA
S

LOD &
LOQ

VALIDASI
METODE

AKURASI

PROSEDUR UJI LINEARITAS

Larutan standard diencerkan untuk mendapatkan
larutan dengan kadar Rosiglitazon 0,10 25 g /
mL, glimepirid 0,125-12,5 g / mL, dan Nicardipin
20 g / mL.
Dibuat persamaan regresi
Area vs Konsentrasi

LOD & LOQ

LOQ dan LOD dihitung menurut ICH
guidelines (ICH Topic Q2B
2004),dengan menggunakan
persamaan :
LOQ =10 Sa/b
LOD =3,3 Sa/b
Sa(standart deviasi)
b (slope)

LOD & LOQ

Nilai LOQ ditemukan sebesar
0,13g/ml untuk ROS dan 0,11 g/ml
untuk GLM. Dan masing- masing
mempunyai nilai LOD sebesar 0,04
g/ml.

UJI AKURASI
Analisis statistik hasil yang diperoleh
dengan menggunakan Student t-test
dan rasio varians F-test
mengungkapkan tidak ada perbedaan
yang signifikan antara kinerja dari dua
metode mengenai akurasi dan presisi,
masing-masing (Tabel 2).

Penerapan metode untuk analisis Avandaryl tablet

Timbang 10 tablet Avandaryl

Serbukkan (timbang berat serbuk total)

Timbang serbuk setara 20,0 mg Rosiglitazone dan 10 mg Glimepiride

Masukkan corong pisah

Ekstraksi dengan 30ml methanol (3X)

Ekstrak disaring dan dimasukkan ke labu ukur 100ml

Corong pisah dan kertas saring dicuci dengan methanol

Methanol ad tanda

Lakukan pengenceran sehingga

didapatkan kadar yang memenuhi
rentang persamaan regresi (Linieritas)
Suntikkan ke HPLC

Penerapan metode untuk plasma manusia

Plasma kosong ditambah larutan standar dari kedua obat untuk mencapai konsentrasi standar kalibrasi
0,1-0,25-0,5-0,75 dan 1,0 g / mL; untuk masing-masing Rosiglitazone dan Glimepiride pada
konsentrasi konstan Nicardipin (2 g mL-1)

1ml plasma manusia dengan konsentrasi obat yang meningkat dipindahkan ke dalam tabung sentrifus
Masing-masing tabung + 2ml Acetonitril
Vortex selama 5menit
Disentrifus dengan kecepatan 3500rpm selama 15menit pada suhu kamar
Supernatan tersebut diuapkan menggunakan gas nitrogen pada suhu 45 C
Sampel kering direkonstitusi dengan Acetonitril

Suntikkan 30l (3X replikasi)

Rasio luas puncak diplot versus konsentrasi obat dalam g mL-1

untuk mendapatkan grafik kalibrasi

APLIKASI PHARMACEUTICAL
Analisis bentuk sediaan
Aplikasi Biologi
Presisi metode yang diusulkan pada spiked
human plasma.

Analisis bentuk sediaan

Metode yang diusulkan selanjutnya
diterapkan pada penentuan obat di
tablet ko-formulasi. (hasilnya
ditampilkan di tabel).
Selektivitas metode diselidiki
dengan mengobservasi setiap
gangguan yang dihadapi dari eksipien
tablet yang umum, seperti pati,
magnesium stearat, laktosa, dan avisil.
Hal ini menunjukkan bahwa senyawa
ini tidak mengganggu hasil dari

Aplikasi Biologi
Sensitivitas yang tinggi dari metode yang
diusulkan memungkinkan penentuan rosiglitazone
dalam spiked human plasma. Ketersediaan hayati
absolut rosiglitazone adalah 99%.
Gangguan yang timbul dari asam amino
endogen telah diatasi dengan presipitasi sederhana
protein. Metode hanya melibatkan pengendapan
protein plasma sederhana dengan asetonitril
sebelum pengukuran.

Presisi metode yang diusulkan pada spiked

human plasma
Presisi dievaluasi melalui mereplikasi spiked human
plasma dengan konsentrasi ROS dan GLM yang berbeda
dalam satu hari (repeatibility). Rata-rata %recovery adalah
97,70 2,19 dan 98,10 2,62 untuk masing-masing ROS
dan GLM.
Presisi ditentukan dengan menganalisis konsentrasi yang
sama selama tiga hari berturut-turut (Intermediate
Precision). Persentase perolehan kembali rata-rata
berdasarkan rata-rata dari tiga penentuan terpisah adalah
97.19 2.05 dan 93.86 2.04 untuk masing-masing ROS
dan GLM.

KESIMPULAN
Metode HPLC yang dilakukansesuai untuk
analisis Rosiglitazone dan Glimepiride dalam
bentuk sediaan campuran. Metode ini
memiliki keuntungan dibandingkan dengan
metode lainnya dalam hal sensitivitas,
efisiensi waktu dan batas deteksi minimum.
Selain itu metode ini dapat diterapkan pada
penentuan kombinasi obat tersebut dalam
plasma manusia.

HASIL PRAKTIKUM

Kondisi HPLC
Kolom : Bondapak C 18
Fase mobil : Metanol Air (85:15)
Detektor : Spektrofotometer Diode
Array
( 287 nm)
Flow Rate : 1,5 ml /menit
Temperatur : 30C

Validasi Metode
Selektivitas
Linieritas
Akurasi & Presisi

Selektivitas
Harga Rs tidak dapat dihitung
karena pada waktu pengamatan pada
HPLC, peak Trimetoprim tidak tampak.

Linieritas
Baku Kerja

Kadar
Sulfametoksa
zol (ppm)

sulfametoksazol
Rt (min)

Area

99

1,865

3199,17603

II

148,5

1,870

4922,23340

III

198

1,880

6233,46973

IV

247,5

1,884

8252,52344

297

1,894

9628,42969

Persamaan regresi : y = bx + a
y = 32,7046x - 28,3525
r = 0,9982

Akurasi dan Presisi

% recovery : 45,38%
RSD : 86,55%
Tidak memenuhi persyaratan