6 Poglavlje - Sinteza I Obrada RNA

Poglavlje 6
1. Sinteza i obrada RNA

Gutter, str. 231:
Transkripcija u prokariota
Eukariotske RNA-polimeraze i transkripcijski faktori
Regulacija transkripcije u eukariota
Obrada i promet RNA
Kljuni pokus: Izolacija eukariotskih
transkripcijskih faktora
Kljuni pokus: Otkrie snRNPs
231
239
244
261
251
268
U 4. i 5. poglavlju razmatrana je organizacija i odravanje genomske DNA, koja bi se mogla

promatrati kao skup genetskih instrukcija to upravljaju svim staninim aktivnostima.
Instrukcije se prenose na RNA koja potom upravlja procesom sinteze proteina. Vano je
napomenuti da ponaanje stanice nije odreeno iskljuivo nasljeenim genima nego kako su ti
geni izraeni u neko odreeno vrijeme. Regulacija genske ekspresije omoguava stanicama
prilagodbu na promjene njihova okolia, a odgovorna je i za odreene aktivnosti viestruko
diferenciranih staninih vrsta koje ine vie biljke i ivotinje. Miine i jetrene stanice,
primjerice, sadre iste gene; funkcije tih stanica nisu odreene razlikama u njihovim
genomima, nego reguliranim nainom izraaja gena koji upravljaju razvojem i
diferencijacijom.
Prvi korak u ekspresiji gena, transkripcija DNA u RNA, primarni je nivo na kojemu se
regulira genska ekspresija i u prokariotskim i u eukariotskim stanicama. RNA molekule u
eukariotskim stanicama naknadno se mijenjaju na razliite naine primjerice, introni se
uklanjaju prekrajanjem ime se primarni transkript prevodi u svoj funkcionalni oblik.
Razliite vrste RNA imaju razliite uloge u stanicama. Glasnike RNA (mRNAs) slue kao
kalupi za sintezu proteina; ribosomalne RNA (rRNAs) i transportne RNA (tRNAs) djelatne su
u procesu translacije mRNA. Druge male RNA molekule slue regulaciji gena, prekrajanju
mRNA, obraivanju tRNA te razvrstavanju proteina u eukariota. U ovom poglavlju
razmatraju se transkripcija i obrada RNA. Krajnji korak u ekspresiji gena, translacija
glasnike RNA u protein, razmatra se u poglavlju 7.
1.1. Transkripcija u prokariota
Kao u veini podruja molekularne biologije, studije na E. coli osigurale su model za kasnija
istraivanja transkripcije u eukariotskim stanicama. Kako je reeno u poglavlju 3, mRNA je
prvotno otkrivena u E. coli. Takoer, E. coli je prvi organizam iz kojega je izolirana i
prouavana RNA-polimeraza. Osnovni mehanizmi pomou kojih je transkripcija regulirana
rasvijetljeni su na slian nain pionirskim pokusima na E. coli. U tim je pokusima pokazano
da regulirana genska ekspresija omoguava stanici da odgovori na promjene u okolini,
primjerice na nedostatak hranjivog sastojka. Razumijevanje transkripcije u E. coli omoguilo
je prouavanje mnogo sloenijih mehanizama koji reguliraju transkripciju u eukariotskim
stanicama.
1.1.1. RNA-polimeraza i transkripcija
Enzim odgovoran za sintezu RNA jest RNA-polimeraza koja katalizira polimerizaciju
ribonukleozid 5'-trifosfata (NTPs) usmjerenu kalupom DNA. Sinteza je RNA slina sintezi
DNA i slino DNA-polimerazi RNA-polimeraza katalizira rast RNA lanca uvijek u smjeru 5'
prema 3'. Meutim, za razliku od DNA-polimeraze, RNA-polimeraza ne treba pripremljenu
klicu za zapoinjanje (inicijaciju) sinteze RNA. Umjesto toga, transkripcija zapoinje de novo
www.perpetuum-lab.com
na specifinim mjestima na poetku gena. Proces zapoinjanja posebice je vaan jer je to

znaajan nivo na kojem se regulira transkripcija.
RNA-polimeraza, slino kao i DNA-polimeraza, sloen je enzim koji se sastoji od
vie polipeptidnih lanaca. Bakterijski enzim sastavljen je iz pet razliitih podjedinica,
nazvanih , , ', i (slika 6.1). podjedinica je relativno slabo vezana i moe se
razdvojiti od ostalih pet podjedinica, dajui sr enzima nainjenu od dvije , jedne , jedne '
i jedne podjedinice. Sr polimeraze potpuno je sposobna katalizirati polimerizaciju NTPs u
RNA, to ukazuje da podjedinica nije potrebna za osnovnu katalitiku aktivnost enzima.
Meutim, sr enzima ne moe se specifino vezati na sljedove DNA, to je pokazatelj
normalne inicijacije transkripcije, stoga je podjedinica potrebna za utvrivanje ispravnih
mjesta za zapoinjanje transkripcije. Izbor je tih mjesta kritini dio transkripcije, jer sinteza
funkcionalne RNA mora zapoeti na poetku gena.
Slijed DNA na koji se vee RNA-polimeraza kako bi zapoela transkripciju gena
naziva se promotor. Sljedovi DNA ukljueni u promotorsku funkciju najprije su utvreni
usporedbom nukleotidnih sljedova niza razliitih gena izoliranih iz E. coli. Usporedbe su
pokazale da podruja uzvodno od mjesta zapoinjanja transkripcije sadre dvije skupine
sljedova koje su sline u mnogim genima. Svaki od tih zajednikih sljedova sastoji se od est
nukleotida i smjeten je oko 10 i 35 baznih parova uzvodno od poetnog transkripcijskog
mjesta (slika 6.2). Oni se nazivaju -10 i -35 dijelovi, oznaavajui njihovu poziciju u odnosu
na poetno transkripcijsko mjesto koje je definirano kao +1. Sljedovi na -10 i -35 poziciji u
razliitim promotorima nisu jednaki, ali su svi dovoljno slini da postave usuglaeni slijed
najee naene baze na svakoj poziciji.
Nekoliko vrsta eksperimentalnih dokaza potvruju funkcionalnu vanost -10 i -35
promotorskih dijelova. Prvo, geni s promotorima koji se razlikuju od usuglaenih sljedova
transkribiraju se manje uinkovito od gena iji se promotori mnogo bolje podudaraju s
usuglaenim sljedovima. Drugo, mutacije uvedene bilo u -10 ili u -35 usuglaene sljedove
imaju jake uinke na promotorsku funkciju. Tree, mjesta na kojima se RNA-polimeraza vee
na promotore izravno su utvrena pokusima otiska stopala, koji se uobiajeno koriste za
utvrivanje mjesta na kojima se proteini veu na DNA (slika 6.3). U pokusima te vrste,
ulomak DNA radioaktivno je oznaen na jednom kraju. Oznaena DNA inkubira se s
proteinima koji se ispituju (primjerice RNA-polimeraza) i naknadno parcijalno ragrauje s
DNazom. Naelo je metode da su podruja DNA na koja se vezao protein zatiena od
razgradnje DNazom. Stoga se ta podruja mogu utvrditi usporedbom razgradnih produkata
DNA na koju su se vezali proteini s identinim paralelnim uzorkom DNA, koja nije bila
inkubirana s proteinima. Varijacije ove osnovne metode, koja koristi kemijske reagense za
modifikaciju i razgradnju DNA na odreenim nukleotidima, mogu se koristiti za utvrivanje
specifinih baza na DNA koje su u kontaktu s proteinom. Analiza otiska stopala pokazala je
da se RNA-polimeraza openito vee na promotore preko podruja od oko 60 baznih parova
koji se proteu od -40 do +20 ( od 40 nukleotida uzvodno do 20 nukleotida nizvodno od
poetnog transkripcijskog mjesta). Podjedinica specifino se vee na sljedove u oba -35 i
-10 promotorska podruja, potkrepljujui vanost tih sljedova u promotorskoj funkciji.
Dodatno, neki E. coli promotori imaju trei slijed smjeten uzvodno od -35 podruja koji je
specifian i vee slijed za -podjedinicu RNA-polimeraze.
U odsutnosti podjedinice, RNA-polimeraza vee se nespecifino na DNA s niskim
afinitetom. Uloga podjedinice sastoji se u upravljanju polimeraze k promotorima
specifinim vezivanjem na oba sljeda, -35 i -10, dovodei do zapoinjanja transkripcije na
poetcima gena (slika 6.4). Poetno vezivanje izmeu polimeraze i promotora nazvano je
zatvorenim promotorskim kompleksom budui da DNA nije odmotana. Polimeraza potom
odmotava 14 baza DNA, od -12 do +2, stvarajui otvoreni promotorski kompleks u kome
jednolanana DNA slui kao kalup za transkripciju. Transkripcija zapoinje povezivanjem

dva slobodna NTPs. Nakon dodatka prvih deset nukleotida, podjedinica oslobaa se s
polimeraze koja ostavlja promotor i kree se du kalupa DNA da bi nastavila produljenje
(elongaciju) rastueg lanca RNA.
Tijekom produljenja, polimeraza ostaje zdruena s kalupom nastavljajui sintezu
mRNA. Kako se ona kree du kalupa DNA, polimeraza odmotava kalup ispred sebe, a
smotava ga iza sebe, odravajui odmotano podruje od oko 15 baznih parova u dijelu koji se
transkribira. Visoko-rezolutna strukturna analiza bakterijske RNA-polimeraze ukazuje da i
' podjedinice tvore strukturu slinu rakovim tipaljkama koja vrsto dri DNA kalup (slika
6.5). Unutarnji lijeb izmeu i ' podjedinica moe smjestiti 20 baznih parova DNA i
sadri aktivno mjesto polimeraze.
Sinteza RNA nastavlja se sve dok polimeraza ne naie na terminacijski znak, na tom
se mjestu zaustavlja transkripcija, RNA se oslobaa s polimeraze, a enzim disocira s DNA
kalupa. Najjednostavniji i najei terminacijski signal u E. coli sastoji se od simetrino
obrnutog ponavljanja sljeda bogatog GC bazama iza kojega slijedi etiri ili vie A baza (slika
6.6). Transkripcija GC-bogatog obrnuto-simetrinog ponavljanja dovodi do stvaranja
segmenta RNA koji moe tvoriti stabilne strukture omine peteljke komplementarnim
sparivanjem baza. Nastanak takvih struktura u RNA, koje su same sebi komplementarne,
raskida asocijaciju RNA s DNA kalupom i zaustavlja transkripciju. S obzirom da su vodikovi
mostovi izmeu A i U slabiji nego izmeu G i C, prisutnost A baza nizvodno od obrnutoponavljajueg sljeda promie disocijaciju RNA s DNA kalupa. Druge vrste terminacijskih
signala, i u prokariotskim i u eukariotskim stanicama, prije ovise o vezivanju proteina koji
zaustavljaju transkripciju na specifinim sljedovima DNA, nego o nastanku strukture peteljke
ome u RNA.
1.1.2. Represori i negativna kontrola transkripcije
Pedesetih godina prolog stoljea Franois Jacob i Jacques Monod izveli su pionirska
istraivanja regulacije gena u E. coli. Ovi istraivai zajedno sa svojim suradnicima analizirali
su ekspresiju enzima djelatnih u metabolizmu laktoze iji se razgradni produkti, glukoza i
galaktoza, mogu koristiti kao izvor ugljika i energije (slika 6.7). Enzim koji katalizira
razgradnju laktoze (-galaktozidaza) kao i ostali enzimi djelatni u metabolizmu laktoze
eksprimirani su samo ako je laktoza na raspolaganju bakterijama.Inae, stanica je sposobna
racionalno gospodariti ne ulaui energiju u sintezu RNA i proteina koji joj nisu potrebni.
Tako laktoza inducira sintezu enzima koji sudjeluju u njenom vlastitom metabolizmu. Osim
-galaktozidaze za metabolizam laktoze potrebni su produkti dva druga gena koji su usko
povezani: permeaza koja transportira laktozu u stanicu i transacetilaza ija je zadaa
inaktivirati toksine tiogalaktozide koji se skupa s laktozom transportiraju u stanicu pomou
permeaze. Na osnovi istih genetikih pokusa, Jacob i Monod deducirali su mehanizam kojim
je regulirana ekspresija ovih gena, postavljajui model fundamentalan za razumijevanje
regulacije transkripcije.
Poetna toka u analizi bila je izolacija mutanti s defektnom regulacijom gena vanih
za metabolizam laktoze. Izolirane su dvije vrste mutanti: konstitutivne mutante koje
eksprimiraju sva tri gena i u odsutnosti laktoze i neinducibilne mutante koje ne eksprimiraju
ove gene ni u prisutnosti laktoze. Genetikim mapiranjem ovih mutanti lokalizirana su dva
odvojena mjesta, nazvana o i i smjetena neposredno uzvodno od strukturnog gena za galaktozidazu. Genske promjene (mutacije) koje pogaaju o dovode do konstitutivne
ekspresije, a mutacije vezane uz i ili do konstitutivne ili do neinducibilne ekspresije.
Funkcije ovih regulatornih gena ispitane su pokusima s dvije bakterijske loze, koje
meusobno isprepletene daju diploidne stanice to sadre gene oba roditelja (slika 6.8).
Analiza ekspresije gena u takvim diploidnim bakterijama dala je kritiki uvid i definirala koji
je alel regulatornih gena dominantan, a koji recesivan. Primjerice, ako se bakterije s

normalnim i genom (i+) isprepletu s bakterijama nositeljima mutacije u i genu, to ima za
posljedicu konstitutivnu ekspresiju (i mutacija), a nastale diploidne bakterije pokazuju
normalnu inducibilnost. Stoga je normalni i+ gen bio dominantan nad mutiranim i. Nasuprot
tome, prepletanje normalnih bakterija s bakterijama nositeljima oc mutacije (konstitutivna
ekspresija) daje diploide s konstitutivnom ekspresijom, ukazujui da je oc dominantan nad o+.
Dodatni pokusi u kojima su mutirani o i i kombinirani s razliitim mutacijama u strukturnim
genima pokazali su da o utjee na ekspresiju samo onih gena koji su fiziki povezani, dok i
utjee na ekspresiju gena na obje kromosomske kopije u diploidnim bakterijama. Tako, u
oc/o+ stanici, samo su strukturni geni povezani s oc konstitutivno eksprimirani. Nasuprot tome,
u i+/ i stanici, strukturni geni na oba kromosoma normalno su regulirani. Ti su rezultati doveli
do zakljuka da o predstavlja podruje DNA koje kontrolira transkripciju susjednih gena, a i
gen kodira regulatorni faktor (protein) koji moe difundirati kroz cijelu stanicu i kontrolirati
gene na oba kromosoma.
Model genske regulacije postavljen na temelju ovih pokusa ilustrira slika 6.9. Geni za
-galaktozidazu, permeazu i transacetilazu eksprimirani su kao jedna jedinica nazvana
operon. Transkripcija operona kontrolirana je genom o (operator) smjetenim u susjedstvu
poetnog mjesta transkripcije. Gen i kodira protein koji vezivanjem na operator kontrolira
transkripciju. S obzirom da su i mutante (to dovodi do konstitutivne ekspresije) recesivne,
zakljueno je da te mutante ne mogu stvarati funkcionalni genski produkt. Taj rezultat ukazuje
da je normalni produkt i gena represor koji sprjeava transkripciju vezivanjem na o.
Prisutnost laktoze izaziva indukciju operona jer se laktoza vee na represor, sprjeavajui tako
njegovo vezivanje na operatorsku DNA. U neinducibilnih i mutanti (koje su dominantne nad
i+), represor se ne vee na laktozu, pa se ni operon ne moe inducirati.
Model dostatno odgovara rezultatima genetikih pokusa iz kojih je postavljen. U i
stanicama, represor se ne stvara, tako da je lac operon konstitutivno eksprimiran. Diploidne
i+/ i stanice normalno su inducibilne, s obzirom da je funkcionalni represor kodiran i+alelom.
Konano, u oc mutanti ne postoji funkcionalni operator te stoga represor ne moe biti vezan.
Sukladno tome, oc mutante su dominantne, ali utjeu na ekspresiju samo onih strukturnih gena
koji su fiziki s njima povezani.
Mnogi pokusi potvrdili su ovaj temeljni model, ukljuujui i Walter Gilbertovu
izolaciju lac represora i analizu njegovog vezivanja na operatorsku DNA 60. godina prolog
stoljea. Molekularnom analizom definirana je operatorska DNA kao 20-tak baznih parova
DNA smjetenih nekoliko baza ispred inicijacijskog mjesta transkripcije. Analizom otiska
stopala identificirano je to podruje kao mjesto na koje se vee represor sprjeavajui
transkripciju tako to interferira s vezivanjem RNA-polimeraze na promotor. Kao to je
predvieno, laktoza se vee na represor sprjeavajui njegovo vezivanje na operatorsku DNA;
sprjeavanje vezivanja represora ima za posljedicu konstitutivnu ekspresiju gena.
Sredinji je princip regulacije gena, protumaen na primjeru laktoza operona, da je
kontrola transkripcije posredovana interakcijom regulatornih proteina sa specifinim
sljedovima DNA. Opi nain regulacije iroko je primjenjiv i kod prokariotskih i kod
eukariotskih stanica. Regulatorni sljedovi poput operatora nazivaju se cis-djelujui kontrolni
elementi, s obzirom da utjeu na ekspresiju samo onih gena koji su vezani na istu molekulu
DNA. S druge strane, proteini poput represora nazivaju se trans-djelujui initelji jer mogu
utjecati na ekspresiju gena smjetenih na drugim kromosomima u stanici. Lac operon je
primjer negativne kontrole, jer vezivanje represora sprjeava transkripciju. Meutim, to nije
uvijek sluaj; mnogi trans-djelujui initelji prije su aktivatori nego inhibitori transkripcije.
1.1.3. Pozitivna kontrola transkripcije
Najbolje istraen primjer pozitivne kontrole u E. coli jest utjecaj glukoze na ekspresiju gena
koji kodiraju enzime djelatne u razgradnji (katabolizmu) drugih eera (ukljuujui laktozu)
to predstavljaju alternativni izvor ugljika i energije. Prioritetno se koristi glukoza, tako dok
je glukoza na raspolaganju, enzimi djelatni u katabolizmu alternativnih izvora energije nisu
eksprimirani. Primjerice, ako E. coli raste u mediju koji sadri i glukozu i laktozu, lac operon
se ne inducira, a bakterije koriste samo glukozu. Tako glukoza gui lac operon ak i u
prisutnosti normalnog induktora (laktoza).
Danas je poznato da je represija glukozom (openito nazvano represija katabolitom)
posredovana pozitivnim kontrolnim sistemom, koji je povezan s razinom ciklikog AMP-a
(cAMP) (slika 6.10). Enzim adenil-ciklaza, koji prevodi ATP u cAMP, u bakterijama je
reguliran na nain da pad razine glukoze izaziva porast cAMP. cAMP se potom vee na
protein koji regulira transkripciju, nazvan kataboliki protein aktivator (CAP). Vezivanje
cAMP stimulira vezivanje CAP na ciljni DNA slijed, u lac operonu smjeten oko 60 baza
uzvodno od poetnog mjesta transkripcije. CAP zatim stupa u interakciju s podjedinicom
RNA-polimeraze, promiui vezivanje polimeraze na promotor i aktivirajui transkripciju.
1.2. Eukariotske RNA-polimeraze i transkripcijski faktori
Iako se transkripcija u svim stanicama odvija po istom temeljnom mehanizmu, u eukariotskim
stanicama taj je proces znatno sloeniji nego u bakterijama. To se zrcali u dvije izrazite razlike
izmeu prokariotskog i eukariotskog sustava. Prvo, dok se u bakterijama svi geni prepisuju
pomou jedne jedine RNA-polimeraze, eukariotske stanice sadre nekoliko razliitih RNApolimeraza koje prepisuju odreene skupine gena. Drugo, eukariotske RNA-polimeraze ne
vezuju se izravno na promotorske sljedove nego trebaju interakciju s nizom dodatnih proteina
da bi specifino zapoele transkripciju. To poveava sloenost eukariotske transkripcije,
posebice sofisticiranu regulaciju genske ekspresije, potrebnu za usmjeravanje aktivnosti
velikog broja razliitih stanica u viestaninom organizmu.
1.2.1. Eukariotske RNA-polimeraze
Eukariotske stanice posjeduju tri razliite RNA-polimeraze smjetene u jezgri koje prepisuju
razliite skupine gena (Tablica 6.1). Geni koji kodiraju proteine prepisuju se pomou RNApolimeraze II dajui mRNA, a ribosomalne (rRNAs) i transportne RNA (tRNAs) se prepisuju
pomou RNA-polimeraze I i III. RNA-polimeraza I specifino je odreena za transkripciju tri
najvee vrste rRNA oznaene kao 28S, 18S i 5,8S u skladu s brzinom njihove sedimentacije.
RNA-polimeraza III prepisuje gene za tRNA i za najmanju ribosomalnu RNA (5S rRNA).
Neke od malih RNA djelatnih u prekrajanju RNA i prijenosu proteina (snRNAs i scRNAs)
takoer se prepisuju pomou RNA-polimeraze III, dok su ostali transkripti nastali uz
polimerazu II. Uz to, posebne RNA-polimeraze (sline bakterijskim RNA-polimerazama)
nalaze se u kloroplastima i mitohondrijima gdje specifino prepisuju DNA tih organela.
Sve su tri jezgrine RNA-polimeraze sloeni enzimi koji se sastoje od 12 do 17
razliitih podjedinica. Premda prepoznaju razliite promotore i prepisuju razliite skupine
gena po nekim su svojstvima meusobno sline, pa ak i s bakterijskom RNA-polimerazom.
Posebice, sve tri RNA-polimeraze sadre devet konzerviranih podjedinica, od kojih su pet
slini , , i podjedinicama bakterijske RNA-polimeraze. Nedavno kristalografsko
odreivanje strukture kvaeve RNA-polimeraze II ponovno je pokazalo kako je arhitektura
ove eukariotske RNA-polimeraze vrlo slina bakterijskom enzimu (slika 6.11), sugerirajui da
sve RNA-polimeraze koriste temeljni konzervirani mehanizam za transkripciju DNA.
1.2.2.Transkripcijski faktori i zapoinjanje transkripcije pomou RNA-polimeraze II
U aritu veine studija transkripcije nalazi se RNA-polimeraza II s obzirom da je odgovorna
za sintezu mRNA gena koji kodiraju proteine. Rani pokuaji prouavanja tog enzima pokazali
su da je njegova aktivnost razliita od prokariotske RNA-polimeraze. Tono prepisivanje
bakterijskih gena to se moe savreno izvesti in vitro jednostavnim dodatkom proiene
RNA-polimeraze DNA molekuli koja sadri promotor, nije mogue u eukariotskom sustavu.
Osnova ove razlike rasvijetljena je 1979. godine kada je Robert Roeder sa suradnicima otkrio
da je RNA-polimeraza sposobna zapoeti transkripciju samo ako su u reakciji prisutni dodatni
proteini. Tako se ini kako su za transkripciju u eukariotskom sustavu potrebni razliiti
inicijacijski imbenici, koji (za razliku od bakterijskih faktora) nisu zdrueni s
polimerazom.
Biokemijskim frakcioniranjem jezgrinog ekstrakta identificirani su specifini proteini
(nazvani transkripcijski faktori) koji su potrebni RNA-polimerazi za zapoinjanje
transkripcije. Identifikacija i karakterizacija ovih faktora predstavlja najvei dio nastojanja da
se razumije transkripcija u eukariotskim stanicama. Utvrene su dvije osnovne skupine
transkripcijskih faktora. Opi transkripcijski faktori djelatni su u transkripciji svih promotora
polimeraze II i ine dio bazne transkripcijske mainerije. Transkripcijski faktori specifini za
gene (razmatrani kasnije u ovom poglavlju) veu se na DNA sljedove koji kontroliraju
ekspresiju individualnih gena pa su tako odgovorni za gensku ekspresiju. Procijenjeno je kako
oko 5% gena humanog genoma kodira transkripcijske faktore, naglaavajui znaenje ovih
proteina.
Za zapoinjanje transkripcije RNA-polimerazom II u uspostavljenom
(rekonstituiranom) in vitro sistemu (slika 6.12) potrebno je pet opih transkripcijskih faktora.
Promotori mnogih gena koji se prepisuju RNA-polimerazom II sadre slijed slian TATAA 25
do 30 nukleotida uzvodno od poetnog transkripcijskog mjesta. Taj slijed (nazvan TATA-slog)
nalikuje 10 sljedu u bakterijskim promotorima, a rezultati uvoenja mutacija u TATA-slog
ukazali su na njegovu ulogu u zapoinjanju transkripcije. Prvi je korak u nastanku
transkripcijskog kompleksa vezanje opeg transkripcijskog faktora nazvanog TFIID na TATAslog (TF oznaava transkripcijski faktor; II oznaava polimerazu II). TFIID je i sam sloen od
vie podjedinica, ukljuujui protein koji se vee na TATA-slog (TBP), TBP se specifino
vee na TATA usuglaeni slijed i oko 10 polipeptida nazvanih faktori zdrueni s TBP
(TAFs). Nakon vezivanja TFIID slijedi pridruivanje drugog opeg transkripcijskog faktora
(TFIIB) koji se vee na TBP kao i na DNA sljedove prisutne uzvodno od TATA-sloga u nekim
promotorima (slika 6.13) TFIIB slui kao most za RNA-polimerazu II koja se vee na
kompleks TBP-TFIIB zdruen s treim faktorom, TFIIF.
Slijedei pridruivanje RNA-polimeraze II na promotor, za inicijaciju transkripcije
potrebno je vezivanje dva dodatna faktora (TFIIE i TFIIH). TFIIH se sastoji iz vie
podjedinica, a igra dvije vane uloge. Prvo, dvije su podjedinice TFIIH helikaze koje
odmotavaju DNA oko inicijacijskog mjesta. (Te podjedinice TFIIH jesu XPB i XPD proteini,
potrebni za popravak nukleotidnim izrezivanjem, koji serazmatraju u poglavlju 5.) Druga je
podjedinica TFIIH proteinska kinaza koja fosforilira ponavljane sljedove prisutne u podruju
C-kraja najvee podjedinice RNA-polimeraze II. C-krajnji dio polimeraze II (ili CTD) sastoji
se iz uzastopnih ponavljanja (27 ponavljanja u kvasca, a 52 u ovjeka) od 7 amino-kiselina s
usuglaenim sljedom Tyr-Ser-Pro-Thr- Ser- Pro-Ser. Fosforilacija ovih amino-kiselina
oslobaa polimerazu iz njenog zdruenja s preinicijacijskim kompleksom i vodi do
pridruivanja drugih proteina koji doputaju polimerazi da zapone transkripciju te dalje
sintetizira rastui mRNA lanac.
Uz TATA-slog promotori mnogih gena koji se prepisuju RNA-polimerazom II sadre
jo jedan vaan element ( inicijator, ili Inr slijed) koji se protee unutar poetnog mjesta za
transkripciju. tovie, neki promotori RNA-polimeraze II sastoje se samo od Inr elementa,
bez TATA-sloga. Mnogi promotori koji ne sadre TATA-slog, a sadre Inr element, takoer
sadre jo jedan nizvodni promotorski element (DPE) smjeten oko 30 baznih parova
nizvodno od poetnog mjesta za transkripciju koji kooperativno funkcionira s Inr sljedom.
Inicijacija tih promotora zahtjeva TFIID (i TBP), premda TBP oito ne prepoznaje takve
promotore izravnim vezivanjem na TATA-slog. Umjesto toga ini se da se podjedinice TFIID
(TAFs) veu na Inr i DPE. Vezanje TAF na ove elemente pridruuje TBP, TFIIB i polimerazu
II promotoru nakon ega se zdruuju ostali transkripcijski faktori kako je ve opisano. TBP
tako igra sredinju ulogu u inicijaciji transkripcije polimerazom II, ak i ako promotori ne
posjeduju TATA-slog.
Premda ovdje opisano sekvencijsko pridruivanje pet opih transkripcijskih faktora i
RNA-polimeraze II predstavlja minimalni sustav potreban za transkripciju in vitro, u stanici
su potrebni dodatni faktori. Oni obuhvaaju posredniki proteinski kompleks (engl.
Mediator) koji omoguuje da polimeraza odgovori na transkripcijske faktore specifine za
gene koji reguliraju gensku ekspresiju. Najmanje je jedan dio RNA-polimeraze II u kvasca i u
stanicama sisavaca prisutan u obliku velikog kompleksa (nazvan RNA-polimeraza II
holoenzim) u kojem je polimeraza zdruena s posrednikim proteinima, kao i s skupinom
opih transkripcijskih faktora ukljuujui TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH. Posredniki su proteini
zdrueni s domenom na C-kraju (CTD) polimeraze II, a oslobaaju se s polimeraze pratei
zdruivanje preinicijacijskog kompleksa i fosforiliranje polimerazne domene na C-kraju (slika
6.14). Fosforilirana CTD potom vee ostale proteine koji promiu transkripcijsku elongaciju i
djeluju u procesu obrade mRNA, kako se razmatra kasnije u ovom poglavlju.
1.2.3. Transkripcija polimerazom I i III
Kako je ranije razmatrano, razliite RNA-polimeraze odgovorne su za transkripciju gena koji
kodiraju ribosomalne i transportne RNA u eukariotskim stanicama. Meutim, sve tri RNApolimeraze trebaju dodatne transkripcijske faktore zdruene s odgovarajuim promotorskim
sljedovima. Nadalje, premda tri razliite polimeraze u eukariotskim stanicama prepoznaju
razliite vrste promotora, ini se da je transkripcijski faktor protein koji se vee na TATAslog (TBP) potreban za inicijaciju transkripcije bilo kojim od tri enzima.
RNA-polimeraza I odreena je iskljuivo za transkripciju gena za ribosomalne RNA,
prisutnih u uzastopnim ponavljanjima. Transkripcijom tih gena nastaje velika 45S pre-rRNA
koja obradom daje 28S, 18S i 5,8S rRNA (slika 6.15). Promotor gena za ribosomalne RNA
obuhvaa oko 150 baznih parova neposredno uzvodno od inicijacijskog mjesta transkripcije.
Te promotorske sljedove prepoznaju dva transkripcijska faktora, UBF (faktor koji se vee
uzvodno, engl. upstream binding factor) i SL1 (faktor selekcije 1, engl. selectivity factor 1),
koji se kooperativno veu na promotor i potom pridruuju polimerazu I da bi nastao
inicijacijski kompleks (slika 6.16). SL1 transkripcijski faktor sastoji se od etiri podjedinice, a
jedna od njih je TBP. Uloga TBP izravno je pokazana nalazom da su kvasci nositelji mutacije
u TBP defektni ne samo u transkripciji gena uz polimerazu II, nego i u transkripciji gena uz
polimeraze I i III. Tako je TBP zajedniki transkripcijski faktor potreban za sve tri vrste
eukariotskih RNA-polimeraza. S obzirom da geni koji kodiraju ribosomalne RNA ne sadre
TATA-slog, TBP se ne vee na specifini promotorski slijed. Umjesto toga, zdruenje TBP s
genima za ribosomalne RNA je posredovano vezivanjem drugih proteina iz SL1 kompleksa
na promotor to je slino zdruivanju TBP s Inr sljedovima gena, koje prepisuje polimeraza II,
a koji ne posjeduju TATA-slog.
Geni za tRNA, 5S rRNA i neke male RNA molekule djelatne u RNA-prekrajanju i
prijenosu proteina prepisuju se uz polimerazu III. Ti se geni prepisuju od tri razliite skupine
promotora, od kojih su dva smjetena prije unutar nego uzvodno od sljeda koji se prepisuje
(slika 6.17). Najvie prouavani geni od svih koji se prepisuju uz polimerazu III jesu geni za
5S rRNA Xenopusa. TFIIIA (prvi proieni transkripcijski faktor) inicira zdruivanje
transkripcijskog kompleksa vezivanjem na specifine sljedove DNA i 5S rRNA promotoru. To
je vezivanje praeno sekvencijskim vezivanjem TFIIIC, TFIIIB i polimeraze. Promotori gena
za tRNA razlikuju se od 5S rRNA promotora time to ne posjeduju slijed DNA koji
prepoznaje TFIIIA. Umjesto toga TFIIIC se izravno vee na promotore gena za tRNA, sluei
za pridruivanje TFIIIB i polimeraze da bi nastao transkripcijski kompleks. Promotori tree
skupine gena prepisivanih polimerazom III, ukljuujui i gene za male jezgrine RNA djelatne
u RNA-prekrajanju, smjeteni su uzvodno od poetnog transkripcijskog mjesta. Ti promotori
sadre TATA-slog (slino promotorima za polimerazu II) kao i vezujua mjesta za druge
faktore nazvane SNAP. SNAP i TFIIIB veu se kooperativno na promotore, s tim da se
TFIIIB izravno vee na TATA-slog. Vezivanje je posredovano proteinom koji se vee na
TATA-slog, TBP, podjedinicom TFIIIB. Kao i u sluaju promotora za gene prepisivane
polimerazom III, TFIIIB potom pridruuje polimerazu u transkripcijski kompleks.
1.3. Regulacija transkripcije u eukariota
Premda je kontrola ekspresije gena puno sloenija u eukariotima nego u bakterijama, vrijede
isti temeljni principi. Ekspresija eukariotskih gena primarno je kontrolirana na razini
inicijacije transkripcije, a u mnogim sluajevima i tijekom elongacije. Kao i kod bakterija,
transkripcija u eukariotskim stanicama kontrolirana je proteinima koji se specifino veu za
regulatorne sljedove i moduliraju aktivnost RNA-polimeraze. Meutim, vana razlika izmeu
regulacije transkripcije u prokariotskim i eukariotskim stanicama, rezultat je pakiranja
eukariotske DNA u kromatin koji ograniava raspoloivost DNA kao kalupa za transkripciju.
Stoga, modifikacija kromatinske strukture igra kljunu ulogu u kontroli transkripcije u
eukariotskim stanicama.
1.3.1. Cis-djelujui regulatorni sljedovi: promotori i pojaivai
Kako je upravo obrazloeno, transkripcija je u bakterijama regulairana vezivanjem proteina
na cis-djelujue sljedove (primjerice lac operator) koji kontroliraju transkripciju susjednih
gena. Slini cis-djelujui sljedovi reguliraju ekspresiju eukariotskih gena. Ti su sljedovi
identificirani u stanicama sisavaca primjenom testa prijenosa gena za studij vjerojatnih
regulatornih podruja kloniranih gena (slika 6.18). Eukariotski regulatorni sljedovi obino su
vezani na reporterski gen koji kodira enzim jednostavan za detekciju. Ekspresija reporterskog
gena nakon prijenosa u kultivirane stanice omoguuje osjetljivo ispitivanje sposobnosti
kloniranih regulatornih sljedova da upravljaju transkripcijom. Bioloki aktivna regulatorna
podruja mogu se tako utvrditi, a in vivo mutageneza se primjenjuje za utvrivanje uloge
specifinih sljedova unutar odreenog podruja.
Geni koji se prepisuju RNA-polimerazom II imaju srne promotorske elemente,
zajedno s TATA-slogom i Inr sljedom koji slue kao vezna mjesta za ope transkripcijske
faktore. Drugi cis-djelujui sljedovi slue kao vezna mjesta za iroku lepezu regulatornih
faktora koji kontroliraju ekspresiju individualnih gena. Cis-djelujui regulatorni sljedovi su
esto, ali ne uvijek, smjeteni uzvodno od TATA-sloga. Primjerice, dva regulatorna sljeda,
naena u mnogim eukariotskim genima, identificirana su istraivanjem promotora gena koji
kodira timidin kinazu u virusu herpes simplex (slika 6.19). Oba sljeda smjetena su unutar
100 baznih parova uzvodno od TATA-sloga: usuglaeni su njihovi sljedovi CCAAT i
GGGCGG (nazvan GC-slog). Specifini proteini koji se veu na te sljedove i stimuliraju
transkripciju takoer su identificirani.
Nasuprot relativno jednostavnoj organizaciji CCAAT i GC-slogova u promotoru gena
za timidin kinazu kod herpes virusa, mnoge gene u stanicama sisavaca kontroliraju regulatorni
sljedovi smjeteni vrlo daleko (ponekad vie od 10 kilobaza) od poetnog transkripcijskog
mjesta. Ti sljedovi, nazvani pojaivai (engl. enhancer), prvotno su identificirani tijekom
istraivanja promotora jednog drugog virusa, SV40 (slika 6.20). Za uinkovitu transkripciju
kontroliranu tim promotorom, osim TATA-sloga potrebni su i est GC-slogova te dva
ponavljanja od 72-bazna para smjetena dalje uzvodno. Utvreno je da ti sljedovi stimuliraju
transkripciju od drugih promotora kao i od SV40 te da, izneneujue, njihova aktivnost ne
ovisi niti o udaljenosti niti o orijentaciji u odnosu na inicijacijsko transkripcijsko mjesto (slika
6.21). Oni mogu stimulirati transkripciju bez obzira jesu li smjeteni uzvodno ili nizvodno od
promotora ili u orijentaciji naprijed ili nazad.
Sposobnost pojaivaa da djeluju i kad su vrlo udaljeni od inicijacijskog mjesta za

transkripciju sugerira u prvi mah da oni funkcioniraju po drugom principu od promotora.
Meutim, ta je pretpostavka odbaena: pojaivai, slino promotorima, funkcioniraju
vezivanjem transkripcijskih faktora koji potom mogu regulirati RNA-polimerazu. To je
mogue s obzirom na postojanje DNA omi to omoguuje transkripcijskim faktorima
vezanim na udaljene pojaivae da stupaju u interakciju s proteinima zdruenim s RNApolimerazom na promotoru (slika 6.22). Tako transkripcijski faktori vezani na udaljene
pojaivae djeluju na isti nain kao i oni vezani na susjedne promotore, to znai da nema
fundamentalne razlike izmeu djelovanja pojaivaa i cis-djelujuih regulatornih sljedova u
susjedstvu poetnog mjesta za transkripciju. Zanimljivo je da su pojaivai prvo identificirani
u stanicama sisavaca, a potom naeni i u bakterijama neobian sluaj da istraivanja
eukariota slue kao model za jednostavnije prokariotske sustave.
Vezivanje specifinih transkripcijskih regulatornih proteina na pojaivae odgovorno
je za kontrolu ekspresije gena tijekom razvoja i diferencijacije, kao i za odgovor stanica na
hormone i faktore rasta. Jedan od najbolje istraenih pojaivaa sisavaca kontrolira
transkripciju gena za imunoglobulin u B limfocitima. Pokusima prijenosa gena ustanovljeno
je da je imunoglobulinski pojaiva aktivan samo u limfocitima, a ne i u drugim vrstama
stanica. Tako je ovaj regulatorni slijed djelomino odgovoran za specifinu tkivnu ekspresiju
imunoglobulinskih gena u odgovarajui diferenciranim staninim vrstama.
Vaan je aspekt pojaivaa to to oni sadre vie funkcionalnih elemenata koji veu
razliite regulatorne proteine. Kada djeluju zajedno, ti proteini reguliraju ekspresiju gena.
Pojaiva tekog lanca imunoglobulina, primjerice, obuhvaa oko 200 baznih parova i sadri
najmanje devet razliitih elemenata koji slue kao vezujua mjesta za proteine (slika 6.23).
Mutacija bilo kojeg od sljedova smanjuje, ali ne unitava pojaivaku aktivnost, ukazujui da
su funkcije individualnih proteina koji se veu na pojaiva, najmanje, dijelom suvine.
Mnogi od pojedinanih sljedova imunoglobulinskog pojaivaa sami po sebi stimuliraju
transkripciju u nelimfoidnim stanicama. Stoga ograniena aktivnost cijelog pojaivaa u B
limfocitima nije rezultat specifine tkivne funkcije svake od njegovih komponenata. Umjesto
toga, specifina tkivna ekspresija posljedica je kombinacije individualnih sljednih elemenata
koji upotpunjuju cijeli pojaiva. Ti elementi obuhvaaju neke cis-djelujue regulatorne
sljedove koji veu transkripcijske aktivatore, specifino eksprimirane u B limfocitima, kao i
druge regulatorne sljedove koji veu represore u nelimfoidnim stanicama. Prema tome,
imunoglobulinski pojaiva sadri negativne regulatorne elemente koji inhibiraju
transkripciju u neodgovarajuoj vrsti stanica, ali i pozitivne regulatorne elemente koji
aktiviraju transkripciju u B limfocitima. Ukupna aktivnost pojaivaa vea je od zbroja
pojedinanih aktivnosti, odraavajui kombinirano djelovanje proteina zdruenih sa svakim
individualnim sljedom.
Premda stvaranje omi u DNA molekuli omoguava pojaivaima da djeluju sa znatne
udaljenosti od promotora, aktivnost bilo kojeg pojaivaa specifina je za promotor
odreenog ciljanoga gena. Ta se specifinost odrava pomou inzulatora koji dijele
kromosome u neovisna podruja i sprjeavaju pojaivae da djeluju na promotore smjetene u
oblinjem podruju. Inzulatori takoer sprjeavaju irenje kromatinske strukture jedne
domene na susjedstvo, i tako odraavaju neovisno regulirana podruja genoma.
1.3.2. Transkripcijski regulatorni proteini
Izoliranje velikog broja razliitih transkripcijskih regulatornih proteina utemeljeno je na
njihovom specifinom vezanju na promotorske ili pojaivake sljedove. Vezivanje proteina na
DNA sljedove analizirano je s dva tipa pokusa. Prvi tip, otisak stopala opisan je ranije u svezi
s vezivanjem RNA-polimeraze na prokariotske promotore (vidi sliku 6.3). Drugi je pristup
test pomaka u elektroforetskoj pokretljivosti, u kojem se radioaktivno oznaeni fragment
DNA inkubira s proteinima, a potom podvrgne elektroforetskoj separaciji na
nedenaturirajuem gelu (slika 6.24). Vezanje proteina detektira se kao smanjenje

elektroforetske pokretljivosti fragmenta DNA, s obzirom da je njegovo kretanje kroz gel
usporeno vezanim proteinom. Kombinirana primjena otiska stopala i pomaka u
elektroforetskoj pokretljivosti omoguila je usporedbu vezujuih mjesta za proteine s
regulatornim elementima pojaivaa i promotora te ukazala da ti sljedovi openito sainjavaju
mjesta prepoznavanja specifinih proteina koji se veu na DNA.
Robert Tjian i suradnici prvi su identificirali jedan od prototipova eukariotskog
transkripcijskog faktora istraujui transkripciju SV40 DNA. Utvreno je da taj faktor
(nazvan Sp1, od engl. specificity protein 1) stimulira transkripciju od SV40 promotora, ali ne
od nekoliko drugih promotora u ekstraktima bez stanica (engl. cell-free extracts). Takoer je
utvreno da stimulacija transkripcije Sp1 ovisi o prisutnosti GC-slogova u SV40 promotoru:
ako su ti sljedovi deletirani sprjeena je stimulacija Sp1. tovie, pokusima otiska stopala
utvreno je da se Sp1 specifino vee na GC-slogove. Uzevi sve u obzir, rezultati ukazuju da
GC-slog predstavlja specifino vezujue mjesto za aktivator transkripcijske Sp1. Slini
pokusi pokazali su da mnogi drugi transkripcijski regulatorni sljedovi, zajedno s CCAATslogom i razliitim drugim elementima imunoglobulinskog pojaivaa, takoer predstavljaju
mjesta prepoznavanja za proteine koji se veu na specifine sljedove DNA.
Specifino vezanje Sp1 na GC-slog ne predstavlja samo djelovanje Sp1 kao
transkripcijskog faktora, nego i opi pristup proiavanju transkripcijskih faktora. Izolacija
tih proteina prvotno je predstavljala golem izazov s obzirom da su prisutni u vrlo malim
koliinama (npr. samo 0,001% ukupnih staninih proteina) koje je teko proistiti
konvencionalnim biokemijskim tehnikama. Problem je otklonjen proiavanjem Sp1 DNAafinitetnom kromatografijom (slika 6.25). Mnogobrojne kopije oligonukleotida, koji
odgovaraju sljedu GC-sloga, vezane su na vrsti nosa, a stanini ekstrakt prolazi kroz
oligonukleotidnu kolonu. Poto je Sp1 vezan na GC-slog (KLJUNI POKUS 1: Izolacija
eukariotskog transkripcijskog faktora, str. 251) jakim afinitetom, specifino je zadran na
koloni, dok ostali proteini nisu. Proieni Sp1 mogao se tako ponovno dobiti i koristiti za
studij, ukljuujui i odreivanje njegovog aminokiselinskog sljeda, nakon ega se moe
klonirati Sp1 gen.
Metoda DNA-afinitetne kromatografije, prvotno optimirana za proiavanje Sp1,
uspjeno je koritena za izolaciju velikog broja proteina koji se veu na specifine sljedove
DNA iz eukariotskih stanica. Geni koji kodiraju druge transkripcijske faktore izolirani su
pretraivanjem cDNA ekspresijskih knjinica na rekombinantni protein koji se vee na
specifine sljedove. Kloniranje i sekvenciranje cDNA za transkripcijske faktore omoguilo je
brojne informacije o strukturi i funkciji ovih vanih regulatornih proteina.
1.3.3. Struktura i funkcija transkripcijskih aktivatora
S obzirom da transkripcijski faktori imaju sredinju ulogu u regulaciji ekspresije gena,
razumijevanje mehanizama njihova djelovanja najvee je podruje znanstvenog interesa u
staninoj i molekularnoj biologiji. Najvie su istraeni transkripcijski aktivatori, koji se,
slino Sph1, veu na rgulativne DNA sljedove i stimuliraju transkripciju. Openito, ti se
faktori sastoje od dvije domene: jedna se domena specifino vee na DNA, a druga stimulira
transkripciju stupanjem u interakciju s drugim proteinima, ukljuujui komponente
transkripcijske mainerije (slika 6.26). Transkripcijski su faktori modularni proteini, u smislu
da se DNA vezujua i aktivirajua domena razliitih faktora moe meusobno zamjenjivati
pomou tehnika rekombinantne DNA. Takvim manipulacijama nastaju hibridni transkripcijski
faktori koji aktiviraju transkripciju vezivanjem na promotorske ili pojaivake sljedove kako
je odreeno njihovom vezujuom domenom. Iz tog proizlazi da je osnovna funkcija domene
za vezivanje na DNA sidrenje transkripcijskog faktora na prikladno mjesto na DNA;
aktivacijska domena potom neovisno stimulira transkripciju interakcijom protein-protein.
10
Mnogi razliiti transkripcijski faktori identificirani su u eukariotskim stanicama i,

kako se oekivalo, pokazali su svu kompleksnost tkivno-specifine i inducibilne genske
ekspresije u sloenim viestaninim organizmima. Molekularna je karakterizacija pak
rasvijetlila slinost domena za vezivanje na DNA u mnogim tim proteinima (slika 6.27).
Domene cinkova prsta sadre ponavljanja cisteinskih i histidinskih ostataka koji veu
cinkove ione i smotani su u ome ("prsti") to se veu na DNA. Prvotno su te domene
identificirane u transkripcijskom faktoru polimeraze III, TFIIIA, ali su prisutne i u
transkripcijskim faktorima koji reguliraju promotore polimeraze II, ukljuujui i Sph1.
Drugi primjeri transkripcijskih fakotra to sadre domenu cinkovog prsta jesu receptori za
steroidne hormone, regulatori transkripcije gena u odgovoru na steroidne hormone, kao to su
estrogen i testosteron.
Uzvojnica-okret-uzvojnica (helix-turn-helix) motiv prvi je put prepoznat kod
prokariotskih proteina koji se veu na DNA, ukljuujui E. coli protein aktivator katabolizma
(CAP). U tih proteina jedna uzvojnica ostvaruje veinu kontakata s DNA, dok druga
uzvojnica premouje kompleks da bi stabilizirala interakciju. U eukariotskim stanicama
proteini uzvojnica-okret-uzvojnica ukljuuju homeodomenske proteine koji su vani u
regulaciji genske ekspresije tijekom embrionalnog razvoja. Geni koji kodiraju te proteine
najprije su otkriveni u razvojnim mutantama Drosophilae. Neke od najranije prepoznatih
mutanti Drosophilae (nazvane homeotske mutante 1984. godine) dovode do razvoja muica
kod kojih je jedan dio tijela transformiran u drugi. Primjerice, u homeotskoj mutanti nazvanoj
Antennapedia, noge, a ne antene, rastu iz glave muice (slika 6.28). Pionirskim radom Ed
Lewisa u 40. godinama prolog stoljea, napravljena je genetika analiza te muice i pokazalo
se da Drosophila sadri devet homeotskih gena, a svaki od njih odgovoran je za identitet
odreenog dijela tijela. Molekularno kloniranje i analiza tih gena ukazala je da oni sadre
konzervirane sljedove od 180 baznih parova (nazvane homeo-slogovima) koji kodiraju
domene transkripcijskih fakotra to se vezuju na DNA (homeodomene). Mnogo
homeodomenskih proteina naeno je u gljivama, biljkama i ivotinjama, kao i kod ovjeka.
Geni s homeo-slogovima u kraljenjaka vrlo su slini, strukturno i funkcionalno, takvim
genima u Drosophili, to govori o evolucijski vrlo ouvanim ulogama tih transkripcijskih
faktora u ivotinjskom razvoju.
Druge dvije porodice proteina koji se veu na DNA, proteini s leucinskim
zatvaraem i uzvojnica-oma-uzvojnica proteini, sadre vezujue domene nastale
dimerizacijom dvaju polipeptidnih lanaca. Leucinski zatvara sadri etiri ili pet leucinskih
ostataka razmaknutih u intervalima od po sedam aminokiselina, ime su njihovi hidrofobni
postranini lanci izloeni na jednoj strani uzvojnice. Taj dio uzvojnice slui kao
dimerizacijska domena za dvije proteinske podjedinice koje se dre zajedno hidrofobnim
interakcijama postraninih lanaca leucina. Odmah nakon domene s leucinskim ziperom nalazi
se domena bogata pozitivno nabijenim aminokiselinama (lizin i arginin) koja se vee na
DNA. Proteini uzvojnica-oma-uzvojnica sline su strukture, osim to je svaka njihova
dimerizacijska domena izgraena od dvije uzvojnice razdvojene omom. Vano je svojstvo
transkripcijskih faktora tipa leucinskih zatvaraa ili uzvojnica-oma-uzvojnica to razliiti
lanovi ovih porodica mogu dimerizirati meusobno. Tako kombinacija razliitih proteinskih
podjedinica moe stvarati veliki broj faktora koji se razlikuju, kako u prepoznavanju sljeda
DNA na koji se veu, tako i u stimulaciji transkripcije. Proteini s leucinskim zatvaraem i
uzvojnica-oma-uzvojnica proteini vani su u regulaciji specifine tkivne i inducibilne genske
ekspresije, a nastanak dimera izmeu razliitih lanova tih porodica vaan je aspekt kontrole
njihove funkcije.
Aktivirajua domena nije tako dobro karakterizirana kao vezujua domena. Neke,
nazvane kisele aktivirajue domene, bogate su negativno nabijenim ostatcima (aspartat i
glutamat), druge su pak bogate prolinima i glutaminima. Aktivirajue domene eukariotskih
11
transkripcijskih faktora stimuliraju transkripciju na dva razliita naina (slika 6.29). Prema
prvom mehanizmu, one reagiraju s posrednikim proteinima i opim transkripcijskim
faktorima kao to su TFIIB ili TFIID da bi pridruili RNA polimerazu i olakali zdruivanje
transkripcijskog kompleksa na promotoru, slino transkripcijskim aktivatorima u bakterijama
(vidi sliku 6.10). Nadalje, eukariotski transkripcijski faktori stupaju u interakciju s mnogim
koaktivatorima koji stimuliraju transkripciju modificiranjem strukture kromatina, kako e se i
razmatrati kasnije u ovom poglavlju.
1.3.4. Eukariotski represori
Ekspresija gena u eukariotskim stanicama regulirana je kako represorima tako i
transkripcijskim aktivatorima. Slino prokariotskim represorima, eukariotski se represori veu
na specifian slijed DNA i inhibiraju transkripciju. U nekim sluajevima eukariotski represori
jednostavno interferiraju s vezivanjem drugih transkripcijskih faktora na DNA (slika 6.30).
Primjerice, vezivanje represora u blizini poetnog mjesta za transkripciju moe sprijeiti
interakciju RNA polimeraze ili opih transkripcijskih faktora s promotorom, to je slino
djelovanju represora u bakterijama. Drugi se represori natjeu s aktivatorima za vezanje na
specifian regulatorni slijed. Tako neki represori sadre istu domenu za vezivanje na DNA kao
i aktivatori, ali nemaju njihovu aktivacijsku domenu. Posljedica je toga da njihovo vezanje na
promotor ili pojaiva sprjeava vezanje aktivatora na to mjesto ime je inhibirana
transkripcija.
U opreci spram receptora koji jednostavno interferiraju s vezanjem aktivatora, drugi
represori (nazvani aktivni represori) sadre specifine funkcionalne domene koje inhibiraju
transkripciju protein-protein interakcijama (slika 6.30B). Prvi takav aktivni represor opisan je
1990. godine pri istraivanju gena nazvanog Krppel, djelatnog u embrionalnom razvoju
Drosophilae. Molekularna analiza Krppel proteina pokazala je da on sadri diskretnu
represijsku domenu povezanu s domenom cinkovog prsta koja se vee na DNA. Krppelova
represijska domena moe se izmjenjivati s odreenim domenama transkripcijskih faktora koje
se veu na DNA. Takve hibridne molekule, takoer, djeluju represijski na transkripciju, to
ukazuje da Krppelova represijska domena inhibira transkripciju preko protein-protein
interakcija, neovisno o mjestu njegova vezivanja na DNA.
Utvreno je da mnogi aktivni represori imaju kljunu ulogu u regulaciji transkripcije u
ivotinjskim stanicama, u mnogim sluajevima oni su kritini regulatori staninog rasta i
diferencijacije. Kao i kod transkripcijskih aktivatora, identificirano je nekoliko razliitih vrsta
represijskih domena. Primjerice, represijska domena Krppelova proteina bogata je
alaninskim ostatcima, dok su druge represijske domene bogate prolinom ili kiselim ostatcima.
Funkcionalni su ciljevi represora takoer razliiti; represori mogu inhibirati transkripciju
interakcijom sa specifinim aktivatorskim ili posrednikim proteinima ili s opim
transkripcijskim faktorima ili pak, s korepresorima koji modificiraju kromatinsku strukturu.
Regulacija transkripcije represorima, kao i aktivatorima, znaajno iri niz mehanizama
koji kontroliraju ekspresiju eukariotskih gena. Znaajna uloga represora mogla bi biti
inhibicija ekspresije gena u odreenim tkivima. Primjerice, kako je napomenuto ranije, mjesto
za vezanje represora u imunoglobulinskom pojaivau pridonosi specifinoj tkivnoj
ekspresiji, sprjeavajui transkripciju u ne-limfoidnim stanicama. Drugi represori igraju
kljune uloge u kontroli proliferacije i diferencijacije stanica izloenih djelovanju hormona i
faktora rasta (vidi poglavlja 13 i 14).
1.3.5. Povezanost kromatinske strukture i transkripcije
Kako je napomenuto u prethodnoj diskusiji, aktivatori i represori reguliraju transkripciju u
eukariotima, ne samo interakcijom s drugim imbenicima transkripcijske mainerije, nego i
izazivanjem promjena u kromatinskoj strukturi. DNA svih eukariotskih stanica vezana je na
histone. Osnovna strukturna jedinica kromatina jest nukleosom koji se sastoji od 146 baznih
parova DNA omotane oko dvije molekule svakog histonskog proteina, H2A, H2B, H3 i H4, te
12
jedne molekule histona H1 vezanog na DNA pri ulasku u sr nukleosomske estice (vidi sliku
4.12). Kromatin je potom kondenziran smotavanjem u obliku spirale u strukturu vieg reda
organiziranu u velike ome DNA. Ovakvo pakiranje eukariotske DNA u kromatin sigurno ima
vane posljedice po raspoloivost DNA kao kalupa za transkripciju. Tako kromatinska
struktura predstavlja kritian apekt genske ekspresije u eukariotskim stanicama.
Geni koji se aktivno transkribiraju smjeteni su u relativno dekondenziranom
kromatinu, koji se vjerojatno podudara s 30-nm kromatinskim vlaknom razmatranim u 4.
poglavlju (vidi sliku 4.13). Primjerice, mikroskopska vizualizacija politenskog kromosoma
Drosophilae ukazuje da se podruja genoma, aktivno upletena u sintezu RNA, podudaraju s
dekondenziranim kromosomskim dijelom (slika 6.31). Usprkos tomu, aktivno prepisivani
geni ostaju vezani na histone i pakirani u nukleosome, transkripcijski faktori i RNApolimeraza stalno se susreu s problemom interakcije prije s kromatinom nego s golom DNA.
Gusto namotana DNA oko sri nukleosomske estice najvea je prepreka transkripciji, to
utjee kako na sposobnost transkripcijskih faktora da se veu na DNA, tako i na sposobnost
RNA-polimeraze da transkribira kroz kromatinski kalup.
Nekoliko modifikacija, obuhvaajui i modifikacije histona, karakteristine su za
transkripcijski aktivan kromatin, ukljuujui modifikacije histona, rearanman nukleosoma te
zdruivanje dva nehistonska kromosomalna proteina, nazvana HMGN proteini, s
nukleosomima aktivno transkribiranih gena. Vezna mjesta za HMGN na nukleosomima
preklapaju se s veznim mjestima za histon H1 i ini se da HMGN proteini stimuliraju
transkripciju, mijenjajui interakciju histona H1 s nukleosomima da bi odrali
dekondenziranu kromatinsku strukturu.
Acetiliranje histona povezivalo se s transkripcijski aktivnim kromatinom u vrlo
velikom broju staninih vrsta (slika 6.32). Srni histoni (H2A, H2B, H3 i H4) imaju dvije
domene: domena histonskog namatanja, ukljuena u interakcije s drugim histonima i
smotavanje DNA oko sri nukleosomske estice, te domena repa na amino-kraju koja se prua
izvan nukleosoma. Repna domena na amino-kraju bogata je lizinom i moe se modificirati
acetiliranjem na specifinim lizinskim ostatcima. Acetiliranje smanjuje ukupni pozitivni naboj
histona, a moe i oslabiti njihovo vezanje na DNA kao i promijeniti njihove interakcije s
drugim proteinima. tovie, pokazano je da acetiliranje histona olakava vezanje
transkripcijskih faktora na nukleosomalnu DNA, to ukazuje da acetiliranje histona poveava
pristupanost kromatina proteinima koji se veu na DNA.
Istraivanja dvije skupine znanstvenika 1996. godine pruila su dokaze o izravnoj
svezi izmeu acetiliranja histona i reguliranja transkripcije te pokazala da su transkripcijski
aktivatori i represori zdrueni s acetil-transferazom i deacetilazom. Ta je asocijacija prvi put
otkrivena pri kloniranju gena koji kodira histonsku acetil-transferazu u Tetrahymeni.
Neoekivano, sekvenca histonske acetil-transferaze u bliskoj je svezi s prethodno poznatim
transkripcijskim koaktivatorom u kvascima, nazvanim Gcn5p, koji stimulira transkripciju u
povezanosti s nekoliko razliitih specifinih transkripcijskih aktivatora. Daljnji su pokusi
otkrili da sam Gcn5p djeluje kao acetil-transferaza, sugerirajui da je aktiviranje transkripcije
izravna posljedica acetiliranja histona. Rezultati su proireni spoznajama o tome da je acetiltransferaza zdruena s brojnim transkripcijskim koaktivatorima sisavaca, kao i s opim
transkripcijskim faktorom TFIID. Naprotiv, mnogi transkripcijski korepresori kako u
stanicama kvasca tako i u stanicama sisavaca djeluju kao histonske deacetilaze, uklanjajui
acetilnu skupinu s histonskog repa. Acetiliranje histona tako je izravna meta i transkripcijskih
aktivatora i represora, ukazujui da acetiliranje ima kljunu ulogu u regulaciji genske
ekspresije u eukariotima.
Histoni se ne modificiraju samo acetiliranjem, nego i fosforiliranjem serinskih
ostataka, metiliranjem lizinskih i argininskih ostataka te dodatkom ubikvitina (mali peptid
razmatran u 7. poglavlju) na lizinske ostatke. Slino acetiliranju, ove se modifikacije dogaaju
13
na specifinim aminokiselinskim ostatcima u histonskom repu, a povezane su s promjenama

transkripcijske aktivnosti (slika 6.33). Pored toga to utjeu na kromatinsku strukturu
pretpostavljeno je da histonske modifikacije utjeu i na gensku ekspresiju priskrbom veznih
mjesta za druge proteine koji reguliraju transkripciju. U skladu s tom hipotezom, kombinacija
specifinih histonskih modifikacija tvori "histonski kod" koji regulira gensku ekspresiju
pridruivanjem drugih regulatornih proteina na kromatinski kalup. Primjerice, transkripcijski
aktivan kromatin u svezi je s nekoliko specifinih modifikacija histona H3, ukljuujui
metiliranje lizina-4, fosforiliranje serina-10 te acetiliranje lizina-9 i lizina-14. Nasuprot tome,
metiliranje lizina-9 povezano je s represijom, a enzim koji katalizira metiliranje H3 lizina-9
pridruuje se ciljnim genima pomou korepresora. Metilirani lizinski ostatak na poziciji 9 u
H3 histonu slui, kako je naknadno pokazano, kao vezno mjesto za proteine koji induciraju
kondenzaciju kromatina, izravno povezujui ovu histonsku modifikaciju s represijom
transkripcije.
Treba imati na umu da te modifikacije histonskog repa reguliraju svaku sljedeu,
dovodei do potvrde da razliiti uzorci histonskih modifikacija koreliraju s transkripcijskom
aktivnou. Primjerice, fosforiliranje H3 serina-10 promovira acetiliranje lizina-14, ali
inhibira metiliranje lizina-9, dovodei do postavke uzorka H3 modifikacije koji je
karakteristian za transkripcijski aktivan kromatin. Metiliranje lizina-4 takoer inhibira
metiliranje lizina-9 i obrnuto, to je u skladu s obrnutim djelovanjem metiliranja ovih dvaju
lizinskih ostataka na transkripcijsku aktivaciju odnosno represiju. Meusobni utjecaji
modifikacija razliitih ostataka daju tako uzorke histonske modifikacije koji osiguravaju
stabilni regulatorni kod za transkripcijsku aktivnost kromatina.
Nasuprot enzimima koji reguliraju kromatinsku strukturu modificiranjem histona,
nukleosomalni remodelirajui faktori jesu proteinski kompleksi koji mijenjaju aranman ili
strukturu nukleosoma bez uklanjanja ili kovalentne modifikacije histona (slika 6.34). Jedan
mehanizam kojim djeluju nukleosomalni remodelirajui faktori jest taj da kataliziraju
pomicanje histonskih oktamera du DNA. Tako se repozicioniraju nukleosomi da bi se
promijenila izloenost specifinog sljeda DNA prema transkripcijskim faktorima. Osim toga,
nukleosomalni remodelirajui faktori mogu djelovati tako da izazivaju promjene u
konformaciji nukleosoma, utjeu na sposobnost specifinih sljedova DNA da stupaju u
interakciju s regulatornim transkripcijskim proteinima. Slino enzimima koji modificiraju
histone, nukleosomalni remodelirajui faktori mogu se pridruiti DNA u asocijaciji s drugim
tranksripcijskim aktivatorima ili represorima te promijeniti aranman nukleosoma da bi
stimulirali ili inhibirali transkripciju.
Pridruivanje enzima koji modificiraju histone i nukleosomalnih remodelirajuih
faktora djelovanjem transkripcijskih aktivatora stimulira zapoinjanje transkripcije
mijenjanjem kromatinske strukture u podrujima pojaivaa ili promotora. Meutim, nakon
zapoinjanja transkripcije, RNA-polimeraza i dalje je suoena s problemom elongacije
kromatinskog kalupa. Moda je iznenaujue, ali pakiranje DNA u nukleosome ne predstavlja
nepremostivu zapreku RNA-polimerazi, ona je sposobna transkribirati kroz sr nukleosoma
kidajui kontakte histona i DNA. Sposobnost RNA-polimeraze da transkribira kromatinski
kalup olakana je zdruivanjem HMGN proteina s nukleosomima aktivno transkribiranih
gena, kao i s elongacijskim faktorima koji su zdrueni s fosforiliranom domenom na Ckraju RNA-polimeraze II nakon zapoinjanja transkripcije (vidi sliku 6.14). Elongacijski
faktori pridruuju histonsku acetil-transferazu, a djeluju i izravno na kidanju nukleosomske
strukture tijekom transkripcije.
1.3.5. Reguliranje transkripcije nekodirajuim RNA
Najnovije spoznaje ukazuju na to da se ekspresija gena moe regulirati, osim transkripcijskim
regulatornim proteinima, kako je ve razmatrano, i nekodirajuim regulatornim RNA
molekulama. Jedan je nain djelovanja nekodirajuih regulatornih RNA inhibicija translacije
14
RNA interferencijom; pojava kad kratke dvolanane RNA izazivaju degradaciju homologne
mRNA (vidi sliku 3.41). Osim toga, nekodirajue RNA ini se da imaju vanu ulogu u
represiji transkripcije na nekim mjestima na kromosomima, inducirajui modifikacije histona
koje dovode do kondenzacije kromatina i nastanka heterokromatina. Premda ostaje mnogo
toga za nauiti u svezi s mehanizmom njihova djelovanja, nekodirajue RNA nesumnjivo
igraju vane uloge u reguliranju kromatinske strukture i funkcije u eukariotskim stanicama.
Pojava inaktiviranja X kromosoma priskrbila je primjer uloge nekodirajuih RNA u
regulaciji genske ekspresije u sisavaca. U mnogih ivotinja kao i u ovjeka enke imaju dva X
kromosoma, a mujaci jedan X i jedan Y kromosom. X kromosom sadri stotine gena koji
nisu prisutni na mnogo manjem Y kromosomu (vidi sliku 4.29). Tako enke imaju dva puta
vie kopija veine gena smjetenih na X kromosomu u odnosu na mujake. Usprkos toj razlici
i mujaci i enke sadre istu koliinu proteina kodiranih veinom gena na X kromosomu.
Rezultat je to kompenzacijskog mehanizma za doziranje kojima se veina gena s jednog od
dva X kromosoma u stanicama enke rano u razvoju inaktivira konverzijom u heterokromatin.
Slijedom tog, samo jedna kopija veine gena smjetenih na X kromosomu na raspolaganju je
za transkripciju u stanicama kako enki tako i mujaka.
Premda mehanizam inaktivacije X kromosoma nije potpuno razjanjen, ini se da je
kljuni element nekodirajua RNA nastala transkripcijom regulatornog gena, nazvanog Xist,
koji se nalazi na inaktivnom X kromosomu. Xist RNA ostaje na inaktivnom X kromosomu,
vee se na njega i prekriva ga (slika 6.35). Nadalje, Xist RNA pridruuje regulatorne proteine
koji utiavaju transkripciju veine gena na inaktivnom X kromosomu. Premda ti proteini nisu
jo identificirani, naelno je djelovanje Xist RNA indukcija metiliranja lizinskog ostatka-9 na
histonu H3, to izaziva kondenziranje kromatina i prevoenje inaktivnog X u heterokromatin.
Nekodirajue RNA, kako je nedavno pokazano, igraju vanu ulogu u gaenju
transkripcije i nastanku heterokromatina u podruju centromera kod fisijskih kvasca
Schizosaccharomyces pombe. U tom sluaju RNA molekule homologne ponavljajuim
centromerskim DNA sljedovima djeluju na nain da stiavaju transkripciju i izazivaju
nastanak heterokromatina na centromeri. Kao i inaktivacija X kromosoma, metiliranje lizina-9
na histonu H3 rani je dogaaj u nastanku heterokromatina na centromeri kvasca. Zanimljivo
je da djelovanje regulatornih centromerskih RNA u S. pombe zahtijevaju prevoenje u male
dvolanane RNA molekule staninom mainerijom, odgovornom za stvaranje interferirajuih
RNA koje zaprjeavaju ekspresiju gena upuivanjem mRNA za razgradnju.
1.3.6. Metiliranje DNA
Metiliranje DNA sljedei je opi mehanizam kojim je kontrola transkripcije u kraljenjaka
povezana s strukturom kromatina. Citozinski ostatci u DNA kraljenjaka mogu se modificirati
dodatkom metilne skupine na ugljikov atom na poloaju 5 (slika 6.36). DNA se metilira
specifino na citozinskim ostatcima kojima prethode gvanini u lancu DNA (CpG
dinukleotidi). Metiliranje je povezano sa smanjenom transkripcijskom aktivnosti gena koji
sadre velik broj CpG dinukleotida u blizini promotora. Metiliranje inhibira transkripciju tih
gena tako da interferira s vezanjem nekih transkripcijskih aktivatora, kao i da pridruuje
represore koji se specifino veu na metiliranu DNA. Represori koji se veu na metiliranu
DNA djeluju kao kompleksi s histonskom deacetilazom, povezujui metiliranje DNA s
mijenjanjem acetiliranja histona i nukleosomske strukture.
Premda metiliranje DNA moe inhibirati transkripciju, openito se ini da su metilirani samo
oni geni koji su ve suprimirani. Metiliranje DNA naelno prije slui stabiliziranju i
odravanju inaktivacije tijekom razvoja, nego to je zapravo primarni uzrok inaktiviranja
transkripcije. Primjerice, geni na inaktivnom X kromosomu metiliraju se nakon represije
transkripcije pomou Xist RNA i metiliranja lizina-9 na histonu H3, to moe sluiti za
usmjeravanje enzima odgovornih za indukciju metiliranja DNA na inaktivne gene. U biljkama
je takoer sugerirano da nekodirajue RNA usmjeravaju metiliranje DNA suprimiranih gena.
15
Vana regulatorna uloga metiliranja DNA predstavljena je pojavom znanom kao

genomski otisak (engl. ***), koja kontrolira ekspresiju nekih gena djelatnih u embrionalnom
razvoju sisavaca. U veini sluajeva, oba alela, majin i oev, bivaju eksprimirani u
diploidnim stanicama. Meutim, postoji mali broj otisnutih gena (preko dvadeset opisanih u
mia i ovjeka) ija ekspresija ovisi o tome jesu li naslijeeni od majke ili od oca. U nekim je
sluajevima eksprimiran samo oev alel otisnutog gena, a majin je alel transkripcijski
inaktivan. Za druge otisnute gene majin je alel aktivan, a oev inaktivan.
ini se da metiliranje DNA igra kljunu ulogu u razlikovanju izmeu majinih i
oevih alela otisnutih gena. Dobar je primjer gen H19, koji se transkribira samo s majine
kopije (slika 6.37). H19 gen je specifino metiliran tijekom razvoja mukih, ali ne i enskih
spolnih stanica. Spajanje spermatozoida s jajnom stanicom u trenutku oplodnje daje embrij
koji sadri metilirane oeve i nemetilirane majine alele tog gena. Ta se razlika u metilaciji
zadrava i nakon replikacije DNA te specifinog metiliranja oevog lanca (slika 6.38). Oev
H19 alel stoga ostaje metiliran i transkripcijski inaktivan u embrionalnim stanicama i
somatskim tkivima. Meutim, oev H19 alel demetilira se u germinativnoj liniji, omoguujui
uspostavu novog uzorka metilacije u sljedeoj generaciji.
1.4. Obrada i promet RNA
Premda je transkripcija prvi i vrlo ureeni korak u genskoj ekspresiji, obino predstavlja
poetak niza dogaanja potrebnih za nastanak funkcionalne RNA. Veina novosintetiziranih
RNA mora se modificirati na razliite naine da bi bila prevedena u funkcionalni oblik.
Bakterijske su mRNA iznimke; one se odmah koriste kao kalupi za sintezu proteina, dok se
jo transkribiraju. Meutim, primarni transkripti rRNA i tRNA moraju proi niz koraka
obrade, kako u prokariotskim tako i u eukariotskim stanicama. Slino, primarni transkripti
eukariotskih mRNA prolaze intenzivne modifikacije, kao uklanjanje introna prekrajanjem,
prije nego se transportiraju iz jezgre u citoplazmu, gdje slue kao kalup za sintezu proteina.
Regulacija koraka obrade osigurava dodatni stupanj kontrole genske ekspresije, kao i
regulacija brzine kojom razliite mRNA bivaju razgraene u stanici.
1.4.1. Obrada ribosomalnih i transportnih RNA
Osnovna obrada ribosomalnih i transportnih RNA slina je u prokariotskim i u eukaritskim
stanicama, kako se moe i oekivati s obzirom na fundamentalnu ulogu tih RNA u sintezi
proteina. Kako je ve razmatrano eukarioti imaju etiri vrste ribosomalne RNA (vidi Tablica
6.1), tri su od njih (28S, 18S i 5,8 rRNA) derivati cijepanja jednog dugog prekursorskog
transkripta, nazvanog pre-rRNA (slika 6.39). Prokarioti imaju tri ribosomalne RNA (23S,
16S i 5S), ekvivalentne 28S, 18S i 5S rRNA eukariotskih stanica i takoer su nastale obradom
jednog pre-rRNA transkripta. Jedina rRNA koja se ne obrauje sveobuhvatno jest 5S rRNA u
eukariotima, koja se transkribira s odvojenog gena.
Prokariotske i eukariotske pre-rRNA obrauju se u nekoliko koraka. Inicijalno
cijepanje bakterijske pre-rRNA daje odvojene prekursore za tri individualne rRNA; one se
dalje obrauju sekundarnim cijepanjem u konane produkte. U eukariotskim stanicama, prerRNA prvo se cijepa na mjestu koje je u blizini 5,8S rRNA na njenoj 5' strani, dajui dva
odvojena prekursora koji sadre 18S i 28S + 5,8S rRNA. Daljnje cijepanje prevodi ih u
konane produkte, s 5,8S rRNA vezanom vodikovim vezama na 28S molekulu. Osim ovih
cijepanja, obrada rRNA ukljuuje dodatak metilne skupine na bazu i eerni dio specifinih
nukleotida. Obrada rRNA dogaa se u nukleolusu eukariotskih stanica, o emu e biti govora
u 8. poglavlju.
Slino rRNA, tRNA u bakterijama i eukariotima sintetiziraju se kao duge prekursorske
molekule (pre-tRNA), od kojih neke sadre nekoliko individualnih tRNA sljedova (slika
6.40). U bakterijama neke tRNA nalaze se u pre-rRNA transkriptima. Obrada 5' kraja pretRNA ukljuuje cijepanje enzimom nazvanim RNaza P, koje je posebno zanimljivo s obzirom
16
da predstavlja prototipni model reakcije katalizirane RNA enzimom. RNaza P sastoji se od

RNA i proteinske molekule, a obje su potrebne za maksimalnu aktivnost. Godine 1983.
Sidney Altman i suradnici pokazali su da je izolirana RNA komponenta RNaze P sposobna
katalizirati pre-tRNA cijepanje. Prema tim je pokusima RNaza P ribozim enzim u kojem
je prije RNA nego protein odgovorna za katalitiku aktivnost.
3' kraj tRNA nastaje djelovanjem konvencionalnog proteina RNaze, ali obrada tog
kraja tRNA molekule takoer ukljuuje neobinu aktivnost: dodatak CCA kraja. Sve tRNA
imaju CCA slijed na 3' krajevima. Taj je slijed mjesto privezivanja aminokiseline, potrebno
za tRNA funkciju tijekom sinteze proteina. CCA kraj nekih tRNA kodiran je DNA slijedom,
ali kod drugih nije, stoga se dodaje kao korak obrade RNA enzimom koji prepoznaje i
nadodaje CCA na 3' kraj svih tRNA koje nemaju taj slijed.
Drugi je neobian aspekt obrade tRNA sveobuhvatna modifikacija baza u tRNA
molekuli. Oko 10% svih baza u tRNA molekuli promijenjeno je i daje tako razliite
modificirane nukleotide na specifinim poloajima u tRNA molekulama (vidi sliku 6.40).
Funkcije su veine tih modificiranih baza nepoznate, ali neke su vane u sintezi proteina tako
to mijenjaju svojstva tRNA, s obzirom na sparivanje komplementarnih baza (vidi 7.
poglavlje).
Neke pre-tRNA, kao i pre-rRNA u malom broju organizama, sadre introne koji se
uklanjanju prekrajanjem. U opreci spram drugih reakcija prekrajanja, koje (kako e biti
razmatrano u sljedeem odjeljku) obuhvaaju djelovanje katalitikih RNA, prekrajanje tRNA
posredovano je konvencionalnim proteinskim enzimima. Endonukleaza cijepa pre-tRNA na
mjestu prekrajanja da bi izrezala intron, nakon ega slijedi spajanje eksona i nastanak zrele
molekule tRNA.
1.4.2. Obrada mRNA u eukariotima
Nasuprot obradi ribosomalnih i transportnih RNA, obrada glasnikih RNA predstavlja
najveu razliku izmeu prokariotskih i eukariotskih stanica. U bakterijama, ribosomi imaju
izravan pristup mRNA molekuli u nastajanju i translacija zapravo zapoinje na nastajuem
mRNA lancu jo dok traje transkripcija. U eukariotima, mRNA sintetizirana u jezgri mora se
prvo transportirati u citoplazmu, prije nego to se moe upotrijebiti kao kalup za sintezu
proteina. tovie, poetni produkti transkripcije u eukariotskim stanicama (pre-mRNA)
sveobuhvatno se modificiraju prije izlaska iz jezgre. Obrada mRNA obuhvaa modifikaciju
oba kraja primarnoga transkripta, kao i uklanjanje introna (slika 6.41). Reakcije obrade prije
su povezane s transkripcijom, nego to su neovisni dogaaji koji slijede nakon sinteze premRNA. Tako su sinteza mRNA i njena obrada tijesno koordinirani koraci u ekspresiji gena.
Domena na C-kraju (CTD) RNA-polimeraze II igra kljunu ulogu u koordiniranju tih procesa,
sluei kao vezno mjesto za enzimske komplekse ukljuene u obradu mRNA. Zdruivanje tih
enzima za obradu RNA s CTD polimeraze II pridonose njihovoj specifinosti u procesu
obrade mRNA; polimeraze I i III nemaju CTD, tako se njihovi transkripti ne obrauju istim
enzimskim kompleksima.
Prvi je korak u procesu obrade mRNA modificiranje 5' kraja transkripta dodavanjem
strukture nazvane 7-metilgvanozinska kapa. Enzimi odgovorni za dodavanje kape pridruuju
se fosforiliranoj CTD, slijedei zapoinjanje transkripcije, a kapa se dodaje nakon
transkripcije prvih 20-30 nukleotida RNA. Dodavanje kape inicirano je dodatkom GTP u
obrnutoj orijentaciji na 5' krajnji nukleotid RNA. Nakon toga dodaje se metilna skupina na G
bazu i na ribozni dio jednog ili dva nukleotida na 5' kraju RNA lanca. 5' kapa stabilizira RNA
i svrstava eukariotske mRNA na ribosomima tijekom translacije (vidi 7. poglavlje).
3' kraj veine eukariotskih mRNA nije definiran zaustavljanjem transkripcije, nego
cijepanjem primarnog transkripta i dodavanjem poli-A-repa reakcija procesa obrade
nazvana poliadenilacija (slika 6.42). Signali za poliadenilaciju obuhvaaju visoko
konzervirane heksanukleotide (AAUAAA u stanicama sisavaca), smjetene 10 do 30
17
nukleotida uzvodno od mjesta poliadenilacije, i G-U bogati nizvodni sljedni element. Osim
toga, neki geni imaju U-bogate sljedne elemente uzvodno od AAUAAA. Te sljedove
prepoznaje proteinski kompleks koji obuhvaa endonukleaze to cijepaju RNA lanac i
odvojenu poli-A polimerazu koja dodaje poli-A rep od oko 200 nukleotida na transkript.
Enzimi djelatni u procesu obrade povezani su s fosforiliranom CTD RNA-polimeraze II i
mogu putovati s polimerazom od mjesta zapoinjanja transkripcije do kraja. Cijepanje i
poliadenilacijski signal zaustavljanja transkripcije obino se pojavljuju nekoliko stotina
nukleotida nizvodno od mjesta dodavanja poli-A.
Gotovo su sve mRNA u eukariotima poliadenilirane, a poli-A rep, pokazano je,
regulira i translaciju i stabilnost mRNA. Osim toga, poliadenilacija igra vanu regulatornu
ulogu u ranom razvoju, gdje promjene duljine poli-A repova kontroliraju translaciju mRNA.
Primjerice, mnoge mRNA uskladitene su u neoploenim jajima u obliku neprimjerenom za
translaciju s kratkim poli-A repovima (obino 30 do 50 nukleotida dugom). Oplodnja
stimulira produljivanje poli-A repova usladitenih mRNA, to potom aktivira njihovu
translaciju i sintezu proteina potrebnih za rani embrionalni razvoj.
Najdojmljivija je modifikacija pre-mRNA uklanjanje introna prekrajanjem. Kao to je
razmatrano u 4. poglavlju, kodirajui sljedovi veine eukariotskih gena isprekidani su
nekodirajuim sljedovima (intronima) koji se precizno izrezuju iz zrele mRNA. U sisavaca,
veina gena sadri viestruke introne, koji pridonose veliini pre-mRNA od oko deset puta
veoj nego kad bi sadravala samo eksone. Neoekivano otkrie introna 1977. godine
usmjerilo je istraivake napore u smjeru razumijevanja mehanizma prekrajanja, vrlo
specifinog za stvaranje funkcionalne mRNA. Daljnja istraivanja prekrajanja nisu samo
rasvijetlila nove mehanizme regulacije gena, nego su razotkrila neobine katalitike
aktivnosti RNA molekula.
1.4.3. Mehanizam prekrajanja
Klju je razumijevanja prekrajanja pre-mRNA razvoj in vitro sustava koji efikasno izvodi
reakciju prekrajanja (slika 6.43). Pre-mRNA sintetiziraju se in vitro kloniranjem strukturnih
gena (s njihovim intronima) u blizinu promotora za bakteriofagne RNA-polimeraze koje se
mogu izolirati u velikim koliinama. Transkripcija tih plazmida moe se potom koristiti za
pripravu velikih koliina mRNA, koje, kad se dodaju nuklearnom ekstraktu stanica sisavaca,
bivaju korektno prekrojene. Kao kod transkripcije, primjena ovakvih in vitro sustava
omoguuje detaljnije istraivanje prekrajanja nego bi to bilo mogue u cjelovitim stanicama.
Analiza reakcijskih produkata i poluproizvoda nastalih in vitro razotkrila je da se
prekrajanje mRNA odvija u dva koraka (slika 6.44). Prvo, mRNA se cijepa na 5' mjestu za
prekrajanje i 5' kraj introna spaja se s adeninskim nukleotidom unutar introna (blizu 3' kraja).
U ovom koraku nastaje neobina veza izmeu 5' kraja introna i 2' hidroksilne skupine
adeninskog nukleotida. Nastali intermedijer slian je lasu u kojem intron pravi omu. Drugi
korak u prekrajanju odvija se istodobnim cijepanjem na 3' mjestu za prekrajanje i
sljepljivanjem (ligacijom) dva eksona. Intron je tako isjeen u obliku lasa, biva potom
lineariziran i razgraen u jezgri cjelovite stanice.
Ove reakcije definiraju tri kritina sljedna elementa u mRNA: slijed na 5' mjestu za
prekrajanje, slijed na 3' mjestu za prekrajanje i slijed unutar introna na toki grananja (mjesto
gdje se 5' kraj introna povezuje da bi nastala struktura slina lasu) (vidi sliku 6.44). PremRNA sadri sline dogovorene sljedove na svakoj od navedenih pozicija, omoguavajui
maineriji za prekrajanje da prepozna pre-mRNA i izvede reakcije cijepanja i sljepljivanja
obuhvaene procesom prekrajanja.
Biokemijska analiza nuklearnih ekstrakata otkrila je da se prekrajanje odvija u velikim
kompleksima nazvanim tjelecima za prekrajanje (engl.spliceosom) koji se sastoje od proteina
i RNA. RNA komponente tjeleaca za prekrajanje svrstane su u pet skupina malih nuklearnih
RNA (snRNA) nazvanim U1, U2, U4, U5 i U6. Te snRNA, veliine od oko 50 do 200
18
nukleotida (KLJUNI POKUS 2: Otkrie snRNP, str. 268), nalaze se u kompleksu sa est
do deset proteinskih molekula tvorei male nuklearne ribonukleoproteinske estice
(snRNP) koje igraju sredinju ulogu u procesu prekrajanja. U1, U2 i U5 snRNP svaka sadri
jednu snRNA molekulu, dok su U4 i U6 snRNA meusobno kompleksirane u jednu snRNP.
Prvi je korak u zdruivanju tjeleca za prekrajanje vezivanje U1snRNP na 5' mjesto za
prekrajanje pre-mRNA (slika 6.45). Prepoznavanje 5' mjesta za prekrajanje obuhvaa
sparivanje baza izmeu 5' dogovorenog sljeda za prekrajanje i komplementarnog sljeda na 5'
kraju U1 snRNA (slika 6.46). Potom se U2 snRNP vee na toku grananja slinim
komplementarnim sparivanjem izmeu U2 snRNA i sljeda toke grananja. Ve nastali
kompleks sastavljen od U4/U6 i U5 snRNP ugrauje se u tjelece za prekrajanje, s
vezivanjem U5 na slijed uzvodno od 5' mjesta za prekrajanje. Reakcija prekrajanja povezana
je s rearanmanom snRNA. Disocijacija U6 od U4 i premjetanje U1 na 5' mjesto za
prekrajanje prethode prvom koraku u procesu prekrajanja (nastanak poluproizvoda strukturno
slinog lasu). U5 se nakon toga vee na sljedove na 3' mjestu za prekrajanje, iza ega slijedi
isjecanje introna i sljepljivanje eksona.
SnRNA ne samo da prepoznaju dogovorene sljedove na toki grananja i mjestima
prekrajanja, one takoer izravno kataliziraju reakciju prekrajanja. Katalitika uloga RNA u
procesu prekrajanja pokazana je otkriem nekih RNA sposobnih za samo-prekrajanje; one
mogu katalizirati uklanjanje vlastitih introna u odsutnosti drugih proteina ili RNA imbenika.
Samo-prekrajanje prvi put je opisao Tom Cech i suradnici prouavajui 28S rRNA u protozoi
Tetrahymena. Ta RNA sadri intron veliine od oko 400 baza koji se precizno uklanja nakon
inkubacije pre-rRNA u odsutnosti dodanih proteina. Daljnji su studiji objelodanili da je
prekrajanje katalizirano intronom, koji djeluje kao ribozim upravljajui isjecanjem samoga
sebe iz pre-rRNA. Otkrie samo-prekrajajuih rRNA Tetrahymene zajedno s ipitivanjem
RNaze P, o emu je bilo rijei, prvi je put ukazalo na katalitiku aktivnost RNA.
Daljnja ispitivanja razotkrila su samo-prekrajajue RNA u mitohondrijima,
kloroplastima i bakterijama. Samo-prekrajajue RNA svrstane su u dvije skupine na osnovi
reakcijskog mehanizma samo-prekrajanja (slika 6.47). Prvi je korak u prekrajanju skupine 1
introna (primjerice, Tetrahymena pre-rRNA) cijepanje na 5' mjestu za prekrajanje
posredovano gvanozinskim kofaktorom. 3' kraj slobodnog eksona potom reagira s 3' mjestom
za prekrajanje da bi se isjekao intron kao linerana RNA. Nasuprot tome, samo-prekrajajue
reakcije skupine II introna (primjerice, neke mitohondrijske pre-mRNA) jako nalikuju
nuklearnom prekrajanju mRNA kod kojeg do cijepanja 5' mjesta za prekrajanje dolazi zbog
napada adenozinskog nukleotida u intronu. Kao i kod pre-mRNA prekrajanja nastaje
poluproizvod slian lasu koji se izrezuje.
Slinost izmeu prekrajanja pre-mRNA posredovanog tjelecima za prekrajanje i
samo-prekrajanja skupine II introna sugerira da su aktivne katalitike komponente tjeleca za
prekrajanje prije RNA nego proteini. Precizno, slinosti ukazuju da je prekrajanje pre-mRNA
katalizirano snRNA u tjelecu za prekrajanje. Nastavak istraivanja pre-mRNA prekrajanja
potkrijepilo je taj stav time to je pokazano da U2 i U6 snRNA u odsutnosti proteina mogu
katalizirati prvi korak u prekrajanju pre-mRNA. Smatra se da proces prekrajanja pre-mRNA
jest reakcija utemeljena na RNA, snRNA u tjelecu za prekrajanje djeluje analogno skupini II
samo-prekrajajuih introna. Unutar stanice, proteinske komponente snRNP takoer su
potrebne i participiraju kako u zdruivanju tjeleca za prekrajanje tako i u samoj reakciji
prekrajanja.
Brojni proteinski imbenici prekrajanja, koji nisu snRNP, takoer igraju vanu ulogu u
zdruivanju tjeleaca za prekrajanje, posebice u identifikaciji korektnog mjesta za prekrajanje
u pre-mRNA (slika 6.48). Pre-mRNA sisavaca uobiajeno sadri kratke eksone (prosjeno
oko 150 nukleotida u ljudi) razdvojene mnogo veim intronima (prosjeno 3500 nukleotida).
Introni esto sadre vie sljedova koji odgovaraju mjestu prekrajanja, tako mainerija za
19
prekrajanje mora biti sposobna identificirati odgovarajua 5' i 3' prekrajajua mjesta u
graninom podruju introna/eksona da bi nastale funkcionalne mRNA. Prekrajajui faktori
slue za upravljanje tjeleca za prekrajanje na korektno mjesto prekrajanja vezivanjem na
specifine RNA sljedove unutar eksona, pridruujui potom U1 i U2 snRNP na odgovarajua
mjesta na pre-mRNA interakcijama protein-protein. Osim toga, prekrajajui faktori povezuju
prekrajanje s transkripcijom, zdruujui se s fosforiliranom CTD RNA-polimeraze II. To sidri
maineriju za prekrajanje na RNA-polimerazu to je vano za jamenje da e se eksoni
slijepiti korektnim redosljedom kako je pre-mRNA sintetizirana.
1.4.4. Alternativno prekrajanje
Sredinja uloga prekrajanja u procesu obrade pre-mRNA otvara mogunosti regulacije genske
ekspresije kontrolom prekrajajue mainerije. Budui da veina pre-mRNA sadri brojne
introne, razliite mRNA mogu nastati iz istoga gena razliitim kombinacijama 5' i 3' mjesta za
prekrajanje. Mogunost da se eksoni spoje meusobno u raznim kombinacijama baca novo
svjetlo na kontrolu genske ekspresije, jer se brojne mRNA (i stoga brojnih proteina) mogu
generirati iz iste pre-mRNA. Taj proces, nazvan alternativno prekrajanje, dogaa se esto u
genima sloenih eukariota. Primjerice, procijenjeno je da alternativnim prekrajanjem mogu
nastati tri ili vie mRNA od prosjenog gena sisavaca, znaajno poveavajui raznolikost
proteina koji su kodirani s 30 do 40 tisua gena u genomu sisavaca. S obzirom da alternativno
prekrajanje moe biti razliito u razliitim tkivima, ono osigurava vaan mehanizam za
specifinu tkivnu i razvojno reguliranu ekspresiju gena.
Dobro istraen primjer alternativnog prekrajanja specifinog za odreeno tkivo
predstavlja odreivanje spola u Drosophilae, gdje alternativno prekrajanje iste pre-mRNA
odreuje da li je muica enka ili mujak (slika 6.49). Alternativno prekrajanje pre-mRNA
gena nazvanog transformirajui (engl.transformer) kontrolirano je proteinom (SXL) koji je
eksprimiran samo u enkama. Transformirajua pre-mRNA ima tri eksona, ali razliiti drugi
ekson ugraen je u pre-mRNA kao rezultat upotrebe alternativnog 3' mjesta za prekrajanje u
dva razliita spola. U mujaka ekson 1 spaja se uzvodno od 3' mjesta, odabranog vezanjem
U2AF faktora prekrajanja na slijed u eksonu 2. U enkama SXL protein vee se na to mjesto u
eksonu 2, sprjeavajui vezanje U2AF. Dosljedno tome, uzvodno 3' mjesto prekrajanja
preskoeno je u enkama, a ekson 1 se umjesto toga spaja na alternativno mjesto prekrajanja
dalje silazno. Sljedovi u eksonu 2 u mujaka sadre kodon za terminaciju translacije, tako da
ne nastaje protein. Terminacijski kodon ne nalazi se u mRNA enki, tako da enke
eksprimiraju funkcionalni transformirajui protein, koji djeluje kao kljuni regulator spolnog
odreivanja.
Alternativno prekrajanje transformirajueg gena ilustrira djelovanje represora (SXL
protein) koji djeluje, sprjeavajui vezanje faktora prekrajanja (U2AF). U drugim
sluajevima, alternativno prekrajanje kontrolira se aktivatorima. Aktivatori pridruuju faktore
prekrajanja, mjestu prekrajanja koje na drugi nain ne bi bilo prepoznato. Brojni mehanizmi
mogu tako regulirati alternativno prekrajanje, a varijacije u alternativnom prekrajanju najvie
pridonose raznolikosti proteina eksprimiranih tijekom razvoja i diferencijacije.
1.4.5. Ureivanje RNA
Ureivanje RNA odnosi se na dogaanja u procesu obrade RNA (koji nisu prekrajanje) to
mijenjaju kodirajue sljedove proteina nekih mRNA. Taj neoekivani oblik procesa obrade
RNA otkriven je u mitohondrijskim mRNA Trypanosoma, gdje se U ostatci dodaju i briu na
vie mjesta u molekuli. Mnogo kasnije opisano je ureivanje mitohondrijskih mRNA drugih
organizama, mRNA iz kloroplasta viih biljaka te nuklearnih mRNA nekih gena sisavaca.
Ureivanje nuklearnih mRNA sisavaca, kao i mitohondrijskih i kloroplastnih RNA
viih biljaka, obuhvaa promjene jedne baze kao posljedice modifikacijskih reakcija, slino
onima djelatnim u procesu obrade tRNA. U stanicama sisavaca reakcije ureivanja RNA
obuhvaaju deaminiranje citozina u uridin i adenozina u inozin. Jedan od najbolje istraenih
20
primjera jest ureivanje mRNA za apolipoprotein B, lipoprotein koji sudjeluje u transportu

lipida u krvi. U tom sluaju, ureivanje RNA specifino za odreeno tkivo ima za posljedicu
dva oblika apolipoproteina B (slika 6.50). Kod ljudi, Apo-B100 (4536 aminokiselina)
sintetizira se u jetri translacijom neureene mRNA. Meutim, krai protein (Apo-B48, 2152
aminokiseline) nastaje sintezom u crijevima kao rezultat translacije ureene mRNA u kojoj je
C promijenjen u U deaminiranjem. Te alternativne promjene kodona za glutamin (CAA) u
neureenoj mRNA u kodon za terminaciju translacije (UAA) u ureenoj mRNA imaju za
posljedicu sintezu kraeg Apo-B proteina. Ekspresija strukturno i funkcionalno razliitih
proteina u jetri i crijevima proizlazi iz ureivanja Apo-B mRNA specifinog za tkivo. Protein
pune duljine, Apo-B100 nastao u jetri, transportira lipide u cirkulaciji; Apo-B48 djelatan je u
apsorpciji lipida iz hrane u crijevu.
Ureivanje RNA deaminiranjem adenozina u inozin najuobiajeniji je oblik ureivanja
nuklearne RNA u sisavaca. Taj oblik ureivanja igra vanu ulogu u nervnom sustavu, gdje Au-I ureivanje ima za posljedicu izmjene jedne aminokiseline u receptorima za neke signalne
molekule na povrini neurona. Vanost reakcije ureivanja jasno je pokazano upotrebom
homologne rekombinacije za inaktiviranje gena koji kodira enzim odgovoran za A-u I
ureivanje u mia (vidi 3. poglavlje). Mievi koji nemaju taj enzim umiru u mladoj dobi
nakon ponavljanih epileptikih napada kao posljedice disfunkcije neprikladno ureenih
receptora.
1.4.6. Razgradnja RNA
Iz koraka u procesu obrade, razmatranih u prethodnom dijelu, proizlaze zrele mRNA koje se
prenose u citoplazmu da bi upravljale sintezom proteina. Meutim umjesto toga, veina se
sljedova transkribiranih u mRNA razgrauje u jezgri. Preko 90% pre-mRNA predstavljaju
intronski sljedovi koji se razgrauju u jezgri nakon izrezivanja u procesu prekrajanja.
Razgradnju izvodi enzim koji prepoznaje jedinstveni 2'-5' vez nastao u toki grananja, kao i
enzim koji prepoznaje ili 5' ili 3' krajeve RNA molekula i katalizira degradaciju RNA u oba
smjera. 5' i 3' krajevi mRNA zatieni su od djelovanja degradacijske mainerije dodavanjem
kape i poliadenilacijom, dok nezatieni krajevi introna bivaju prepoznati i razgraeni.
Osim za razgradnju introna, stanice posjeduju sustav za kontrolu kvalitete (nazvan
nesmisleno-posredovana razgradnja mRNA) koji vodi u razgradnju mRNA bez cjelovitog
okvira itanja. To eliminira defektne mRNA molekule i sprjeava sintezu nenormalno
skraenih proteina. Nesmisleno-posredovana razgradnja mRNA u kvasaca dogaa se u
citoplazmi, a izazvana je onda kada se ribosom sretne s preranim terminacijskim kodonom
tijekom sinteze proteina. U sisavaca, meutim, dogaa se najmanje nekoliko nesmislenoposredovanih razgradnji mRNA u jezgri. Mehanizam kojim se prepoznaju terminacijski
kodoni unutar jezgre stanica sisavaca nije rasvijetljen, premda istraivanja u posljednje
vrijeme ukazuju da bi ribosomi unutar jezgre mogli biti djelatni u prepoznavanju i tovie
translaciji nuklearnih mRNA.
Krajnji aspekt procesa obrade RNA molekule jest njezina eventualna degradacija u
citoplazmi. S obzirom da je unutarstanina razina bilo koje RNA odreena ravnoteom
izmeu sinteze i razgradnje, brzina kojom se individualne RNA razgrauju jest druga razina
na kojoj se moe kontrolirati ekspresija gena. Obje, ribosomalna i transportna RNA, stabilne
su, a ta stabilnost uvelike doprinosi visokoj razini tih RNA (vie od 90% svih RNA) i u
prokariotskim i u eukariotskim stanicama. Suprotno tome, bakterijske se RNA brzo
razgrauju, obino imaju poluivot od 2 do 3 minute. Taj brzi promet bakterijskih mRNA
omoguava stanici da odgovori brzo na promjene u okoliu, kao to su promjene u
nutrientima potrebnim za rast. U eukariotskim stanicama, meutim, razliite mRNA
razgrauju se razliitim brzinama, to predstavlja dodatni imbenik u regulaciji genske
ekspresije u eukariotima.
21
Citoplazmatska razgradnja veine eukariotskih mRNA inicirana je skraivanjem

njihovih poli-A repova. Nakon toga slijedi uklanjanje 5' kape i razgradnja RNA nukleazama
djelatnim na oba kraja. Poluivot mRNA u stanicama sisavaca kree se od 30 minuta do oko
20 sati. Nestabilne mRNA esto kodiraju regulatorne proteine, ukljuujui neke
transkripcijske faktore ija se stanina razina brzo mijenja u skladu s poticajima iz okolia. Te
mRNA esto sadre specifine AU-bogate sljedove blizu svojih 3' krajeva koje, kako se ini,
signaliziraju brzu degradaciju promiui deadeniliranje.
Stabilnost nekih mRNA moe se regulirati u skladu s vanstaninim signalima. Dobar
je primjer mRNA koja kodira transferinski receptor protein smjeten na povrini stanice
djelatan u procesu unoenja eljeza u stanicu sisavaca. Koliina transferinskih receptora
regulirana je dostupnou eljeza, najvie kao rezultat moduliranja stabilnosti njihovih mRNA
(slika 6.51). U prisutnosti odgovarajue koliine eljeza mRNA za transferinske receptore
brzo se razgrauje kao posljedica nukleaznog cijepanja na sljedovima u blizini 3' kraja. Ako je
snabdjevenost eljezom neodgovarajua, onda je mRNA stabilizirana, iz ega proizlazi
poveana sinteza transferinskih receptora i vee unoenje eljeza u stanicu. Ova je regulacija
posredovana proteinom koji se vee na specifine sljedove (nazvane elementi odgovorni za
eljezo, engl. iron response element, IRE) u blizini 3' kraja mRNA za transferinski receptor i
tako titi mRNA od cijepanja. Vezanje regulatornog proteina na IRE je pak kontrolirano
razinom eljeza unutar stanice: ako stanica oskudijeva u eljezu, protein se vee na IRE ime
zatiuje mRNA za transferinski receptor od razgradnje. Sline promjene stabilnosti drugih
mRNA ukljuene su u reguliranje genske ekspresije nekim hormonima. Premda transkripcija
ostaje primarna razina na kojoj se regulira ekspresija gena, varijacije u brzini razgradnje
mRNA takoer imaju vanu ulogu u kontroli ustaljenog stanja mRNA u stanici.
KLJUNI POJMOVI
SAETAK
RNA-polimeraza, promotor, otisak stopala
operon, operator, represor, cis-djelujui

kontrolni elementi, trans-djelujui faktori
TRANSKRIPCIJA U PROKARIOTIMA
RNA-polimeraza i transkripcija: E. coli
RNA-polimeraza sastoji se od ,,, i
podjedinica. Transkripcija zapoinje
vezanjem na promotorski slijed. Nakon
sinteze oko prvih 10 nukleotida RNA, sr
enzima disocira od i putuje du kalupa
DNA kako produljuje novosintetizirani RNA
lanac. Transkripcija se nastavlja dok ne naie
na terminacijski signal.
Represori i negativna kontrola
transkripcije: prototipni je model za gensku
regulaciju u bakterijama lac operon, reguliran
vezanjem represora na specifini slijed u
DNA unutar promotora.
Pozitivna kontrola transkripcije: neki
bakterijski geni regulirani su prije
transkripcijskim aktivatorima nego
represorima.
TRANSKRIPCIJA U EUKARIOTIMA
Eukariotske RNA-polimeraze: eukariotske
stanice sadre tri razliite nuklearne RNApolimeraze to transkribiraju gene koji
kodiraju mRNA (polimeraza II), rRNA
(polimeraza I i III) te tRNA (polimeraza III).
22
transkripcijski faktori, opi transkripcijski

faktori, TATA-slog, TATA-vezujui protein
(TBP), TBP-zdrueni faktor (TAF),
posrednik
pojaivai, inzulatori
test pomaka elektroforetske pokretljivosti,

DNA-afinitetna kromatografija
transkripcijski aktivator, domena cinkova
prsta, receptor za steroidni hormon,
uzvojnica-obrat-uzvojnica, homeodomena,
homeo-slog, leucinski zatvara, uzvojnicaoma-uzvojnica, koaktivator
korepresor
Opi transkripcijski faktori i zapoinjanje

transkripcije RNA-polimerazom II:
eukariotske RNA-polimeraze ne veu se
izravno za promotorske sljedove; one trebaju
dodatne proteine (ope transkripcijske
faktore) za zapoinjanje transkripcije.
Promotorske sljedove mnogih gena koje
transkribira polimeraza II prepoznaju proteini
koji se vezuju na TATA-slog, oni pridruuju
dodatne transkripcijske faktore i RNA
polimerazu do promotora.
Transkripcija RNA-polimerazom I i III:
RNA-polimeraze I i III takoer trebaju
dodatne transkripcijske faktore da bi se
vezale na promotore gena koji kodiraju
rRNA, tRNA i neke snRNA.
REGULACIJA TRANSKRIPCIJE U
EUKARIOTIMA
Cis-djelujui regulatorni sljedovi:
promotori i pojaivai: Transkripcija
eukariotskih gena kontrolirana je proteinima
koji se veu na regulatorne sljedove udaljene
do nekoliko kilobaza od mjesta zapoinjanja
transkripcije. Pojaivai tipino sadre vezna
mjesta za vie proteina koji zajednikim
djelovanjem reguliraju gensku ekspresiju.
Proteini koji reguliraju transkripciju:
mnogi eukariotski transkripcijski faktori
izolirani su na temelju vezanja na specifine
DNA sljedove.
Struktura i funkcija transkripcijskih
aktivatora: transkripcijski su aktivatori
modularni proteini koji se sastoje iz razliitih
domena, jedne se veu na DNA, a druge su
aktivacijske domene. Domene koje se veu
na DNA posreduju zdruivanje sa specifinim
regulatornim sljedovima; aktivacijske
domene stimuliraju transkripciju stupajui u
interakciju s posrednikim proteinima i
opim transkripcijskim faktorima, kao i
koaktivatorima koji modificiraju kromatinsku
strukturu.
Eukariotski represori: genska ekspresija u
eukariotskim stanicama regulirana je kako
represorima tako i aktivatorima. Neki
represori interferiraju s vezanjem aktivatora
ili opih transkripcijskih faktora na DNA.
Drugi pak represori sadre diskretne
represijske domene koje inhibiraju
transkripciju stupajui u interakciju ili s
23
HMGN proteini, acetiliranje histona,

histonski kod, faktori koji remodeliraju
nukleosome, elongacijski faktori
inaktivacija X kromosoma
genomski otisaj
pre-rRNA, pre-tRNA, RNaza P, ribozim
opim transkripcijskim faktorima,

transkripcijskim aktivatorima ili
korepresorima koji djeluju na kromatinsku
strukturu.
Veza kromatinske strukture s
transkripcijom: pakiranje DNA u
nukleosome predstavlja prepreku za
transkripciju u eukariotskim stanicama.
Modificiranje histona acetiliranjem poveava
pristupanost nukleosomalne DNA
transkripcijskim faktorima i ta je modifikacija
kromatina usko vezana na regulaciju
transkripcije. Enzimi koji kataliziraju
acetiliranje histona zdrueni su s
transkripcijskim aktivatorima, dok histonske
deacetilaze s represorima. Histoni se takoer
modificiraju fosforiliranjem i metiliranjem, a
specifine modifikacije histona djeluju na
gensku ekspresiju, sluei kao vezna mjesta
za druge regulatorne proteine. Osim toga,
faktori koji remodeliraju nukleosome
olakavaju vezanje transkripcijskih faktora na
DNA mijenjanjem aranmana ili strukture
nukleosoma. RNA-polimeraze su potom
sposobne transkribirati kroz nukleosom
raskidanjem kontakata histona i DNA.
Elongacija transkripcije olakana je
nehistonskim HMGN kromosomalnim
proteinima i elongacijskim faktorima koji
pridruuju histonske acetil-transferaze kao i
djelujui izravno na kidanju nukleosomske
strukture.
Regulacija transkripcije nekodirajuim
RNA: Transkripcija moe biti regulirana
nekodirajuim RNA kao i regulatornim
proteinima. Inaktivacija X kromosoma
predstavlja primjer genske regulacije
nekodirajuim RNA u sisavcima.
Metiliranje DNA: Metiliranje citozinskog
ostatka moe sprijeiti transkripciju gena
kraljenjaka. Regulacija genske ekspresije
metiliranjem igra vanu ulogu u genomskom
otisku koji kontrolira transkripciju nekih gena
djelatnih u razvoju sisavaca.
PROCES OBRADE RNA I PROMET
Obrada ribosomalne i transportne RNA:
ribosomalne i transportne RNA derivati su
cijepanja dugih primarnih transkripata i u
prokariotskim i u eukariotskim stanicama.
Metilne se skupine dodaju na rRNA, a
24
pre-mRNA, 7-metilgvanozinska kapa, poliA rep, poliadenilacija

tjelece za prekrajanje, male nuklearne
RNA (snRNA), snRNP, samo-prekrajanje
alternativno prekrajanje
ureivanje RNA
mRNA razgradnja posredovana

nesmislenim sljedom
razliite se baze modificiraju u tRNA.

Obrada mRNA u eukariotima: eukariotske,
osim uklanjanja introna prekarajanjem, premRNA se modificiraju dodavanjem 7metilgvanozinske kape i 3' poli-A repa.
Mehanizam prekrajanja: prekrajanje
nuklearnih pre-mRNA dogaa se u velikim
kompleksima, nazvanim tjelecima za
prekrajanje, sastavljenim od proteina i malih
nuklearnih RNA (snRNA). SnRNA
prepoznaju sljedove na mjestima za
prekrajanje u pre-mRNA i kataliziraju samu
reakciju. Neke mitohondrijske, kloroplastne i
bakterijske RNA prolaze samo-prekrajanje u
kome je reakcija prekrajanja katalizirana
intronskim sljedom.
Alternativno prekrajanje: Eksoni se mogu
povezati u razliitim kombinacijama kao
posljedica alternativnog prekrajanja koje
predstavlja vaan mehanizam za kontrolu
genske ekspresije specifinu za odreeno
tkivo u sloenim eukariotima.
Ureivanje RNA: neke se mRNA
modificiraju u procesu obrade tako da se
mijenja slijed aminokiselina u proteinu koji je
njima kodiran. Ureivanje mitohondrijskih
mRNA u nekim protozoama obuhvaa
dodavanje i brisanje U ostataka na vie
mjesta u molekuli. Drugi oblici ureivanja
mRNA u biljkama i stanicama sisavaca
obuhvaaju modifikacije specifine baze.
Razgradnja RNA: introni se razgrauju u
jezgri, a nenormalne mRNA, kojima
nedostaje potpun otvoreni okvir itanja,
eliminiraju se raspadom posredovnim
nesmislenim mRNA. Funkcionalne mRNA u
eukariotskim stanicama razgrauju se na vie
naina, osiguravajui tako dodatne
mehanizme za kontrolu genske ekspresije. U
nekim sluajevima, brzina razgradnje mRNA
regulirana je signalima izvan stanice.
1.5. Pitanja
1.Kako laktoza inducira ekspresiju proteina koji su potrebni E. coli da uzme i metabolizira
laktozu?
2. Usuglaeni slijed E. coli 10 promotorskog elementa je TATAAT. Usporedite dva
promotora koji imaju 10 sljedove TATGAT i CATGAT. Koji ese slijed efikasnije
transkribirati prema Vaem oekivanju?
3. Radite s dva soja E. coli. Jedan sadri divlji tip gena za -galaktozidazu i jednu i mutaciju;
drugi sadri gen za -galaktozidazu koji je temperaturno osjetljiv i oc mutaciju. Nakon
25
spajanja tih sojeva, testirate produkciju -galaktozidazu kod doputene i nedoputene

temperature u odsutnosti laktoze. to oekujete da ete nai?
4. Kako DNA otiska stopala pokazuje gdje se protein vee na specifini DNA slijed?
5. Koja je uloga sigma () faktora u sintezi RNA u bakterijama?
6. Kako se zavrava mRNA u E. coli?
7. Eukariotske stanice imaju tri razliite RNA-polimeraze. Koje RNA nastaju transkripcijom
svake od njih?
8. Usporeujete to je potrebno za in vitro bazalnu transkripciju dva gena koji se
transkribiraju polimerazom II, od kojih jedan sadri TATA-slog a drugi sadri samo Inr slijed.
Jesu li za transkripciju od tih promotora potrebni TBP ili TFIID?
9. Kako se pojaivai razlikuju od promotora kao cis-djelujui regulatorni sljedovi u
eukariotima?
10. Istraujete pojaiva gena koji se normalno eksprimira samo u neuronima. Konstrukt u
kojemu je taj pojaiva povezan na reporterski gen eksprimiran je u neuronima ali ne u
fibroblastima. Meutim, ako mutirate specifini element sljeda unutar pojaivaa, dobit ete
ekspresiju i u fibroblastima i u neuronima. Koja bi se vrsta regulatornog proteina prema
Vaem oekivanju vezala na pojaivaki element?
11. Transkripcijski faktor aktivira transkripciju vezanjem na razliite DNA sljedove u
miinim i jetrenim stanicama. Kako bi alternativno prekrajanje moglo biti obuhvaeno u
odreivanju te tkivne specifinosti aktivatora?
12. Koja je funkcija inzulatora?
13. Objasnite mehanizam inaktivacije X kromosoma u ena?
KLJUNI POKUS 1.
(str. 251)
Izolacija eukariotskog transkripcijskog faktora
Afinitetno proiavanje proteina koji se vee na specifian slijed na DNA
James T. Kadonaga i Robert Tjian
Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1986,Volumen 83, str. 5889-5893
Kontekst
S istraivanjima lac operona Jacoba i Monoda postalo je jasno da je transkripcija regulirana
proteinima koji se veu na specifine DNA sljedove. Jedan od prototipnih sistema za
studiranje genske ekspresije u eukariotskim stanicama jest majmunski virus SV 40, u kojem je
identificirano nekoliko regulatornih DNA sljedova ranih 80. godina prolog stoljea. William
Dynan i Robert Tjian pokazali su 1983. da je jedan od tih sljednih elemenata (GC-slog)
specifino vezno mjesto za protein koji se moe detektirati u nuklearnom ekstraktu humanih
stanica. Protein (nazvan Sp1 za specifini protein 1) ne vee se samo za GC-slog, on takoer
stimulira transkripciju in vitro, pokazujui da je transkripcijski aktivator.
Da bi se mogao prouavati mehanizam djelovanja Sp1, bilo je potrebno imati transkripcijski
faktor u istom obliku i eventualno klonirati Sp1 gen. Izolacija istog Sp1 bila je nuna, ali
istodobno je to bio zastraujui tehniki izazov.
Sp1 i drugi transkripcijski faktori predstavljaju samo oko 0,001% ukupnih staninih
proteina, tako se oni ne mogu proistiti konvencionalnim biokemijskim tehnikama. James
Kadonaga i Robert Tjian rjeili su taj problem razvitkom metode DNA-afinitetne
kromatografije, metode kojom su proieni Sp1 i mnogi drugi eukariotski transkripcijski
faktori, otvarajui tako vrata za molekularnu analizu ragulacije transkripcije u eukariotskim
stanicama.
Pokus
Metoda DNA-afinitetne kromatografije Kadonage i Tjiana koristila je specifino visokoafinitetno vezanje Sp1 na GC-slog, GGGCGG. Sintetski oligonukleotidi koji sadre
mnogobrojne kopije tog sljeda vezani su na vrste kuglice, a grubi nuklearni ekstrakt prolazio
26
je kroz kolonu koja je sadravala kuglice na kojima je vazan GC-slog. Kuglice su potom
oprane da bi se isprali proteini koji se nisu specifino vezali na oligonukleotide. Konano su
kuglice oprane u puferu s visokom koncentracijom soli (0,5 M KCl) to raskida vezu Sp1 i
DNA, oslobaajui tako Sp1 s kolone.
Gel elektroforeza pokazala je da je grubi nuklearni ekstrakt dodan na poetku na
kolonu sloena mjeavina protein (vidi sliku). Suprotno tome, oko 90% proteina ponovno
dobiveno nakon dva ciklusa DNA-afinitetne kromatografije predstavljaju dva polipeptida,
koji su identificirani kao Sp1 na osnovi vezanja na DNA i djelovanja na transkripciju u in
vitro testovima. Tako je Sp1 uspjeno proien DNA-afinitetnom kromatografijom.
Utjecaj
U lanku iz 1986. Kadonaga i Tjian tvrdili su kako se tehnika DNA-afinitetne kromatografije
moe openito primijeniti u proiavanju drugih proteina koji se specifino veu sljedove
DNA. Pretpostavka je potvrena proiavanjem brojnih eukariotskih transkripcijskih
faktora upravo tom metodom. Geni koji kodiraju druge transkripcijske faktore izolirani su
alternativnim postupkom (razvijen neovisno 1988. u laboratoriju Phillipa Sharpa i Stevena
McKnighta) u kom se cDNA ekspresijska knjinica prosijava s oligonukleotidnom sondom da
bi se detektirali proteini koji se specifino veu na odreene sljedove. Mogunost izolacije
proteina koji se specifino veu na odreene sljedove DNA ovim metodama dovelo je do
detaljne karakterizacije strukture i funkcije velikog broja transkripcijskih regulatornih
proteina, osiguravajui temelj za nae dananje razumijevanje genske ekspresije u
eukariotskim stanicama.
Slika:
Proiavanje Sp1. Gel elektroforeza proteina poetno prisutnih u grubom nuklearnom
ekstraktu (kolona 1) i proteina dobivenih nakon jednog (kolona 2) ili dva ciklusa DNAafinitetne kromatografije (kolona 3). Veliina proteina markera (u kilodaltonima) oznaena je
na lijevoj strani gela, a Sp1 polipeptida strelicama.
KLJUNI POKUS 2.
(str. 268)
Otkrie snRNP
Protutijela na male nuklearne RNA u kompleksu s proteinima dobiveni su od pacijenata sa
sistemskim lupus eritematozusom
Michael R. Lerner i Joan A. Steitz
Yale University, New Haven, Connecticut
Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1979, volumen 76, str. 5495-5499.
Kontekst
Otkrie introna 1977. godine dalo je naslutiti da su potpuno nepredviene reakcije obrade
potrebne da bi nastala mRNA u eukariotskim stanicama. Introni se moraju precizno isjei iz
pre-mRNA nakon ega slijedi spajanje eksona i nastanak zrele mRNA molekule. Neoekivana
priroda prekrajanja pre-mRNA i njeno razumijevanje zaokupilo je panju mnogih
molekularnih biologa.
Jedan od najvanijih koraka u razumijevanju mehanizma prekrajanja bilo je otkrie snRNP i
njihovog djelovanja u prekrajanju.
Male jezgrine RNA identificirane su prvi put u eukariotskim stanicama kasnih 60.
godina prolog stoljea. Meutim, funkcija snRNA bila je nepoznata. U lanku 1979. Michael
Lerner i Joan Steitz pokazali su kako je veina snRNA prisutna kao kompleks RNA i proteina
nazvan snRNP. Osim toga, oni su po prvi put sugerirali da bi ti kompleksi RNA i proteina
mogli biti djelatni u prekrajanju pre-mRNA. Nakon identifikacije snRNP uslijedili su razliiti
pokusi koji su utvrdili njihovu ulogu i rasvijetlili mehanizam po kojem se odvija prekrajanje
pre-mRNA.
27
Pokus
Identifikacija snRNP temeljila se na upotrebi antiseruma dobivenih od pacijenata oboljelih od
sistemskog lupus eritematozusa, autoimune bolesti kod koje bolesnici stvaraju protutijela
naspram vlastitih, normalnih staninih sastojaka. Mnoga protutijela kod lupus eritematozusa
stvorena su naspram komponenti jezgre, obuhvaajui DNA, RNA i histone. Otkrie snRNP
proisteklo je iz istraivanja kojima su Lerner i Steitz nastojali okarakterizirati dva antigena,
nazvana ribonukleinski protein (RNP) i Sm, koji su bili prepoznati protutijelima dobivenim od
bolesnika s lupus eritematozusom. Neizravni su podatci su sugerirali da se RNP sastoji i iz
proteina i iz RNA, na to ukazuje samo ime, ali ni jedno ni drugo nije karakterizirano na
molekularnom nivou.
Da bi identificirali mogue imbenike RNP i Sm antigena, jezgrine RNA izolirane iz
mijih stanica radioaktivno su oznaene s 32P i potom imunoprecipitirane s antiserumima
bolesnika oboljelih od razliitih oblika lupus eritematozusa (vidi sliku 3.30). Pronaeno je
est razliitih vrsta snRNA koje su selektivno imunoprecipitirane antiserumima od razliitih
bolesnika, ali ne i serumom zdrave, kontrolne, osobe (vidi sliku). Anti Sm serum
imunoprecipitirao je svih tih est snRNA koje su oznaene U1a, U1b, U2, U4, U5 i U6. AntiRNP serum imunoprecipitirao je samo U1a i U1b, a serum treeg bolesnika (koji je
okarakteriziran kao veinom anti-RNP) imunoprecipitirao je U1a, U1b i U6.
Imunoprecipitirane snRNA naknadno su okarakterizirane analizom sljeda, koja je pokazala da
su U1a, U1b i U2 identini najeim snRNA ve poznatim u jezgrama sisavaca, a U1a i U1b
predstavljaju inaice iste vrste U1 snRNA prisutne u humanim stanicama. Nasuprot tomu, U4,
U5 i U6 snRNA jesu novootkrivene snRNA u ovom pokusu Lernera i Steitza.
Vano je istaknuti kako imunoprecipitacija ovih snRNA pokazuje da su one bile
komponente kompleksa RNA i proteina. Anti-Sm serum, koji je imunoprecipitirao svih est
snRNA, serum je naspram proteinskog antigena. Slino tomu, otprije je poznato kako je
protein potreban za prepoznavanje antigena anti-RNP-serumom. tovie, Lerner i Steitz
pokazali su da se nijedna snRNA ne bi mogla imunoprecipirati ako se prvo ukloni protein
ekstrakcijom RNA fenolom. Daljnja analiza stanica u kojima su proteini radioaktivno
oznaeni 35S-metioninom identificirala je sedam znaajnih nuklearnih proteina koji su
imunoprecipitirani skupa sa snRNA pomou anti-Sm i anti-RNP serumima. Ti podatci stoga
ukazuju da je svaka od est snRNA prisutna u snRNP kompleksu sa specifinim nuklearnim
proteinima.
Utjecaj
Otkrie da su snRNA komponente snRNP koji su prepoznati specifinim antiserumima
otvorila je novi pristup u istraivanju funkcije snRNA. Lerner i Steitz zamijetili su da bi
najintrigantnija mogua uloga snRNA bila u prekrajanju pre-mRNA te su naglasili da su
sljedovi u blizini 5 kraja U1 snRNA komplementarni mjestu prekrajanja.
Steitz i njeni suradnici ili su dalje s nizom pokusa kojima su pokazali kako su snRNP
kritini imbenici za snRNP u prekrajanju. Ta su istraivanja obuhvatila i dalekoseniju
analizu sljeda od one koja je ukazala na komplementarnost 5 konzerviranih sljedova U1
snRNA s usuglaenim sljedovima na mjestima prekrajanja, sugerirajui da U1 ima ulogu u
prepoznavanju 5 mjesta za prekrajanje. Osim toga, antiserumi naspram snRNP upotrijebljeni
su za pokazivanje da je U1 potrebna za pre-mRNA prekrajanje kako u izoliranim jezgrama
tako i u in vitro ekstraktima. Daljnja su istraivanja ukazala na vanost da snRNA ne samo u
identificiranju mjesta za prekrajanje, nego i kao katalizatori reakcije prekrajanja. Inicijalno
otkrie da su snRNA imbenici snRNP te da ih mogu prepoznati specifini antiserumi,
omoguilo je razumijevanje mehanizma prekrajanja pre-mRNA.
Slika:
Imunoprecipitacija snRNA antiserumima bolesnika oboljelih od lupus e
28
ritematozusa. Kolona 1, anti-Sm; kolona 2, normalni kontrolni serum; kolona 3, antiserum

koji primarno prepoznaje RNP antigen; kolona 4, anti-RNP. Obrati panju na to da je
nespecifina RNA oznaena X prisutna u svim imunoprecipitatima ukljuujui i kontrolu.
1.6.Osnovna i dodatna literatura
Transkripcija u prokariota
Busby, S. And R. H. Ebright. 1994. Promoter structure, promoter recognition, and
transcription activation in prokaryotes. Cell 79: 743-746. R
Darst, S. A. 2001. Bacterial RNA polymerase. Curr. Opin. Struc. Biol. 11: 155-162. R
Gilbert, W. And B. Muller-Hill. 1966. Isolation of the lac repressor. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 56: 1891-1899. P
Hochschild, A. And S. L. Dove. 1998. Protein-protein contacts that activate and repress
prokaryotic transcription. Cell 92: 597-600. R
Jacob, F. and J. Monod. 1961. Genetic and regulatory mechanisms in the synthesis of
proteins. J. Mol. Biol. 3: 318-356. P
Lewis, M., G. Chang, N. C. Horton, M. A. Kirchner, H. C. Pace, M. A. Schumacher, R. G.
Brennan and P. Lu. 1996. Crystal structure of the lactose operon repressor and its
complexes with DNA and inducer. Science 271: 1247-1254. P
Murakami, K. S., S. Masuda and S. A. Darst. 2002. Structural basis of transcription initiation:
RNA polymerase holoenzyme at 4 resolution. Science 296: 1280-1284. P
Ptashne, M. And A. Gann. 2002. Genes and Signals. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring
Harbor Laboratory Press.
Uptain, S. M., C. M. Kane and M. J. Chamberlin. 1997. Basic mechanisms of transcript
elongation and its regulation. Ann. Rev. Biochem. 66: 117-172. R
Vassylyev, D. G., S. Sekine, O. Laptenko, J. Lee, M. N. Vassylyeva, S. Borukhov and S.
Yokoyama. 2002. Crystal structrure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6
resolution. Nature 417: 712-719. P
Zhang, G., E. A. Campbell, L. Minakhin, C. Richter, K. Severinov and S. A. Darst. 1999.
Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 resolution. Cell 98:
811-824. P
Eukariotske RNA-polimeraze i opi transkripcijski faktori
Butler, J. E. F: and J. T. Kadonaga. 2002. The RNA polymerase II core promoter: a key
component in the regulation of gene expression. Genes Dev. 16: 2583-2592. R
Conaway, J. W., A. Shilatifard, A. Dvir and R. C. Conaway. 2000. Control of elongation by
RNA polymerase II. Trends Biochem. Sci. 25: 375-380. R
Cramer, P., D. A. Bushnell, J. Fu, A. L. Gnatt, B. Maier-Davis, N. E. Thompson, R. R.
Burgess, A. M. Edwards, P. R. David and R. D. Kornberg. 2000. Architecture of RNA
polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science 288: 640-649. P
Cramer, P., D. A. Bushnell and R. D. Kornberg. 2001. Structural basis of transcription: RNA
polymerase II at 2.8 resolution. Science 292: 1863-1876. P
Ebright, R. H. 2000. RNA polymerase structural similarities between bacterial RNA
polymerase and eukaryoric RNA polymerase II. J. Mol. Biol. 304: 687-698. R
Lee, T. I. And R. A. Young. 2000. Transcription of eukaryotic protein-coding genes. Ann. Rev.
Genet. 34: 77-137. R
Matsui, T., J. Segall, P. A. Weil and R. G. Roeder. 1980. Multiple factors are rquired for
accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase II. J. Biol. Chem. 255:
11992-11996. P
29
Myers, L. C. and R. D. Kornberg. 2000. Mediator of transcriptional regulation. Ann. Rev.

Biochem. 69: 729-749. R
Naar, A. M., B. D. Lemon and R. Tjian. 2001. Trancriptional coactivator complexes. Ann.
Rev. Biochem. 70: 475-501. R
Nikolov, D. B., H. Chen, E. D. Halay, A. A: Usheva, K. Hisatake, D. K. Lee, R. G. Roeder
and S. K. Burley. 1995. Crystal structure of a TFIIB-TBP-TATA-element ternary complex.
Nature 377: 119-128. P
Orphanides, G. and D. Reinberg. 2002. A unified theory of gene expression. Cell 108: 439451. R
Schramm, L. and N. Hernandez. 2002. Recruitment of RNA polymerase III to its target
promoters. Genes Dev. 16: 2593-2620. R
Weil, P. A., D. S. Luse, J. Segall and R. G. Roeder. 1979. Selective and accurate transcription
at the Ad2 major late promoter in soluble system dependent on purified RNA polymerase II
and DNA. Cell 18: 469-484. P
Woychik, N. A. and M. Hampsey. 2002. The RNA polymerase II machinery: structure
illuminates function. Cell 108: 453-463. R
Regulacija transkripcije u eukariota
Atchison, M. L. 1988. Enhancers: Mechanisms of action and cell specificity. Ann. Rev. Cell.
Biol. 4: 127-153. R
Banerji, J., S. Rusconi and W. Schaffner. 1981. Expression of a globin gene is enhanced by
remote SV40 DNA sequences. Cell 27: 299-308. P
Berger, S. L. 2002. Histone modification in transcriptional regulation. Curr. Opin. Genet. Dev.
12: 142-148. R
Bird, A. 2002. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16: 6-21. R
Brent, R. and M. Ptashne. 1985. A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA
specificity of a prokaryotic repressor. Cell 43: 729-736. P
Brownell, J. E., J. Zhou, T. Ranalli, R. Kobayashi, D. G. Edmondson, S. Y. Roth and C. D:
Allis. 1996. Tetrahymena histone acetyltransferase A: A homolog to yeast Gcn5p linking
histone acetylation to gene activation. Cell 84: 843-851. P
Bustin, M. 2001. Chromatin unfolding and activation by HMGN chromosomal proteins.
Trends Biochem. Sci. 26: 431-437. R
Cohen, D. E. and J. T. Lee.2002. X-chromosome inactivation and the search for chromosomewide silencer. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 219-224. R
Conaway, J. W., A. Shilatifard, A. Dvir and R. C. Conaway. 2000. Control of elongation by
RNA polymerase II. Trends Biochem. Sci. 25: 375-380. R
Courey, A. J. and S. Jia. 2001. Transcriptional repression: the long and short of it. Genes Dev.
15: 2786-2796. R
Dynan, W. S. and R. Tjian. 1983. The promoter-specific transcription factor Sp1 binds to
upstream sequences in the SV40 early promoter. Cell 35: 79-87. P
Ferguson-Smith, A. C. and M. A. Surani. 2001. Imprinting and epigenetic asymmetry between
parental genomes. Science 293: 1086-1089. R
Hanna-Rose, W. and U. Hansen. 1996. Active repression mechanisms of eukaryotic
transcription repressors. Trends Genet. 12: 229-234. R
Horn, P. J. and C. L. Peterson. 2002. Chromatin higher order folding: wrapping up
transcription. Science 297: 1824-1827. R
Jenuwein, T. and C. D. Allis. 2001. Translating the histone code. Science 293: 1074-1080. R
30
Kadonga, J. T. 1998. Eukaryotic transcription: An interlaced network of transcription factors

and chromatin-modifying machines. Cell 92: 307-313. R
Kadonga, J. T. and R. Tjian. 1986. Affinity purification of sequence-specific DNA-binding
proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5889-5893. P
Lee, T. I. and R. A. Young. 2000. Transcription of eukaryotic protein-coding genes. Ann. Rev.
Genet. 34: 77-137. R
Licht, J. D., M. J. Grossel, J. Figge and U. M. Hansen. 1990. Drosophila Krppel protein is a
transcriptional repressor. Nature 346: 76-79. P
Matzke, M., A. J. M. Matzke and J. M. Kooter. 2001. RNA: guiding gene silencing. Science
293: 1080-1083. R
McKenna, N. J. and B. W. O'Malley. 2002. Combinatorial control of gene expression by
nuclear receptors and coregulators. Cell 108: 465-474. R
McKnight, S. L. and R. Kingsbury. 1982. Transcriptional control signals of eukaryotic
protein-coding gene. Science 217: 316-324. P
Naar, A. M., B. D. Lemon and R. Tjian. 2001. Transcriptional coactivator complexes. Ann.
Rev. Biochem. 70: 475-501. R
Narlikar, G. J., H.-Y. Fan and R. E. Kingston. 2002. Cooperation between complexes that
regulate chromatin structure and transcription. Cell 108: 475-487. R
Orphanides, G. and D. Reinberg. 2000. RNA polymerase II elongation through chromatin.
Nature 407: 471-475. R
Pabo, C. O. and R. T. Sauer. 1992. Transcriptional factors: Structural families and principles
of DNA recognition. Ann. Rev. Biochem. 61: 1053-1095. R
Panning, B. and R. Jaenisch. 1998. RNA and the epigenetic regulation of X chromosome
inactivation. Cell 93: 305-308. R
Ptashne, M. and A. Gann. 2002. Genes and Signals. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring
Harbor Laboratory Press.
Richards, E. J. and S. C. R. Elgin. 2002. Epigenetic codes for heterochromatin formation and
silencing: rounding up the usual suspect. Cell 108: 489-500. R
Screiber, S. L. and B. E. Bernstein. 2002. Signaling network model of chromatin. Cell 111:
771-778. R
Staudt, L. M. and M. J. Lenardo. 1991. Immunoglobulin gene transcription. Ann. Rev.
Immunol. 9: 373-398. R
Taunton, J., C. A: Hassig and S. L. Schreiber. 1996. A mammalian histone deacetylase related
to the yeast transcriptional regulator Rpd3p. Science 272: 408-411. P
Tilghman, S. M. 1999. The sins of the fathers and mothers: Genomic imprinting in
mammalian development. Cell 96: 185-193. R
Turner, B. M. 2002. Cellular memory and the histone code. Cell 111: 285-291. R
Volpe, T. A., C. Kidner, J. M. Hall, G. Teng, S. I. S. Grewal and R. A. Martienssen. 2002.
Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi.
Science 297: 1833-1837. P
West, A. G., M. Gaszner and G. Felsenfeld. 2002. Insulators: many functions, many
mechanisms. Genes Dev. 16: 271-288. R
Wolffe, A. 1998. Chromatin: Structure and Function. 3rd ed. New York: Academic Press.
Obrada i promet RNA
Abelson, J., C. R. Trotta and H. Li. 1998. tRNA splicing. J. Biol. Chem. 273: 12685-12688.
R
Baker, B. S.1989. Sex in flies: the splice of life. Nature 340: 521-524. R
31
Blanc, V. and N. O. Davidson. 2003. C-toU RNA editing: mechanisms leading to genetic
diversity. J. Biol. Chem. 278: 1395-1398. R
Cech, T. R. 1990. Self-splicing of group I introns. Ann. Rev. Biochem. 59: 543-568. R
Dodson, R. E. and D. J. Shapiro. 2002. Regulation of pathways of mRNA destabilization and
stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 129-164. R
Frank, D. N. and N. R. Pace. 1998. Ribonuclease P: Unity and diversity in a tRNA processing
ribozyme. Ann. Rev. Biochem. 67: 153-180. R
Guerrier-Takada, C., K. Gardiner, T. Marsh, N. Pace and S. Altman. 1983. The RNA moiety
of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. Cell 35: 849-857. P
Hirose, Y. and J. I. Manley. 2000. RNA polymerase II and the integration of nuclear events.
Genes Dev. 14: 1415-1429. R
Hopper, A. K. and E. M. Phizicky. 2003. tRNA transfers to the limelight. Genes Dev. 17: 162180. R
Klausner, R. D., T. A. Rouault and J. B. Harford. 1993. Regulating the fate of mRNA: The
control of cellular iron metabolism. Cell 72: 19-28. R
Kruger, K., P. J. Grabowski, A. Zaug, A. J. Sands, D. E. Gottschling and T. R. Cech. 1982.
Self-splicing RNA: Autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening
sequence of Tetrahymena. Cell 31: 147-157. P
Maas, S., A. Rich and K. Nishikura. 2003. A-to I RNA editing: recent news and residual
mysteries. J. Biol. Chem. 278: 1391-1394. R
Madison-Antenucci, S., J. Grams and S. L. Hajduk. 2002. Editing machines: the complexities
of Trypanosome RNA editing. Cell 108: 435-438. R
Maniatis, T. and R. Reed. 2002. An extensive network of coupling among gene expression
machines. Nature 416: 499-506. R
Maniatis, T. and B. Tasic. 2002. Alternative pre-mRNA splicing and proteome expansion in
metazoans. Nature 418: 236-243. R
Moore, M. J. 2002. Nuclear RNA turnover. Cell 108: 431-434. R
Padgett, R. A., M. M. Konarska, P. J. Grabowski, S. F. Hardy and P. A. Sharp. 1984. Lariat
RNAs as intermediates and products in the splicing of messenger RNA precursors. Science
225: 898-903. P
Padgett, R. A., S. M. Mount, J. A. Steitz and P. A. Sharp. 1983. Splicing of messenger RNA
precursors is inhibited by antisera to small nuclear ribonucleoprotein. Cell 35: 101-107. P
Proudfoot, N. J., A. Furger and M. J. Dye. 2002. Intergrating mRNA processing with
transcription. Cell 108: 501-512. R
Ruskin, B. , A. R: Krainer, T. Maniatis and M. R. Green. 1984. Excision of an intact intron as
a novel lariat structure during pre-mRNA splicing in vitro. Cell 38: 317-331. P
Smith, C. W. J. and J. Valcarcel. 2000. Alternative pre-mRNA splicing: the logic of
combinatorial control. Trends Biochem. Sci. 25: 381-388. R
Valadkhan, S. and J. L. Manley. 2001. Splicing-related catalysis by protein-free snRNAs.
Nature 413: 701-7078. P
Van Hoof, A. and R. Parker. 2002. Messenger RNA degradation: beginning at the end. Curr.
Biol. 12: R285-R287. R
Villa, T., J. A. Pleiss and C. Guthrie. 2002. Spliceosomal snRNAs: Mg 2+-dependent chemistry
at the catalytic core? Cell 109: 149-152. R
Str. 232:
Slika 6.1 RNA-polimeraza iz E. coli
32
Str. 232:
Str. 233:
Str. 234:
Enzim se sastoji iz 6 podjedinica: dvije , jedne , jedne ', jedne i

jedne . podjedinica relativno je slabo vezana i moe disocirati od
ostalih pet podjedinica, koje ine sr polimeraze.
Slika 6.2 Sljedovi promotora E. coli
Znaajku E. coli promotora predstavljaju dva niza sljedova smjeteni 10 i 35
baznih parova uzvodno od poetnog mjesta za transkripciju (+1). Usuglaeni
sljedovi pokazuju da su u skladu s najee naenim bazama u razliitim
promotorima.
Slika 6.3 DNA otisak stopala
Uzorak koji sadri fragmente DNA radioaktivno oznaene na jednom kraju
podijeljen je u dva dijela, a jedna polovica uzorka inkubirana je s proteinima
koji se veu na specifine DNA sljedove unutar fragmenta. Oba se uzorka
potom digestiraju DNazom pod takvim uvjetima da DNaza uvodi prosjeno
jedan rez po molekuli. Dio DNA vezan na protein zatien je od digestije
DNazom. Kompleksi DNA-protein se denaturiraju, a veliina radioaktivnooznaenih fragmenata nastalih djelovanjem DNaze elektroforetski je
analizirana. Fragmenti DNA nastali cijepanjem DNazom unutar podruja
zatienog vezanjem proteina na DNA nedostaju u uzorku DNA koji je
inkubiran s proteinom.
Fragment DNA, Radioaktivno oznaavanje
Razdioba uzorka
Protein, inkubacija s proteinom, inkubacija bez proteina
Protein vezan na specifini DNA slijed
Digestija DNazom, Digestija DNazom
Denaturacija, denaturacija
Elektroforeza
Autoradiografija
Podruje DNA zatieno vezanjem proteina
Slika 6.4 transkripcija polimerazom iz E. coli
U poetku se polimeraza vee nespecifino na DNA i kree po molekuli sve
dok se podjedinica ne vee na 35 i 10 promotorske elemente, stvarajui
zatvoreni promotorski kompleks. Polimeraza potom razmata DNA oko
inicijacijskog mjesta, a transkripcija zapoinje polimerizacijom slobodnih NTP.
podjedinica potom disocira od sri polimeraze, koja se kree du DNA i
produljuje rastui lanac RNA.
Polimeraza nespecifino vezana na DNA
Promotor, Specifino vezanje podjedinice na 35 i 10 promotorske sljedove
Razmotavanje DNA oko inicijacijskog mjesta
Inicijacija transkripcije
Otputanje
Produljenje RNA lanca
Str. 235:
Slika 6.5 struktura bakterijske RNA polimeraze

podjedinice polimeraze obojene su tamnozeleno i svijetlozeleno, plavo,
ruiasto i uto. (Ljubaznou Seth Darsta, Sveuilite Rockefeller)
Str. 236:
Slika 6.5 Terminacija transkripcije

33
Terminacija transkripcije signalizirana je obrnutim ponavljanjima bogatim GC

iza kojih slijede etiri A ostatka. Obrnuta ponavljanja stvaraju stabilne peteljkaoma strukture u RNA, uzrokujui disocijaciju RNA s DNA kalupa.
Stvaranje peteljke ome
Disocijacija RNA s DNA kalupa
Str. 236:
Slika 6.7 Metabolizam laktoze

-galaktozidaza katalizira hidrolizu laktoze na glukozu i galaktozu.
----------------------------------------------------------------------------------------------Laktoza
-galaktozidaza
Galaktoza, Glukoza
Str. 237:
Slika 6.8 regulacija -galaktozidaze u diploidnim E. coli

Spajanjem dva bakterijska roda nastaju diploidne stanice koje sadre gene od
oba roditelja. U tim primjerima pretpostavljeno je da se geni koji kodiraju galaktozidazu (z geni) mogu razlikovati na osnovi strukturnih genskih
mutacija, oznaenih z1 i z2. U i/i+ diploidu (lijevo), oba su strukturna gena
inducibilna; stoga, i+ je dominantna naspram i i utjee na ekspresiju z gena na
oba kromosoma. Suprotno tome, u oc/o+ diploidu (desno), z gen vezan na oc
konstitutivno je bio eksprimiran, dok je z gen vezan na o+ inducibilan. Tako, o
utjee na ekspresiju samo susjednog z gena na istom kromosomu.
Str. 238:
Str. 239:
Roditeljske bakterije
Inducibilne, Konstitutivne, Inducibilne, Konstitutivne
Diploidi
Oboje, z1 i z2 inducibilne, , z1 inducibilno
z2 konstitutivno
Slika 6.9 Negativna kontrola lac operona
i gen kodira represor koji se, u odsutnosti laktoze (vrh), vee na operator (o) i
interferira s vezivanjem RNA polimeraze na promotor, blokirajui transkripciju
tri strukturna gena (z, -galaktozidaze; y, permeaze; a, transacetilaze). Laktoza
inducira ekspresiju operona vezivanjem na represor (dno) to sprjeava
represor da se vee na operator. P=promotor; Pol=polimeraza.
Sprjeena transkripcija
Represor
lac mRNA
Laktoza
Inaktivni represor
Slika 6.10 Pozitivna kontrola lac operona glukozom
Niska razina glukoze aktivira adenilat-ciklazu koja prevodi ATP u cikliki
AMP (cAMP). Cikliki AMP vee se potom na katabolitni aktivatorski protein
(CAP) ime stimulira njegovo vezanje na regulatorne sljedove mnogih operona
povezanih s metabolizmom alternativnih eera, kao to je laktoza. CAP stupa
u interakciju s podjedinicom RNA polimeraze olakavajui tako vezanje
polimeraze za promotor.
34
Str. 239:
Tablica 6.1 Skupine gena transkribiranih eukariotskim RNA polimerazama
Vrsta sinetizirane RNA
RNA polimeraza
Nuklearni geni
MRNA
II
TRNA
III
rRNA
5,8S, 18S, 28S
I
5S
III
snRNA i scRNA
II i IIIa
Mitohondrijski geni
Mitohondrijskab
Kloroplastni geni
Kloroplastnab
a
Neke male nuklearne (sn) i male citoplazmatske (sc) RNA transkribiraju se polimerazom II, a
druge polimerazom III.
b
Mitohondrijske i kloroplastne RNA polimeraze sline su bakterijskim enzimima.
Str. 240:
Str. 241:
Str.242:
Str. 243:
Slika 6.11 Struktura kvaeve RNA-polimeraze II

Individualne podjedinice prikazane su u razliitim bojama. (Od P. D: Kramer i
sur., 2001. Science 292: 1863.)
Slika 6.12 Stvaranje transkripcijskog kompleksa polimeraze II
Mnogi promotori polimeraze II imaju TATA-slog (usuglaeni slijed TATAA) 25
do 30 nukleotida uzvodno od poetnog mjesta za transkripciju. Taj slijed
prepoznaje transkripcijski faktor TFIID koji se sastoji od TATA-veznog
proteina (TBP) i TBP-zdrueni faktori (TAFs). TFIIB(B) se potom vee na
TBP, nakon ega slijedi vezanje polimeraze u asocijaciji s TFIIF(F). Konano,
TFIIE(E) i TFIIH(H) se pridruuju kompleksu.
---------------------------------------------------------------------------------------Vezanje TFIID
Vezanje TFIIB
Vezanje polimeraze i TFIIF
Polimeraza
Vezanje TFIIE i TFIIH
Polimeraza
Slika 6.13 Model kompleksa TBP-TFIIB vezanog na DNA
DNA je prikazana u obliku tapa, sastoji se iz utog i zelenog lanca s poetnim
mjestom za transkripciju oznaenim 1. TBP se sastoji iz dva ponavljanja
obojena svijetloplavo i tamnoplavo. TFIIB ponavljanja obojena su naranasto i
grimizno. Vano je zamijetiti da TBP vezanje savija DNA za oko 110. ( Od D.
B. Nikolov i sur., 1995. Nature 377: 119.)
Slika 6.14 RNA-polimeraza II/Posredniki kompleks
RNA-polimeraza II zdruena je s posrednikim proteinima, kao i s opim
transkripcijskim faktorima na promotoru. Posredniki kompleks vee se na
nefosforilirani CTD polimeraze II, a oslobaa se nakon fosforiliranja CTD kad
je zapoeta transkripcija. Fosforilirani CTD potom vee elongacijske i
obradbene faktore koji olakavaju sintezu mRNAS i njenu obradu.
Posrednik, Polimeraza
Fosforiliranje CTD, inicijacija transkripcije
Posrednik, polimeraza
Elongacijski i obradbeni faktori
35
Str. 243:
Str. 244:
Str. 245.
Str. 246:
Str. 246:
Str. 247:
Str. 247:
Slika 6.15 Geni za ribosomalnu RNA

Ribosomalna DNA transkribira se dajui velike RNA molekule (45S pre-rRNA
koje se naknadno cijepaju na 28S, 18S i 5,8S rRNA.
Promotor
Transkripcija
Obrada
Slika 6.16 Inicijacija transkripcije rDNA
Dva transkripcijska faktora, UBF i SL1, kooperativno se veu na promotor
rDDNA i pridruuju RNA-polimerazu I stvarajui tako inicijacijski kompleks.
Jedna podjedinica SL1 je TATA-vezujui protein (TBP).
Promotor rDNA
Slika 6.17 Transkripcija gena polimerazom III
Geni transkribirani polimerazom III eksprimiraju se pomou dvije vrste
promotora. Promotori gena za 5S rRNA i tRNA nalaze se nizvodno od
inicijacijskog transkripcijskog mjesta. Transkripcija gena za 5S rRNA je
inicirana vezanjem TFIIIA nakon ega slijedi vezanje TFIIIC, TFIIIB i
polimeraze. Promotori za tRNA ne sadre vezno mjesto za TFIIIA, a on nije ni
potreban za njihovu transkripciju. Umjesto toga, TFIIIC inicira transkripciju
tRNA gena vezanjem na promotorski slijed., a potom se zdruuju TFIIIB i
polimeraza. Promotor gena za U6 snRNA je uzvodno od poetnog mjesta za
transkripciju i sadri TATA-slog kojeg prepoznaje TATA-vezujua proteinska
(TBP) podjedinica transkripcijskog faktora TFIIIB u kooperaciji s drugim
faktorom nazvanim SNAP.
Polimeraza III, Promotor
Polimeraza III, Promotor
Promotor, Polimeraza III
Slika 6.18 Identificiranje eukariotskih regulatornih sljedova
Regulatorni slijed kloniranog eukariotskog gena spojen je s reporterskim
genom. Reporterski gen kodira enzim iju aktivnost je lako detektirati. Nastali
plazmid potom se uvodi u kulturu stanica primatelja transfekcijom. Aktivni
regulatorni slijed upravlja transkripcijom reporterskog gena, a njegova se
ekspresija detektira u transfektiranim stanicama.
Regulatorni slijed
Reporterski gen
Plazmidna DNA
Transfekcija stanica primatelja
Ekspresija reporterskog gena
Slika 6.19 Eukariotski promotor
Promotor gena za timidin kinazu virusa herpes simplex sadri tri sljedna
elementa uzvodno od TATA-sloga koji su potrebni za uinkovitu transkripciju:
CCAAT-slog i dva GC-sloga (usuglaeni slijed GGGCGG).
Slika 6.20 SV40 pojaiva
SV40 promotor za ranu ekspresiju gena sadri TATA-slog i est GC-slogova
araniranih u tri niza ponavljajuih sljedova. Osim toga, za uinkovitu
transkripciju, potreban je uzvodni pojaiva koji se sastoji od dva ponavljanja
od po 72-bazna para (bp).
Pojaiva, Promotor
Ponavljanja od po 72-bp, GC-slog
Slika 6.21 Djelovanje pojaivaa
36
Bez pojaivaa gen se transkribira na niskoj osnovnoj razini (A). Dodatkom

pojaivaa, E primjerice, SV40 72-bp ponavljanja stimulira transkripciju.
Pojaiva je aktivan ne samo kad je smjeten neposredno uzvodno od
promotora (B), nego i kad je ubaen nekoliko kilobaza uzvodno ili nizvodno od
startnog transkripcijskog mjesta (C i D). Osim toga, pojaiva je aktivan u obje
orijentacije, naprijed i nazad (E).
Osnovna transkripcija
Gen
Stimulirana transkripcija
Gen
Gen
Gen
Str. 248:
Str. 248:
Str. 249:
Gen
Slika 6.22 Stvaranje ome DNA
Transkripcijski faktori vezani na udaljene pojaivae u stanju su stupati u
interakciju s kompleksom RNA-polimeraza/posrednik ili opim
transkripcijskim faktorima na promotoru. Razlog tomu su ome to ih moe
stvarati DNA. Nema temeljne razlike izmeu djelovanja transkripcijskih
fakotra vezanih na DNA neposredno uzvodno od promotora i udaljenog
pojaivaa.
Pojaiva
Oma DNA
Specifini transkripcijski faktori
Inicijacijski kompleks
Posrednik
Slika 6.23 Imunoglobulinski pojaiva
Pojaiva imunoglobulinskog tekog lanca premotava oko 200 baza i sadre
devet funkcionalnih sljednih elemenata (E, E1-5, , B i OCT), koji zajedno
stimuliraju transkripciju u B limfocitima.
200 baznih parova
Slika 6.24 Test pomaka u elektroforetskoj pokretljivosti
Uzorak koji sadri radioaktivno oznaeni fragment DNA podijeli se u dva
dijela te se jedna polovica inkubira s proteinom koji se vee na specifini DNA
slijed. Uzorci se potom analiziraju elektroforetski u nedenaturirajuem gelu
(protein ostaje vezan na DNA). Vezanje proteina utvruje se usporedbom
usporene migracije kompleksa DNA-protein u odnosu na slobodnu DNA.
Samo dio DNA u uzorku je vezan na protein pa se mogu detektirati i kompleks
DNA-protein i slobodna DNA u uzorku inkubiranom s proteinom.
DNA fragment
Dioba uzorka
Protein, Inkubacija s proteinom, Inkubacija bez proteina
Protein vezan na DNA
Elektroforeza, Autoradiografija
Kompleks DNA-protein
37
Str. 250:
Str. 250:
Slobodna DNA
Slika 6.25 Proiavanje Sp1 pomou DNA-afinitetne kromatografije
Dvolanani oligonukleotid koji sadri ponavljane GC-slogove vee se na
agarozne kuglice smjetene u kolonu. Smjesa staninih proteina, koja sadri
Sp1, nanese se na kolonu; s obzirom na specifino vezanje Sp1 na GC-slog
oligonukleotida, Sp1 zadrava se na koloni dok drugi proteini prolaze kroz nju.
Ispiranje kolone puferom s visokom koncentracijom soli izaziva disocijaciju
Sp1 od GC-sloga DNA, dajui proieni Sp1.
Kuglica agaroze, GC-slog DNA; Sp1, Dodana smjesa staninih proteina; Pufer
s visokom koncentracijom soli
Sp1 vezan na kolonu
GC-slog DNA kolona; Drugi proteini prolaze kroz kolonu; Proieni Sp1
Tablica 6.2 Primjeri transkripcijskih faktora i mjesta za vezanje na DNA
Transkripcijski faktor
Specifini protein 1 (Sp1)
CCAAT/Protein koji se vee na pojaiva
(C/EBP)
Aktivatorski protein 1 (AP1)
Oktamer vezujui proteini
(OCT-1 i OCT-2)
E-slog vezujui proteini
(E12, E47, E2-2)
a
N lanci za bilo koji nukleotid
Str.252:
Str. 253:
Usuglaeno vezno mjesto

GGGCGG
CCAAT
TGACTCA
ATGCAAAT
CANNTG
Slika 6.26 Struktura transkripcijskih aktivatora

Transkripcijski aktivatori sastoje se iz dvije neovisne domene. Domena koja se
vee na DNA prepoznaje specifini DNA slijed, a aktivacijska domena stupa u
interakciju s drugim imbenicima transkripcijske mainerije.
Aktivacijska domena
Domena koja se vee na DNA; Posrednik; TATA
Slika 6.27 Porodica domena koje se veu na DNA
(A) Domena cinkova prsta sastoji se iz nekoliko omi u kojima jedan heliks i
nabrana ploa koordinativno veu cinkov ion. (B) Heliks-obrat-heliks
domene sastoje se iz tri (ili u nekim sluajevima etiri) helikalna podruja.
Jedan heliks (heliks3) ostvaruje veinu kontakata s DNA, dok heliks 1 i 2 lee
na vrhu i stabiliziraju interakciju. (C) Domene proteina s leucinskim
zatvaraem koje se veu na DNA nastaju iz dva udaljena polipeptidna lanca.
Interakcije izmeu hidrofobnih postraninih lanaca leucinskih ostataka koji su
izloeni na jednoj strani helikalnog podruja (leucinski zatvara) odgovorne su
za dimerizaciju. Odmah nakon podruja leucinskog zatvaraa slijedi heliks to
se vee na DNA koji je bogat u bazinim aminokiselinama. (D) Heliks-omaheliks domene sline su leucinskom zatvarau, osim to se svaka
dimerizacijska domena tih proteina sastoji od dva helikalna podruja
razdvojena omom.
(A) Cinkovi prsti
Cinkov ion; heliks; nabrana ploa
(B) Heliks-obrat-heliks
(C) Leucinski zatvara
38
Str.254:
Str. 254:
Str. 255:
Str. 257:
Str. 257:
Str. 258:
Postranini lanac leucina; Domena leucinskog zatvaraa

Heliks koji se vee na DNA
(D) Heliks-oma-heliks
Heliks
Oma
Heliks koji se vee na DNA
Slika 6.28 Mutacija Antennapedia
Antennapedia mutantne muice imaju noge koje rastu iz njihovih glava na
mjestu antene. (A) Glava normalne muice. (B) Glava Antennapedia mutante.
(Ljubaznou F. Rudolf Turner, Indiana University).
Slika 6.29: Djelovanje transkripcijskih aktivatora
Eukariotski aktivatori stimuliraju transkripciju na dva naina. Oni stupaju u
interakciju s posrednikim proteinima i opim transkripcijskim faktorima
olakavajui zdruivanje transkripcijskog kompleksa. Osim toga, oni mogu
stupiti i u interakciju s koaktivatorima koji olakavaju transkripciju
modificirajui kromatinsku strukturu.
Domena koja se vee na DNA
Aktivacijska domena
Interakcija s posrednikom i opim transkripcijskim faktorima; Modificiranje
kromatinske strukture
Slika 6.30 Djelovanje eukariotskih represora
(A) Neki represori sprjeavaju vezanje aktivatora na regulatorne sljedove.
(B) Drugi represori posjeduju represijske domene koje inhibiraju transkripciju
svojom interakcijom ili s posrednikim proteinima ili s opim transkripcijskim
faktorima, ili, pak, s korepresorima koji modificiraju kromatinsku strukturu.
Aktivator
Represor; Represor se natjee s aktivatorom za vezivanja na DNA
Represorska domena; DNA-vezujua domena; Represor se vee na DNA i
sprjeava transkripciju interakcijom protein-protein; Posrednik
Slika 6.31 dekondenzirana podruja kromosoma u Drosophilae
Svjetlosna mikrografija pokazuje dekondenzirana podruja politenskog
kromosoma (strelice), aktivnoga u sintezi RNA. (Ljubaznou Joseph Galla,
Institut Carnegie)
Slika 6.32 Acetiliranje histona
(A) Histoni sri imaju domenu smatanja histona. Ona stri izvan nukleosoma, a
u interakciji je s drugim histonima i DNA. Repovi na N-kraju histona sri (npr.
H3) modificiraju se dodatkom acetilnih grupa (Ac) na postranini lanac
lizinskih ostataka. (B) Transkripcijski aktivatori i represori zdrueni su s
koaktivatorima i korepresorima, koji su zapravo histonske acetil-transferaze
(HAT) i deacetilaze (HDAC). Acetiliranje histona svojstvo je aktivno
transkribiranog kromatina i moe oslabiti vezanje histona na DNA ili, pak,
promijeniti njihove interakcije s drugim proteinima.
Rep na N-kraju; Domena smatanja histona; Lisin (K); Acetilna skupina (Ac)
Koaktivator; Aktivator; Acetilirani histon; Aktivni kromatin
Korepresor; represor
Deacetilirani histon; Inaktivni kromatin
Slika 6.33 Metiliranje i fosforiliranje histona
Metiliranje i fosofriliranje specifinih aminokiselinskih ostataka u histonskom
repu, kao i acetiliranje, utjeu na transkripcijsku aktivnost kromatina.
Primjerice, metiliranje H3 lizina-4, fosforiliranje serina-10 i acetiliranje lizinawww.perpetuum-lab.com
39
Str. 259:
Str. 260:
Str. 260:
Str. 261:
Str. 261:
Str. 262:
Str. 263:
9 i lizina-14 svojstva su transkripcijski aktivnog kromatina. Nasuprot tomu, za

inaktivni kromatin karakteristino je metiliranje H3 lizina-9.
Aktivni kromatin; Rep na N-kraju H3
Inaktivni kromatin
Metiliranje, Acetiliranje, Fosforiliranje
Slika 6.34 Faktori koji remodeliraju nukleosome
Faktori koji remodeliraju nukleosome mijenjaju aranman ili strukturu
nukleosoma. Primjerice, faktor koji remodelira nukleosome moe olakati
vezanje transkripcijskih faktora na kromatin repozicioniranjem nukleosoma na
DNA.
Transkripcijski faktor; DNA omotana oko nukleosoma; Promijenjeno mjesto
nukleosoma da bi se omoguilo vezanje transkripcijskih faktora; Faktor koji
remodelira nukleosome
Slika 6.35 Inaktiviranje X kromosoma
Inaktivni X kromosoma (plavo) obloen je s Xist RNA (crveno). (Od B.
Panning i R. Jaenisch, 1988. Cell 93: 305.)
Slika 6.36 Metiliranje DNA
Metilna skupina dodaje se na C-5 u citozinskom prstenu u DNA.
----------------------------------------------------------------------------------------------Citozin; Metiliranje; 5-metilcitozin
Slika 6.37 Genomski otisak
H19 gen specifino se metilira tijekom razvoja mukih spolnih stanica. Stoga,
spermiji sadre metilirani H19 alel, a jajne stanice nemetilirani alel. Nakon
oplodnje, metilirani roditeljski alel ostaje transkripcijski inaktivan, a
nemetilirani alel od majke eksprimira se u embriju.
Jajna stanica; Spermij, Oplodnja; Majin aktivni alel; Oev inaktivni alel
Slika 6.38 Odravanje uzorka metiliranja
U roditeljskoj DNA oba se lanca metiliraju na komplementarnim CpG
sljedovima. Nakon replikacije, samo roditeljski lanac svake molekule keri je
metiliran. Novosintetizirani lanci potom se metiliraju specifinim enzimom
koji prepoznaje CpG sljedove nasuprot mjestu metiliranja.
Metilirana roditeljska DNA; Replikacija DNA; Metiliranje; Metilirana DNA
Slika 6.39 Proces obrade ribosomalnih RNA
Prokariotske stanice sadre tri rRNA (16S, 23S i 5S) koje nastaju cijepanjem
pre-rRNA transkripta. Eukariotske stanice (npr. humane stanice) sadre etiri
rRNA. Jedna od njih (5S rRNA) transkribira se odvojeno, dok ostale tri (18S,
28S i 5,8S) derivati su zajednike pre-rRNA. Nakon cijepanja 5,8S rRNA
(jedinstvena u eukariota) vee se vodikovim vezama na 28S rRNA.
Prokarioti
Zrela rRNA
Eukarioti
Zrela rRNA
Slika 6.40 Proces obrade transportnih RNA
(A) Transportne RNA derivati su pre-tRNA, od kojih neke sadre nekoliko
individualnih tRNA molekula. Cijepanje na 5-kraju tRNA katalizirano je
ribozimom RNaza P; a cijepanje na 3-kraju katalizirano konvencionalnim
proteinom RNazom. CCA kraj se potom dodaje na 3-kraj mnogih tRNA u
procesu posttranskripcijske obrade. Konano, neke baze se modificiraju na
karakteristinim pozicijama u tRNA molekuli. U ovom primjeru, modificirani
40
Str. 264:
Str. 265:
Str. 266:
nukleozidi obuhvaaju dihidrouridin (DHU), metilgvanozin (mG), inozin (I),

ribotimidin (T) i pseudouridin (). (B) Struktura modificiranih baza.
Ribotimidin, dihidrouridin i pseudouridin nastaju modificiranjem uridina u
tRNA. Inozin i metilgvanozin nastaju modificiranjem gvanozina.
A:
RNaza P ribozim
Cijepanje
Dodatak CCA na 3-kraj
Modificiranje baze
B:
Riboza, Dihidrouridin (DHU); Riboza, Ribotimidin (T); Riboza,
Pseudouridin (); Riboza, Inozin; Riboza, 2N-metilgvanozin (mG)
Slika 6.41 Proces obrade eukariotskih glasnikih RNA
Proces obrade mRNA obuhvaa modificiranje 5-kraja dodavanjem kape sa
7-metilgvanozinom (m7G), modificiranje 3-kraja poliadeniliranjem i
uklanjanje introna prekrajanjem. 5-kapa nastaje dodatkom GTP u obrnutoj
orijentaciji naspram 5-kraja mRNA, stvarajui 5-5 vez. Dodani G potom se
metilira na poloaju N-7, a metilne se skupine dodaju i na riboze koje
pripadaju prvom ili prva dva nukleotida u mRNA.
7-metilgvanozin; 5-5 vez; Baza 1; 5-kraj mRNA; Baza 2
5-mjesto za prekrajanje, 3-mjesto za prekrajanje, mjesto za poliadenilaciju,
Intron
Transkripcija
Dodavanje kape na 5-kraju
3- poliadenilacija
Prekrajanje
Slika 6.42 Nastanak 3-krajeva na eukariotskim mRNA
Poliadenilacijski signali u stanicama sisavaca sastoje se od est nukleotida
AAUAAA uz uzvodne i nizvodne elemente (bogate G-U). Endonukleaza cijepa
pre-mRNA 10 do 30 nukleotida nizvodno od AAUAAA, obino na CA sljedu.
Poli-A-polimeraza nakon toga dodaje poli-A rep koji se sastoji od oko 200 A na
3-kraj RNA.
Uzvodni element, Nizvodni element; G-U bogat
Transkripcija
Uzvodni element, Nizvodni element; G-U bogat
Cijepanje endonukleazom
Uzvodni element
Poli-A-polimeraza
Uzvodni element
Slika 6.43 In vitro prekrajanje
Gen koji sadri intron kloniran je nizvodno od promotora (P) koji prepoznaje
bakteriofagna RNA-polimeraza. Plazmid je digestiran restrikcijskim enzimom
koji cijepa na 3-kraju kloniranog gena dajui linearnu DNA molekulu. Ta se
DNA transkribira in vitro bakteriofagnom polimerazom dajui RNA. Reakcije
prekrajanja mogu se ispitivati in vitro dodatkom nastalih pre-mRNA
nuklearnom ekstraktu stanica sisavaca.
Intron 1, Ekson 1, Ekson 2
41
Str. 267:
Str. 270:
Str. 271:
Str. 271:
Promotor za bakteriofagnu RNA-polimerazu, Mjesto za restrikcijski enzim

Digestija restrikcijskim enzimom
Ekson 1, Intron 1, Ekson 2
In vitro transkripcija
Ekson 1, Intron 1, Ekson 2
Dodatak nuklearnom ekstraktu
Nuklearni ekstrakt
In vitro prekrajanje
Prekrojena mRNA, Ekson 1, Ekson 2
Slika 6.44 Prekrajanje pre-mRNA
Reakcija prekrajanja odvija se u dva koraka. Prvi korak obuhvaa cijepanje na
5-mjestu za prekrajanje (engl. splice site, SS) i spajanje 5-kraja introna na A
unutar introna (engl. branch point, toka grananja). Tom reakcijom nastaje
poluproizvod slian lasu (engl. lariat-like). Drugi je korak cijepanje i simultano
spajanje eksona, ime dolazi do isjecanja strukture introna sline lasu.
Ekson 1, Toka grananja, Ekson 2
Cijepanje na 5-mjestu prekrajanja, Nastanak poluproizvoda slinog lasu
Ekson 1, Ekson 2
Cijepanje na 3-mjestu za prekrajanje
Spajanje eksona
Ekson 1, Ekson 2
Slika 6.45 Nastanak tjeleca za prekrajanje (engl. spliceosome)
Prvi je korak u nastanku tjeleca za prekrajanje vezanje U1 snRNP na 5-mjesto
za prekrajanje (SS), nakon ega slijedi vezanje U2 snRNP na toku grananja.
Prethodno nastali kompleks sastavljen od U4/U6 i U5 snRNP ulazi u tjelece za
prekrajanje (spliceosome). U5 se vee na sljedove uzvodno od 5-mjesta za
prekrajanje, a U6 disocira s U4 i pomie U1 prije nego nastane poluproizvod u
obliku lasa. U5 se potom vee na 3-mjesto za prekrajanje nakon ega slijedi
izrezivanje introna i spajanje eksona.
Nastanak poluproizvoda u obliku lasa
Izrezivanje introna, Spajanje eksona
Slika 6.46 Vezanje U1 snRNA na 5-mjesto za prekrajanje
5-kraj U1 snRNA vee se na usuglaene sljedove na 5-mjestu za prekrajanje
komplementarnim sparivanjem.
Ekson 1, Intron, Ekson 2
Slika 6.47 Samo-rekrajajui introni
Skupina I i skupina II samo-rekrajajuih introna razlikuje se po reakcijskim
mehanizmima prekrajanja. U skupini I introna, prvi korak u prekrajanju jest
cijepanje 5-mjesta za prekrajanje reakcijom s gvanozinskim kofaktorom. Tako
nastaje linearni poluproizvod s G dodanim na 5-kraj introna. U skupini II
introna (kao kod pre-mRNA prekrajanja) prvi je korak cijepanje 5-mjesta za
prekrajanje reakcijom s A unutar introna, stvarajui poluproizvod u obliku lasa.
U oba sluaja, drugi je korak simultano cijepanje 3-mjesta za prekrajanje i
spajanje eksona.
Ekson 1, Ekson 2
Gvanozinski kofaktor napada 5-mjesto za prekrajanje
Ekson 1, Ekson 2
42
Str. 272:
Str. 273:
Str. 274:
Str. 275:
Cijepanje 3-mjesta za prekrajanje, Spajanje eksona

Ekson 1, Ekson 2
Ekson 1, Ekson 2
Adenozin u intronu napada 5-mjesto za prekrajanje
Ekson 1, Ekson 2
Cijepanje 3-mjesta za prekrajanje, Spajanje eksona
Ekson 1, Ekson 2
Slika 6.48 Uloga faktora za prekrajanje u zdruivanju tjeleca za
prekrajanje
Faktori za prekrajanje (engl. splicing factors, SR proteini) veu se na specifine
sljedove unutar eksona. SR proteini pridruuju U1 snRNP na 5-mjesto za
prekrajanje, a dodatni faktor za prekrajanje (U2AF) na 3-mjesto za
prekrajanje. U2AF potom pridruuje U2 snRNP na toku grananja.
Slika 6.49 Alternativno prekrajanje u odreivanju spola u Drosophilae
Alternativno prekrajanje transformirajue (engl. transformer, tra) mRNA
regulirano je SXL proteinom, eksprimiranim samo u enskim muicama. U
mukih muica prvi ekson tra mRNA spojen je na 3-mjesto za prekrajanje 5
dajui sekundarni ekson koji sadri kodon za terminaciju translacije, tako da
tra protein ne nastaje. U enkama vezanje SXL proteina sprjeava vezanje
U2AF na 3-mjesto za prekrajanje, to dovodi do upotrebe alternativnog mjesta
dalje nizvodno u eksonu 2. To je alternativno 3-mjesto za prekrajanje nizvodno
od terminacijskog mjesta za translaciju, tako da mRNA eksprimirana u
enkama upravlja sintezom funkcionalnog tra proteina.
Mujaci, enke
Prekrajanje, Prekrajanje
Translacija, Translacija
Prerana terminacija, Nema funkcionalnog proteina; Funkcionalni tra protein
Slika 6.50 Ureivanje mRNA za apolipoprotein B
U ljudskoj se jetri, neureena mRNA translatira dajui protein od 4536aminokiselinskih ostataka nazvan Apo-B100. Meutim, u ljudskim crijevima
mRNA se ureuje modificiranjem baza to mijenja specifini C u U. Ta
modifikacija mijenja kodon za glutamin (CAA) u terminacijski kodon (UAA),
to ima za posljedicu sintezu kraeg proteina (Apo-B48, sastoji se iz 2152
aminokiseline).
RNA ureivanje
Neureena RNA, Ureena RNA
Translacija, Translacija
Jetra, Crijeva
Slika 6.51 Regulacija stabilnosti mRNA za transferinski receptor
Koliine mRNA za transferinski receptor regulirane su raspoloivou eljeza.
Ako je odgovarajui unos eljeza, mRNA se brzo razgrauje kao rezultat
nukleaznog cijepanja u blizini 3-kraja. Meutim, ako je eljezo nedostatno,
regulatorni protein (nazvan vezni protein za element odgovoran za eljezo ili
IRE-BP) vee se na slijed u blizini 3-kraja mRNA (element odgovoran za
eljezo ili IRE) zatiujui tako mRNA od cijepanja nukleazom.
Podruje koje kodira protein,
43
Dostatno eljezo, Nedostatak eljeza

Nukleaza, Nukleaza
Brzo razgraivanje mRNA, Stabilizirana mRNA
44

6 Poglavlje - Sinteza I Obrada RNA

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

6 Poglavlje - Sinteza I Obrada RNA

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Poglavlje 6

1. Sinteza i obrada RNA

U 4. i 5. poglavlju razmatrana je organizacija i odravanje genomske DNA, koja bi se mogla

na specifinim mjestima na poetku gena. Proces zapoinjanja posebice je vaan jer je to

jednolanana DNA slui kao kalup za transkripciju. Transkripcija zapoinje povezivanjem

je alel regulatornih gena dominantan, a koji recesivan. Primjerice, ako se bakterije s

Sposobnost pojaivaa da djeluju i kad su vrlo udaljeni od inicijacijskog mjesta za

nedenaturirajuem gelu (slika 6.24). Vezanje proteina detektira se kao smanjenje

Mnogi razliiti transkripcijski faktori identificirani su u eukariotskim stanicama i,

na specifinim aminokiselinskim ostatcima u histonskom repu, a povezane su s promjenama

Vana regulatorna uloga metiliranja DNA predstavljena je pojavom znanom kao

da predstavlja prototipni model reakcije katalizirane RNA enzimom. RNaza P sastoji se od

primjera jest ureivanje mRNA za apolipoprotein B, lipoprotein koji sudjeluje u transportu

Citoplazmatska razgradnja veine eukariotskih mRNA inicirana je skraivanjem

operon, operator, represor, cis-djelujui

transkripcijski faktori, opi transkripcijski

test pomaka elektroforetske pokretljivosti,

Opi transkripcijski faktori i zapoinjanje

HMGN proteini, acetiliranje histona,

pre-rRNA, pre-tRNA, RNaza P, ribozim

opim transkripcijskim faktorima,

pre-mRNA, 7-metilgvanozinska kapa, poliA rep, poliadenilacija

mRNA razgradnja posredovana

razliite se baze modificiraju u tRNA.

spajanja tih sojeva, testirate produkciju -galaktozidazu kod doputene i nedoputene

ritematozusa. Kolona 1, anti-Sm; kolona 2, normalni kontrolni serum; kolona 3, antiserum

Myers, L. C. and R. D. Kornberg. 2000. Mediator of transcriptional regulation. Ann. Rev.

Kadonga, J. T. 1998. Eukaryotic transcription: An interlaced network of transcription factors

Slika 6.1 RNA-polimeraza iz E. coli

Enzim se sastoji iz 6 podjedinica: dvije , jedne , jedne ', jedne i

Slika 6.5 struktura bakterijske RNA polimeraze

Slika 6.5 Terminacija transkripcije

Terminacija transkripcije signalizirana je obrnutim ponavljanjima bogatim GC

Slika 6.7 Metabolizam laktoze

Slika 6.8 regulacija -galaktozidaze u diploidnim E. coli

Slika 6.11 Struktura kvaeve RNA-polimeraze II

Slika 6.15 Geni za ribosomalnu RNA

Bez pojaivaa gen se transkribira na niskoj osnovnoj razini (A). Dodatkom

Usuglaeno vezno mjesto

Slika 6.26 Struktura transkripcijskih aktivatora

Postranini lanac leucina; Domena leucinskog zatvaraa

9 i lizina-14 svojstva su transkripcijski aktivnog kromatina. Nasuprot tomu, za

nukleozidi obuhvaaju dihidrouridin (DHU), metilgvanozin (mG), inozin (I),

Promotor za bakteriofagnu RNA-polimerazu, Mjesto za restrikcijski enzim

Cijepanje 3-mjesta za prekrajanje, Spajanje eksona

Dostatno eljezo, Nedostatak eljeza

You might also like