Int J. Nanosci, Nanotechnol, Vol. 8, No. 3, Sep. 2012, pp. 181-184 Short Communication Protein Bands Detection by Nanoparticles after Paper Chromatography F. Ramezani - Nanotechnology group of Shahid Beheshti Medical University, Tehran, I. R. Iran - Young Research Club, Pharmacy Faculty, Islamic Azad University of Medical Science, Tehran, LR. Iran (*) Corresponding author: Fr_750@yahoo.com (Received:03 Jun, 2012 and Accepted: 19 Sep. 2012) Abstract: Paper chromatography is an analytical technique for separating and identifving mixtures of materials. It is a useful technique since it is relatively quick, and requires small quantities of the material. By emergence of nanotechnology, paper chromatography has found many applications in biology and biotechnology: In ths stud, we employed gold and silver nanoparticles to detect protein bands after the paper chromatography method. We Jirst performed paper chromatography on a solution containing Bovine Serum Albumin (BSA) protein. Then, the ‘old and silver nanoparticles were exploited for paper coloration. Asa result, it was noticed that location ofthe protein bands was clearly distinct and detectable with this technique. Keywords: chromatography, detection, nanoparticle, protein 1, INTRODUCTION An analytical method for mixture separation and identification is paper chromatography. Paper chromatography is @ useful technique since it is relatively quick and requires small quantities of the material. In paper chromatography method, substances are distributed between a stationa phase and a mobile phase. The stationary phase is usually a piece of high quality filter paper. On the other hand, the mobile phase is a developing solution that ‘avels up the stationary phase, carrying the samples with it (1, 2} The use of nanomaterials in biotechnology ‘merges the fields of material science and biology. Nanoparticles provide a particularly platform, demonstrating unique properties ‘with potentially wide-ranging applications [3]. usefil Nanotechnology in biology and biotechnology has also found many applications [4]. Some applications of nanomaterials in biology or medicine include fluorescent biological labels [5,6], detection of pathogens [7], drug and gene delivery {8,9,10], detection of proteins [11,12], hyperthermia [13,14], tissue engineering [15,16], imaging contrast enhancement [17], separation and purification of biological molecules and cells us} Tn this study we introduce a new approach for detecting proteins after paper chromatography. MATERIALS AND METHODS 2.1, Nanoparticles synthesis Gold nanoparticles were synthesized according 181ANALISIS KUALITATIF FENILALANIN SECARA CHROMATOGRAPHY KERTAS DAN CHROMATOGRAPHY LAPIS. TIPIS (Studi Awal Pengembangan Metode Deteksi Penyakit Phenylketonuria) Begum Fauziyah UIN Maulana Malik Ibrahim Malang ABSTRAK The qualitative analysis of fenilalanin as paper chromatography and thin layer chromatography is developed as the beginning study of detection phenylketonuria disease. The result of identification qualitatively fenilalanin solution with concentration variation using paper chromatography media shows that the clearest spot is gotten by concentration minimal 50 ppm. The result of identification qualitatively fenilalanin solution with variation concentration 1, 3, 5, 10, 25 and 50 (ppm) using thin layer chromatography shows that from the smallest concentration that is I ppm, has already give the clear qualitative experiment result, that is purple. Fenilalanin analysis with thin layer chromatography gives more sensitive result than with paper chromatography. memberikan hasil yang lebih sensitif daripada dengan chromatography kertas. Keywords : fenilalanin, paper chromatography, thin layer chromatography A, PENDAHULUAN berfungsi merubah asam amino Phenylketonuria atau PKU ialah fenilalanin menjadi asam amino suatu penyakit yang disebabkan tirosin, Fenilalanin yang bersumber Karena seseorang tidak mampu dari protein = makanan akan merubah asam amino fenilalanin terakumulasi dan menyebabkan menjadi tirosin. Ketidakmampuan Kekurangan tirosin. Fenilalanin yang merubah asam amino fenilalanin berlebihan dapat_—_dimetabolisme menjadi tirosin disebabkan Karena menjadi phenylketones _—_(Suryo, penderita tidak memiliki enzim 2005). fenilalanin hidroksilase (PAH) yang PAH 5 Chromosome 12, Gambar 1. Kromosom 12, pengode enzim PAH 1014 Analisis Kualitatif Fenilalanin Seeara ... analisis konsentrasi__terkecil fenilalanin_ menggunakan_ kromato- grafi lapis tipis, 1. Anali Fenilala Meng- gunakan Kromatografi Kertas Penelitian ini _menggunakan kertas saring ukuran 20em x 25em sebagai media, fasa gerak campuran larutan butanoVasam asetatakuades dengan komposisi 60:15:25. Pe laksanaan pemisahan dengan metode kromatografi kertasterbagi dalam tiga tahap yaitu tahap penotolan cuplikan, tahap pengembangan dan tahap identifikasi atau penampakan noda. Pada tahap penotolan cuplikan, mula — mula siapkan — kertas kromatografi dengan ukuran 20cm x 2Sem. Gans awal dibuat dengan jarak 3 cm dengan salah satu ujung kertas. Sampel yang digunakan adalah larutan fenilalanin dengan konsentrasi | ppm, 3 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 25 ppm dan 50 ppm. Masing ‘masing sampel dipipet menggunakan mikropipet sebanyak 200 mikroliter don ditotolkan atau pipa kapiler pada garis awal tadi kemudian keringkan, Identifikasi senyawa asam amino dalam kromatografi kertas dilakukan menggunakan pereaksi _ninhidrin, Ninhidrin merupakan hidrat dari wiketon siklik, dan bila bereaksi dengan asam amino menghasilkan zat berwarna_ungu, Ninhidrin merupakan suatu oksidator sangat kuat yang dapat menyebabkan terjadinya’ dekarboksilasi__oksi- datif asam = a-amino untuk menghasilkan CO-72.NH3 dan suatu aldehid dengan satu atom karbon kurang daripada asam amino induknya. Reaksi gugus amino dengan ninhidrin menghasilkan senyawa jingga sesuai dengan gambar : Gambar 3. Reaksi asam amnino dan ninhidrin Noda berwarna jingga ditentukan harga Rf-nya. Besamya Rf ini menyatakan derajat retensi suatu Komponen dalam fasa diam, Harga RE dibitung sebagai jarak yang ditempuh oleh Komponen dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh eluen (fasa gerak). ‘Rf=jarak yang ditompuh oleh senvawa jarak yang ditempuh oleh pelarut SAINSTIS. VOLUME 1, NOMOR 2, JANUARI JUNI 2012 ISSN:15 Analisis Kualitatif Fenilalanin Secara .. Hasil analisis fenilalanin dengan menggunakan metode kromatografi kertas ditunjukkan pada gambar 4 dan tabel | berikut ini : ‘Gambar 4. Analisis fenilalanin menggunakan kromatografi kertas ‘Tabel 1. Hasil analisis fenilalanin menggunakan kromatografi kertas | ulangan 1 wlangan 2 konsentrasi (ppm) Spot i ‘Spot 2 Spot Spot? tt t 030" > wt t 0.30" 0.40" t t 0.30" 0.60" io it t 0.30" 0.60" 7 t w 0.30" 0.50" 50 030 ro) 026 0.50 Koleragan 1 tidak tampak * = warna sangat lemah dan samar Dari gambar 4 dan tabel 1 diketahui bahwa hasil identifikasi larutan fenilalanin pada berbagai konsentrasi_menggunakan media kromatografi kertas hanya tampak jelas teramati secara jelas pada konsentrasi minimal 50 ppm. Larutan dengan Konsentrasi dibawah 50 ppm tidak dapat teramati secara jelas bahkan tidak tampak sama_sekali Hal ini disebabkan kapasitas fasa diam yaitu. molekul IO yang teradsorbsi_ pada selulosa _/kertas hanya mampu menahan_ sejumlah kecil molekul asam amino fenilalanin dari sampel. Apabila jumlah dari fenilalanin hanya sedikit maka ketika direaksikan dengan ninhidrin tidak cukup untuk mem berikan perubahan secara visual. Nilai Rf adalah rasio jarak yang ditempuh oleh suatu zat terlarut terhadap jarak yang dipindahkan oleh garis depan pelarut selama waktu sama, Nilai Rf yang identik untuk suatu senyawa yang diketahui dan yang tidak diketahui dengan menggunakan beberapa sistem pelarut yang berbeda_memberikan bukti yang kuat bahwa nilai untuk kedua senyawa tersebut adalah identik, terutama _jika _ senyawa tersebut —dijalankan——secara berdampingan di sepanjang pita kertas yang sama Pada kasus yang sukses zat terlarut dari campuran SAINSTIS. VOLUME 1, NOMOR 2, JANUARI JUNI 2012. ISSN: 2089-069916 Analisis Kualitatif Fenilalanin Secara . yang asli akan bergerak di sepanjang kertas dengan kecepatan yang berbeda-beda, membentuk sederetan noda yang terpisah, Pada tabel 4.1 diketahui pula bahwa nilai Rf yang teramati ada 2 yaitu 0.28 dan 0,495. Nilai Rf yang cukup konsisten dari beberapa ulangan adalah antara 0,25- 0,30 sehingga identifikasi senyawa fenilalanin dengan fasa __gerak campuran larutan —butanol/asam asetaVakuades dengan komposisi 65:15:25 adalah pada Rf 0,28, Pelebaran spot yang terjadi dapat disebabkan oleh proses clusi_ yang menyebabkan media kertas sangat basah sehingga kertas tidak dapat tegak secara konsisten. Hal ini membuat proses distribusi senyawa fenilalanin pada fasa diam dan fasa gerak menjadi tidak stabil yang menyebabkan pelebaran area Khas dari fenilalanin iti senditi Kekurangan kromatografi_kertas selama ini adalah menjaga Konsistensi dari media kertas. Ter bentuknya spot kedua diduga disebabkan oleh senyawa lain yang berbeda kepolaran dengan fenilalanin. Bentuk dari asam amino yang terhidrolisis menjadi kation menyebabkan spesies asam amino dapat satu senyawa lebih dari satu yaitu. molekul fenilalanin, kation fenilalanin bahkan dimer fenilalanin. 2. Analisis Fenilalanin = Meng- gunakan Kromatografi Lapis Tipis (Kit) Dalam penelitian ini digunakan kromatografi lapis tipis dengan fasa diam silica. Plat KLT dipotong dengan ukuran 10 x 10 cm dan dibagi 6 dengan jarak masing-masing 1,6 cm. Jarak masing-masing sampel tidak boleh terlalu dekat karena dapat saling mengkontaminasi akibat dari pergerakan molekul sampel yang didorong oleh fasa gerak campuran butanol: asam asetat : air ( 60: 15 : 25), Jarak titik sampel dengan tepi bawah 1 cm dan dijaga agar fasa gerak tidak berinteraksi_langsung dengan sampel. Apabila jarak tepi bawah terlalu kecil atau jumlah fasa gerak cukup banyak maka sampel akan bersentuhan dengan fasa gerak dan ada sebagian molekul sampel akan terlarut dalam fasa gerak. Hal ini menyebabkan hasil elusi pada kromatografi lapis tipis tidak valid Sampel larutan fenilalanin dengan konsentasi 1 ppm, 3 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 25 ppm, dan 50 ppm dalam pelarut air ditotolkan di masing masing titik sampel pada lempeng kromatografi lapis tipis sebanyak 200 mikroliter (ul). Noda sampel dibuat sekecil mungkin agar tidak terjadi pelebaran area dari senyawa fenilalanin. Cara membuat noda yang kecil adalah dengan menotolkan menggunakan pipa kapiler kemudian dikeringkan dan seterusnya. Sisi Iempengan tersebut — divelupkan kedalam fasa bergerak yang sesuai. Pelarut bergerak naik di sepanjang lapisan tipis zat padat diatas lempengan, dan bersamaan dengan pergerakan pelarut tersebut, zat terlarut sampel dibawa dengan laju yang tergantung pada kelarutan zat terlarut tersebut data fase bergerak dan interaksinya dengan zat padat. Setelah garis depan pelarut bergerak hampir mendekati batas —akhir, lempengan dikeringkan kemudian lempeng kromatografi lapis tipis disemprot dengan larutan ninhidrin 2 %. Ketika menyemprotkan larutan ninhidrin pada lempeng KLT harus dilakukan dengan hati hati pada posisi mendatar. _ Penyemprotan reagen dengan debit besar akan membuat pelebaran spot senyawa akibat tekanan zat cair reagen, demikian pula jika posisi dari plat SAINSTIS. VOLUME 1, NOMOR 2, JANUARI JUNI 2012. ISSN: 2089-0699(Wahyu Widyaningsih, dkk) 1 a Penghambatan Aktivitas Xanthine Oxidase PENGHAMBATAN AKTIVITAS XANTHINE OXIDASE OLEH EKSTRAK ETANOL AKAR SAMBILOTO (Andrographis paniculata,Ness) SECARA IN VITRO XANTHINE OXIDASE INHIBITORY OF ETHANOLIC EXTRACT OF SAMBILOTO ROOT Ulfah Septianingsih, Hari Susanti, Wahyu Widyaningsih Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan II Prof Dr Soepomo Yogyakarta, Telp. (0274) 379418 Abstrak Tanaman Sambiloto merupakan salah satu tanaman yang mengandung flavonoid yang digunakan masyarakat untuk pengobatan tradisional. Dari penelitian terdahulu dilaporkan bahwa senyawa flavonoid dapat berpotensi menurunkan kadar asam urat darah dengan cara menghambat aktivitas xanthine oxidase. Oleh karena adanya flavonoid yang terkandung dalam akar Sambiloto maka dilakukan penelitian apakah ekstrak etanol akar Sambiloto dapat menghambat aktivitas xanthine oxidase. Sebagai pembanding digunakan Allopurinol. Ekstrak etanol dibuat dari serbuk akar Sambiloto diekstraksi dengan etanol menggunakan metode penyarian dengan alat Soxhlet, sebelum penyarian dilakukan pengawalemakan menggunakan petroleum eter. Penghambatan aktivitas xanthine oxidase oleh ekstrak etanol akar Sambiloto ditentukan melalui penurunan produksi asam urat yang dimonitor dengan spektrofotometer pada 295 nm dengan xanthine sebagai substrat. Nilai kecepatan yang diperoleh selanjutnya digunakan untuk menghitung nilai aktivitas, Kemudian ditentukan konsentrasi ekstrak etanol yang mampu menghambat aktivitas xanthine oxidase sebesar 50% (ICs0). Hasil dianalisis secara kuantitatif, dengan menggunakan uji Kruskal Wallis dengan taraf kepercayaan 95%, kemudian dilanjutkan dengan uji Mann Withney. Flavonoid dalam ekstrak etanol dipisah dengan cara kromatografi kertas dan perubahan bercak ditentukan dengan UV 366 dengan dan tanpa pemberian uap amoniak. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol akar Sambiloto menghambat aktivitas Xanthine Oxidase dengan ICs 16,82 ug/ml sedangkan ICs Allopurinol adalah 4,29 ug/ml. Ekstrak etanol akar Sambiloto diduga mengandung flavonoid golongan flavon atau flavonol. Kata Kunci : akar Sambiloto, xanthine oxidase, asam urat.Penghambatan Aktivitas Xanthine Oxidase .... (Wahyu Widyaningsih, dkk) 157 xanthine oxidase oleh 200 pl allopurinol menggunakan konsentrasi 2,5 jig/ml, 5 ug/ml, 7,5 ug/ml dan 10 pg/ml. h. Identifikasi flavonoid dalam ekstrak etanol akar Sambiloto Identifikasi adanya _ fvonoid dalam ekstrak etanol akar Sambiloto dilakukan dengan uji pendahuluan dan pemeriksaan kromatografi_ kertas. Uji pendahuluan dilakukan dengan cara memberi uap amonia pada tetesan kering larutan ekstrak etanol dalam etanol pada kertas Whatman. Bercak berwarna kuning menunjukkan adanya flavonoid. Pemeriksaan kromatografi kertas untuk mengetahui bercak warna dan pemisahan flavonoid yang terdapat pada larutan ekstrak etanol dalam etanol dengan cara kromatografi kertas dengan fase gerak n-butanol-asam_asetat-air (4:1:5) fase atas, Warna dan perubahan warna bercak dengan dan tanpa amoniak diperiksa menggunakan lampu UV 366. Analisis Data Data yang diperoleh berupa hasil pengukuran terapan secara spektrofotometri UV yaitu A A2o5/menit dan besarnya aktivitas enzim dihitung dengan rumus: Aktivitas (unit/ml enzim) = 1,024 adalah volume total campuran (ml), 12,2 adalah koefisien ekstingsi asam_urat (mM), 0,1 adalah volume enzim yang digunakan (ml). Aktivitas enzim dapat dinyatakan dalam satuan yang lain dan dihitung dengan rumus = unit / ml en; Unitimg solid - SM enim _ mg solid / ml enzim Hasil — digunakan untuk menghitung persentase penghambatan xanthine oxidase dengan rumus: sivas anpa ban j= aitas aan iva apa baba 2% inhibi 100% Nilai Cs) (konsentrasi inhibitor yang menghasilkan _ penghambatan aktivitas xanthine oxidase sebesar 50%) dapat ditentukan dengan analisis regresi linier antara konsentrasi senyawa uji terhadap —persentase _ penghambatan aktivitas xanthine oxidase. HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan aktivitas xanthine oxidase Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan sediaan uji yaitu. ekstrak etanol akar Sambiloto dibandingkan —Allupurinol dalam menghambat aktivitas enzim xanthine oxidase secara in vitro. Aktivitas xanthine oxidase di- tentukan secara spektrofotometri dengan mengamati kecepatan _pembentukan asam urat pada % 295 nm. xanthine mempunyai serapan disekitar 4 260 nm (Nagao dkk, 1999). Menurut Van Hoorn dkk (2002) selama 6 menit kinetika reaksi adalah linier. Kecepatan pem- bentukan asam urat pada penelitian ini linier sampai menit ke-3. Kurva mulai landai pada menit ke-4, sehingga untuk penelitian selanjutnya hanya dilakukan pada menit ke-0 sampai_ke-3. Edmondson dkk (1972) mengusulkan mekanisme reaksi katalisis oleh xanthine