Imunologie curs 4 Imunologie — Curs 4 Activarea limfocitelor T; Limfocitele B; Organizarea sistemului imun Activarea limfocitelor T este momentul central al mari majoritati a RI (presc. Raspuns Imun, & plural); aceasta activare nu se realizeaza in orice condifii, Activarea are loc in conditi diferite in vitro fata de in vivo. Pentru activarea in vivo, sunt mai importante trei condi 1. limfocitele T pot fi activate doar de antigene timodependente; 2. activarea limfocitelor T se realizeaza doar in cadrul unei cooperari celulare la care este obligatorie prezenta APC (presc. Antigen Presenting Cells). (ee Me See frie Al | id a Ay tisade, 3 Hue adliteaya | \ “oo hai, 7 caiuct | + hin) Tu au Ro ly ae capitan he tg Rf gt0nias (cm) (2 Te). are Limfocitele T pot activa (n. ed. alte) limfocite T prin APC. APC au din abundenta receptori pentru opsonine si pot capta antigene timodependente opsonizate, pe care le endociteaza gi le prelucreaza. in urma acestei prelucrari rezulta epitopi, iar dintre acesti epitopi sunt selectati epitopii imunodominanti, care sunt expusi pe APC in context MHC (presc. Major Histocompatibility Complex). Un alt motiv pentru care prezenta APC este obligatorie il constituie faptul ca limfocitele T recunosc doar determinanti antigenici liniari. 3. cooperarea celulara si activarea care rezulté pentru generarea unui RI eficient sunt bidirectionale. Cele doua celule se stimuleaz reciproc. Din acest punct de vedere distingem doua tipuri de activari a) Activarea anterograda se realizeaza dinspre APC spre limfocitele T fiind urmata de activare metabolica a limfocitelor T. Se numeste anterograda pentru cd ea se exercitd in acelasi sens cu prezentarea si recunoasterea antigenului. Activarea anterograda presupune transmiterea spre limfocitele T a unor semnale. Doua cai sunt mai importante pentru aceasta transmitere: 1. Calea TcR-CD3 este utilizaté in cazul recunoasterii antigenice; semnalele transmise pe aceasta cale determina activarea metabolica a limfocitelor T si stimularea di mitotice a limfocitelor T antigen-specifice, cu cresterea numarului de celule al clonei antigen-specifice (expansiune clonalai);Imunologie curs 4 Il Calea accesorie CD80-CD28 de activare anterograda se realizeaz& prin CD28. Receptorul CD28 de pe membrana limfocitului T se activeaza in urma legarii cu CD80 de pe membrana APC. Realizarea complexului CD80-CD28 costituie semnalul activator, care initiazé maturarea funefionala a limfocitului T, in urma careia rezulta limfocitul T activat. Limfocitele T activate: - produc cantitati crescute de interleukine (subsetul T helper); - produc cantitati crescute de mediatori citotoxici (subsetul T citotoxice). Rezultatele activarii anterograde asupra limfocitelor T sunt: 1. activarea metabolica; 2. expansiunea clonala; 3. maturarea functionala. b) Activarea retrograda (AR) se realizeaz dinspre limfocitele T activate metabolic spre APC; la sférsitul ef are loc activarea metabolicé a APC. Activarea retrograda decurge in sens opus prezentarii si recunoasterii antigenului. AR se realizeaza prin intermediul unor citokine produse de limfocitele T helper. Dintre acestea sunt mai importante IL-4 si IFN 7 avand ca acfiune comuna stimularea receptorilor de suprafaté ai APC (n.ed. repetafi dupa mine: ). Aceasta stimulare duce la intensificarea expresiei MHC pe suprafata acestor celule (mai ales a MHC Il), cu cresterea expresiei de epitopi pe suprafata celular. Ca urmare rezulta o stimulare antigenica suplimentard a limfocitelor T si cascada se poate relua pana la atingerea valorii prag a declangarii RI (n. ed. fenomen de amplificare prin feedback pozitiv. Activarea_in_sens_anterograd se realizeazA doar in cadrul cooperarii celulare APC-limfocit T. Se descriu doua etape’ |. Etapa antigen-independenta a activari limfocitelor T presupune contactul intim intre membrana APC si membrana limfocitului T, constituindu-se cupluri de adeziune intercelulara: a) de linia |: CD2 (de pe limfocitul T) se leaga foarte eficient si rapid cu CD58 (LFA3 de pe APC); b) de linia II: LFA‘ (de pe limfocitul T) cu molecule ICAM. Formarea legaturilor de linia | precede si favorizeaza formarea legaturilor de linia Il; afinitatea LFA1 pentru ICAM este mai mica. nDImunologie curs 4 PROTVIN-TIROZIN-KINAZA (PTR: TIROZINA DIN POZITIA 30S Rolurile etapei antigen-independente sunt: A. Favorizarea neta a recunoasterii antigenice; B. Se realizeaz pregatirea declangairii activariilimfocitelor T. Cand CD2 stabileste legaturi cu LFA3 are loc o modificare conformationalé a moleculei CD2 (mai ales in segmentul intracelular) care permite alunecarea PLC (n. ed. fosfolipaza C) dinspre citoplasma spre membrana. Aceasté etapa antigen-independenté are loc in permanenta: 1. In situatia in care APC nu prezinté antigen — expune molecule MHC vide sau goale. Limfocitele T realizeaz aceste contacte pentru ca sunt molecule intens recirculante (n. ed. mot-a-mot, no questions asked). La capatul circuitului este obligatorie stabilirea de legaturi cu APC. Prin aceste contacte (CD2-CD58/LFA3; LFA1-ICAM) se realizeaza o supraveghere imunologica a APC de catre limfocitele T (desi MHC este vid). 2. Cand APC prezinta un epitop ce nu a fost inc& recunoscut prin TcR: complexele TcR-MHC-epitop sunt situate la distanta pe membrana. Il, Etapa antigen-dependenta a activariilimfocitelor T presupune expunerea de c&tre APC a unui epitop (sau antigen) pe MHC Il. In urma recunoasterii antigenice (asociative) sunt generate doua categorii de semnale pe calea TCR: 1. Datorité recunoasterii CD4/CD8 a domeniilor monomorfe MHC => transmitere prin segmentul intracitoplasmatic CD4/CD8 spre PTK a unui semnal inhibitor care se soldeaza cu modificari conformationale ale PTK ce contribuie net la exteriorizarea Tyr din pozitia 5aS (n. ed. SaS? 50S?...). Pe suprafata moleculei aceasta tirozina se autofosforileaza. Efectul fosforilarii este inhibitia de moment a activitatii PTK. Semnalul inhibitor reprezinta un mecanism de protectie prin care se evita activarea limfocitelor T cand acestea au contact cu APC cu MHC sau ’Imunologie curs 4 i. evita activarea policlonala a limfocitelor T (unele clone activate pot avea efecte negative prin recunoasterea unor autoantigene; ji, __evit& reactia limfocitelor T (subset Tc) fata de propriile APC. 2. Al 2-lea semnal activator apare cand APC prezinté un epitop. Se transmite pe cale TcR din aproape in aproape pana la lantul zeta: a. 0 parte din semnale sunt transmise la CD45 via lantul zeta; are loc o activare a CD45, care capata proprietati enzimatice de PTP (protein-tirozin-fosfataz4). PTP preia P de pe PTK. Survine 0 defosforilare a PTK cu activarea ei. Activarea PTK initiaza cascada de activare metabolica a limfocitelor T. © alt& enzim& asociaté la lantul zeta (ZAP 70 ; mas 70 kDa) primeste si ea semnal activator de la lantul zeta, apoi preia P (fosfatidil) de pe CD45, il transmite PLC (fosfolipaza C). Rezulta un complex PLC-P care constituie forma activata a fosfolipazei C. PLC-P sta la baza cascadei _inozitoltrifosfatului: PLC — hidrolizeaza fosfatidilinozitolul membranar la inozitoltrifosfat (IPs) si diacilglicerol Inozitoltrifosfatul este hidrosolubil sr va difuza in toata citoplasma, venind astfel in contact cu reticulul endoplasmic neted, care prezinta receptori pentru IP3. In urma legarii IPs de acesti receptori se elibereaza in limfocitele T Ca** depozitat in reticul. Concentratia citoplasmatica a Ca” creste (hipercalcitie). Hipercalcitia activeaza indirect unele functii nucleare: Ca’ in concentrafie crescuté _stimuleaza calcineurina citoplasmatica (fosfataz& calmodulin-dependenta) care la randul ei stimuleazé unele funcfii nucleare prin activarea unui factor transcriptional ce patrunde in nucleu Acest factor este notat NF-AT, . NF-AT este un polipeptid aflat in citoplasma limfocitului T; in mod normal este inhibat datorita fosforilarii Calcineurina defosforileaza NF-AT, activandu-|. Dupa activare trece din citoplasma in nucleu unde stimuleaza transcrierea unor gene, cu doua efecte majore: |. stimuleazé divizunea mitotica a limfocitului T; Il, stimuleazé moderat expresia genelor pentru interleukine/ citokine. Diacilglicerolul (DAG) este o substanta liposolubila si nu va difuza in citoplasma, ramanand la nivelul membranei, unde activeaz PKC (proteinkinaza C). PKC activeaza la randul ei anumite seturi de enzime, care realizeaz o amplificare a activarii metabolice a limfocitului T si influenteazé indirect unele funcfii nucleare ale limfocitului T, prin factori transcriptional, cum este NF-kB. NF-kB este factorul transcriptional al limfocitului B pentru lanturile usoare k ale imunoglobulinelor (a fost evidentiat in limfocite B mielomatoase).Imunologie curs 4 NF-KB se afla in mod normal in citoplasma in stare inactiva datorita cuplarii cu un inhibitor proteic; activarea lui are loc prin fosforilarea acestui inhibitor sub actiunea PKC. Inhibitorul fosforilat se desprinde de pe molecula NF-kB, care ajunge astfel in stare activata si migreazi in nucleu. La nivelul nucleului actiunile NF-kB sunt de stimulare intensa a expresiei genelor pentru interleukina 2 si pentru receptorul acesteia (CD25). Acest efect sta la baza autoactivarii autocrine a limfocitului T prin propria interleukiné 2 (n. ed. alt exemplu de amplificare prin feedback pozitiv) b. semnalele de pe calea accesorie: CD28 se activeaza prin stabilirea de legaturi cu CD80 (de pe APC). CD28 activat in acest mod are efecte pe nucleu. CD28 RC sau activeazé CD28 RE ( pentru CD 28 RC) care la randul sau activeaza genele promotoare pentru majoritatea interleukinelor (in Th) sau mediatori citotoxici (in Tc). Morfologic: prin stimulare limfocitele T aflate in stare de repaus (Go) tree in limfoblaste T (interfaza:G1=>S—>Gz). timfoblastul T, celula aflata in interfaza, are dimensiuni mai mari decat limfocitul T de repaus, aspect neregulat, citoplasma abundenta, o reprezentare mai bogata a mitecondriilor (activare metabolic) gi reticul endoplasmic abundent; de asemenea se modifica expresia fenotipica, crescand expresia TcR, CD4, CD8 $i a receptorilor de adeziune (LFA-1). Dupa interfazé urmeaza diviziunea mitotic’. Majoritatea celulelor rezultate din aceasté diviziune devin limfocite T efectorii. Limfocitele T efectorii sunt de doua tipuri: 1. producatoare de interleukine, cu rol in amplificarea Rl (subsetul Th); 2. producatoare de mediatori citotoxici (subset Tc) Un numar (n. ed. foarte) mic de celule raman ca celule T cu memorie, adica celule T preactivate. Acestea nu mai revin la Go si la un nou contact cu antigenul rspund foarte repede. Limfocitele B Caracterele generale ale limfocitelor B: 1, Limfocitele B reprezinté 0 minoritate de 20...25 % din totalul limfocitelor mici din sangele periferic; 2. Sunt celule cu o duraté de viaté mai mica, de ordinul sptamani....luni; 3, Sunt celule putin recirculante, fiind distribuite mai ales in organele limfoide, unde stationeaz un timp mai indelungat (cortex ganglionar si pals externa a splinei). Receptorii de suprafata ai limfocitelor B cad in trei categorii |.” Receptori de recunoastere antigenica; Il, Receptori cu rol accesor in activarea limfocitului B: CD 45 (); lll. Receptori de adeziune intercelulara - cel mai important este LFA- 1. -5-Imunologie curs 4 |. Receptori de recunoastere antigenica Caracteristicile principale ale recunoasterii_ antigenice la_nivelul limfocitului B sunt 1. limfocitele B recunose antigenele numai dupa conformatia Spatiala a determinantului antigenic, nu dupa structura primara a acestuia (n. ed. conformatia este determinaté de mai multi factori, printre care se numara structura primara, pH-ul mediului, temperatura; in sensul recunoasterii, conformatia este 0 caracteristicd mai restrictiva decat structura primara, aceeasi structura primara putand prezenta o multitudine de conformatii, de exemplu in functie de pH); 2. limfocitele B (spre deosebire de limfocitele T) recunosc doar antigene solubile, nefind niciodaté necesara prezentarea antigenului. In cazul limfocitului B, la recunoasterea antigenica participa un complex receptorial format din trei componente: 1. BCR (n._ ed, B-Cell Receptor 2) este o imunoglobulina transmembranara. In ordinea descrescdtoare a frecventei aceasta imunoglobulina poate fi: IgM, IgD, IgG, IgA, IgE (ultimete trei tipuri sunt rar intalnite ca BCR). BCR este format din doua perechi de lanturi (n. ed. este un tetramer HzL2). Lanturile grele H sunt transmembranare cu capatul aminoterminal la exteriorul celulei; sunt asociate prin legaturi disulfurice Lanturile usoare sunt extramembranare. Cele doua perechi de lanturi se asociaza prin capetele aminoterminale, formand doua cavitati de dimensiuni reduse (situsuri combinative pentru antigen, notat SCAg). SCAg poate recunoaste determinanti antigenici conformationali prezenti la suprafata moleculelor de antigen nativ. Cele doudImunologie curs 4 SCAg au aceesi structura gi recunose acelagi tip de determinant antigenic. Prin urmare BCR este un receptor antigenic monospecific. Prin capetele carboxiterminale lanturile contribuie la activarea limfocitului B, find in contact fizic cu 0 proteinkinaza (proteinkinaza are alta structura decat cea gasite la limfocitele 7) 2. Iga (CD79 a) 3.19 B (CD 79 B) Cele doua molecule CD 79 sunt glicoproteine transmembranare codate de gene diferite. Ambele au in segmentul extracelular cate un domeniu. Cele doua domenii extracelulare ale unei perechi CD 79 « - CD 79 8 sunt dispuse simetric (asemanator cu Ig). Rolul CD 79 este de a transmite unele semnale BCR (rol ). Prin legaturi disulfurice au contact cu lanturile grele din BCR; sunt asociate si la CD 45, tot prin legaturi disulfurice. Mecanismele activarii limfocitului B: Activarea limfocitului B este rezultatul recunoasterii prin BCR a diferitelor antigene. Stimulii activatori_ se transmit pe doua cai a. calea scurta consta in activarea directa a PTK. PTK preia P din citoplasma si il transmite unor structuri cum ar fi de exemplu segmentul intracitoplasmatic al Ig a si Ig . Prin fosforilare CD 79 sufera transformari conformationale. Semnalul se transmite apoi pe calea lunga; b. calea lunga: de la CD 79 semnalul ajunge la CD 45, care activat are functie de PT-fosfataza, preluand P de pe CD 79 si transmitandu-| PLC. Prin fosforilare PLC este activata, initiind cascada fosfatidilinozitolilor. 4 indoblant é, | siltapa > y 2 J m Expresia fenotipicai se modifica: ~ creste expresia LFA 1; - cregte foarte mult expresia moleculelor MHC Il In stadiul de limfoblast, ca urmare a acestor modificari, limfocitul B isi comuta functia de la recunoastere antigenica la APC. Celulele care trec de stadiul Gz intré in diviziune mitotic. in urma mitozei majoritatea celulelor rezultate sunt celule B efectorii (plasmocite). Un numar mic de celule devin limfocite B cu memorie (limfocite B preactivate), intre stadiile Gy-G, Organizarea sistemului imun Sistemul imun are dou compartimente:Imunologie curs 4 1. Compartimentul central este format din: +maduva hematogena, unde se produc limfocite B si T si unde se matureaza limfocitele B; +timus — loc de maturatie a limfocitelor. 2. Compartimentul periferic estre format din ganglionii limfatici si splind. {n splina si ganglionii limfatici periferici sunt distribuite majoritatea clonelor limfocitarea T si B; aici ajung foarte frecvent toate APC si aici au loc réspunsurile imune. Splina este alcatuita din capsula si parenchim splenic. Parenchimul este format din pulpa rosie (care nu are rol imunologic) si din pulpa alba. Pulpa alba. Pulpa alba prezint trei mangoane concentrice de populatii limfocitare distincte in jurul unei arteriole centrale. Splina genereaza RI fata de antigenele circulante: - __ RIU se desféigoara integral in splina; RIC este inifat la nivelul splinei; se desfasoara in fesutul antigenic. wt cat ak nd “pple ipuee Hy Principalele etape ale RIU intrasplenic - Antigenele din circulatie pot fi: - Antigene solubile (n.ed. libere); - Antigene (n. ed. solubile) transportate de celulele dendritice sanguine. in pals externa antigenele solubile sunt captate de CD (care au rol de filtru); rezult& 0 concentrare local de antigene. Datorité recunoasterii_ antigenului limfocitele B se activeaza trecdnd in limfoblaste B care incepe sa migreze. Antigenul transportat ajuns in splin& se cantoneaza doar in pals interna, unde are loc tranzitia CDS — IDS. IDS prezinta antigenul in context MHC II. -8-Imunologie curs 4 Pentru unele limfocite (n. ed. T) are loc activarea limfocitarai gi transformarea in limfoblaste T. Limfoblastele T migreaz in pals externa. in pals externa, prin stimulare are loc definitivarea activarii limfocitelor B, care se transforma in Plasmocite. Plasmocitele migreaza la distanté de antigen si produc’ secret anticorpi, Ganglionii - Parenchimul ganglionar are 3 zone: 1. corticala este B-dependent si este formata din limfocite B dispuse in grupuri_numite foliculi limfoizi. Cand limfocitele B sunt neactivate, acesti foliculi se numesc foliculi limfoizi primari: 2. Paracorticala este formata din limfocite T distribuite uniform; 3. Medulara are celularitate mixta, fiind format din limfocite B, T, monocite si macrofage. Functille ganglionului sunt aceleasi cu ale spline. Etapele celulare ale RIV intraganglionar ~ RIU intraganglionar este declangat de drenarea prin limfatice aferente a unor antigene tisulare, concentrate mai ales subcapsular (aduse de CD). Daca antigenele sunt recunoscute foliculil primari trec in foliculi secundari (prin activare antigenica). Foliculii secundari Sunt de dimensiuni mari si se extind foarte mult spre interiorul parenchimului (in urma stimularii antigenice limfocitele B se divid si migreaz’). Celularitatea foliculului se modifica - histologic zona subcapsulara este format din limfocite B mici (aflate in repaus; nestimulate antigenic), zona central este clara i alcatuita din putine limfocite B mici iar zona densa este alcatuita din limfocite B mari (limfoblasti proveniti din zona clara, care au recunoscut antigenul si au migrat),