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Conceitos fundamentais de
Cromatografia a lquido de
Alto Desempenho (HPLC)
Ministrante: Ayrton Argenton
CEP Curso
Contatos: ayrtonargenton@hotmail.com
Apoio
PROPRIEDADE FSICA
Destilao fracionada
Cromatografia
Poder de resoluo
Simplicidade da tcnica
COLUNA CROMATOGRFICA
FLUXO
SINAL
CROMATOGRAMA
TEMPO
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DETECTOR
COLUNA CROMATOGRFICA
FLUXO
SINAL
CROMATOGRAMA
TEMPO
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DETECTOR
COLUNA CROMATOGRFICA
FLUXO
SINAL
CROMATOGRAMA
TEMPO
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DETECTOR
COLUNA CROMATOGRFICA
FLUXO
SINAL
CROMATOGRAMA
TEMPO
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DETECTOR
COLUNA CROMATOGRFICA
FLUXO
SINAL
CROMATOGRAMA
TEMPO
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DETECTOR
CROMATOGRAFIA
PLANAR
TCNICA
FASE
MVEL
EM COLUNA
LQUIDO
FLUIDO
SUPERCRTICO
GS
LQUIDO
FASE
ESTACIONRIA
LQUIDO
SLIDO
FASE LIGADA
LQUIDO
SLIDO
FASE LIGADA
SLIDO
FASE LIGADA
LQUIDO
SLIDO
FASE LIGADA
Analitos
Alimentos
Tintas
Qumica
Polmeros
Clnicas
Farmacutica
Princpios ativos
CG
HPLC
Requisitos da amostra
Tipo de Amostra
Lquidos e slidos
Inicos ou covalentes
Baixo e alto peso molecular
At 300000
At 30000
Capacidade preparativa
Pobre
Boa
Sensibilidade
10-9 g (UV)
10-15 g (coulomtrico)
INJETOR
COLUNA
DETECTOR
BOMBA
AQUISIO
DE DADOS
tampa de teflon
CONSIDERAO IMPORTANTE 2:
A fase mvel deve ser degaseificada para evitar a formao de bolhas no processo
de separao o que pode interferir no desempenho da anlise.
As tcnicas de degaseificao so:
Ultrasom
Refluxo com resistncia de aquecimento
Vcuo (trompa dgua)
Purga com Hlio
Uso de membrana semipermevel e vcuo online.
CONSIDERAES IMPORTANTES
Vazo constante essencial para qualquer separao por HPLC. Alta presso necessria para
impulsionar o solvente atravs da coluna cromatogrfica vencendo a enorme resistncia imposta pela fase
estacionria.
Normalmente se utiliza bombas recprocas com um ou preferencialmente dois pistes o que minimiza
pulsao.
Preferencialmente devem operar com programao de vazo e deve ser possvel a interrupo do
processo em presses fora dos limites mximos e mnimos pr-estabelecidos.
importante introduzir fatores de correo de compressibilidade para a fase mvel utilizada ainda que os
lquidos tenham baixa compressibilidade. Caso contrrio, a vazo real pode diferir da selecionada.
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A figura abaixo ilustra dois cromatogramas obtidos por anlises isocrtica e por gradiente.
ISOCRTICA
GRADIENTE
A amostra introduzida na vlvula com auxlio de uma microseringa com agulha sem ponta
e a injeo efetuada pela rotao da vlvula da posio de carga para a posio de
injeo.
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Comprimento (cm)
3-5
10 15
7 10
At 25 cm (em casos
especiais, at 60 cm)
O detector um dispositivo conectado na sada da coluna que percebe a presena de componentes e emite um sinal
eltrico a ser registrado na forma de um pico cuja rea proporcional a quantidade do componente analisado.
Um detector ideal deve possuir as seguintes caractersticas:
Alta Sensibilidade
Estabilidade
Mudanas de temperatura e vazo de fase mvel no devem alterar o sinal
Reprodutibilidade
Resposta Linear
A resposta do detector deve variar linearmente com a concentrao do analito numa
de concentrao
Resposta rpida aos analitos
No contribuir para o alargamento do pico
O volume da cela do detector deve ser o menor possvel para evitar a perda de eficincia
Celas de baixo volume, contribuem positivamente com a
sensibilidade.
Confiabilidade
Facilidade de manuseio
No destrutivo
Condio necessria para cromatografia preparativa
Seletividade
Habilidade relativa de um detector medir um composto e no outro.
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extensa faixa
do sistema.
TIPOS DE DETECTORES
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ELETROQUMICOS COULOMTRICO
A figura abaixo representa um esquema de uma cela coulomtrica:
ndice de Refrao
Espectrofotometria UVVIS
Fluorescncia
Eletroqumico
Princpio de operao
Mudana do IR da fase
mvel
Oxidao ou reduo em
um potencial fixo
Tipo
Universal
Seletivo
Seletivo
Seletivo
Quantidade mnima
detectvel
Micrograma
Nanograma
< picograma
Fentograma
Faixa de linearidade
103 104
104 105
103 105
105
Volume da cela
(microlitro)
3-15
1-20
8-25
5-10
Sensibilidade a
temperatura
Alta
Baixa
Baixa
Mdia
Aplicaes
Geral
Compostos que
absorvem na regio UVVIS
Compostos ou derivados
que fluorescem
Esta carga transferida para as partculas do analto, que flue em sentido oposto.
Aplicaes do CAD:
Faixa Dinmica
Consistncia de
Resposta
Aplicabilidade
Reprodutibilidade
Compatibilidade
Cromatogrfica
Facilidade
de Uso
Charged Aerosol
UV
Evaporative Light
Scattering
Chemiluminescence
Nitrogen
Refractive Index
Kads =
[adsorvido na FE]
[desorvido na FM]
FM
FE
PARTIO
A fase estacionria um lquido depositado ou quimicamente ligado a um suporte slido.
As molculas dos componentes a serem separados se distribuem entre a fase estacionria
ligada e a fase mvel lquida de acordo com sua afinidade relativa:
Kpart =
[dissolvido na FE]
[dissolvido na FM]
PARTIO
FM
FE
TROCA INICA
POR EXCLUSO
O esquema abaixo ilustra o processo:
BIOAFINIDADE
O esquema abaixo ilustra o processo:
TEMPO DE RETENO
FATOR DE RETENO
FATOR DE SEPARAO
NMERO DE PRATOS
RESOLUO
Definio
Fator de reteno
Fator de separao
Nmero de pratos
Resoluo
N
Rs =
tr / to
tr2 / tr1
= 16 ( tr / Wb )2
Outra medida da eficincia da coluna dada pela altura do prato, H (altura equivalente a um
prato terico.
onde
L = comprimento da coluna
L
H=
N = nmero de pratos
N
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10
5
3
Vazo
FILTRAO EM GEL
(FM aquosa)
Resinas alqudicas
Peptdeos
Epxidos
Proteinas
Poliestirenos
Enzimas
Borracha natural
cidos Nucleicos
Silicones
Lipdios
Colunas de permeao de gel fabricadas com sais de clcio ou chumbo de resinas sulfnicas
com dimetro de poro controlado, so usadas nas anlises de dextrana, oligossacardeos e
acares.
-Si-O-Si- (R)
-Si-OH
-Si-O-Si- (R)
-Si-OH
-Si-O-Si- (R)
-Si-OH
-Si-O-Si- (R)
Grupos silanis so responsveis por retenes no especficas que
provocam alargamento dos picos.
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com
ENDCAPPING
SLICA DE ALTA PUREZA(slica tipo B) maior que 99.995%, com menos de 50ppm de
metais, (metais causam caudas pois tornam os silanols extremamente cidos).
A particula tem diametro total de 2.7m e a camada porosa 0.5m, rea superficial
de 150m2/g, diametro de poro: 90a e pode ser usada na faixa de pH: 2 9.
www.sigmaaldrich.com/supelco/the_reporter/207002-ascentis-express.Pdf
www.mac-mod.com/pb/halo -pb.Hmtl
ADSORVENTES DE
HPLC E
CARACTERSTICAS
FASES ESTACIONRIAS
fase reversa.
OCTADECIL
Si- O - Si O
Si- O - Si O
C18
C18
C18
C8
Si- O - Si -
C8
C8
CH2-
Si- O - Si O
CH2-
Si- O - Si O
Si- O - Si -
FENIL
Si- O - Si O
C8
Si- O - Si O
Si- O - Si -
Si- O - Si O
Si- O - Si O
C18
OCTIL
CH2-
Si- O - Si -
CH2-
FASE MVEL
ESCOLHA DO SOLVENTE EM HPLC
O sucesso da separao cromatogrfica s possvel se for aplicada uma FM
correta a uma FE conveniente.
A escolha da composio da FM leva em conta vrios fatores, tais como:
Propriedades fsico-qumicas que afetam a solubilidade, partio e adsoro e,
portanto, a separao
Propriedades fsicas que afetam a possibilidade de deteco dos componentes
Propriedades fsicas que dificultam o manuseio das bombas, detectores ecoluna
Propriedades que afetam a segurana (toxidez e inflamabilidade)
Custo
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FASE MVEL
SELEO DA FASE MVEL EM FUNO DAS PROPRIEDADES FSICAS
Os seguintes parmetros devem ser considerados para uma escolha adequada da
FM:
Viscosidade
Compressibilidade
Presso de vapor
Toxidez
ndice de Refrao
Corte de UV (cut off) espectro de absoro UV-VIS
Miscibilidade de solventes e outras caractersticas importantes
Fora dos Solventes
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Viscosidade (cP)
Vazo (ml/min)
P (atm)
Metanol
1.1
1.00
102
Isopropanol
2.2
1.00
460
UV cut off
IR 20C
Fora do
Solvente
Viscosidade
a 20C, cP
Hexano
no
200
1.3750
0.00
0.33
Isooctano
no
200
1.3910
0.01
0.50
Tetracloreto de carbono
no
263
1.4595
0.14
0.97
Clorofrmio
no
245
1.4460
0.31
0.57
Cloreto de metileno
no
235
1.4240
0.32
0.44
Tetrahidrofurano
sim
215
1.4070
0.35
0.55
ter dietlico
no
215
1.3530
0.29
0.23
Acetona
sim
330
1.3590
0.43
0.32
Acetato de etila
pobre
260
1.3720
0.45
0.45
Dioxano
sim
215
1.4220
0.49
1.54
Acetonitrila
sim
190
1.3440
0.50
0.37
2-Propanol
sim
210
1.3770
0.63
2.30
Metanol
sim
205
1.3290
0.73
0.60
gua
sim
1.3328
>0.73
1.00
FASE MVEL
RELAO ENTRE SELETIVIDADE COM POLARIDADE DA FM
Ao variar a polaridade da
fase mvel, varia o fator
capacidade(k=tr/to) e
consequentemente a
seletividade na separao.
Variao de tr e resoluo
com a composio do
solvente em anlise de
metil, etil, propil e butil
parabenos. coluna ODS
(10cm x 0.6 cm), UV
254nm, 40C, gua/metanol
FASE MVEL
Fase mvel
100% Orgnica
Adicione gua
(incrementos de
20%) at k = 5
injete amostra
Diminua vazo
Aumente a coluna
Diminua as partculas
ainda no separa
OCl-
Glicina
OClMERC
Isoindol
reactor
reactor
50C
coluna
fluormetro
registrador
bomba
OCl-
bomba
OPA / MERC
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AO CORRETIVA
VAZIOS NA COLUNA
SUBSTITUA A COLUNA.
TENTATIVA DE PREENCHER OS VAZIOS
RARAMENTE VALE A PENA.
A anlise de compostos com carga tem sido obtida por supresso de ion (ajuste
cuidadoso do pH da fase mvel para resultar em analito no ionizvel.
Quando usado com colunas hidrofbicas Fase Reversa , os reagentes ion par podem
ser usados para aumentar seletivamente a reteno de analitos carregados.
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%i
Ai
x100
Ai
Ai = rea do composto i
Ai = somatria das reas de todos componentes
Considera-se que todos os componente apresentam resposta proporcional a sua
concentrao e que mesma concentrao de diferentes compostos resulte em
reas iguais (o que dificilmente ocorre).
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Ai xFi
x100
Ai xFi
Ai = rea do composto i
Fi = fator de resposta do componente i
AiFi = somatria das reas de todos componentes multiplicadas pelos respectivos
fatores de resposta
necessrio conhecer todos os componentes da amostra para determinao dos
fatores de resposta de cada componente
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Ai
Ci
Nesta tcnica, se o volume injetado no for exatamente o mesmo ou se houver alterao de algum
parmetro que afete a resposta do componente no detector, como por exemplo, variao da intensidade
de luz do UV-VIS ou alterao na FM, as reas dos picos podero ser maiores ou menores daquelas
obtidas na calibrao e consequentemente os resultados sero incorretos.
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Ai / Api
Ci / Cpi
A tecnica utiliza particulas menores que 2m o que fornece colunas com maior
eficincia( maior nmero de pratos) e consequentemente melhor separao, desde
que os analitos tenham coeficiente de partio diferentes.
Normalmente utiliza-se colunas com 1.7m o que acarreta maior presso no
sistema, sendo necessrio utilizar equipamento configurado para isso.
O sistema necessita de baixo volume morto, bomba para trabalhar com presses
maiores que HPLC convencional, detectores de baixo volume da cela.
Em analises rpidas, o detector precisa permitir velocidade de amostragem na faixa
de 50milisegundos ou invez de 400 na HPLC convencional e constante de tempo de
0.05 seg.
SISTEMAS UHPLC E FASES ESTACIONARIAS
Waters Corporation Acquity UPLC System 6 FE BEH/slica
Thermo Scientific Accela High Speed LC 3 FE Hypersil Gold
Agilent 1200 Series 8 FE Eclipse, Extend e Stablebond
Restek(colunas) Pinnacle DB 1.9m
Grace/ Alltech - colunas
Parmetros avaliados:
Hidrofobicidade
Quelao de metais
Seletividade
Densidade de ligaes
Projeto Snyder/Dolan Grupo de trabalho Impurezas PQRI informao obtida em Wyeth, Eli Lilly,
FDA-laboratorio de Rockville, 3M, Laboratorio de Snyder/Dolan - 8 compostos/ 2 amostras
Parmetros avaliados:
Hidrofobicidade
Seletividade
Acidez pontes de H
Basicidade pontes de H
Capacidade de troca inica
Site: www.usp.org/USPNF/columns.html
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Modern HPLC for practicing scientists Michael W.Dong Wiley Interscience 2006
HPLC A practical users guide Marvin C. McMaster John Wiley & Sons - 2007
FONTES DE INTERNET
www.chem.agilent.com
www.alltech.web
www.dionex.com
www.esind.com
www.gls.co.jp
www.hamiltoncompany.com
www.macherey-nagel.com
www.mac-mod.com
www.merck.de
www.microlc.com
www.microsolvtech.com/
www.phenomenex.com
www.instruments.perkinelmer.com
www.polymerlabs.com
www.restekcorp.com/h
www.sigmaaldrich.com/Brands/Supelco
www.thermo.com
www.tosoh.com/
www.varianinc.com
www.vydac.com/
www.waters.com
www.zirchrom.com/
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Agradecimentos
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Dentro das diversas reas que o CEP atua, destacam-se: Instrumentao e Desenvolvimento Analtico,
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Informaes: www.cepcursos.com / info@cepcursos.com
Professor Ayrton: ayrtonargenton@hotmail.com
Av. Ibirapuera 2907, Ed. Comercial State, Conj. 1709, Moema - SP - SP - TEL/ FAX: 11 50539755