Bahan dan Metode

Baris sel epitel

Sel TR146, baris sel karsinoma skuamosa mulut berasal dari metastasis kelenjar
getah bening lokal yang diperoleh dari Balai Laboratorium Clare (Penelitian Cancer
UK). Dulbecco yang dimodifikasi kultur sel Elang Menengah (DMEM) (Gibco, Belgia)
dilengkapi dengan 10% panas serum janin sapi yang tidak aktif (Greiner bio-satu,
Belgia), 22,8 mg/mL penisilin-streptomisin (5000 U / mL; Gibco, Belgia) dan 2,5
mg/mL amfoterisin B (Bristol-Myers Squibb, Belgia). Sel dikultur pada 37 C dan
10% CO2 dan secara teratur dikontrol menjadi Mycoplasma bebas (MycoAlert
Mycoplasma Deteksi kit, Lonza, USA).
Penyinaran
Sebuah foton sinar single 6 MV dihasilkan dengan menggunakan akselerator linier
(SLi-18, Elekta, UK). 24 piring dengan baik ditempatkan di atas 1,5 cm Perspex (poli
metil metakrilat) piring untuk mengkompensasi untuk membangun efek dan disinari
dari bawah. Model diiradiasi dengan dosis total 10 Gy pada tingkat dosis sesaat 430
cGy/menit.
Koleksi swab oral
Sebelum pengambilan sampel, rongga mulut dari sukarelawan yang sehat adalah
dengan memberi air minum. Sebuah kapas steril digunakan untuk menggosok
mukosa bukal 10 kali sebelum perendaman dalam 2 mL buffer saliva sintetis.
Secara singkat, buffer organik (500 mg / L ureum), buffer anorganik (2,987 g/L KCl,
2.96 g/L NaH2PO4, 0,667 g/L KSCN, 1,9 g/L Na2SO4, 0,993 g/L NaCl dan 10,8 mM
NaOH ) dan buffer aditif (483 mg/L amilase, 167 mg/L musin dan 50 mg/L asam
urat) yang diautoklaf dan dicampurkan dengan perbandingan (4: 3: 3) segera
sebelum digunakan. Setelah inkubasi oral swab selama 15 menit pada suhu 37C,
suspensi mikroba dengan cepat yang dibekukan dalam nitrogen cair dan disimpan
pada -80C sampai percobaan dilakukan. Untuk semua eksperimen, oral swab yang
berbeda diambil dari relawan sehat yang sama.
Model mukosa mulut
Untuk co-budaya mikrobiota dan sel-sel epitel TR146 dalam kondisi tidak menular,
kami menggunakan model mukosa mulut yang baru-baru ini diterbitkan kami.
Secara singkat, 75 uL agar/solusi musin agar terlihat di membran berpori (ukuran
pori 0,4 um) dari 24 sumur piring sistem Transwell (Corning Inc., USA) dan
dibiarkan mengeras selama minimal 30 menit. Setelah pencairan pada suhu kamar,
20 uL sampel mikroba (~ 3,2 log / filter) dibawa di atas agar/lapisan musin. Dalam
kompartemen basal, lapisan konfluen sel TR146 dihasilkan oleh pembenihan 300
000 sel TR146 ke dalam sumur setelah label dengan solusi pelabelan sel Dil

(teknologi Hidup Eropa, Belgia). Sel diizinkan untuk melampirkan dan tumbuh
selama 3 hari sebelum melukai.
uji penyembuhan luka
Monolayers TR146 yang digores dengan menggunakan ujung pipet plastik steril.
Mengambang sel dihilangkan dengan mengganti medium dengan serum segar yang
bebas, antibiotik bebas DMEM. Filter yang mengandung mikrobiota dan lapisan
agar/musin yang ditempatkan di atas sel-sel yang terluka sebelum iradiasi. Dengan
cara mikroskop fluoresensi otomatis (Zeiss Axiovert 200M), gambar 4 titik yang
dipilih sepanjang luka di setiap sumur diambil segera setelah iradiasi (0 h) dan 24
jam setelah inkubasi pada 37C dan 5% CO 2. Migrasi sel ke daerah yang ke hadapan
terluka dan tidak adanya mikroba mulut dinilai dengan membandingkan mikrograf
setelah 0 dan 24 jam (Angka 1A dan 2A). Relatif permukaan (%) dari luka ditentukan
dengan membagi permukaan luka setelah 24 jam oleh permukaan luka saat 0.
Untuk ini kami menggunakan makro custom-made di ImageJ. Untuk baik setiap ,
nilai rata-rata dari permukaan luka dihitung (n = 1) dan digunakan untuk analisis
lebih lanjut. Secara total, 5 percobaan independen dilakukan, masing-masing
dengan 2 sampai 4 sumur per kondisi.
pencacahan mikroba
Untuk menghitung mikrobiota pada awal percobaan, pengenceran 10 kali lipat dari
suspensi swab mulut disiapkan dalam PBS steril dan berlapis di piring BHI agar
(Sigma, Belgia) dengan menggunakan teknik dilusi plating mikro. Setelah 24 jam
co-budaya, mikrobiota dalam kompartemen apikal dihentikan pada 200 uL PBS steril
sebelum plating pengenceran 10 kali lipat seperti yang dijelaskan di atas.
M 454 pyrosequencing
Ekstraksi DNA dan 454 analisis pyrosequencing kompartemen apikal dilakukan
seperti yang dijelaskan sebelumnya. Rata-rata, 12 907 jumlah membaca yang
dihasilkan oleh pyrosequencing untuk setiap sampel. Setelah pengolahan hasil, unit
taksonomi operasional diklasifikasikan menggunakan database RDP.
statistika
Analisis statistik dilakukan dengan SPSS statistik 22. Setelah normalitas cek dengan
uji Shapiro-Wilk, sebuah ANOVA, murid T, Kruskal Wallis atau uji Mann Whitney-U
digunakan. Koreksi Bonferroni dilakukan untuk mengoreksi beberapa perbandingan.
Semua teknik lain yang digunakan untuk penelitian ini dijelaskan secara rinci di De
Ryck et al.