BIOKEMIJSKA

TEHNIKA
2007/2008

1. VAJA
DOLOEVANJE
KONCENTRACIJE
PROTEINOV

Ime in priimek
19. 5. 2008

TEORETINE OSNOVE
Proteini so polimeri amino kislin, kjer so amino kislinske enote med seboj povezane s peptidnimi
vezmi.

(del primarne proteinske kisline)

Kriteriji za izbiro metode za doloevanja proteinov v raztopini so odvisni od prikladnosti,
uporabnosti proteinov za analizo, od prisotnosti dodatkov oz. substanc, ki motijo analizo in od
potrebne stopnje natannosti analize.
Poznamo razline metode za doloevanje koncentracije proteinov:
1. Doloevanje koncentracije proteinov na osnovi absorbanc
- Absorbanca pri 280 nm: (od 20 g do 3 mg, od 200l do 3 ml ali ve, zadovoljiva
natannost).
- Absorbanca pri 205 nm: (od 1 do 100 g, od 200 l do 3 ml ali ve, zadovoljiva natannost)
- Ekstinkcijski koeficient: (od 20 g do 3 mg, od 200 l do 3 ml ali ve, zelo dobra natannost).
2. Kalorimetrina metoda za doloevanje koncentracije proteinov
- Modificirana Lowry-jeva metoda: (od 20 do 300 g, od 1 ml naprej, dobra natannost)
- Biuret-ova matoda: ( od 1 do 10 mg, 5 ml, dobra natannost)
- Bradford-ova analiza: (od 1 do 20 g-mikro analiza, od 20 do 200 g-makro analiza, 1ml-mikro,
5,5 ml-makro, zadovoljiva natannost).
NAMEN VAJE
Doloiti koncentracijo proteinov v danih vzorcih po Lawry-jevi metodi.
POTEK VAJE
Odpipetirali smo 2 ml vzorca z neznano koncentracijo proteinov v centrifugirko, nato smo po vrsti
dodajali 2 ml reagenta A in 0,8 ml reagenta B. Po 10 minutah smo dodali 1,5 ml reagenta C ter
premeali. Centrifugirke smo pustili stati pri sobni temperaturi 10 minut, da se je razvila modra
barva. Potem smo oditali absorbanco pri = 700 nm. Iz umeritvene krivulje smo oditali
koncentracijo prisotnih proteinov v raztopini.
(Uporabili smo encimski preparat: Lipolase T 100)

 MERITVE
Uporabili smo obe enabi krivulj:
1. Enaba krivulje: y = 0,0057x + 0,0163
2. Enaba krivulje: y = 0,0045x + 0,1184
VZOREC
1.
2.
3.
4.
5.
X

konc. v g/ml
0,0013
0,0026
0,0030
0,0033
0,0045
0,00248 g/ml

konc. v
g/5ml

absorbanca

0,00067
0,00130
0,00149
0,00165
0,00228

0,3647
0,6632
0,6910
0,4259
0,8441
0,5928

(=700 nm)

oditki iz
umeritvene v
g/ml
0,00003056
0,00006053
0,00006362
0,00003593
0,00008063
0,00005271

odstotek
pristonih
proteinov (%)

2,281
2,328
2,135
1,089 *
1,768
povpreje:
2,128

* nismo upotevali za izraun povpreja

REZULTAT
X
=> 100 %
0,00005271 => 2,128 %
--------------------------------X= 0,00248 g/ml
To je koncentracija naega vzorca.

OPAANJA IN DISKUSIJA REZULTATOV

- Pri vaji smo se seznanili kako se dolouje neznana koncentracija proteinov. Ko smo pripravljali
vzorce smo morali paziti, da se nam je vsebina dobro raztopila, zato smo centrifugirke poloili v
ultrazvono kopel.
- Na podlagi znane koncentracije proteinov v predhodno pripravljenih raztopinah, smo lahko
doloili koncentracijo proteinov v naem neznanem vzorcu. S pomojo programa Simple Reads
Report smo izmerili absorbance in iz umeritvene krivulje oditali koncentracijo proteinov.
- Glede na ostale absorbance in koncentracije smo dobili logien rezultat: 0,00248 g/ml pri
A=0,5928, glede na to, da je pri 0,0013 g/ml A=0,3647.