Produksi Kultur Sel Tumbuhan

Pertanyaan pertama yang harus dijawab untuk aplikasi komersial kultur sel tanaman untuk
produksi bahan kimia kekhawatiran teknologi dan ekonomis kelayakan. Di pabrik prinsipnya
kultur suspensi sel dapat diperoleh dari tanaman apapun, meskipun beberapa tanaman yang lebih
mudah untuk membuat kultur sel daripada yang lain. Kendala utama, bagaimanapun, dianggap
sensitivitas geser sel tumbuhan. Jika dibandingkan dengan mikroorganisme, sel-sel tumbuhan
jauh lebih besar, terutama karena adanya vakuola besar. Sel tumbuhan menjadi seperti kantong
air dengan dinding sel tipis, ia berpikir bahwa diaduk dalam fermentor besar akan menyebabkan
sel-sel runtuh karena gaya geser yang diproduksi di aduk massa kental sel (stres hidrodinamik).
Sebuah studi oleh Wagner dan Vogel (1977) di mana ia mencatat bahwa produksi antrakuinon
dari garis sel citrifolia Morinda lebih rendah dalam fermentor diaduk daripada di fermentor airlift
telah berkali-kali dikutip sebagai contoh dari efek gaya geser pada sel . Namun, dalam hal ini
berpengaruh pada pertumbuhan sel kecil. Studi tentang pengaruh gaya geser oleh Meijer et al.
(1987) dan Leckie et al. (1990) pada kenyataannya menunjukkan bahwa sensitivitas geser sel
tumbuhan tidak seperti masalah seperti thought.In sel tumbuhan fakta dapat tumbuh di tangki
jenis diaduk bioreaktor, pengaduk geser rendah dapat menguntungkan untuk jalur sel lebih
sensitif. Hal ini juga ditegaskan oleh praktek, beberapa percobaan skala besar telah dilaporkan
dalam literatur, dan produksi komersial dari produk tanaman menggunakan jenis tangki diaduk
bioreaktor telah dicapai (Hibino dan Ushiyama, 1999; Westphal, 1990).
Teknologi yang layak, perekonomian suatu produksi bioteknologi sel tanaman adalah pertanyaan
penting lainnya. Sepuluh Hoopen dan rekan kerja (van Gulik et al 1988;.. Verpoorte et al 1991,
1999) membuat perhitungan biaya untuk berbagai jenis proses, berdasarkan desain untuk fasilitas
untuk sel tanaman produksi bioteknologi dari metabolit sekunder. Sebuah suspensi sel
Catharanthus roseus digunakan sebagai Model, dengan asumsi produktivitas 0,3 g / l Ajmalisin
per 2 minggu, yaitu sekitar maksimum yang telah dilaporkan untuk kultur sel tanaman ini.
Sebuah kepadatan biomassa dari 40 g / l (DW) diasumsikan dicapai dalam langkah pertama dari
proses. Setelah fase pertumbuhan ini dari 1 minggu, media diubah menjadi media produksi yang
mengandung 8% sukrosa (Knobloch dan Berlin, 1980). Sel-sel dipanen setelah 1 minggu dalam
medium produksi. Untuk menghasilkan 3.000 kg Ajmalisin alkaloid indole 6 bioreaktor dari 145

m3 diperlukan. Menghitung biaya berdasarkan depresiasi bioreaktor, dan biaya media dan energi,
harga US $ 1500 / kg disimpulkan. Dari jumlah ini sekitar 65% pergi ke depresiasi. Jika
produktivitas akan meningkat 10 kali lipat menjadi 3 g / l, dengan harga US $ 430 / kg dihitung.
Juga kemungkinan sistem produksi kontinyu dianggap. Dalam sistem seperti sel-sel yang tetap
hidup, dan produk dikumpulkan dari media. Ini, bagaimanapun, mensyaratkan bahwa produk ini
diekskresikan ke medium gratis di luar sel. Dalam sistem fed-batch yang dijelaskan di atas,
dengan kepadatan biomassa dari 40 g / l hampir tidak ada media gratis. Jadi untuk sistem
kontinyu seperti kepadatan biomassa harus menurun. Yang membutuhkan ukuran yang lebih
besar dari bioreaktor (250 m3) dan peningkatan biaya penyusutan, media dan energi. Bahkan
hasil ini dalam dua kali lipat harga dari yang dalam kasus budaya umpan curah system.In bahwa
produk ini tidak diekskresikan ke media, yang paling umum, langkah tambahan diperlukan untuk
permeabilize sel, yang lebih jauh meningkatkan biaya. Kesimpulan dari perhitungan ini adalah
demikian bahwa jenis batch atau makan-batch kultur suspensi sel adalah yang paling ekonomis.
Tujuannya demikian harus untuk meningkatkan produktivitas

sel untuk datang ke proses

komersial.

Peningkatan
a. Screening, seleksi dan optimasi Media
Pendekatan paling umum digunakan yaitu screening, seleksi sel dengan produksi tinggi
dan optmimasi media tumbuh. Pendekatan ini telah banyak digunakan untuk sistem produksi
mikroba dan juga untuk sel tumbuhan seperti kultur Coptis japonicell dimana dihasilkan 7 g/l
(Sato et al., 1982; Sato and Yamada) dan untuk shikonin dengan produksi 3 g/l. Namun untuk
kultur sel

produksinya kurang berhasil karena produk yang dihasilkan kurang stabil dan

beberapa subkultur awal produktivitasnya jauh lebih rendah (for a review see Ohta and
Verpoorte, 1992). Contohnya yaitu morfin, vinblastine dan vincristine yang tidak ditemukan
produk kultur sel awalnya. Dapat dikatakan bahwa untuk kultur sel tumbuhan dengan
pendekatan ini tidak dihasilkan produk apapun (nol).

b. Kultur dengan Sel berbeda

Metabolit sekunder merupakan produk turunan, dalam kultur sel suspensi tidak terjadi
produk turunan. Maka dari itu dilakukan penelitian dengan kultur in vitro pada sel yang berbeda.
Akar, tunas dan embrio dibudidayakan secara in vitro dan dihasilak kultur organ yang mirip
dengan metabolit sekunder. Contohnya yaitu alkaloid tropan hiosiamin dan skopolamin yang
dihasilkan dari kultur akar dan minyak esensial yang dihasilkan dari kultur tunas (diulas lihat,
mis, Oksman-Caldentey et al., 2000; Verpoorte et al.,

1991),. Dari penelitian

Doran dan

Narassu, dengan adanya transformasi Rhizogenes Agrobacterium atau yang disebut akar rambut
dapat diperoleh. Rhizogenes Agrobacterium atau akar rambut merupakan produsen yang baik
untuk metabolit sekunder akar contonya yaitu hyocyamus muticus . Namun, pendektan kultur
organ ini harus dilakukan dalam skala besar. Meskipun dalam pendekatan ini digunakan
bioreactor yang baik untuk kultu akar dan tunas, produksinya memerlukan biaya yang sangat
mahal. Contohnya yaitu akar ginseng (Hibino and Ushiyama, 1999).

c. Imobilisasi Sel
Immobilisasi yaitu ... Pendekatan lain yang dilakukan yaitu imobilisai sel dimana
produktivitas dapat ditingkatkan dengan adanya interaksi sel. Pendekatan ini juga dilakukan
dalam skala besar.
d. Elisitasi
Sebuah pendekatan lain untuk memperbaiki produk yang dihasilkan pada kultur sel
tanaman adalah alterasi metabolisme sel melalui faktor-faktor eksternal, misalnya faktor stress,
penambahan ion logam berat dan garam anorganik. . Enzim-enzim dari metabolisme sekunder
juga diinduksi oleh pathogen yang menginvasi yang menghasilkan fitoaleksin. Dalam hal ini
elicitor berperan penting dalam menginduksi enzim yang terlibat dalam siklus metabolisme.
Fitoaleksin itu sendiri merupakan senyawa antibiotik yang mempunyai berat molekul rendah,
dan dibentuk pada tumbuhan tinggi sebagai respons terhadap infeksi mikroba patogen. Senyawa
yang merupakan bagian dari mekanisme tersebut dapat dianalogikan dengan antibodi yang

terbentuk sebagai respons imun pada hewan. Induksi ini dikarenakan molekul yang terbentuk
dari degradasi dinding sel tumbuhan atau dinding sel mikroba.

Sebagai respon terhadap stres faktor, seperti kejutan osmotik, penambahan ion logam
berat, garam anorganik, homogenat mikroba atau radiasi UV, akumulasi beberapa metabolit
sekunder dapat ditingkatkan pada tanaman atau kultur sel tanaman. Pada tumbuhan jalur
metabolit sekunder tertentu yang disebabkan oleh infeksi dengan mikroorganisme. Senyawa
yang terbentuk adalah phytoalexins, senyawa molekul rendah berat badan dengan aktivitas
antimikroba (Smith 1996). Induksi adalah karena molekul tertentu yang terbentuk dari degradasi
dinding sel tanaman atau dinding sel mikroba. Ini disebut Elisitor biotik juga dapat digunakan
untuk memicu produksi phytoalexins dalam kultur sel tanaman. Ini menawarkan model yang
sangat baik untuk mempelajari sistem pertahanan tanaman. Sejumlah turunan fenilpropanoid
bertindak sebagai agen defensif terhadap cekaman biotik atau abiotik (Dixon dan Paiva, 1995),
oleh karena itu sebagian besar kemajuan yang telah diperoleh pada penjelasan jalur ini dan
regulation.Elicitation mereka juga dapat diterapkan pada skala besar untuk mendorong produksi
senyawa tertentu di pra-waktu yang ditetapkan dalam proses; Selain itu, produk ini sering
diekskresikan ke medium, sehingga sel-sel dapat didaur ulang dan re-menimbulkan. Kurz et al.
(1987) menunjukkan bahwa untuk produksi sanguinarine dalam kultur sel poppy, proses yang
berkesinambungan layak di mana urutan elisitasi dan perubahan media dapat digunakan untuk
menghasilkan alkaloid ini. Juga dalam kasus produksi paclitaxel elisitasi telah terbukti
menyebabkan peningkatan yang jelas dalam produktivitas (Laskaris et al., 1999). Sayangnya,
sebagian besar metabolit sekunder tanaman bunga tidak phytoalexins. Akibatnya produksi
mereka tidak diinduksi atau meningkat sebesar elisitasi. Di sisi lain, elisitasi dari kultur sel
tanaman dapat menyebabkan produksi dalam jumlah besar untuk setiap tanaman metabolit
sekunder tertentu, yang menawarkan sumber yang menarik dari chemodiversity untuk skrining
untuk pelanggan baru untuk pengembangan obat (McAlpine dkk., 1999).
Hal demikian dapat disimpulkan bahwa untuk produksi komersial budaya suspensi sel
tanaman yang sangat memproduksi adalah yang paling menjanjikan. Penelitian demikian harus
fokus pada metode untuk meningkatkan produktivitas, dengan meningkatkan laju pertumbuhan

dan dengan meningkatkan akumulasi metabolit sekunder. Untuk ini, rekayasa metabolik
menawarkan perspektif yang menarik untuk meningkatkan produktivitas pabrik sel tanaman.
Akibatnya dalam beberapa tahun terakhir satu telah pergi ke studi tentang jalur
biosintesis, dengan tujuan untuk memetakan jalur lengkap, mengidentifikasi tingkat
kemungkinan membatasi langkah, dan mempelajari lebih lanjut tentang peraturan (Dixon, 1999;
Facchini, 2001; Hashimoto dan Yamada, 1994 ; Kutchan, 1995; Verpoorte et al, 1998, 1999;.
Zenk 1991, 1995). Informasi ini akhirnya harus mengarah pada pendekatan baru untuk
meningkatkan sekunder produksi metabolit dalam tanaman atau kultur sel tanaman. Rekayasa
metabolik jelas membutuhkan pengetahuan menyeluruh dari semua langkah dalam jalur, dan gen
yang mengkode langkah-langkah. Pemetaan biosintesis jalur merupakan langkah pertama dalam
pendekatan ini.
PEMETAAN JALUR BIOSINTESIS
Pengetahuan tentang jalur metabolit sekunder pada kenyataannya terbatas. Sebagian
besar pengetahuan kita didasarkan pada pekerjaan dari tahun 1960-an, 1970-an, ketika banyak
pekerjaan dilakukan dengan makan berbagai zat antara berlabel radioaktif. Berdasarkan
penggabungan dan argumen kimia kemudian jalur yang diperkirakan untuk sebagian besar kelas
metabolit sekunder, dan dalam senyawa penting secara farmasi tertentu. Namun, banyak
langkah-langkah individu masih belum jelas, karena tidak ada zat antara yang tersedia untuk
menguji langkah-langkah. Meskipun banyak pekerjaan yang baik dilakukan di sepanjang garisgaris ini, melihat penggabungan radioaktivitas juga membawa risiko bahwa radioaktivitas masuk
ke produk akhir bersama dengan cara yang berbeda dari yang diharapkan, misalnya, setelah
kerusakan prekursor ditambahkan dan penyaluran berikutnya ke dalam produk akhir bersama
jalur yang berbeda. Contoh terbaik dari ini mungkin adalah biosintesis terpenoid. Banyak
penelitian telah dilakukan pada penggabungan mevalonate di berbagai terpenoid, termasuk
alkaloid indol terpenoid juga (Banthorpe et al, 1972;. Cordell, 1974) .Tapi dalam tahun terakhir
telah menunjukkan bahwa ada biosintesis terpenoid lain jalur yang tidak pergi melalui
mevalonate, tetapi melibatkan deoxyxylose sebagai perantara penting (Rohmer, 1999;
Lichtenthaler, 1999). Karena tampaknya jalur plastidial ini menyebabkan karotenoid, monoand
diterpenes. Juga alkaloid indol terpenoid baru-baru ini terbukti berasal dari jalur ini (Contin et al,
1998;.. Eichinger et al, 1999). Keterlibatan jalur ini dalam biosintesis alkaloid dilakukan melalui

pendekatan retrobiosynthetic, di mana prekursor sangat awal seperti gula atau piruvat, label
khusus pada satu posisi dengan label 13C, dimasukkan ke pabrik, organ tanaman atau tumbuhan
sel. Dengan cara NMR-analisis produk, jalur biosintesis yang terlibat dapat disimpulkan
(Eisenreich dan Bacher, 2000). Masih ini hanya menunjukkan rute yang dilalui, tetapi langkahlangkah individu masih perlu dibentuk. Hal ini hanya dapat dilakukan dengan memberi makan
dengan intermediet berlabel yang diusulkan, atau dengan inkubasi in vitro dari ekstrak protein
dari tanaman memproduksi dengan intermediate dan jika perlu, co-faktor yang mungkin
dibutuhkan untuk reaksi yang diharapkan. Kedua pendekatan ini terhambat oleh fakta bahwa
antara mungkin tidak tersedia, dan bisa sulit untuk mendapatkan oleh isolasi dari bahan tanaman
atau sintesis. Dalam kasus in vivo tes ada kemungkinan bahwa perantara tidak mencapai lokasi
yang tepat untuk konversi, dan bukannya diubah menjadi produk lain. Dalam kasus uji in vitro,
masalahnya mungkin bahwa enzim tidak dapat dipisahkan dalam bentuk aktif stabil. Ini juga
mungkin bahwa agregat enzim bertanggung jawab atas serangkaian langkah-langkah berikutnya,
yang tidak dapat dipisahkan menjadi individu contoh reactions.For dalam biosintesis flavonoid
dalam Arabidopsis beberapa enzim tampaknya dikumpulkan (Burbulis dan WinkelShirley,1999).
Dalam mikroorganisme satu telah menggunakan mutan untuk identifikasi enzim dan gen
yang terlibat dalam langkah-langkah tertentu. Pendekatan ini dapat diterapkan ketika sejumlah
besar mutan dapat dengan mudah diperoleh dan tumbuh. Hal ini membutuhkan analisis semua
mutan untuk akumulasi perantara. Dalam kasus senyawa berwarna ini dapat dengan mudah
dilakukan secara visual. Hal ini antara lain alasan bahwa salah satu yang terbaik dipelajari jalur
biosintesis pada tanaman adalah salah satu yang mengarah ke anthocyanin (Davies, 2000; Holton
dan Cornish, 1995; Mulder-Krieger dan Verpoorte, 1994). Mutan dalam warna bunga dapat
dengan mudah dibedakan dengan mata. Ketersediaan berbagai intermediet untuk konfirmasi
kegiatan enzim juga untuk pendekatan ini biologi akhirnya important.Molecular menawarkan
beberapa pendekatan baru untuk kloning gen. Dalam kasus metabolisme sekunder, mereka
memiliki penerapan yang terbatas. Misalnya, hasil transposon tagging pada tanaman yang
mungkin diblokir pada langkah tertentu, tetapi seperti dengan mutan, ini mensyaratkan bahwa
seseorang dapat mengidentifikasi blok. Ini berarti analisis sejumlah besar plants.The pendekatan
yang lebih menjanjikan adalah kombinasi dari analisis Transkriptome, proteome dan
metabolome, dan membandingkan tanaman atau sel-sel tanaman yang menghasilkan atau tidak

menghasilkan senyawa yang menarik. Pendekatan ini sekarang sedang dikembangkan di banyak
tempat (Jacobs et al, 2000;. Fiehn et al, 2000;. Trethewey, 2001). Masalah utama adalah bahwa
tidak ada langsung hubungan logis antara metabolome dan proteoma, karena merupakan kasus
untuk proteome dan gen. Selain itu, tiga tingkat memiliki kinetika yang berbeda, sehingga
mereka perlu dihubungkan melalui waktu melalui metode statistik. masalah dengan proteoma
adalah bahwa hal itu akan sulit untuk memetakan semua protein (Jacobs et al., diterima untuk
diterbitkan). Selain itu, untuk metabolisme sekunder ada masalah tingkat yang sangat rendah
protein yang terlibat jika dibandingkan dengan metabolisme primer. Dalam hal orang dapat
dengan mudah mengisolasi jaringan memproduksi tertentu, seperti misalnya rambut kelenjar atau
lateks (Fairnbairn dan Steele, 1981;. Paniego et al, 1999) satu set yang lebih spesifik enzim dapat
diperoleh. Dalam tahun-tahun mendatang metode baru perlu dikembangkan untuk mengatasi
permasalahan tersebut.
Dalam kesimpulan untuk saat ini pendekatan klasik mengidentifikasi setiap langkah
individu dalam langkah biosintesis, dan kemudian isolasi enzim dan kloning gen encoding
tampaknya cara paling pasti untuk mencapai tujuan pemetaan jalur biosintesis. Dengan cara ini
tropane, isoquinoline dan jalur biosintesis alkaloid indol sedang dibedah dan informasi yang
diperoleh dari studi ini sedang diterapkan untuk rekayasa metabolik (Facchini, 2001; Hashimoto
et al 1993;. Kutchan, 1995; Sato et al., 2001; Verpoorte et al, 2000;. Verpoorte dan Alfermann,
2000; Yun et al., 1992).
Airlift fermentor (ALF) umumnya diklasifikasikan sebagai reaktor pneumatik tanpa
pengaturan pengadukan mekanis untuk pencampuran. Turbulensi yang disebabkan oleh aliran
fluida menjamin pencampuran yang memadai dari cairan. Draft tube disediakan di bagian tengah
reaktor. Pengenalan cairan (air / liquid) menyebabkan gerakan ke atas dan menghasilkan aliran
peredaran darah di seluruh reaktor. Para kecepatan udara / cairan akan rendah dan karenanya
konsumsi energi juga rendah. Alfs dapat digunakan untuk kedua sel bebas dan amobil. Ada
sangat sedikit laporan tentang Alfs untuk produksi metabolit. Keuntungan dari reaktor Airlift
adalah penghapusan efek gesekan umumnya ditemui dalam reaktor gelisah mekanis. Hal ini
cocok untuk budaya aerobik sejak koefisien perpindahan massa oksigen yang cukup tinggi
dibandingkan dengan reaktor tangki berpengaduk. Ini sangat ideal untuk produksi SCP dari
metanol sebagai substrat karbon. Hal ini digunakan terutama

untuk menghindari kelebihan panas yang dihasilkan selama agitasi mekanik.

Kesimpulan
Kultur sel tanaman dalam skala besar telah terbukti layak untuk produksi industri.
Namun, untuk phytochemical saat ini digunakan hanya untuk proses beberapa telah berhasil
dikembangkan. Untuk yang lain produksi terlalu rendah untuk bersaing dengan metode produksi
ini ada. Sebagai pasar untuk sebagian besar produk yang mapan, dan keuntungan kecil, sedikit
uang yang tersedia untuk berinvestasi dalam produksi bioteknologi baru. Dengan kapasitas besar
penyaringan throughput tinggi untuk senyawa biologis aktif yang baru, tanaman merupakan
sumber yang sangat menarik dari chemodiversity untuk program skrining tersebut. Hal ini tentu
akan menghasilkan obat yang berasal dari tanaman baru. Kultur sel tanaman tawarkan di sini
kemungkinan untuk produksi selama fase pertama dari pengembangan obat, di mana juga
metode produksi lainnya dapat dipertimbangkan. Hal ini akan menghindari masalah seperti yang
dihadapi dengan pasokan paclitaxel. Rekayasa metabolik adalah dalam konteks ini alat penting
untuk meningkatkan pabrik sel tanaman untuk produksi phytochemical yang diinginkan. Hal ini
dapat digunakan baik untuk tanaman dan kultur sel tanaman, dan bahkan jalur pendek
(bioconversions) dapat diperkenalkan ke mikroorganisme. Namun, perlu pengetahuan dasar
tentang jalur dan regulasi. Seperti banyak langkah dalam jalur biosintesis melibatkan aspek
fisiologis (misalnya, transportasi, akumulasi) dan tidak langsung terkait dengan reaksi kimia,
penggunaan gen pengatur dapat menjadi alat penting untuk meningkatkan dengan seluruh jalur.