Konfirmasi Kualitas cDNA Hasil Sintesis Menggunakan

Metode PCR dari Isolat RNA Larva Zebrafish (Danio rerio)

Konfirmasi Kualitas cDNA Hasil Sintesis Menggunakan Metode

PCR dari Isolat RNA Larva Zebrafish (Danio rerio)
Annisaulhusna Yasman1, David Gunawan1, Gladyza Putri V.1,
Maria Masitoh Makajanma1,& Rahayu Jatiningsih1
1

Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung

Jalan Ganesha No. 10, Bandung 40132, Indonesia
Email: rahayu.jatiningsih@gmail.com

Abstrak: RNA adalah polimer asam nukleat dari monomer nukleotida dengan template yang dapat
berperan dalam sintesis cDNA melalui suatu reaksi yang dikatalisis oleh enzim reverse
transkriptase dan DNA polimerase. Template yang spesifik berasal dari mRNA. Tujuan
mengkonversi mRNA menjadi cDNA adalah karena DNA sifatnya lebih stabil daripada RNA.
Setelah dikonversi, untai cDNA tersebut dapat digunakan untuk PCR, sebagai probe analisis
ekspresi serta perbanyakan atau kloning sekuen mRNA. Tujuan dari percobaan kali ini adalah
untuk menentukan kualitas menggunakan elektroforesis dan kuantitas menggunakan
spektrofotemeter isolat RNA hasil isolasi melalui larva zebrafish. Serta menentukan hasil sintesis
cDNA dari RNA hasil isolasi dan konfirmasi kualitas cDNA hasil sintesis dengan metode PCR.
Berdasarkan hasil yang diperoleh, RNA dari zebrafish berhasil diisolasi dilihat dari teramatinya
band pada elektroforesis. Rasio A260/280 dari hasil spektrofotometri RNA yang di uji
kemurniannya bernilai sebesar 2.5120. Nilai rasio tersebut menandakan bahwa sampel merupakan
RNA murni. Sampel RNA yang diuji memiliki massa molekul yang besar, namun konsentrasi
sampelnya hanya sedikit. Hasil yang diperoleh juga didapati hampir tidak ada cDNA yang
disintesis oleh isolat RNA.
Keywords: RNA, cDNA, PCR, Elektroforesis, Spektrofotometer, A260/280.

1. Pendahuluan
RNA merupakan polimer asam nukleat dari monomer nukleotida yang memiliki
peran penting dalam proses penerjemahan informasi genetik dari DNA menjadi
produk berupa protein. RNA bertindak sebagai messenger antara DNA dan
kompleks sintesis protein yang juga disebut dengan ribosom. Selain itu RNA
berperan sebagai molekul carrier yang essensial untuk asam amino saat terjadi
sintesis protein. RNA sangat mirip dengn DNA namun terdapat perbedaan pada
strukturnya, yaitu : RNA berbentuk single stranded, sedangkan DNA berbentuk
double stranded. Selain itu nukleotida RNA terdiri dari gula ribose sedangkan
DNA terdiri dari gula Deoksiribosa dan RNA menggunakan basa Uracil
sedangkan pada DNA digunakan basa timin. RNA ditranskrip dari DNA oleh
enzim yang disebut dengan RNA polymerase dan pada proses selanjutnya
digunakan enzim - enzim yang lain[1].
Molekul DNA memiliki peran aktif dalam katalisis reaksi biologis didalam sel,
seperti mengontrol ekspresi gen, atau sebagai sensing serta mengontrol respon
komunikasi sinyal seluler. Salah satu dari proses yang aktif dilakukan adalah
sintesis protein, yang merupakan fungsi umum dari molekul mRNA yang

Konfirmasi Kualitas cDNA Hasil Sintesis Menggunakan

Metode PCR dari Isolat RNA Larva Zebrafish (Danio rerio)

bertemu langsung dengan protein di ribosom. Proses ini menggunakan molekul

transfer RNA (tRNA) sebagai pengantar asam amino ke ribosom, ketika RNA
Ribosom (rRNA) berikatan dengan asam amino, keduanya akan bersama-sama
membentuk protein. RNA merupakan polimer dengan gula ribosa dan fosfat pada
rangka strukturnya dan memiliki empat basa yang berbeda, yaitu adenine,
guanine, sitosin, dan urasil[1].
cDNA merupakan untai DNA yang disintesis dari template RNA melalui suatu
reaksi yang dikatalisis oleh enzim reverse transkriptase dan DNA polymerase.
cDNA disebut juga DNA komplemen, beruntai tunggal atau untai ganda yang di
sintesis invitro dari template mRNA menggunakan enzim reverse transcriptase.
Sintesis cDNA ini dilakukan dengan mengunakan enzim reverse transcriptase dan
primer oligo dT yang akan menempel pada daerah ekor poli A yang merupakan
ciri khas dari mRNA. Hal ini dilakukan supaya mRNA yang digunakan dapat di
amplifikasi saat dilakukan pengecekan dengan menggunakan PCR. Dalam
melakukan sintesis cDNA diperlukan beberapa tahapan, yaitu isolasi mRNA yang
akan digunakan, visualisasi dengan menggunakan elektroforesis, sintesis cDNA
untai pertama dan amplifikasi cDNA yang didapatkan. Terdapat 2 enzim yang
berperan dalam proses sintesis cDNA, yaitu enzim DNA polimerase I (Klenow
fragment) dan S1 nuklease[2].
Tujuan mengkonversi mRNA menjadi cDNA adalah karena DNA sifatnya lebih
stabil daripada RNA. Setelah dikonversi, untai cDNA tersebut dapat digunakan
untuk PCR, sebagai probe untuk analisis ekspresi dan untuk perbanyakan /
cloning sekuen mRNA. Jika seorang peneliti ingin mengekspresikan suatu protein
spesifik dalam sel yang tidak lazim memproduksi protein tersebut satu cara
sederhana adalah dengan mentransfer cDNA yang mengkode protein tersebut ke
sel resipien. Pada kondisi alamiah, cDNA tersintesis oleh reverse transcriptase
yang mengubah untai tungal RNA berdasarkan urutan pasangan basanya dan
memasangkan dengan basa DNA yang sesuai (A, U, G dan C berpasangan dengan
T, A, C dan G)[2].
Teknik ekstraksi dan isolasi molekuler merupakan teknik yang amat krusial
dalam biologi molekuler. Isolasi RNA merupakan salah satunya. RNA merupakan
suatu molekul yang amat tidak stabil dan membutuhkan penanganan yang hatihati dikarenakan RNA sangat rentan terhadap degradasi. Isolasi RNA diperlukan
untuk mengisolasi RNA dimana RNA merupakan suatu molekul yang
berpengaruh terhadap ekspresi protein [3]. Protein dihasilkan dari kode yang
terdapat pada RNA dalam bentuk urutan nukleotida yang berasal dari DNA
template. Urutan basa nukleotida tersebut nantinya akan ditranslasikan dengan
bantuan ribosom dan tRNA, menghasilkan suatu urutan asam amino yang
merupakan cikal bakal dari polipeptida [4]. Disini, dapat dilihat bahwa RNA
memegang posisi penting dalam sintesis protein. Dengan mengisolasi RNA maka
ekspresi protein dan sintesis polipeptida yang membutuhkan RNA dapat dipelajari
lebih dalam.

Konfirmasi Kualitas cDNA Hasil Sintesis Menggunakan

Metode PCR dari Isolat RNA Larva Zebrafish (Danio rerio)

RNA merupakan molekul yang bertanggung jawab dalam mengekspresikan

protein. Dalam mempelajari ekspresi gen, kita membutuhkan banyak sampel
RNA. Namun, selain tidak stabil, RNA tidak bisa langsung diperbanyak dan
dipakai begitu saja setelah diisolasi. Untuk dapat mengekspresikan suatu protein
dan diperbanyak jumlahnya, RNA harus melalui suatu proses khusus dan harus
diubah terlebih dahulu menjadi cDNA atau Complementary DNA. Complementary
DNA adalah suatu untai DNA yang berasal dari untai RNA yang melalui proses
yang disebut Reverse Transkriptase, suatu proses dimana dari suatu untai RNA
disintesis urutan nukleotida pasangannya menggunakan enzim reverse
transkriptase yang biasa ada pada virus dan membentuk cDNA [5]. Pada saat sudah
menjadi bentuk cDNA inilah cDNA yang berasal dari untai RNA yang ingin
diperbanyak tadi dapat dimultiplikasi dengan teknik PCR. Nantinya cDNA yang
sudah diperbanyak dapat menghasilkan untai RNA yang sebelumnya dipakai
untuk membentuk cDNA dengan menggunakan cDNA tersebut sebagai template.
2. Metodologi
Isolasi RNA Zebrafish
Larva Zebrafish ditempatkan ke dalam microtube 1.5 ml. Larva zebrafish dibuat
pingsan dengan cara menginkubasi pada suhu rendah (larva zebrafish yang di
dalam microtube di benamkan di dalam es) selama 2 - 3 menit. Larva zebrafish
yang telah pingsan dapat digunakan sebagai sampel untuk isolasi RNA. Isolasi
RNA dilakukan dengan menggunakan Pure Link RNA Mini Kit. Isolat RNA
yang telah didapat dengan menggunakan Kit tersebut disimpan pada- 80C. Isolat
RNA kemudian di cek kuantitas dan kualitasnya dengan menggunakan
spektrofotometer dan elektroforesis. Untuk menjamin Isolat yang didapat murni
RNA tanpa ada campuran DNA, dilakukan treatment DNase pada isolate RNA.
Komponen RNA, Buffer reaksi MgCl2 dan DNase I (masing-masing 1 1 g atau 1
l) dan ditambahkan Nuclease-free water sebanyak 10l, keseluruhan komponen
dimasukkan ke mikrotube PCR. Lalu di quick spin dan di inkubasi pada 37oC
selama 30 menit. Lalu ditambahkan 0.2 M EDTA sebanyak 1 l dan di inkubasi
pada 65oC selama 10 menit.
Sintesis cDNA
Komponen RNA (1 g), Oligo (dT) 18 primer (1 l) ditambahkan 12 l NucleaeFree water. Kemudian dicampurkan 5x buffer reaksi sebanyak 5 l, ditambahkan
Ribolock TM RNase inhibitor (1 l), 10 mM dNTP Mix (2l), dan Revert aid TM
M-MuLV Reverse Trancriptase 1 l. Keseluruhan komponen dicampurkan ke
dalam mikrotube PCR. Lalu di quick spin, di inkubasi pada 42oC selama 60
menit, di inkubasi pada 70oC selama 5 menit (Terminate reaction), kemudian
simpan cDNA hasil sintesis pada -80oC. Kemudian dilakukan PCR konfirmasi
dengan gen spesifik actin (house keeping gene). Seluruh komponen ( Nuclease
free water 2 l, Primer forward 0,5 l, Primer reverse 0,5 l, Dream Taq PCR
Mix 5 l, dan template (cDNA) sebanyak 2 l) dicampurkan ke dalam microtube
PCR. Kemudian dilakukan quick spin, dan siklus PCR, kemudian hasil PCR di
elektroforesis gel Agarose.

Konfirmasi Kualitas cDNA Hasil Sintesis Menggunakan

Metode PCR dari Isolat RNA Larva Zebrafish (Danio rerio)

3. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

Fungsi Reagen dalam Isolasi RNA
Isolasi RNA memerlukan beberapa reagen tertentu agar dapat berjalan dengan
lancar. Reagen-reagen tersebut beberapa sudah ada pada kit yang digunakan untuk
isolasi RNA yaitu pada PureLink miRNA Isolation Kit. Selain yang sudah ada
perlu ditambah juga reagen-reagen lain yang tidak ada dalam kit tersebut. Ada
beberapa reagen utama yang diperlukan dalam isolasi RNA. Pertama yaitu Etanol
75% dan 100%. Dalam isolasi RNA etanol berfungsi untuk proses washing atau
saat proses pencucian [6]. Konsentrasi etanol yang dipakai berbeda tergantung
molekulnya. Untuk RNA biasanya sekitar 75%, namun untuk asam amino dalam
kadar rendah memerlukan etanol 90-100%. Reagen berikutnya adalah Merkaptoetanol. -Merkaptoetanol adalah suatu reagen antioksidan yang dapat
memutus ikatan disulfida dalam ikatan intramolekular pada protein, dan membuat
protein melepas lipatannya dan menjadi bentuk linear [7]. -Merkaptoetanol ini
dipakai dalam tahap awal saat proses penghancuran sampel untuk mendapatkan
RNA dengan melepas ikatan protein agar mudah dihancurkan. Bahan berikutnya
yang diperlukan adalah EDTA atau Ethylenediaminetetraacetic acid. EDTA
merupakan suatu chelating agent yang diperlukan dalam isolasi RNA untuk
mengikat ion-ion logam dan mencegah magnesium mengagregasi molekul asam
nukleat dan protein (Lekgari, 2010). Bahan berikutnya adalah M-MoL V Reverse
Transcryptase atau Moloney Marine Leukimia Virus. M-Mol V ini adalah bahan
yang dibutuhkan dalam proses reverse transkriptase untuk mensintesis cDNA
yang nantinya akan dimultiplikasi dengan PCR. Kemudian dalam mengisolasi
RNA, DNA tidak boleh ada oleh karena itu DNA dihancurkan dengan reagen
berikutnya yaitu DNAse.
Fungsi Reagen dalam Sintesis cDNA
Reverse transcription-polymerase chain reaction merupakan metode dengan
prinsip dasar mengubah untai RNA menjadi untai DNA. Enzim yang bekerja
adalah reverse transkriptase yang dalam percobaan ini menggunakan Revert
aidTM M-Mulv Reverse Transcriptase. Enzim tersebut memasangkan nukleotida
(dNTP mix) dari template RNA untuk menghasilkan untai DNA dengan primer
tertentu. Primer oligo-dT merupakan beberapa nukleotida dengan basa timin (poliT) yang akan menangkap ujung 3 poli-A pada mRNA eukariot kemudian enzim
reverse transkriptase dapat memasangkan template RNA dengan basa
komplemennya [8].
Metode RT-PCR melibatkan DNA dan RNA, oleh karena itu air atau media
pelarut yang digunakan harus bebas dari DNase dan RNase. Pada percobaan ini
digunakan nuclease-free water dan RibolockTM RNase Inhibitor untuk mencegah
RNA hasilnisolasi dan DNA hasil reverse transkripsi tidak terdegradasi. Pelarut
juga mengandung reaction buffer untuk menjaga pH agar reaksi-reaksi yang
terjadi, terutama yang melibatkan kerja enzim, dapat berlangsung optimal [9].

Konfirmasi Kualitas cDNA Hasil Sintesis Menggunakan

Metode PCR dari Isolat RNA Larva Zebrafish (Danio rerio)

Pengaturan suhu yang tepat juga dibutuhkan untuk keberlangsungan proses RTPCR dalam membentuk cDNA. Pada percobaan dilakukan inkubasi pasa suhu
420C selama 60 menit. Pada suhu tersebut primer oligo-dT dapat menempel pada
untai RNA dan enzim reverse transcriptase dapat bekerja melakukan proses
elongasi. Inkubasi pada suhu 700C selama 5 menit merupakan kondisi optimal
untuk terminate reaction. Pada suhu tersebut DNA yang telah terbentuk terlepas
dari RNA template [9].
Fungsi Reagen dalam Proses PCR (Konfirmasi) cDNA
Amplifikasi cDNA dilakukan dengan teknik PCR standar untuk mendapatkan
kopi dari cDNA dalam jumlah besar secara in vitro. Enzim utama yang bekerja
adalah Taq DNA polimerase, yang pada percobaan ini digunakan Dream Taq
PCR Mix, yang dapat bekerja pada suhu tinggi untuk memasangkan basa-basa
komplemen dalam proses elongasi [10]. Primer yang digunakan adalah primer
forward dan reverse untuk gen aktin zebrafish. Proses amplifikasi ini melibatkan
DNA, sehingga pelarut yang digunakan adalah nuclease-free water untuk
mencegah DNA terdegradasi. Konfirmasi cDNA hasil amplifikasi dilakukan
dengan metode elektroforesis pada gel agarosa. Gel agarosa akan memisahkan
cDNA sesuai dengan panjang basanya, buffer yang digunakan berfungsi untuk
menjaga pH dan mencegah degradasi DNA karena mengandung EDTA yang
mengikat logam kofaktor enzim nuklease, loading dye berfungsi sebagai pemberat
cDNA agar masuk ke dalam sumur elektroforesis dengan baik serta memberi
warna agar dapat diamati ketika elektroforesis berlangsung [8].
Hasil Elektroforesis Isolat RNA
Berikut hasil dari isolasi RNA yang telah dilakukan dalam percobaan (Gambar 1).
Nomor 15 menunjukkan hasil isolasi RNA dari kelompok 15. Berdasarkan hasil
yang dapat diamati, RNA dari zebrafish berhasil diisolasi dilihat dari teramatinya
band pada hasil elektroforesis. Smear yang teramati mengindikasikan adanya
pengotor lain dalam hasil isolasi dan mengganggu hasil elektroforesis [8].

Gambar 1 Hasil elektroforesis isolasi RNA

Konfirmasi Kualitas cDNA Hasil Sintesis Menggunakan

Metode PCR dari Isolat RNA Larva Zebrafish (Danio rerio)

Hasil Kemurnian RNA yang Di Peroleh

Tabel 1 Data Absorbansi Isolat RNA

Molekul asam nukleat dan protein menyerap (mengabsorbsi) penuh sinar UV pada
gelombang cahaya 260 nm (A260) dan 280 nm (A280) [11]. Rasio A260/A280 dari
hasil spektrofotometri sampel asam nukleat menyatakan sampel adalah RNA
murni apabila nilainya lebih atau sama dengan 2.0 [11]. Berdasarkan tabel 2 yang
memuat data absorbansi isolat RNA, Rasio A260/280 dari hasil spektrofotometri
RNA yang penulis uji kemurniannya (kelompok 15) bernilai sebesar 2.5120. Nilai
rasio tersebut menandakan bahwa sampel yang diuji merupakan sampel RNA
murni. Nilai rasio lebih tinggi dari 2.0 mungkin didapatkan karena adanya
penyimpangan pada spektrum warna yang dihasilkan alat spektrofotometer, bukan
dari adanya kontaminasi senyawa non-RNA [11].

Gambar 2 Hasil Elektroforesis Isolasi RNA Larva Zebrafish

Konfirmasi Kualitas cDNA Hasil Sintesis Menggunakan

Metode PCR dari Isolat RNA Larva Zebrafish (Danio rerio)

Berdasarkan hasil elektroforesis yang ditunjukan oleh Gambar 2, hanya terdapat

satu pita tebal dan terang yang terletak tepat di bawah sumur gel agarosa pada
hasil elektroforesis RNA yang diuji (sumur ke-15). Di bawah pita tersebut, hanya
terdapat dua pita tipis dan smear halus yang panjangnya tak mencapai ujung
bawah ladder 1 Kb. Laju migrasi molekul asam nukleat pada gel agarosa
berbanding terbalik dengan massa molekul atau panjang basanya (base pair
length) [12]. Hasil elektroforesis RNA ini menunjukkan bahwa sampel RNA yang
diuji memiliki massa molekul yang besar, namun konsentrasi sampelnya hanya
sedikit.
Keberhasilan Sintesis cDNA Melalui PCR

Gambar 3 Hasil Elektroforesis PCR cDNA (Konfirmasi)

Berdasarkan hasil elektroforesis PCR cDNA yang ditunjukan pada gambar 3,

diperoleh bahwa pita terang tidak tampak di atas sumur gel agarosa (sumur ke-15)
pada hasil elektroforesis konfirmasi cDNA yang diuji. Hanya terdapat smear yang
sangat redup dan sangat tipis cenderung tak tampak pada daerah di atas sumur
tersebutdibandingkan dengan ladder 500 bp yang digunakan sebagai marker.
Hasil ini menandakan hampir tidak ada cDNA yang disintesis oleh isolat RNA.
Indikator penentuan kualitas kemurnian RNA yang lebih baik dari rasio hasil
spektrofotometri adalah dengan aplikasi langsung fungsi RNA, salah satunya
dengan sintesis cDNA [11]. Karena isolat RNA tidak dapat berfungsi penuh untuk
menyintesis cDNA,dapat dinyatakan bahwa isolat RNA yang digunakan dalam
sintesis cDNA tidak murni. Berkurangnya kualitas kemurnian isolat RNA dapat
disebabkan oleh denaturasi RNA sebelum sampel RNA dimasukkan ke dalam gel
agarosa karena senyawa gel agarosa bersifat non-denaturing [13].
4. Kesimpulan
RNA dari zebrafish berhasil diisolasi dilihat dari teramatinya band pada
elektroforesis. Rasio A260/280 dari hasil spektrofotometri RNA yang di uji
kemurniannya bernilai sebesar 2.5120. Nilai rasio tersebut menandakan bahwa

Konfirmasi Kualitas cDNA Hasil Sintesis Menggunakan

Metode PCR dari Isolat RNA Larva Zebrafish (Danio rerio)

sampel merupakan RNA murni. Sampel RNA yang diuji memiliki massa
molekul yang besar, namun konsentrasi sampelnya hanya sedikit. Hasil yang
diperoleh juga didapati hampir tidak ada cDNA yang disintesis oleh isolat
RNA.

5. Daftar Pustaka
[1] Anthony JF Griffiths, Jeffrey H Miller, David T Suzuki, Richard C Lewontin, and William M
Gelbart (2000). "An Introduction to Genetic Analysis". Harvard University (ed. 7) (W. H.
Freeman)
[2] Allison LA. 2007. Fundamental Molecular Biology. Blackwell: Oxford.
[3] Tan, Siun Cee., Yiap, Beow Chin. 2009. DNA, RNA, and Protein Extraction : The Past and
The
Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. Vol 2009
[4] Alberts, et al. 2008. Molecular Biology of The Cell 5th edition. New York: Garland Science
[5] Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Couldridge, C. E., Bale, J. S., Pritchard, J. 2006. A Phloemenriched cDNA Library From Ricinus : Insights Into Phloem Functions. Journal of
Experimental Botany. Vol. 57, No. 12 page 3183-3193
[6] White, Peter PhD. 2004. RNA Extraction From Mammalian Tissue Traditional Method.
University of Pennsylvania
[7] Lekgari, Lorato. 2010. Extraction of Nucleic Acids (DNA and RNA) From Plant Tissues
[8] Ausubel, F.M. 2003. Current Protocols in Molecular Biology Volume I. New York : John Wiley
& Sons, Inc.
[9] Yamaya, M. 2002. Human airway cell culture. Methods in Molecular Biology. 188: 111
[10] Annisa. 2012. Isolasi RNA dan Pengklonan Gen Tripsin Kation dari Pankreas Sapi. Skripsi
Fakultas MIPA Universitas Indonesia.
[11]Thermo Scientific. 2011. Assessment of Nucleic Acid Purity. Technical
Bulletin. ,http://www.nanodrop.com/Library/T042-NanoDrop-SpectrophotometersNucleic-Acid-Purity-Ratios.pdf>. diakses pada tanggal 9 November 2014 pukul 22.00
[12]Nature. 2014. Gel electrophoresis.Scitable by Nature Education.
http://www.nature.com/scitable/definition/gel-electrophoresis-286 diakses pada tanggal 9
November 2014 pukul 22.15
[13] Evrogen. 2014. RNA analysis on non-denaturing agarose gel electrophoresis.Methods of
Nucleic Acid Research. <http://www.evrogen.com/technologies/RNAelectrophoresis.shtml> diakses pada tanggal 9 November 2014 pukul 23.05