ITEM 52. CALCULO DEL NUMERO HAS PROBABLE (NMP) Un cfileulo matenético de 12 densidad probable de bacteriae ea una mucs~ tra se puede efectuar combinando los resultados positives y negativos obtenides en las prusbas de tubos aGltiples. Aunque los cAlcutos del nGmero me probable pueden ser hechos en base 4 cualquier combinacién de porciones de muestra enpleada, 1a combina ciGn de tubos nGltiples mis frecuentomente utilizada es 1a de cinco por- ciones de 10 nl para exlinenes de agua potable, y de cinco porciones de tres diferentes diluciones decimales para obtener datos vflidos en fuen- tes de agua cruda, en investigaci6n de aguas contaninadas, y para con- trolar 1a calidad de tratamiento de los efluentes. La priictica de utilicar series de tres tubos en lugar de cinco para acu- ular datos de NAP que son utilizados para establecer estfndares de Lidad del agua, da cono resultado un NMP de precisin significativamento reducida. La mayoria de las tablas de NMP estén generalmente limitadas # valores de pruebas que comienzan con porciones de muestra de 10 i. Los resul- tados de pruebas que enpiecen por dilucfones decinales requieren para su interpratacién la siguiente £6raulat 10. Valor en la tabla del Px yO WMP por 100 at Por ejeaplo, para una serie senbrada con volimenes de muestra de 1 ml, 0.1 nL, 0.01 ml, y con tubos positives correspondientes a 4, 2 y 0; tenemos que: 2a x 22 = 220 m0 por 100m EXAMEN DE COLIFORNES POR LA TECNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (Ten 53. 36 APLICADA COMO ENSAYO ESTANDAR La mayorfa de las nuestras de agua puede ser snalizads por loe métedos de filtros de membrana, Actualmente, 1a prueba de filtro de menbrana esté siendo utilizada como un método norealizado para evaluar la cali- dad sanitaria del agua y definir su potabilided. Con esta técnica es posible examinar volfimenes muy variables de agua y ofrece un resultado directo de 1a concentracién de bacterias colifornes fon lugar de un estinado estadistico, como es el caso de 1a técnica de tubos miltiples.cada laboratorio debe realizar pruebas comparativas con la técnica de tubos m@ltiples ¢ fin de establecer la validez de 1a prueba FM. Este entudio conparativo se basa en la interpretacién sanitaria de la cali- dad del agua y no requiere que las dos prucbas proporcionen el miso valor on cuanto a la concentracién de colifornes. Algunos tipos de nuestras no pueden ser Filtrades debido a la presencia Ge turbiedad, poblaciones excesivanente altas de bacterias no colifor~ mes, © compuestos metalicos pesados (1)(2)(3). sta dificultades pue- den encontrarse a1 exawinar muestras de algunas aguas de pozo, reservo- rios, lagos pequeiios, efluentes industriales y efluentes clorados de baja calidad. Ep mucstras turbias con pocos coliformes es reconenda~ ble usar el precedimiento de tubos miltiples, VTEN Sh, PROCEDIMIENTO FH PARA COLIFORMES TOTALES wo @ @ wo Se reconienda filtrar un volumen de 100 a 200 ml para agua potable. La Limitacidn en volumen depende también de 1a presencia de turbiedad. En este caso se recomienda que 1a muestra de agua se onalice por duplicado Eiltando, por ejemplo, 50 ml en cada menbrana. Para aguas contaninadas ea necesario diluir previemente las muestras. Al efectuar la dilucién, es necesario tener en consideracién que cl ni- mero ideal de colonias en el filtro menbrana es de 20 a 80 en 1a deter— minacién de coliformes totales. El equipo de FiltraciGa debe estar esterilizado al comienzo de cada serie de fileraciones que pueden ser 30 0 mig muestra. Una filtraci6n en se- tie se considera interrunpida si hay un intervalo de 30 minutos o més entre las filtraciones de las muestras. a caterilizacién del equipo norasinente se hace en el sutoclave @ 121°C durante 15 minatos. Para protegerlo de 1a contaminacién durante su al~ macenanienco se le debe envolver en papel grueso resistente (kraft) Dien papel de aluminio, Si es necesario reesterilizar el equipo durante el dia de trabajo. es aconsejable exponer el enbudo y el soporte a la Jue ultravioleta durante 2 minutos. Este procediniento es efectivo pars 1a esterilizecién y permite un ahorro de tienpo. (4) CLARK, LF.; KABLER, P.W. & GBLDREIGH, E.E. Advantages and Limitations of che membrane Filter procedures. Hater & Sewage Works, 104:385-387, 1957 SHIPE, EL. & CAMERON, G.M. A comparison of the membrane filter with the moat probable number method for coliform determinations from several waters. Appl. Microbiol., 2:85-88, 1954 SHIPE, El. & FIELDS, A. A comparison of the molecular filter technique with agar plate count for enumeration of Bscherichia coli. Appl. Micro- biol., 2:382-384, 1954 RHINES, C.R. & CHEEVERS, W.P. Decontamination of membrane filter holders by Ultraviolet light. J. ANWA, 57(4):500-504, April, 1965 37Tabla 3 UTA PARA VOLUMENES DE MUESTRA A SER FILTRADOS EN LA PRUEBA DE. COLIFORMES PECALES POR EL MBTODO DE FILAROS DE MEMBRANA Fuente de Agua Cantidad filtrada (el) 100 | 50 | 10 | 2 | 0.1 0.01] 0.001 Lagos, reservorios x Foros, vertientes x [x | x Fuentes superficisles de plantas de agua potable x |x ‘Aguae naturales para bafiistas x [x |x EEluentes de plantas secundarias ‘de tratamiento de aguas resid. x Eatanques de granjas, rios x jx] x Corrientes de aguas de Iuvia en areas urbanas x} x[ x Aguas residuales municipales ‘Area de engorde de aninales x| x] x Para asegurar que no existe contaminacién al conenzar las prucbas se fen someter 100 al de agua de diluciGn al procedimiento de los FM, ar de inieiar el procesaniento de las miestras de agua. t EL procedimiento de £iltraci6n consiste en hacer pasar por medio de va— cio. 1a muestra de agua a través de una menbrana de celulosa de 0.45 ¥. Luego de filtrada la muestra ge lava el enbudo tres veces con volfine~ nes de 20 - 30 ml de agua de dilucién estéril. Con una pinze estéril se retira 1a menbrana de 1a unidad de filtracién y se coloca con sumo cuidado una placa de agar Endo o alnohadilla ea~ bebida con medio Endo. Bs necesario evitar que se aprieionen burbujas de aire en 1a membrana. Si esto ocurre, se pueden eliminar facilmente presionando suayenente fen los bordes de la membrana o disloc&ndola con una pinza estéril. Los £iltros de mexbrana son extrenadamente delicados y se dafian con fe cilidad. Por este motivo es reconendable utilizar pinzas adecuadas. EL caldo M-Endo y el agar M-Endo se usan para coliformes totsles. 38ITEM 55. ITEM 56. INCUBACION DE CULTIVOS DE FM PARA COLIFORMES TOTALES BL tienpo transcurride desde 1a filtracién hasta iniciar 1a incubaciéa no debe exceder de 20 minutos. Los cultivos de menbranas para coliformes totales se incuban durante 22-24 horas a 35°C + 0.5°C, en posiciGn invertida. Se debe utilizar Encubadoras con un alto nivel de hunedad (aproximadanente 90%). Un va~ lor inferior podria caugar que la superficie de ia menbrana pierda hu- medad mas répidamente de lo que pueda reponerse por difusién del medio proveniente de la almohadilla absorbente. Fste puede inhibir el creci~ miento 0 producir colonias pequelias no bien diferenciadas. Un bafio de agua @ tenperatura constante se puede transfornar en una ex~ celente incubadora. El bao de agua debe ser cubierto y tener una pla: taforma apropiada, justo encima de 1a superficie del agua, sobre 1s cual pueden ser colocados los recipientes de cultivo para’ ser incubados. Se obtienen mejores resultados si se coloca una toalla hfmeda sobre los, recipientes de cultivo durante la incubactén. ‘También se puede utilizar un incubador convencional. En este caso, los recipientes de cultivo deben ser cclecados en recipientes herméticanente cerrades, con un papel 0 paiio himedo en su interior, pare mantener las condiciones necesarias de humedad, Se puede user para este fin un reci~ piente del tipo de los que son utilizados para guardar verduras en las refrigeradoras doséeticac. Si en una incubadora no se puede mantener cl alto grado de hunedad requerida, 9c pueden realizar los cultivos en cajas de Petri plisticas colocadas en envases hernéticanente cerrado: Bn estos racipientes se establece el nivel de humedad necesario por eva~ poracign de una parte del medio de cultivo dentro de le caja de Petri. RECUENTO Para el recuento de colonias de coliformes se recomienda el uso de un microscopio estereoscSpico con luz Fluorescente. Se obtendr une mejor Jectura on el medio Endo con un aumento de 10 a 15 dignstvon y una fuente de luz Fluorescente ajuatade a un Sagula de 60 2 80° encine de las colonias para una optima refleceién del brillo verde amarillento metélico,caracteristice de 1as colonias de coliformes en oste medio. ‘Tanto en el medio M-Endo como en el medio U-Endo ager LES las colonias tipicas de coliformes tienen un color rosa a rojo oscuro con un brillo netélico dorado 0 verde anarillento. Se reconienda la verificacin de las colonias, sembrandolas en caldo lee~ tosado y posteriormente en caldo lactosado bilis verde brillente. Las colonias expuestas al secado por nis de algunos minutos no podrén ser ca~ paces de desarrollarse cuando sean transferidas a los tubos de caldo Jac— tosado. 39Colonias colifornes totales por 100 al = Existen casos on que oe encuentran en el agua ciertas bacterias coli- formes que no Llegan a producir colonias tipicas. Por lo tanto, si se observa un gran nfinero de colonias atipicas se debe proceder a identi- fiearl Puede cuceder también que desarrollen en las aguas ciertos organis~ tos no coliformes que produzcan colonias tfpicas del grupo coliforme. Muchos bacter{6Logos han reportado 1a presencia de grupos de dercmonae que presentan este tipo de colonias. En eate caso hay que recurrir Ja prucba de la citocrono-ouidasa para dirimir cualquier duda. GBlcuto y expresin de tos resultados Los resultados de 1s densidad de coliformes totales determinados por el procedimiento de PM se reportan siempre como "coliformes totales por 100 mi", independiente de 1a diluciéa y naturaleza de la nuestra ueilizada. Fara ol cdlculo de 1a densided de coliformes totales se utiliza 1a ex- Presién siguiente: x 100 Volusen de mucstra filtrada La densidad de coliformes es expresads, por lo tanto, en térninos de co- Liformes totales por 100 al. Las menbranae idealnente seleccionadas para efectuar el recuento de co- Lifornes totales en aguas contaminadas son aquellas que tienen entre 20 y 80 colonias y no exceden de 200 colonias. Si el crecimiento de colonias no esté bien definide se puede informar como “crecimiento conglomerade". Si el nfimero de colonias es excesivanente grande, el resultado se infor mar como “nfinero excesivo para ser contado". En estos cagos ee deber! colectar una nueva muestra seleccionando los volGaenes apropiados para Ja filtracién. ITEM 57. PROCEDIMJENTO DE FM PARA COLIFORMES FECALES 40 La tGenica de filteo de mombrana para coliformes fecales es idéntica a Ja de coliformes totales con las siguientes excepeioncs: ~ El caldo N-¥C os usado para coliformes fecales. = Para efectuar 1s dilucién se debe tener en consideracién que el nmero deal de colonias en 1a menbrana de filtro es de 20-60. = Los cultivos on membrana para colifornes fecales se incuban en bolsas de plastico corracas hernéticanente y sunergidas en Baionaria 2 44,5°C # 0,2°C durante 24 horas.ITEM $8. = EL tiempo transcurrido desde 1a (iltraciéa hasta la incubaci6n no dobe exceder de 30 minutos. Todas las colenias azules son coli~ Forges fecales. PRUEBA ESTANDAR FA CON ENRIQUECIMIENTO PREVIO| Bn casos especiales, 1a utilizacién de esta prueba permite obtener una recuperaciéa ade completa de los coliformes totales. Es una modifica~ ciGn de 1a prueba estdndar y consiste en efectuar 1a incubaciGn inicial del filtro an caldo lauril triptosa a 35°C #0.5°C durante 1 1/2 = 2 ho~ ras. ‘Luego ge tranefiere el filtro de menbrana al medio normal de M-Endo © Wado agar LES para la incubacién final de 22 ~ 24 horas a 35°C + 0.5 Bn todos los pasos siguientes esta prucba es igual a 1a esténdar. INFORME DE RESULTADOS DE PRUEBAS DE COLIFORMES ITEM 59. REGISTRO DE EXAMENES DE LABORATORIO Los resultados de los andlisis bacteriol6gicos deben ser guardados en el laboratorio por lo menos durante unos seis meses por si en algin monento son requeridos para 1a evaluacién de 1a calidad del agua. £1 labora~ torio o la seccidn de ingenieria debe tener disponible un resumen del ninero de pruebas presuntivas, confirmativas y complenentaries realize: das por el uétodo de tubos milciples durante, por lo menos, los Gitimos 12 meses. Se pueden utilizar andlisis estadisticos del nGnero de prue- realizadas por aiio para: 1, Denostrer 1a posible necesidad de utilizar caldo lauril triptoss, lo que podria reducir la frecuencia de resultados falso-positivos presuntivos, y 2, Probar 1a valides de 1a prueba confirnativa por suficiente nimero de comparaciones con 1a prueba complenentaria. Igualmente, se debe tener disponible un resumen con el nGwero de resul- tados positives y negatives por el procediniento de loo Filtros de men— brana que se realizaron para exaninar suministros de agua de consumo du- rante los Giltimos 12 meses. ITEM 60, INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Las normas nacionales (0 en caso de no existir, 12s normas internacio- nales de la OMS-1971) doben ser aplicadas en 12 evaluacién de los re~ ‘sultadoa. Los resultados ne satisfactories deben ser comunicados inmediatanente al operador de 1s planta y/o a los responsables de 1a red de distribu- cidn para que sean tomadas les modidas correctivas adecuada: a