Biotehnologija - biotehnoloki lekovi /

biofarmaceutici
(eng. biopharmaceuticals)

Doc. dr Sneana Savi

2006 SPI USA, Inc.

ta je biotehnologija?

Termin se odnosi na bilo koju tehniku koja koristi ive
organizme (npr. mikroorganizme) u proizvodnji ili
modifikaciji proizvoda.

Klasian primer proteinski lekovi dobijeni
rekombinantnom - rDNK tehnologijom

Meutim, biotehnologija danas ukljuuje primenu kultura
tkiva, ivih elija, elijskih enzima, da bi se dobio
definisani proizvod

Na prvom mestu tehnologija rekombinantne DNK i
tehnologija monoklonskih antitela u razvoju novih
dijagnostikih sredstava i lekova

2006 SPI USA, Inc.

Razvoj biotehnologije...

Prvi primeri biotehnolokih lekova bili su jednostavni
proteini "replacement therapy

Tranzicija ka molekularnoj medicini i otkrivanje npr. veeg
broja gena koji su povezani sa malignim oboljenjima
(otkriveni su i klonirani neki kancer-determiniui geni)
biotehnoloki lekovi kao zamena za hemoterapiju

Trenutno ispitivanja na vie od 100 potencijalno terapijskih
gena su u toku, sprovode se klinika ispitivanja na
konjugatima molekula dobijenih genetskim inenjeringom
specifino toksini za elije neoplazmi

Prvi rekombinantni protein bio je humani insulin uveden
1982. godine
2006 SPI USA, Inc.

Razvoj biotehnologije...

Kasnih 90-tih vie od 350 biotehnolokih lekova bilo je u
razliitim fazama razvoja u vie od 140 farmaceutskih i
biotehnolokih kompanija

Predvialo se da pacijenti sa hemofilijom, ozbiljnim
sepsama, ulcerima koe, reumatoidnim artritisom, i
brojnim kancerima mogu imati koristi u nastupajuim
godinama, kada lekovi koji prou klinika ispitivanja
dobiju dozvolu za putanje u promet

Neki od ovih lekova ve su na tritu (Refacto za
hemofiliju, Fuzeon za terapiju HIV-a, Kineret za
hemoterapiju, Xigris za teke sepse...)

2006 SPI USA, Inc.

FDA definicija biotehnolokog

proizvoda
Bilo koji virus, terapijski serum,
toksin, antitoksin, ili analogni
proizvod koji se moe primeniti u
prevenciji, tretmanu ili leenju
bolesti ili povreda kod ljudi.

2006 SPI USA, Inc.

Biofarmaceutici
(izvor: Medical Biotechnology, Elsevier, 2009.)

Jedan od najoiglednijih (i najprofitabilnijih!) doprinosa

biotehnologije = lekovi za iju se proizvodnju koriste
biotehnoloki postupci

Vie od 1/3 lekova koji se trenutno razvijaju su
biofarmaceutici

BIOFARMACEUTIK je PROTEIN ili NUKLEINSKA
KISELINA, koji se koriste kao lek, a proizvode ih ivi
organizmi

MONOKLONSKA ANTITELA, REKOMBINANTNI
PROTEINI ILI OLIGONUKLEOTIDI (VAKCINE),
SEKVENCE NUKLEOTIDA I VEKTORI (GENSKA
TERAPIJA), KAO I VELIKI BROJ REKOMBINANTNIH
PROTEINA KOJI SE KORISTE KAO LEKOVI...

2006 SPI USA, Inc.

Biofarmaceutici

Biofarmaceutici se takoe definiu i kao
modifikatori biolokog odgovora (engl. biological
response modifiers ili biologics); definiu se kao
prirodne supstance (identine kao humane),
koje modifikuju normalan (esto imuni)
odgovor...

Veliki broj utie na autoimuna oboljenja
(reumatoidni artritis, psorijaza, Kronova bolest...)

Veina onih koji se razvijaju imaju za metu
razliite forme kancera

2006 SPI USA, Inc.

Biofarmaceutici

Primer biofarmaceutika koji je efikasan u
tretmanu kancera dojke trastuzumab
(Herceptin), monoklonsko antitelo protiv
Her2 receptora za tirozin kinazu, koji je
pre-eksponiran u oko 1/3 tumora dojke.

Biofarmaceutici postaju standardni oblik
terapije, to ima znaajne implikacije po
proizvoae, dizajn i ispitivanje ovih
supstanci...
2006 SPI USA, Inc.

Biofarmaceutici i genska terapija

Biofarmaceutici prve generacije su uglavnom kopije

endogenih proteina ili antitela, proizvedeni
rekombinantnom DNK tehnologijom

Biofarmaceutici druge generacije su inenjeringom
poboljani proteini ili antitela na nivou fiziko-hemijskih
karakteristika

PRIMENE:
- Terapijska monoklonska antitela
- Rekombinantni hormoni
GENSKA TERAPIJA: podrazumeva genetsku modifikaciju
elija u cilju spreavanja, ublaavanja ili leenja oboljenja

2006 SPI USA, Inc.

Potencijalna primena genske terapije:

Radikalno leenje monogenih bolesti (cistina
fibroza, hemoglobinopatija).

Poboljanje bolesti sa ili bez genetskih
komponenti, ukljuujui mnoge maligne,
neurodegenerativne i infektivne bolesti.

2006 SPI USA, Inc.

Pregled
Biotehnoloki lekovi
Proteinski ili ugljeno-hidratni
proizvodi
Ekstrahovani iz ivih
organizama
Kompleksne strukture
Slabije definisane fizikohemijske karakteristike:

makromolekuli (> 500 kD)

Tercijarna struktura

Mesto, obim i tip PEGilovanja,
proteinilacije, glikolizacije

Osetljivi na toplotu i
mehaniki stres

Konvencionalni lekovi
sintetski, organska
jedinjenja
Definisani su struktura
i fizikohemijske
karakteristike

Hemijska sinteza

mikromolekule

stabilni

2006 SPI USA, Inc.

Sintetski lekovi

Primeri

Acetaminofen
Ibuprofen
Naproxen Na
Prozac

2006 SPI USA, Inc.

Struktura

Jednostavna 3-dimenzionalna struktura
koja ih ini visoko stabilnim jedinjenjima

Samo drastine promene u okruenju mogu

da dovedu do trajnog oteenja ovih molekula

Prisustvo jakih kiselina ili baza

Visoke temperature

2006 SPI USA, Inc.

Karakteristike

Laki za rukovanje, a pacijentima se
primenjuju u razliitim farmaceutskim
oblicima (najee konvencionalnim)

tablete
injekcije
supozitorije...

2006 SPI USA, Inc.


Tradicionalni lekovi lekovite supstance:

razvoj zahteva dugotrajan vremenski
period za pretragu velikog broja slinih
jedinjenja da bi se odredile njihove
interakcije i mesta vezivanja in vivo.

Biotehnoloki lekovi su proteini koji su
identini ili slini prirodnim biolokim
supstancama prisutnim u ljudskom
organizmu.
2006 SPI USA, Inc.

Primeri

Antitela
Interleukini
Vakcine
Enzimi
Hormoni
Human Growth Hormone

2006 SPI USA, Inc.

Nestabilna struktura proteina

Veina lekova dobijenih biotehnolokim
metodama su proteini koji su veoma
osteljivi na promene u njihovom (in vitro i
in vivo) okruenju.

Njihova struktura zavisi od razliitih i slabih
interakcija izmeu aminokiselina.

Ove reakcije se odigravaju unutar veoma

uzanog opsega ambijentalnih uslova koji su
slini onim uslovima koji vladaju u humanom
organizmu

2006 SPI USA, Inc.

Nestabilna struktura proteina

Relativno male promene mogu da otete
strukturu

Temperatura
Koncentracija soli
pH

Na ovaj nain funkcija proteina je potpuno

ili delom "neutralisana

2006 SPI USA, Inc.

Proteinska struktura

Proteini

Polipeptidi kovalentno povezane
aminokiseline (AK)

Polipeptidi sa manje od 40/100 AK zovu
se peptidi

Polipeptidi sa vie od 40/100 AK su
proteini

Funkcija/terapijska efikasnost proteina
odreena je njihovom ne-kovalentnom 3D
strukturom
2006 SPI USA, Inc.

Proteinska struktura

Primarna struktura odgovara "linearnom
nizu sekvenci aminokiselina (AK)

2006 SPI USA, Inc.

10

Proteinska struktura

Sekundarna struktura
je ureena struktura
kreirana vodoninim
povezivanjem
(uglavnom unutar
peptidnog niza).

Kod proteina su
najee zastupljeni
sekundarni strukturni
elementi.

alfa () heliks

beta () lanac (ponekad
oznaen i kao beta
naborana ploa)

2006 SPI USA, Inc.

Proteinska struktura

Tercijarna struktura
nastaje umotavanjem
jednog polipeptidnog
lanca

Vodea sila je interakcija

hidrofobnih i hidrofilnih
grupa.
Vodonino povezivanje
ukljuuje grupe i iz
peptidnog niza kime i
iz bonih lanaca i vano
je u stabilizaciji
tercijarne strukture.

2006 SPI USA, Inc.

11

Proteinska struktura

Kvaternerna struktura
ukljuuje asociranje
dva ili vie
polipeptidnih lanaca u
strukturu koja se sastoji
iz vie pod-jedinica.

Ne ispoljavaju svi
proteini kvaternernu
strukturu.

2006 SPI USA, Inc.

Proteinska struktura

Laktat
dehidrogenaza:
smea /

Imunoglobulin:
preklopljen:

Hemoglobin B
lanac:

2006 SPI USA, Inc.

12

Terapijski proteini

Insulin (dijabetes)

Interferon (relapsna MS)

Interferon (granulomi)

TPA (srani napad)
2006 SPI USA, Inc.

"Problemi " sa proteinima izvod

Velike i nestabilne molekule

Struktura se odrava slabim nekovalentnim silama

Veoma osetljivi, ak i pri veoma blagim
uslovima

Lako se unitavaju/eliminiu i u organizmu

Teko ih je dobiti/proizvesti u velikim
koliinama!!!
2006 SPI USA, Inc.

13

Nespecifino vezivanje

Specifino vezivanje

Interakcije sa drugim lekovima

Interakcije su retke

Mogue kancerogene
supstance

Nekancerogene

Nepredvidiv farmakinetiki
profil

Uglavnom predvidiv FK profil

Retke imunoloke reakcije

Imunogeni efekti mogui

Teorijski bilo koji ciljni molekul

moe biti dostian

Ciljni molekuli su ogranieni na

one van elije

6% nivo uspenosti u fazama I- 25% nivo uspenosti u fazama IIII klinikih ispitivanja
III klinikih ispitivanja
Razvoj skup, proizvodnja
jeftina
2006 SPI USA, Inc.

Razvoj skup,
proizvodnja skupa

Proteinski lekovi - danas

>200 FDA odobrenih proteinskih lekova
(do jula 2006.), od preko 500
biotehnolokih proizvoda (rekombinantni i
drugi proteini, monoklonska antitela,
radioimunokonjugati, vakcine, enzimi i
toksini, proizvodi krvi, kulture elija i
tkiva...)

>30% su rekombinantni (rDNK) proteini

2006 SPI USA, Inc.

14

Prvih 10 biotehnolokih lekova rangiranih po zaradi od

prodaje u SAD 2004
DRUG

COMPANY

DISEASE

2004
SALES ($M)

2003
%
SALES ($M) CHANGE

Epogen

Amgen

Anemia

$2,601

$2,435

7%

Aranesp

Amgen

Anemia

$2,473

$1,544

60%

Rituxan

Genentech
and BiogenIDEC

Non-Hodgkin
lymphoma

$2,326

$1,982

17%

Embrel

Amgen

Arthritis

$1,900

$1,300

46%

Neulasta

Amgen

Neutropenia

$1,740

$1,256

39%

Avonex

Biogen-IDEC

Multiple sclerosis

$1,417

$1,168

21%

Neupogen Amgen

Neutropenia

$1,175

$126

-7%

Rebif

Serono

Multiple sclerosis

$1,091

$819

33%

Synagis

MedImmune

Infectious
disease

$942

$849

11%

Gaucher disease

$839

$739

14%

Cerezyme Genzyme

2006 SPI USA, Inc.

Biotehnoloki lekovi u klinikim

ispitivanjima

2006 SPI USA, Inc.

15

Tehnike koje se koriste za

proizvodnju biotehnolokih proizvoda
Brojne tehnike:

Rekombinantna DNK tehnologija (rDNK)

Tehnologija monoklonskih antitela (MAb) hibridoma
tehnologija

PCR (polymerase chain reaction)

Genska terapija

Blokada nukleotida ili antisens nukleinske kiseline

Peptidna tehnologija

2006 SPI USA, Inc.

Ph. Eur. 7.0

2006 SPI USA, Inc.

16

Ph. Eur. 7.0

2006 SPI USA, Inc.

Ph. Eur. 7.0

2006 SPI USA, Inc.

17

Koncepti u genetskom inenjeringu

Bitni termini
MUTACIJE
MUTAGENEZA

ta to znai?
promene genetskog koda
inenjering genetskog koda

TRANSFORMACIJA
KONJUGACIJA

ubacivanje gena u bakteriju

drugi nain za ulazak gena u bakteriju

PLAZMIDI
BAKTERIOFAGE

nosai za mutaciju
vektor kojim se DNK insertuje u neki organizam

REKOMBINACIJA
TRANSPOZICIJA

kombinovanje gena sa genomskom DNK

obratno insertovanje gena

DNK REPLIKACIJA
DNK REPARACIJA
RNK TRANSKRIPCIJA

pravljenje kopije DNK

nain prirodnog popravljanja/reparacije DNK
pravljenje jedne RNK kopije dela DNK

TRANSLACIJA

sekvenca amino kiselina

bitni termini
genotip
fenotip

ta to znai
DNK sekvenca
posledica DNK sekvence (merljivo)

2006 SPI USA, Inc.

Jednostavni proteini se mogu dobiti

primenom odreenih sojeva bakterija.

Sloenije supstance dobijaju se iz elija
sisara.

!!! Da bi se dobili proizvodi identini
njihovim humanim ekvivalentima,
odgovarajui humani geni moraju biti
umetnuti insertovani u kulture elija.

2006 SPI USA, Inc.

18

Rekombinantna DNK
tehnologija

Rekombinantna DNK tehnologija:

Insertovanje ili modifikacija gena da bi se proizveo eljeni

protein

Primena proteina/enzima oznaenih kao

RESTRIKCIONI ENZIMI omoguuje da se odreeni
gen(i) iz humane DNK izoluje(u) i insertuju u male
cirkularne ekstrahromozomalne bakterijske DNK
(PLAZMIDI) na mesta koja su prethodno iseena istim
enzimom.

Kada se insertuje u plazmid, gen se "lepi" primenom
druge vrste enzima oznaenih kao DNK ligaza.

Restrikcioni enzimi i DNK ligaza su "makaze i lepak"
rekombinantne tehnologije.

2006 SPI USA, Inc.

Rekombinantna DNK
tehnologija

Jednom konstruisan, rekombinantni
plazmid se isertuje u bakterijsku, eliju
plesni ili animalnu eliju u procesu koji se
oznaava kao TRANSFORMACIJA.

2006 SPI USA, Inc.

19

 2006 SPI USA, Inc.

2006 SPI USA, Inc.

Figure 9.1.1

Figure 9.1.2

20

PLAZMID IZ BAKTERIJE
DNK od interesa

Tretiran restrikcionim enzimom

Meanje, krajevi sa
komplementarnim
parovima baza, spajanje
krajeva iseaka
2006 SPI USA, Inc.

Rekombinantna DNK
tehnologija

Ove genetski izmenjene elije sadre:

Enzime koji su potrebni da obezbede uvijanje

polipeptidnih lanaca i proizvodnju proteina
Genetske informacije za sintezu eljenog
proizvoda

2006 SPI USA, Inc.

21


Raspored ovih baza na oba vlakna DNK ini

specifini gen za specifinu osobinu

Tipini gen ima stotine baza ureenih u paru i
nosi informaciju vanu za ouvanje elija i
organizma i odravanje vrste

Da bi se stvorila nova elija ili novi organizam
DNK mora biti u stanju da se duplira klonira

Takoe, ona preko mRNK prenosi informaciju
za sintezu proteina iz 23 AK u eliji (mala fabrika
za produkciju hiljade proteina)

Npr. E. coli je u stanju da proizvede oko 2000
proteina

2006 SPI USA, Inc.

Sposobnost da se selektivno hidrolizuje populacija DNK

molekula sa brojnim endonukleazama uvela je tehniku
udruivanja/spajanja dva razliita DNK molekula:
rekombinantnu DNK (rDNK) tehnologiju

Ova tehnika koristi druge tehnike (replikacija, separacija,
identifikacija) koje omoguuju proizvodnju velikih koliina
preienih DNK fragmenata

Ove kombinovane tehnike (rDNK) mogu da dovedu do
uklanjanja dela DNK iz kompleksne molekule

rDNK se priprema sa DNK fragmentima iz bakterija
kombinovanih sa fragmentima humane DNK, ili virusne
DNK se kombinuju sa fragmentima DNK drugih virusa...

Mogunost da se spoje dva razliita dela DNK na
specifinim mestima unutar molekula postie se sa dva
enzima, restrikciona endonukleaza i DNK ligaza
2006 SPI USA, Inc.

22


Sa rDNK tehnologijom mogu se koristiti nehumane

elije (npr. E. Coli) za proizvodnju proteina identinih
onim koje proizvodi humana elija

Ovaj proces omoguio je naunicima da proizvode
molekule humanog porekla u velikim koliinama

Npr., priblino 50 hipofiza od kadavera potrebno je da bi
se ektrakcijom dobila koliina hormona potrebna za
jednogodinju terapiju samo jednog deteta pre uvoenja
rDNK tehnologije u dobijanju humanog hormona rasta
(hGH)

hGH i insulin bili su prvi rDNK proteini koji su dobili
dozvolu za putanje u promet primena u terapijske
svrhe
2006 SPI USA, Inc.

Rekombinantna DNK
tehnologija

Rekombinantna DNK tehnologija
obuhvata procedure kojima se DNK
razliitih vrsta mogu izolovati, isecati i
spajati nove rekombinantne "
molekule i potom multiplikovati u veoj
koliini u populaciji mitotiki visokoaktivnih elija (npr. bakterije, plesni).

2006 SPI USA, Inc.

23

Rekombinantna DNK
tehnologija

Trenutno je relativno lako da se isee
specifino mesto na DNK, proizvede
veliki broj kopija, odredi sekvenca
nukleotida, blago izmeni i potom
transferuje nazad u eliju.

2006 SPI USA, Inc.

Rekombinantna DNK
tehnologija
Rekombinantna DNK tehnologija je
bazirana na brojnim vanim
momentima:

Bakterija sadri ekstrahromozomalne
molekule DNK zvane plazmidi koji su
krunog oblika.

2006 SPI USA, Inc.

24

Rekombinantna DNK
tehnologija

Bakterija takoe proizvodi enzime zvani

restrikcione endonukleaze koji isecaju
DNK fragmente na specifinim mestima
restrikcioni fragmenti.

2006 SPI USA, Inc.

Rekombinantna DNK tehnologija

Restrikcioni enzimi i plazmid

Postoji vie razliitih vrsta restrikcionih
endonukleaza

Svaka iseca DNK na specifinom mestu
mestu raspoznavanja

2006 SPI USA, Inc.

25

Rekombinantna DNK
tehnologija
Restrikcioni enzimi i plazmid

Restrikcioni enzimi su primarno pronaeni
u bakterijama i davana su im skraena
imena bazirana na rodu i vrsti bakterija.

Jedan od prvih restrikcionih enzima bio je
EcoRI izolovan iz Escherichia coli,
vrste zvane RY13.

2006 SPI USA, Inc.

Digestija DNK sa EcoRI da bi se dobio

kohezivni kraj

2006 SPI USA, Inc.

26

Dobijanje rDNK

2006 SPI USA, Inc.

Rekombinantna DNK tehnologija

plazmidi

Plazmidi su otkriveni u kasnim ezdesetim, i
ubrzo je shvaeno da se mogu koristiti da
"pojaaju " gen koji je specifino interesantan.

Plazmid koji je odgovoran za rezistenciju
prema nekom antibiotiku (obino ampicilinu) ili
tetraciklinu, koristi se kao VEKTOR.

2006 SPI USA, Inc.

27

Rekombinantna DNK tehnologija

Gen od interesa koji poseduje rezistenciju
na ampicilin insertuje se u vektorski
plazmid i novo-konstruisani plazmid se
potom smeta u E. coli, koja je osetljiva na
ampicilin.

Bakterija se potom zasejava na podlogu
koja sadri ampicilin.

2006 SPI USA, Inc.

Rekombinantna DNK tehnologija

Plazmidi i rezistencija na antibiotik

Ampicilin obezbeuje selektivan pritisak,
zbog toga to samo ona bakterija koja
sadri plazmid moe da raste na ovoj
podlozi.

One bakterije koje ne sadre plazmid sa
insertovanim genom od interesa e
uginuti.

2006 SPI USA, Inc.

28

Rekombinantna DNK tehnologija

Plazmidi i rezistencija na antibiotik

to due bakterija raste u podlozi sa
ampicilinom, ona e due koristiti plazmid
da bi opstala i kontinuirano e ga
replicirati, zajedno sa genom od
interesa, koji je prethodno insertovan u
plazmid.

2006 SPI USA, Inc.

rDNK
tehnologija

Izbor gena u
plazmidu i
izbor
antibiotika.

2006 SPI USA, Inc.

29

rDNK tehnologija
Kloniranje humanog gena

Kada se jednom nae u bakteriji, plazmid

koji sadri cDNK se moe umnoavati u
veliki broj replika.

2006 SPI USA, Inc.

rDNK
tehnologija

2006 SPI USA, Inc.

30

Prednosti

Efikasnost i sigurnost

Odreene molekulskim karakteristikama

terapijskog proteina
Zbog njihove strukture, proteini imaju jak afinitet
za specifine "target" molekule
Retko ulaze u nespecifine reakcije tako da su
interakcije sa drugim lekovima i neeljeni efekti
manje prevalentni

Terapijski proteini se ne vezuju nespecifino

za receptore koji stimuliu rast i uzrokuju
kancer
2006 SPI USA, Inc.

Prednosti

Nisu u stanju da penetriraju u unutranjost
elije

Nedostatak: broj moguih meta je ogranien

Terapijski proteini veoma nalikuju

endogenim proteinima

Metabolizam se moe lako predvideti, a

interindividualne varijacije su mnogo manje

2006 SPI USA, Inc.

31

Nedostaci

Vea verovatnoa da e ui u imunoloke
reakcije od malih molekula

Imaju veliku povrinu za napad imunskog

sistema
Imunski sistem ih moe interpretirati kao znak
infekcije

Ovo se moe prevenirati primenom humanizovanih
terapijskih antitela

Proizvedenih insertovanjem gena za humana antitela u

kulture elija

2006 SPI USA, Inc.

Nedostaci

Teko uklanjanje viralne kontaminacije

Prioni
Nukleinske kiseline

Problemi sa

deamidacijom
oksidacijom
drugim modifikacijama

2006 SPI USA, Inc.

32

 2006 SPI USA, Inc.

2006 SPI USA, Inc.

Table 9.1.1

Table 9.1.2

33

Biofarmaceutici prve generacije

2006 SPI USA, Inc.

2006 SPI USA, Inc.

34

 2006 SPI USA, Inc.

2006 SPI USA, Inc.

35

Primer biofarmaceutika I generacije - humani insulin

Cilj terapije insulinom

Spreavanje i brz tretman postprandijalne

hiperglikemije.

Omoguuje adekvatno korienje glukoze i
drugih nutrijenasa u perifernim tkivima.

Suprimira stvaranje glukoze u jetri.

Spreava akutne komplikacije kod
nekontrolisanog dijabetes melitus-a.

Prevenira dugotrajne komplikacije kod
hroninog dijabetes melitus-a.
2006 SPI USA, Inc.

Humani insulin - kljuni regulator

homeostaze glukoze

2006 SPI USA, Inc.

36

Humani insulin hemijske osobine i razvoj

razliitih formulacija insulina

Za formulaciju preparata insulina od znaaja je:
- izoelektrina taka je na pH 5,3 (negativno naelektrisan pri neutralnom pH)
- osobina lakog asociranja u dimere i agregate vieg reda (heksamerni kompleksi
u prisustvu jona Zn)

2006 SPI USA, Inc.

Humani insulin hemijske osobine i razvoj

razliitih formulacija insulina

Komercijalni preparati insulina sadre i fenolne ekscipijense
(npr. fenol, m-krezol ili metilparahidroksibenzoat), kao
konzervanse.

Dodatno, ova jedinjenja imaju sposobnost da se veu za
specifina mesta na insulin heksameru (est veznih mesta),
to dovodi do konformacionih promena koje poveavaju
hemijsku stabilnost insulina u komercijalnim preparatima.

Pored jona Zn i fenolnih konzervanasa savremene formulacije
insulina sadre sredstva za izotonizaciju (glicerol ili NaCl) i/ili
fizioloki pufer (fosfatni) da bi se umanjilo variranje pH
vrednosti u nekim pH-osetljivim formulacijama.

2006 SPI USA, Inc.

37

Normalan pankreas
Kod zdravih osoba insulin se lui u dva sluaja: 1) kao odgovor na unetu hranu,
2) i u cilju odranja bazalnog nivoa izmeu obroka i u toku noi

Efekat insulina

Bolus
Insulin
" Bolus" Insulin
(Meal Associated)
(nakon obroka)

60-80 jedinica/ml

Bazalni Insulin
(~0.5-1.0
U/hr)
Basal Insulin
(~0.5-1.0
U/hr)
5-15
jedinica/ml

Insulin se oslobaa kao odgovor na variranje nivoa glukoze u

krvi, ime ne dolazi do hipoglikemije
2006 SPI USA, Inc.

Preparati humanog insulina i insulinskih

analoga

Kratko-delujui (eng. short-acting - regularni

insulin; rapid-acting - analozi,)

Srednje-delujui (eng. intermediate-acting
insulins)

Dugo-delujui (eng. long-acting insulins)

2006 SPI USA, Inc.

38

Farmakokinetika preparata insulina

PREPARAT

Vreme delovanja

Kratko-deluju
i, supkutani
Lispro
Aspart
Glulizin
Regularni

Kratko-deluju
i, inhalacioni
Inhalacioni regularni insulin
Dugo-deluju
i
NPH
Detemir
Glargin

Po
etak delovanja
(h)

Pik (h)

Efektivno trajanje
delovanja (h)

<0,25

0,5-1,5

3-4

<0,25

0,5-1,5

3-4

<0,25

0,5-1,5

3-4

0,5-1,0

2-3

4-6

<0,25

0,5-1,5

4-6

1-4

6-10

10-16

1-4

__a

12-20

1-4

__a

24

<0,25

1,5 hb

Do 10-16

<0,25

1,5 hb

Do 10-16

<0,25

1,5 hb

Do 10-16

0,5-1

dvojni

10-16

0,5-1

dvojni

10-16

Kombinacije insulina
75/25 75% protamin lispro, 25% lispro
70/30 70% protamin aspart, 30% aspart
50/50 50% protamin lispro, 50% lispro
70/30 70% NPH, 30% regularni insulin
50/50 50% NPH, 50% regularni insulin
2006 SPI USA, Inc.

Preparati humanog insulina i insulinskih

analoga (kratko- i brzo-delujui)

Regularni insulin, animalnog ili humanog porekla
(rekombinantni protein), ne postie punu fizioloku aktivnost
kada se primeni supkutano.

Idealni kratko-delujui insulin treba da ima poetak delovanja
10-20 min, pik nakon 1h i trajanje dejstva do 3h posle
primene.

Regularni humani insulin ima poetak delovanja 30-60 min,
pik 2-3h i trajanje dejstva 4-6h.

ak i kada se humani insulin primeni 30-60 min pre obroka,
moe doi do postprandijalne hiperglikemije, a zatim moe
nastupiti postprandijalna hipoglikemija.

2006 SPI USA, Inc.

39

Preparati humanog insulina i insulinskih

analoga (kratko- i brzo-delujui)
1) Kratko-delujui (regularni i brzo-delujui rastvorni
preparati)

Cilj - dobijanje neutralnih Zn-stabilizovanih rastvora.

U ovim regularnim neutralnim formulacijama hemijska
stabilizacija se izvodi sa 0.4% Zn i fenolnim
konzervansima.

Odloeni poetak aktivnosti usled vremena

potrebnog za disocijaciju heksamera na dimere
i monomere.

2006 SPI USA, Inc.

Preparati humanog insulina i insulinskih

analoga (kratko- i brzo-delujui)

Monomerni insulinski analozi su dizajnirani da se
postigne to prirodniji odgovor na prandijalni porast
nivoa glukoze, to je pogodnije za pacijenta.

Inverzija sekvence na odreenim pozicijama
analozi sa smanjenim potencijalom za povezivanje u
heksamere.

Trenutno su dostupna tri brzo-delujua insulinska
analoga:
- Insulin lispro
- Insulin aspart
- Insulin glulizin.
2006 SPI USA, Inc.

40

Insulin lispro (Ph. Eur. 7.0)

(LysB28ProB29-humani insulin)

Monomerni analog humanog insulina sa inverzijom sekvence u Blancu lizin (29. AK) zamenjen prolinom (28. AK) brz profil
aktivnosti pik se dostie 1h nakon primene.

Nema tendenciju ka samo-asociranju, zadrava se u
monomernom obliku nakon supkutane primene (ne gradi dimere i
heksamere kao regularni insulin).

Meutim, nasuprot drugim monomernim analozima, insulin lispro
se moe stabilisati u konzervans-zavisni heksamerni kompleks koji
obezbeuje dobru hemijsku i fiziku stabilnost proizvoda.

Uprkos heksamernoj strukturi zadrava brzo-delujuu aktivnost.

Smatra se da ovaj heksamer ima smanjen potencijal da gradi
dimere, brzo hidrolizuje do monomera, nakon difuzije fenolnih
konzervanasa u supkutano tkivo na mestu injektovanja.

2006 SPI USA, Inc.

Insulin aspart (Ph. Eur. 7.0), AspB28-humani

insulin

Insulin glulizin

Kod Insulin aspart analoga AK prolin (28. AK u B-lancu)
zamenjena je aspartatom.

Brzina nastupa dejstva je poveana zahvaljujui smanjenom
potencijalu za samo-asociranje nakon supkutane primene, u
odnosu na humani (regularni) insulin.

Kod Insulin glulizin analoga AK asparagin na poziciji 3 u B-lancu
zamenjena je lizinom, a lizin na B-29 poziciji zamenjen je
glutaminom.

I u ovom sluaju, rezultat je smanjen potencijal formiranja
heksamera i poveanje brzine nastupa dejstva.

2006 SPI USA, Inc.

41

Preparati humanog insulina i insulinskih

analoga (kratko- i brzo-delujui)

Brzo-delujui analozi se (prema nekim literaturnim izvorima)
smatraju povoljnom alternativom u odnosu na regularni
(rDNK) humani insulin.

Preporuka - regularni insulin primenjivati intravenski (poluvreme eliminacije 6 min), kod pacijenata koji ve odreeno
vreme sprovode ovu terapiju i ona im odgovara vie nego
primena brzo-delujuih insulinskih analoga.

Insulinski analozi imaju brz poetak nastupa dejstva, praen
brzim vraanjem na bazalnu vrednost.

Na ovaj nain, izbegavaju se postprandijalna hiperglikemija a
potom i postprandijalna hipoglikemija.

Meutim, ni insulinski analozi ne dostiu fizioloki
postprandijalni profil insulina zdravih ljudi.

2006 SPI USA, Inc.

Preparati humanog insulina i insulinskih

analoga (srednje-delujui)

2) Preparati sa srednjom brzinom delovanja
(eng. intermediate-acting insulins)

Ranije dva tipa: NPH i Lente (i dalje oficinalan

prema Ph. Eur. 6.0).

Danas, Lente vie nije prisutan na tritu, pa se
jedinim srednje-delujuim smatra NPH izofan
suspenzija humanog (regularnog) insulina.

Neophodno rastvaranje precipitovane i/ili kristalne
forme insulina (suspenzija) PRIMENA!!!

Ovo rastvaranje je ograniavajui faktor u
bioraspoloivosti srednje- i dugo-delujuih insulina.

2006 SPI USA, Inc.

42

Preparati humanog insulina i insulinskih

analoga (srednje-delujui)

Vreme poetka delovanja dodatno produeno usled odloene
disocijacije heksamera u dimere i monomere.

NPH je oznaka za Neutralni Protamin Hagedorn (pronalaza)
neutralna kristalna suspenzija koja se priprema kokristalizacijom insulina sa protaminom (protein sa 30 AK
primarno je zastupljen arginin).

Ove formulacije imaju minimalni % rastvornog protamina i
insulina.

NPH ima poetak delovanja 1-2h nakon primene, pik se
dostie nakon 6-12h, a trajanje aktivnosti 18-24h.

Kao i kod drugih formulacija varijacije se javljaju usled
faktora kao to su doza, mesto injektovanja, temperatura,
fizika aktivnost.
2006 SPI USA, Inc.

Preparati humanog insulina i insulinskih

analoga (srednje-delujui)

NPH insulin sa varijabilnom farmakodinamikom i

farmakokinetikom nije idealan izbor u terapiji insulin-zavisnog
dijabetesa i veoma esto biva zamenjen dugo-delujuim
insulinom ili smeama brzo-delujueg i protaminovanog brzodelujueg insulina.

Ali, ako se primenjuje pravilno (10-35 puta valjanje izmeu
dlanova, ili prevrtanje boice) primena NPH insulina je
ekonomina alternativa dugo-delujuim insulinskim
analozima ili smeama.

2006 SPI USA, Inc.

43

Priprema NPH insulina za primenu i

primena iz pen injektora

2006 SPI USA, Inc.

Preparati humanog insulina i insulinskih

analoga (dugo-delujui)
3) DUGO-DELUJUI insulini (eng. long-acting)

Ultralente (iz 50-tih) i novi insulinski analozi
- Insulin glargin i Insulin detemir.
- Insulin glargin AK asparagin zamenjena glicinom na
poziciji A-21, a na kraju B-lanca dodate su dve
rezidue arginina.
- Ova promena B-lanca dovodi do pomeranja
izoelektrine take insulina sa pH 5,3 na pH 6,7, to
je blisko neutralnom pH u supkutanom tkivu
humanog organizma.
2006 SPI USA, Inc.

44

Insulin glargin

Uvoenje AK glicina na A-21 poziciju dobijeni protein ini
hemijski stabilnim u kiseloj sredini.

Dobijeni analog ima dobru farmaceutsku stabilnost i usporenu
brzinu apsorpcije iz supkutanog tkiva, uz ouvane
farmakodinamske karakteristike humanog insulina.

Insulin glargin se formulie kao kiseli rastvor (pH =

4.0), uz dodatak soli Zn i m-krezola (konzervans).

Nakon injiciranja u supkutano tkivo, insulin glargin
precipitira usled promene pH sredine.
2006 SPI USA, Inc.

Insulin glargin

Precipitat lagano oslobaa insulin, relativno
konstantnom brzinom u toku 24h, bez
izraenog pika.

Ovakav profil doputa doziranje jednom
dnevno u cilju odravanja bazalnog nivoa
insulina

Insulin glargin se ne sme meati sa bilo kojim
rastvorom/rastvaraem ili drugim insulinom.

2006 SPI USA, Inc.

45

Insulin detemir

Insulin detemir predstavlja najnoviji analog
insulina dugog dejstva.

Izostavljanjem terminalne AK treonina sa
pozicije B-30 i vezivanjem miristinske kiseline za
AK lizin na poziciji B-29 dobijena je struktura
koja se reverzibilno vezuje za albumin u
intravaskularnom i intersticijskom prostoru
spora apsorpcija, produeno delovanje.

U oba sluaja poetak dejstva do 2h nakon injiciranja, praktino
bez pika, trajanje dejstva do 24h.

Insulin glargin jednodozno pakavanje, insulin detemir,
primena jednom ili dva puta dnevno.
2006 SPI USA, Inc.

Kombinacije (smee) insulina (eng.

fixed ratio pre-mixed insulins)

Smee srednje- i kratko- delujuih insulina u fiksnom
odnosu (npr. 70/30, 50/50, ...) humani NPH insulin i
regularni insulin

Ili, smee brzo-delujuih analoga sa srednje-delujuim,
dobijenim dodavanjem protamina (insulin lispro i
insulin aspart) poetak dejstva 15-30 min nakon
primene, pik nakon 2,5 h, trajanje dejstva do 24h.

Smee u penovima 10-14 dana na sobnoj t, a one u
boicama zadravaju aktivnost do 28-30 dana.

Neophodno energino prevrtanje ili valjanje boice
vie puta pre primene.
2006 SPI USA, Inc.

46

Smee insulina (eng. fixed ratio premixed insulin)

"Industrijske" meavine insulina pruaju ugodnost
primene i tanost doziranja.

Adekvatna kontrola glikemije sa 2-3 injekcije dnevno.

Meavine sa brzo-delujuim analozima proizvode
najbolje rezultate i savetuju se u terapiji.
Na primer: 75/25 75% protamin lispro, 25% lispro
70/30 70% protamin aspart, 30% aspart
50/50 50% protamin lispro, 50% lispro
70/30 70% NPH, 30% regularni insulin
50/50 50% NPH, 50% regularni insulin

2006 SPI USA, Inc.

FK profili humanog insulina i analoga

Aspart, Lispro, Glulizin (45 hr)

Nivoi insulina u plazmi

Regularni (610 hr)

NPH (1020 hr)
Ultralente (~1620 hr )
Detemir
~18hr

10

12

Glargin (~24 hr)

14

16

18

20

22

24

Vreme (h)
2006 SPI USA, Inc.

Rosenstock J. Clin Cornerstone. 2001;4:50-61.

47

Pakovanje , uvanje i primena insulina

(staklene boice, 10 ml i penovi, 3 ml)

Flex Pen
OptiClic

2006 SPI USA, Inc.

InnoLet ureaj za pakovanje i

primenu insulina (npr. NPH)

2006 SPI USA, Inc.

48

Primer nekih preparata insulina

registrovanih na domaem tritu

Insulini i analozi, parenteralni, kratkog dejstva

Insulin humani, parenteralno
1. Actrapid HM; Hemofarm AD-Srbija
rastvor za injekcije; 100 i.j./ml, boica 1x10 ml
2. Actrapid Flexpen; Novo Nordisk A/S-Danska
rastvor za injekciju; 100 i.j./ml, karpula sa dozerom u pen aplikatoru, 5x3 ml
Actrapid Novolet; Novo Nordisk A/S-Danska
rastvor za injekciju; 100 i.j./ml, karpula sa dozerom u pen aplikatoru, 5x3 ml
Insulin lispro, parenteralno
Humalog Pen; Eli Lilly Export S.A. vajcarska
rastvor za injekcije; 100 i.j./ml, karpula sa dozerom u pen aplikatoru, 5x3 ml
Insulin aspart, parenteralno
Novorapid; Novo Nordisk A/S-Danska
rastvor za injekciju; 100 i.j./ml, boica, 1x10 ml
Insulin glulizin, parenteralno
Apidra; Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh, Nemaka
rastvor za injekciju; 100 i.j./ml, karpula, 5x3 ml
rastvor za injekciju; 100 i.j./ml, boica, 1x10 ml

2006 SPI USA, Inc.

Primer nekih preparata insulina

registrovanih na domaem tritu

Insulini i analozi, parenteralni, srednje dugog dejstva

Insulin humani, parenteralno
Insuman Basal; Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh, Nemaka
suspenzija za injekciju; 100 i.j./ml, uloak, 5x3 ml
Insuman Bazal Opti Set; Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh, Nemaka
rastvor za injekciju; 100 i.j./ml, karpula sa dozerom u pen aplikatoru, 5x3 ml
Insulin izofan, parenteralno
Humulin Pen NPH; Eli Lilly Export S.A.-vajcarska
suspenzija za injekciju; 100 i.j./ml, karpula sa dozerom u pen aplikatoru, 5x3 ml
Insulini i analozi, parenteralni, srednje dugog dejstva u kombinaciji sa insulinima kratkog
dejstva
Insulin humani
Mixtard 30 Penfill; Hemofarm Koncern A.D. Vrac po licenci Novo Nordiska A/S-Srbija
suspenzija za injekciju; 100 i.j./ml, karpula, 5x3 ml
Insulin kristalni i protamin izofan, humani
Mixtard 50 Novolet; Novo Nordisk A/S-Danska
suspenzija za injekciju; 100 i.j./ml, karpula sa dozerom u pen aplikatoru, 5x3 ml
Insulin aspart, parenteralno
1. Novomix 30 Flexpen; Novo Nordisk A/S-Danska
suspenzija za injekciju; 100 i.j./ml, karpula sa dozerom u pen aplikatoru, 5x3 ml

2006 SPI USA, Inc.

49

Biosimilars - pojam?

2006 SPI USA, Inc.

Biosimilars - pojam?

2006 SPI USA, Inc.

50

Biosimilars - pojam?

2006 SPI USA, Inc.

Biosimilars - pojam?

2006 SPI USA, Inc.

51