Dayan Crcamo;Daniela Daz;Jairo

Lorca;Antonio Montecino;Camila Vargas

HEWLETT-PACKARD
INMUNOLOGIA CLINICA
DOCENTE: SAUL SILVA

Electroforesis de
protenas

INTRODUCCION
Las protenas son sustancias formadas por componentes bsicos ms
pequeos llamados aminocidos los cuales le confieren una carga
elctrica a la protena que puede ser positiva o negativa. Gracias a estas
cargas las protenas se movern en un lquido (medio) cuando se
coloquen en un campo elctrico.
La electroforesis de protenas es un mtodo de laboratorio que
generalmente se realiza en suero para la determinacin y medicin de
protenas especficas contenidas en la parte liquida de la sangre, con la
finalidad de pesquisar enfermedades.
La electroforesis de protenas sricas usa un campo elctrico para
separar las protenas en el suero sanguneo en grupos de tamao, forma
y carga similares.
La magnitud y direccin del desplazamiento est influida por el pH y
fuerza inica del buffer, el voltaje, peso molecular, carga elctrica,
tamao de la protena y tipo de soporte a utilizar, entre los que
encontramos gel de poliacrilamida, agarosa, acetato de celulosa.

ELECTROFORESIS DE
PROTEINAS
La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una
corriente elctrica controlada, con la finalidad de separar biomolculas
segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa.
La electroforesis de protenas separa las protenas en 5 clases segn su
carga elctrica: Albumina; Alfa-1 globulina; Alfa-2 globulina; Beta
globulina y Gamma globulina.
Para la interpretacin de la electroforesis se utiliza trazado
electrofortico en el cual se consigue visualizar claramente los niveles
de cada protena especfica y as poder interpretar si los niveles de
protenas son normales o son indicativas de alguna patologa.
El suero sanguneo contiene dos grupos principales de protenas:
albmina y globulina las cuales transportan sustancias por el torrente
sanguneo. Con la electroforesis de protenas, estos dos grupos se
pueden separar en cinco grupos ms pequeos (fracciones) los cuales
son identificados en este trazado electrofortico:

Albmina: Las protenas de albmina impiden que la sangre se

escape de los vasos sanguneos. La albmina tambin ayuda a
transportar algunos medicamentos y otras sustancias por la
sangre, y es importante para el crecimiento de tejidos y la
curacin. Ms de la mitad de la protena del suero sanguneo es
albmina.

Alfa-1 globulina: La lipoprotena de alta densidad (HDL, por sus

siglas en ingls), el tipo "bueno" de colesterol, se incluye en esta
fraccin.

Alfa-2 globulina: Una protena llamada haptoglobina, que se une

con la hemoglobina, se incluye en la fraccin de alfa-2 globulina.

Beta globulina: Las protenas beta globulina ayudan a

transportar sustancias, como el hierro, por el torrente sanguneo y
ayudan a combatir las infecciones.

Gamma globulina: Estas protenas tambin son llamadas

anticuerpos. Ayudan a prevenir y combatir infecciones. Las gamma
globulinas se adhieren a sustancias extraas, como bacterias o
virus, haciendo que sean destruidas por el sistema inmunitario.

Trazado electrofortico normal de electroforesis.

Los materiales y reactivos que se utilizan para la realizacin de esta

tcnica son los siguientes:
Materiales
- Placa de gel de agarosa para protenas sricas.
- Plantillas para aplicacin de la muestra.
- Secantes A y C.
- Cmara de electroforesis
- Micropipetas
- Puntillas para micropipetas
Reactivos
- Muestra a analizar.
- Tampn Tris-Barbital concentrado.
- Colorante azul cido concentrado.
- Solucin decolorante concentrada.
3

La muestra que se utiliza para la realizacin de la electroforesis es

suero, el cual se obtiene a travs de una puncin venosa; el tubo a
utilizar en la toma de muestras es aquel que tiene tapa roja. Otras
muestras que pueden utilizarse son orina y LCR (lquido
cefalorraqudeo), se debe tomar en cuenta que si se usan estos tipos de
muestras, se debe realizar una previa fase concentracin (50 100X).
El empleo de plasma tendr como resultado la aparicin de una banda
de fibringeno entre las fracciones beta y gamma.
Las muestras y/o controles se deben diluir en proporcin 1:4 (1+3) con
tampn antes de aplicar al gel.
Factores de interferencia:
1. La hemolisis de la muestra puede causar una falsa elevacin de las
fracciones alfa-2 y beta.
2. Las muestras que se han dejado sin cubrir pueden causar una
imprecisin en los resultados debido a la evaporacin de est.

Protocolo a realizar para la tcnica de Electroforesis de protenas.

1) Sacar la placa con agarosa del envase y colocarlo sobre una toalla
de papel. Quitar la lmina protectora y secar la superficie del gel
con un secante C, para que de esta manera las gotas que tiene la
placa no interfieran en el siguiente paso del procedimiento. Luego
de secar la placa, desechar el secante.
2) Alinear la plantilla de aplicacin de la muestra con las flechas
existentes en el borde del gel, la plantilla se utiliza como gua para
que al momento de colocar la muestra en la placa de agarosa,
est quede en el lugar correcto. Colocar un secante A encima de la
plantilla y presionar con un dedo a lo largo de las ranuras para
asegurar un buen contacto, de esta manera, la plantilla queda
fijada en la placa. Retirar el secante A y conservarlo para utilizarlo
luego en el paso 5.
3)

Aplicar 3 l de la muestra en cada ranura y dejar que sea

absorbida durante 4 minutos. La aplicacin de 3 l de muestra es
para que as no se sobrepase el espacio que corresponde a cada
muestra.

4) Mientras la muestra es absorbida, verter aproximadamente 25 ml

del tampn diluido en cada hueco interior de la cmara SAS-MX. El
tampn a utilizar sirve como conductor de la electricidad y
controlador del pH, lo cual es importante para la estabilidad de las
molculas biolgicas, adems tambin sirve para el arrastre de las
protenas.
5) Tras la absorcin de la muestra, secar ligeramente la plantilla con
el secante A (conservado desde el paso 2) para as retirar el
excedente de muestra que queda en la plantilla. Luego retirar el
secante y la plantilla.
6) Colocar el gel en la cmara con la agarosa hacia arriba, alineando
los lados positivo (ctodo) y negativo (nodo) con las posiciones
correspondientes en la cmara. La utilizacin de est campo
elctrico es para que las protenas migren hacia sus polos
respectivos, dependiendo de la carga elctrica que posean.
7) Aplicar la electroforesis al gel: 80 V, 30 minutos. La aplicacin de
80 V es para separar las protenas, las cuales decantaran por la
placa de agarosa y el tiempo es para que las protenas puedan
polimerizar.
8) Al finalizar la electroforesis, secar el gel a 60 -70C para as fijar
las protenas ya decantadas y no destruir la muestra temporadas
muy elevadas.
9) Sumergir el gel seco en la solucin colorante durante 10 minutos,
de esta manera las protenas se teirn y podrn ser observadas
de mejor forma.
10)
Decolorar el gel mediante 2 lavados de 60 segundos cada
uno con la solucin decolorante, o hasta que el fondo est limpio,
para as eliminar el exceso de colorante de la placa.
11)
Lavar brevemente en agua destilada para retirar cualquier
resto de
solucin utilizada en los pasos anteriores. Luego secar.

Los controles a utilizar son de tipo comerciales, los cuales ayudan a la

verificacin de cada una de las fases del procedimiento y tambin

pueden ser utilizados en cada placa. Otros tipos de controles que se

pueden usar son los hechos de manera interna en un laboratorio. Estos
son realizados con sueros de pacientes, los que pueden ser normales o
patolgicos.

PATOLOGIAS ASOCIADAS

Suero normal

Los rangos de los valores normales son:

Protena total: 6.4 a 8.3 g/dL (gramos por decilitro)

Albmina: 3.5 a 5.0 g/dL
Alfa-1 globulina: 0.1 a 0.3 g/dL
Alfa-2 globulina: 0.6 a 1.0 g/dL
Beta globulina: 0.7 a 1.2 g/dL
Gammaglobulina: 0.7 a 1.6 g/dL

Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre

diferentes laboratorios.

Las variaciones que generan patologas son:

Disminucin de la protena total: Indica desnutricin,

sndrome nefrtico, enteropata por prdida de protenas
gastrointestinales.

Aumento de protenas alpha-1 globulina: Esta indica

enfermedad inflamatoria crnica, Malignidad, Enfermedad
inflamatoria aguda.

Disminucin de las
hemlisis.

Aumento de las protenas beta globulinas: Puede indicar

Hiperlipoproteinemia, Terapia de estrgenos.

Disminucin de las protenas beta globulinas: Indica

trastorno de coagulacin congnito, Coagulopata de
consumo, Coagulacin intravascular diseminada.

Aumento de las protenas gama globulinas: Puede indicar

Mieloma
mltiple,
Enfermedad
inflamatoria
crnica,
Hiperinmunizacin, Infeccin aguda, Macroglobulinemia de
Waldenstrom, Enfermedad heptica crnica.

protenas

alfa-2 globulinas:

Indica

INFLAMACION

Inflamacin aguda asociada con:

-aumento de a1 y a2 globulinas

Inflamacin crnica asociada con:

- Aumento de la alfa-1, alfa-2 globulinas y un aumento policlonal
de las gammaglobulinas
- Disminucin de la albmina, globulinas beta (debido a una
disminucin de la transferrina.)

SINDROME NEFROTICO
Esta enfermedad est asociada con:
- Una disminucin de la albmina, alfa-1 globulinas
- Un aumento de la alfa-2 globulinas (debido a un aumento de la
macroglobulina alfa-2).

CIRROSIS

10

Esta enfermedad est asociada con:

- Una disminucin de la albmina, alfa-1 y globulinas alfa-2 (debido a la
insuficiencia hepatocelular)

HIPOGAMMAGLOBULINEMIA

Disminucin de las inmunoglobulinas policlonales en la zona gamma

Se asocia con:
- Parcial o total de la inmunodeficiencia
- El tratamiento inmunosupresor
- Enfermedad de las cadenas ligeras libres o mieloma no secretor

11

HIPERGAMMAGLOBULINEMIA
Aumento de las inmunoglobulinas policlonales en la zona
gamma
Se asocia con:
- Inflamacin
- Cirrosis
- Infecciones subaguda y crnica

12

VOLTAJES Y MEDIOS
Voltajes
La gradiente de voltaje afecta positiva y directamente a la movilidad
inica. Si aplicamos un muy alto voltaje esto origina un calor excesivo,
provocando fenmenos indeseables tales como evaporacin y
gradientes de temperatura irregulares que afectan a la separacin, por
eso cuando se aplican altos voltajes se debe trabajar en cmaras de frio
Se mide en voltios y es lo que define el campo elctrico. Cuanto mayor
sea, mayor ser la velocidad de migracin. Las electroforesis se
consideran de bajo voltaje si se realizan entre 10-500 voltios (la
mayora) y de alto voltaje si se realizan entre 500-10,000 voltios, el
voltaje aplicado.
Realizar la electroforesis a 110 volts por 15 minutos (este voltaje y
tiempo puede ser variable de acuerdo a las condiciones del
laboratorio)
Para la inmunoelectroforesis realizar separacin electrofortica a
220 V por 60 minutos.
El voltaje no se puede incrementar indiscriminadamente porque se
genera un excesivo calor. En contraste, al aplicar bajo voltaje puede
ocurrir una pobre separacin, por causa de la difusin por tiempo muy
prolongado de la corrida electrofortica.

Medios de electroforesis
Papel filtro
Rpido y sencillo, se usa para separar protenas, oligonucletidos
carbohidratos y lpidos, pero con elevada adsorcin debido a los grupos
hidroxilo de la celulosa.
Acetato de celulosa
Se usa para anlisis de fluidos biolgicos, el tiempo de anlisis es corto y
la tcnica es sencilla, los grupos OH estn acetilados, lo que reduce la
adsorcin; baja tincin de fondo; es posible transparentarla o disolverla

13

para detectar y recuperar los componentes separados, pero tiene dbil

resolucin.

Geles
Son polmeros de red tridimensional, el uso de estos como medio de
soporte en electroforesis constituye una alternativa para solucionar
algunos problemas asociados con el uso de el papel y de acetato de
celulosa como la adsorcin, la difusin y poca resolucin de los
compuestos separados. Hay factores que influyen en la migracin de la
muestra en los geles como el tamao del poro y el radio de la molcula,
hay tres tipos de geles:
Almidn
El almidn es una pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en
un tampn caliente (se hinchan), es una tcnica barata, fcil y rpida
pero que actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la
poliacrilamida.
Poliacrilamida
Es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser
preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles
transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua,
relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las
bandas durante tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que
variando la concentracin de polmeros, se puede modificar de manera
controlada el tamao del poro.
Agarosa
La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el
agar-agar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones poseen
la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50C y formar un
gel, semislido al enfriarse. Este esta constituido por una matriz o trama
tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de
medio lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente
para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos.

14

INMUNOFIJACION
Muestras
- Suero fresco o refrigerado a en un tiempo igual o menor a 72hrs
(a 2 8 C).
- Liquido Cefaloraqudeo(LCR).
- Orina.
Espectro clnico
Se utiliza cuando hay un aumento de las regiones beta o gamma en la
electroforesis de protenas en suero, o cuando se sospecha de la
presencia de mieloma mltiple.
Fundamento
La inmunofijacin es una tcnica que tiene como funcin, que una
protena quede anclada al sitio donde migr en la electroforesis, esto se
lleva a cabo por medio de un complejo insoluble con anticuerpos.
Se puede dividir en 4 fases:
- Separacin de las protenas mediante electroforesis en gel de
agarosa
- Fijacin e inmunoprecipitacin de las protenas: se adicionan los
antisueros respectivos y las soluciones fijadoras sobre la superficie
del gel para identificar las protenas especficas y precipitarlas.
- Remocin de protenas solubles que no se precipitaron ni se
unieron a los antisueros.
- Tincin de las protenas precipitadas para permitir su
visualizacin. Las bandas que se inmunoprecipitan se comparan
con las bandas anormales observadas inicialmente en la electroforesis de protenas y segn la reaccin con los antisueros se

15

define su naturaleza y si corresponden o no a un componente

monoclonal.

Interpretacin

Se espera una tincin difusa y politpica de las inmunoglobulinas y

de las cadenas livianas, lo cual se puede notar en la primera
imagen.
La presencia de una protena monotpica, se identifica por una
banda muy definida y delimitada que reacciona con un anticuerpo

16

contra cadena pesada, y con uno contra cadenas livianas;

migrando las dos a la misma distancia.

CONCLUSION
La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo de laboratorio
normalizado que se utiliza para separar e identificar distintos tipos de
protenas, con el fin de revelar distintas patologas mediante la
interpretacin de un trazado electrofortico que deriva de esta
electroforesis.
Derivada de esta electroforesis tambin encontramos la inmunofijacin,
la cual solo se inclina a la identificacin de inmunoglobulinas.
Esta tcnica debe realizarse siempre en el orden que se establece ya
que un solo error u omisin puede implicar una falla en el procedimiento
al igual que en la lectura del resultado y obtener un diagnstico errneo.

17