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ts
(2)
N
El valor de t depende tanto del valor de N-1, que se conoce como grados de libertad asi como del
nivel de confianza requerido. La Tabla II muestra los valores de t para varios niveles de
confianza.
La distribucin de probabilidad de las seales se utiliza en la determinacin del Lmite de
deteccin, como veremos luego.
= x
CALIBRACION
(3)
Se entiende por matriz, a todos los componentes de la muestra que acompaan al analito.
CALIBRACION
y= b + mx
(4)
El trmino b indica la magnitud de la seal estimada del blanco, mientras que m es la pendiente
de la recta de calibrado e indica nuevamente la sensibilidad.
Estadsticamente, una calibracin realizada a partir de dos puntos es muy pobre y
su construccin a partir de un nmero mayor de patrones es obligatoria. El procedimiento
estadstico para determinar los coeficientes b y m de la ecuacin (4) se denomina regresin por
cuadrados mnimos. La regresin por cuadrados mnimos es una herramienta muy til, sin
embargo, deben conocerse sus limitaciones. Adems de la regresin por cuadrados mnimos
siempre debe hacerse una inspeccin grfica de los datos obtenidos, para detectar puntos
anmalos o fallas en la linealidad. Las ecuaciones mediante las que se obtienen los coeficientes
de la ecuacin (4) se detallan en la prxima seccin.
Regresin por cuadrados mnimos
Este mtodo es ampliamente utilizado en todas las ramas de las ciencias, encontrndose
incorporado en muchas calculadoras y planillas de clculo.
Para el modelo de la ecuacin (4) los coeficientes pueden ser calculados de la siguiente
manera:
N
m=
( xi x )( yi y )
i =1
(5)
( xi x )
i =1
b = y mx
(6)
donde x , y son los promedio aritmticos de los valores de x (patrones de concentracin) y valores
de y (seales). En la ecuacin (5), el numerador es simbolizado Sxy y el denominador Sxx . La
N
(y
y i ) 2
N 2
S yy m 2 S xx
N 2
(7)
CALIBRACION
b.- Todas las medidas son estadsticamente independientes unas de otras. Cualquier tendencia de
las seales a travs del tiempo (derivas de la lnea de base o contaminaciones secuenciales)
invalida el calibrado.
c.- Todas las medidas tienen igual desviacin estndar, la cual no depende del valor de la seal
observada, por lo tanto las seales altas tendrn igual desviacin estndar que las pequeas. Esta
suposicin es particularmente discutible si se trabaja en un amplio intervalo de concentraciones.
Si no se cumple, es necesario utilizar un mtodo de calibracin ponderado por las desviaciones
estndar de las medidas.
d.- Las medidas estn normalmente distribuidas. En general, el error en una medida analtica es
una suma de errores independientes provenientes de distintas partes del instrumento. Aunque el
error de cada fuente individual no sea normalmente distribuido, la suma de esas contribuciones,
producir una distribucin normal.
De todas las suposiciones anteriores, la ms dbil es la tercera, porque en general a bajas
concentraciones, la precisin de las medidas empeora. Una buena aproximacin puede realizarse
restringiendo el intervalo en el cual se realiza la curva de calibracin, de manera que la precisin
sea constante. Si no se desea disminuir el rango lineal, se debe hacer una regresin ponderada.
La ecuacin (4) se usa para calcular la concentracin de una muestra incgnita:
x=
y b
m
(8)
sm =
S xx
(9)
sy
m
2
1 1 ( yx y)
+
+
L N
m 2 S xx
(11)
la determinacin disminuye, por lo que es mejor determinar muestras cuyo valor de seal se
encuentre en el centro de la curva de calibrado. Cuantas mas veces se repite el anlisis de la
muestra incgnita, mayor ser L y por lo tanto menor ser la desviacin estndar. El diseo de la
curva de calibrado tambin es importante, puesto que Sxx debe ser pequeo. Esto se logra
aumentando la cantidad de patrones en los extremos de la curva de calibrado.
Cmo expresamos la incertidumbre del resultado de una muestra incgnita? Esto se hace
en base a un intervalo de confianza para el promedio de concentraciones obtenidos mediante L
anlisis repetidos de la muestra. Puesto que en general el nmero de muestras utilizado en la
calibracin es pequeo se debe utilizar el parmetro t para generar un intervalo de confianza.
Este intervalo se calcula mediante la ecuacin (12). Los resultados para una muestra incgnita se
expresan como:
y b
xx = x
t , N 2 s x
(12)
m
donde t depende del nmero de muestras realizadas en la calibracin y del intervalo de confianza
deseado (ver Tabla II). No debemos olvidar el correcto redondeo de las cifras decimales, que
deber hacerse cuando se hayan finalizado los clculos.
Ambito Lineal del calibrado
Una parte importante de la tarea de calibracin de un instrumento analtico es determinar el
intervalo de concentraciones para el cul el modelo lineal es vlido. Hay tres maneras de verificar
sto, ninguna de ellas excluye a las otras.
La primera, es la investigacin del grfico de residuos ( y i y i ) en funcin de la concentracin.
Los residuos deben ser todos de la misma magnitud y deben estar distribuidos aleatoriamente en
su signo (en una secuencia del tipo +-+-+- etc.). Si esto no fuese as, debe sospecharse una
relacin no lineal entre x e y por lo que debe disminuirse el rango de trabajo, o bien aplicar otro
modelo, si la teora as lo permite.
Otra manera de verificar la validez del modelo lineal es mediante el clculo del coeficiente de
correlacin (r):
r=
S xy
S xx S yy
varianza debida al error puramente experimental, calculamos la media de los cuadrados debida a
esta contribucin (MSPE, Mean Squares Pure Error):
k
MS PE =
ni
(y
i
ij
yi ) 2
nk
Donde n es el nmero total de mediciones, k es el nmero total de patrones, i son las repeticiones
de cada patrn y los yij son las seales de todos los experimentos.
Para estimar el posible error debido a una falla de ajuste debida a la eleccin de un modelo
incorrecto, calculamos la media de los cuadrados debida a la falta de ajuste (MSLOF, Mean
Squares Lack of Fit):
k
MS LOF =
( y i y i ) 2
k 2
Esto mide la diferencia media entre la media de las rplicas de cada patrn y su correspondiente
valor estimado por la regresin. Cabe esperar que si el modelo lineal es correcto, las varianzas
MSLOF y MSPE sern comparables. Si MSLOF es mayor que MSPE el ajuste no es correcto y hay
que utilizar otro modelo o reducir el mbito de concentraciones en el cul se hace el calibrado.
Para comparar MSLOF y MSPE hacemos un test F de varianzas calculando:
MS LOF
MS PE
Si Fcal < Fk-2,n-k, (obtenido de tablas) se acepta que existe buen ajuste al modelo lineal.
Los clculos de ANOVA pueden ser un poco engorrosos y se recomienda el uso de planillas de
clculo que facilitan mucho la tarea.
Fcal =
( y i y i )
sy
Un residuo estndar cercano o mayor que 1.5 indica que este residuo es anormalmente alto,
puesto que est a una distancia igual a 1.5 veces su desviacin estndar. Este punto debe ser
examinado mas cuidadosamente para determinar la causa del residuo alto. Esto puede deberse a
una falla en la medicin de la seal o a un problema de ajuste de la recta al modelo lineal. En
todo caso, puede intentarse repetir la regresin quitando este punto del juego de datos, para ver
de que manera cambia el valor de pendiente y ordenada al origen.
Protocolos de calibracin
Para la determinacin de la concentracin pueden ser utilizados distintos modos de
calibracin dependiendo del analito y de la tcnica instrumental usada. El caso descripto
anteriormente se denomina calibracin externa porque las muestras y los patrones se
determinan en forma separada.
CALIBRACION
Otros modos tambin son utilizados: calibracin interna, mtodo del agregado patrn
y tcnicas de dilucin isotpica.
Calibracin interna:
Si antes de la determinacin se le agrega a la muestra una cantidad fija de una sustancia
con caractersticas qumicas similares a las de la especie a determinar, esta sustancia es llamada
estndar interno y el mtodo se denomina de calibracin interna o mtodo del estndar
interno. El agregado sirve para calibrar un paso crtico que de otra manera introduce una gran
incerteza, por ejemplo el volumen de muestra inyectado en una corrida de Cromatografia
Gaseosa. La seal producida por este estndar interno es producida en las mismas condiciones
que la de los analitos, porque se encuentran juntos en la muestra. Para averiguar la concentracin
de los analitos, se aplica alguno de los modelos lineales vistos anteriormente utilizando como
seal del patron, la seal producida por el estndar interno. La concentracin del estndar interno
puede variarse para comprobar la linealidad y construir una curva de calibrado, o puede usarse un
modelo de un nico patrn. Hay que tener en cuenta que si el estndar interno no tiene la misma
sensibilidad en el detector que los analitos, hay que corregir las seales de estos con un factor de
respuesta. Estos factores de respuesta se calculan a priori mediante estndares de los compuestos
a determinar (ver Willett, J. E., Gas Chromatography, Analytical Chemistry by Open Learning,
Wiley, 1987).
La forma ms sofisticada del mtodo del estndar interno es el mtodo de dilucin
isotpica. Aqu se opta por agregar a la muestra una sustancia que es qumicamente igual a la
sustancia a determinar pero an as discernible de la original. Este mtodo utiliza la misma
sustancia como patrn pero con al menos un tomo de su estructura reemplazado por un istopo.
Por ejemplo, 12C es reemplazado por 13C en un compuesto orgnico. Para este mtodo debe
utilizarse un tcnica selectiva a istopos, generalmente espectrometra de masa.
Agregado patrn
En el mtodo del agregado patrn se le agrega a la muestra, concentraciones crecientes del
analito de inters. La seal obtenida se deber a la cantidad de analito originalmente presente en
la muestra sumados a la cantidad agregada. El propsito de este mtodo es generalmente corregir
efectos de interferencias multiplicativas debidas a la matriz de la muestra. Una vez obtenidas, la
seales instrumentales se grafican versus las cantidades de analito aadidas. La recta de
regresin se calcula de manera usual. Para conocer la concentracin de la muestra incgnita se
extrapola la recta al punto sobre el eje x donde y=0. La interseccin negativa sobre el eje x
corresponde a la cantidad de analito en la muestra problema. Este valor viene dado por b/m. En
este caso los resultados se expresan como:
2
sy 1
y
b
x = t , N 2
+ 2
(13)
m
m N m S xx
En esta expresin no aparece L como en la expresin (11), puesto que no se hacen rplicas de
cada muestra, sino que se hace un agregado patrn por cada una de ellas. Esto demanda mucho
tiempo y esfuerzo. No debemos olvidar que para obtener el valor de concentracin en la muestra
original, debemos corregir al valor de x y a su incertidumbre, por las diluciones hechas.
Las interferencias multiplicativas son aquellas que producen un cambio relativo en la concentracin. Por ejemplo,
la presencia de aluminio en exceso en la muestra disminuye la seal de un electrodo de ion selectivo a fluoruro en un
50 %.
CALIBRACION
Lmite de Deteccin
En Anlisis Instrumental, debemos aprender a elegir la tcnica correcta para cumplir con
nuestro anlisis. Para ello, debemos comparar muchas figuras de mrito de cada mtodo. Las
figuras de mrito forman una base comn sobre las que se pueden comparar los mtodos
analticos. Ya hemos visto algunas figuras de mrito, como ser la sensibilidad, la exactitud y la
precisin. Otra figura de mrito importantsima es el Lmite de Deteccin. El clculo del lmite
de deteccin responde la pregunta: Cul es la menor concentracin que podemos detectar con
este mtodo de anlisis? Para responder a esta pregunta, debemos analizar cul es la menor seal
detectable
La probabilidad que la ms pequea seal analtica discernible, yL , puede ser medida y
no corresponde a una fluctuacin aleatoria de la medida del blanco, yB , depende de a cuantas
unidades de desviacin estndar del blanco (sB ) est yL de y B (promedio de las medidas del
blanco). Si la diferencia entre y B e yL es 3sB la probabilidad que la medida de yL sea una
fluctuacin del blanco es menor que el 0,13% (si el nmero de medidas del blanco es superior a
25).
Para determinar la concentracin lmite, xL ,, IUPAC define que :
y L = y B + ksB
(14)
donde k es un valor que se elige de acuerdo al nivel de confianza que se desee, generalmente 3.
La concentracin lmite es una funcin de yL y por lo tanto:
( y yB )
xL = L
(15)
m
Sustituyendo la ecuacin (14) en la (15) se obtiene que:
ks
xL = B
(16)
m
Por lo tanto el lmite de deteccin puede encontrarse dividiendo ksB por la pendiente
obtenida por regresin de la curva de calibracin. Sin embargo, la concentracin lmite as
obtenida ser un reflejo del verdadero lmite de deteccin slo si la pendiente, m, y la ordenada al
origen, b, estn bien calculadas.
El mtodo IUPAC utiliza como fuente de variabilidad de las seales, la desviacin
estndar del blanco. Un mtodo alternativo, aunque menos usado, utiliza la desviacin estndar
de los residuales del calibrado sx (ecuacin 11) como estimador de la desviacin estndar del
blanco. Esto es til si no se ha repetido el blanco y sB no puede calcularse.
El mtodo definido por la ecuacin (16) es vlido solo si la principal fuente de error est
en el blanco. Por lo tanto, en la mayora de los casos este mtodo dar lmites de deteccin mas
bajos que si se tiene e cuenta todo el error del calibrado.
Un detallado artculo sobre lmite de deteccin puede leerse en Analytical Chemistry; 55
(1983) 712A. (este artculo puede obtenerse en la biblioteca Central Leloir).
Bibliografa
D.A. Skoog, J.J. Leary, Analisis Instrumental, pendice 1, McGraw-Hill, 4ta. Edicin, 1994.
J.C. Miller, J.N. Miller, Estadstica para Qumica Analtica, Addison-Wesley, 1993.
M.A. Sharaf, D.L. Illman, B.R. Kowalski, Chemometrics, Wiley, 1986
R. Kellner, J.M. Mermet, M. Otto, H.M. Widmer, Analytical Chemistry, Captulo 12, WileyVCH, 1998.
G.L. Long, J.D.Winefordner; Analytical Chemistry; 55 (1983) 712A.
CALIBRACION
PROBLEMAS
1.- Un mtodo oficial para el anlisis de hidrocarburos clorados en muestras de aire tiene una
desviacin estndar de 0,030 ppm.
a.- Calcular el intervalo de confianza del 95% para la media de cuatro medidas obtenidas con
este mtodo.
b.- Cuantas medidas debern hacerse si se pretende que el intervalo de confianza del 95% valga
0,017.
2.-La exactitud de un mtodo analtico se suele evaluar analizando uno o varios materiales
estndar de referencia cuya composicin se conoce. Siempre, la medida experimental del anlisis
x diferir del valor verdadero obtenido con el estndar. Reordenando la ec. (2) se puede
determinar si la diferencia x es debida a un error sistemtico.
ts
Si | x | >
existe un error sistemtico.
N
ts
Si | x |
no queda demostrada la presencia de un error sistemtico.
N
Determine si en los siguientes ejemplos hay alguna evidencia de error sistemtico. En todos los
casos utilice un nivel de confianza del 95%.
a.- Se analiza un material de referencia cuyo valor de concentracin de Hg se halla
certificado y vale 0.389%. El mismo material se analiza mediante Espectrometra de
Absorcin Atmica por Generacin de Vapor fro de Mercurio obtenindose los
siguientes valores : 0,389; 0,374; 0,371. Cul es la mnima diferencia de porcentajes de
mercurio que podemos detectar con este experimento? Cmo disminuye el sesgo
detectable?
b.- El tanto por ciento de nquel en una muestra particular de un acero de referencia es de
un 1,12%. Un nuevo mtodo espectromtrico para la determinacin de nquel produjo los
siguientes resultados (en %): 1,10; 1,08; 1,09; 1,12; 1,09.
c.- Se estudi la exactitud de un mtodo volumtrico para la determinacin de calcio en
minerales calcreos analizando una piedra caliza estndar que contena 30,15 % de CaO.
El resultado de la media de cuatro anlisis fue de 30,26% de CaO, con una desviacin
estndar de 0,085%.
Indican estos datos la presencia de un error sistemtico?
A partir de un elevado nmero de anlisis, se estableci la desviacin estndar de la
poblacin. O sea s = 0,094% de CaO.
Indicaran estos datos la presencia de un error sistemtico?
Cambian las conclusiones si el estndar tiene una incertidumbre igual a 0.014%
de CaO con una probabilidad de error del 5%?
3.- Se han analizado una serie de soluciones estndar de fluorescena con un
espectrofluormetro, obtenindose las siguientes intensidades de fluorescencia (en unidades
arbitrarias):
Intensidad fluorescencia
(unidades arbitrarias)
Concentracin de
fluorescena (pg/ml)
2,1
5,0
9,0
12,6
17,3
21,0
24,7
10
12
CALIBRACION 10
a.- Calcule la pendiente y la ordenada al origen de la recta de regresin para los datos mostrados.
b.- Calcule la desviacin estndar residual y los lmites de confianza (al 95%) para la pendiente y
la ordenada al origen.
c.- Determine las concentraciones, las desviaciones estndar y sus lmite de confianza (95%) para
soluciones con intensidades de fluorescencia de 2,9; 13,5 y 23 unidades (L=1). Analice cual
presenta el mejor lmite de confianza en valores absolutos. Analice donde es conveniente que
caiga el valor de la seal de la muestra dentro de la curva de calibracin.
d.- Si se considera como el promedio de cuatro medidas el valor de intensidad de fluorescencia
de 13,5, cules sern los valores de la desviacin estndar de la concentracin calculada y el
lmite de confianza?. Y si fuera el promedio de ocho? Analice cual es la mejora obtenida al
aumentar el nmero de medidas.
e- El anlisis del grfico de residuos indica una buena linealidad?
4-En la tabla siguiente se muestran los resultados para la curva de calibrado de la determinacin
de Mn usando un Espectrmetro de Absorcin Atmica por Llama. Las alturas de las seales se
midieron con un registrador electrnico.
Concentracin
0
1
2
3
4
5
(ppm)
Seal (altura en 0.00
0.98
2.10
3.16
3.68
4.15
unidades
0.90
2.20
3.22
3.72
4.27
arbitrarias)
Repita los clculos de los puntos a y b del ejercicio anterior. Compare el ancho de los intervalos
de confianza.
Analice grficamente los residuos de la regresin. Hay alguna tendencia?
Analice si existen fallas del ajuste mediante un Test F.
Si detecta una falla de ajuste Cmo la solucionara?.
5-Los siguientes resultados se obtuvieron para la determinacin de Tl por medio de
Espectrometra Atmica con Horno de Grafito. La evaluacin de la seal se hizo a travs del rea
del pico obtenido. A las seales de las muestras, se les rest automticamente a travs del
software del espectrmetro, la seal obtenida para el blanco.
Concentracin 20
40
60
80
100
de Tl (ng/ml)
Absorbancia
0.038
0.089
0.136
0.186
0.232
(rea del pico
A.s)
Calcule los intervalos de confianza (95%) para la pendiente y la ordenada al origen. Calcule la
sensibilidad con su incerteza. Decida mediante un test de hiptesis si la correccin hecha con el
blanco est bien realizada.
6.- La concentracin de plata en una muestra de desechos fotogrficos se determin por
espectrometra de absorcin atmica con el mtodos de las adiciones estndar. Se obtuvieron los
siguientes resultados: A un volumen de 10.00 ml de muestra se agregan volmenes variables de
una solucin patrn de 100.0 mg/l de Ag y se completa hasta un volumen final de 25.0 ml.
Volumen agregado de la
solucin estndar de Ag (ml)
Absorbancia
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
0,32
0,41
0,52
0,60
0,70
0,77
0,89
CALIBRACION 11
CALIBRACION 12
z
0,67
1,00
1,29
Nivel de
confianza, %
90
95
96
Nivel de
confianza, %
99
99,7
99,9
1,64
1,96
2,00
z
2,58
3,00
3,29
libertad
80
90
95
99
99,9
3,08
6,31
12,7
63,7
637
1,89
2,92
4,30
9,92
31,6
1,64
2,35
3,18
5,84
12,9
1,53
2,13
2,78
4,60
8,60
1,48
2,02
2,57
4,03
6,86
1,44
1,94
2,45
3,71
5,96
1,42
1,90
2,36
3,50
5,40
1,40
1,86
2,31
3,36
5,04
1,38
1,83
2,26
3,25
4,78
10
1,37
1,81
2,23
3,17
4,59
11
1,36
1,80
2,20
3,11
4,44
12
1,36
1,78
2,18
3,06
4,32
13
1,35
1,77
2,16
3,01
4,22
14
1,34
1,76
2,14
2,98
4,14
1,29
1,64
1,96
2,58
3,29
Ejemplo*
Desviacin estndar de x
CALIBRACION 13