Elektronik Mikrobiyoloji Dergisi TR

(Eski ad: OrLab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi)

Yl: 2011 Cilt: 09 Say: 3 Sayfa: 1-7
www.mikrobiyoloji.org/pdf/702110301.pdf

Gdalarn lenmesinde Kullanlan Enzimlerin

Rekombinant DNA Teknolojisi ile retimi
Burcu eri1, Ali Koyiit2, smail Karaboz3
zet
Gdalarn ilenmesi iin birok farkl yntem bulunmaktadr. Enzimler de gdalarn
ilenmesinde ve gda katk maddelerinin retiminde olduka yaygn bir biimde
kullanlmaktadrlar. Enzimler mikroorganizmalardan olduu kadar bitkilerden ve
hayvan dokularndan da elde edilmektedirler. Fakat genellikle klasik yntemlerle elde
edilen bu enzimler gnmzde kullanlan modern gda retim yntemlerine uyum
salayamamaktadrlar. Rekombinant DNA teknolojilerinin gelimesi ile gdalarda
rekombinant mikroorganizmalardan elde edilen enzimlerin kullanlmas fikri nem
kazanmtr. Rekombinant mikroorganizmalarn kullanlmas dk maliyet ve yksek
verimlilikle enzim eldesini salamaktadr. Fakat elde edilen enzimler gdalarda
kullanlaca iin, konak mikroorganizmalarn patojenik ve toksijenik potansiyelleri
nemlidir. Bu sorun da konak organizmalarn mutasyonla gvenilir hale getirilmesiyle
veya fermantasyon koullar dzenlenerek toksin retilmesine engel olunmasyla
almaktadr.

LENM GIDALAR
Enzimler gda endstrisinde olduka nemli rol oynamaktadrlar. Yzyllardr
sregelen ekmek ve peynir retimi enzimlerin aktivitelerine dayanmaktadr. Yine
yourt ve fermente rnler de enzimatik reaksiyonlar sonucunda retilmektedirler
fakat bu rnlerde, saflatrlm enzimlerden ok organizmalar bu reaksiyonlar
gerekletirirler (1). Enzimler, gda proseslerinde, biyodnm ve sentez,
ekstraksiyonlarn gelitirilmesi, viskozitenin azaltlmas ve tattaki deiimler gibi pek
ok ilem iin kullanlmaktadr. Gda uygulamalarnda kullanlacak olan enzimler
GRAS (Generally Recognized as Safe) olarak deerlendirilmi kaynaklardan elde
edilmelidir. nk elde edilecek rekombinant enzimin retiminde kullanlan konak
organizmalarn patojenik ve toksijenik potansiyelleri olduka nemlidir (2).
Gdalarn ilenmesinde kullanlan enzimlerin endstriyel olarak retimi 1874lere
uzanmaktadr. Danimarkal aratrmac Christian Hansen peynir ilemi iin
buzalarn karnlarndan rennin (kimosin) ekstrakte etmitir (3).
1

Ara. Gr, Uzman, 2Ara. Gr, Dr., 3Prof. Dr, Ege niversitesi Fen Fakltesi Biyoloji
Blm, Temel ve Endstriyel Mikrobiyoloji Anabilim Dal, Bornova, 35100, zmir.
Yazmadan sorumlu yazar ismail.karaboz@ege.edu.tr
1

Kimosin gnmzde rekombinant DNA teknikleri ile bovine prokimosin genine sahip
mikroorganizmalarca retilmektedir. Bovine kimosin E. coli K-12de ifade edilmitir ve
US Food and Drug Administration (FDA) tarafndan onaylanan ilk rekombinant
enzimdir (3).
Enzimlerin ekspresyonu iin temel olarak bileeni gerektirir: bir gen, geni ieren
vektr ve ekspresyonu gerekletirecek konak hcre (4). Enzim eldesinde rnn
miktar da olduka nemlidir. Dolaysyla konak hcrelerin rekombinant enzim
retiminde nemli rolleri bulunmaktadr.

Konak mikroorganizmalar
B. subtilis, B. licheniformis, A. niger, A. oryzae gibi birok bakteriyel ve fungal strain
gda proseslerinde kullanlan enzimlerin retimi iin konak hcre olarak
kullanlmaktadrlar. Bu organizmalar uzun yllardr enzim retiminde kullanlmakta olup,
endstriyel retim koullar altnda olduka iyi retilebilmektedirler. Bunlar ayn
zamanda genetik maniplasyonlara uygundurlar ve fermantasyon ortamnda bol
miktarda enzim retebilirler. Bu organizmalarn dnda, E. coli K-12, F. venenatum, P.
fluorescens gibi doal enzimlerin retiminde kullanlmayan pek ok mikroorganizma,
gda proseslerinde kullanlan enzimlerin retiminde kullanlmaktadrlar (3).
Bacillus subtilis
B. subtilis uzun yllardr zelikle alfa amilaz ve proteazlar gibi gda ilemlerinde
kullanlan enzimlerin retiminde konak organizma olarak kullanlmaktadr. B. subtilis
tarafndan retilen rekombinant enzimlerin gvenlii FDAya (Food and Drug
Administration) sunulan GRAS (Generally recognized as safe) tebliinde ve eitli
almalarda belirtilmitir (5-28-29-30). B. licheniformis, B. amyloliquefaciens ve B.
stearothermophilusun (zellikle alfa amilaz enziminin retiminde) gda ilemlerinde
asndan konak hcre olarak kullanlmalarnn gvenli olduu belirtilmitir. Son on
ylda, B. licheniformis ve B. amyloliquefaciens rekombinant enzimlerin
ekspresyonunda kolaylkla kullanlmlardr. ki endstriyel B. licheniformis straininin
tm genomunun sekans kartlm ve B. subtilisin sekansna byk oranda benzer
olduu, fakat insanlarda patojen olan B. cereus ve B. anthracisten farkllk gsterdii
belirlenmitir (6, 7). B. licheniformis, B. amyloliquefaciens ve B. stearothermophilus
un gvenilirlii birok almada belirtilmitir (8-10).
Bacillus trlerinin yabani tip strainleri besin kstlanmas durumunda sporulasyona
girerler. B. thuringiensis pestisidal proteinleri gibi baz nemli ticari bileikleri
sporulasyon esnasnda olutururken, gda proseslerinde kullanlan enzimlerin retimi
sporulasyon ile engellenirler (11). Bu sebeple sporulasyon oluturmayan mutantlar
gelitirilip rekombinant enzimler iin konak hcre olarak kullanlmaktadrlar.
Bacillus trlerinin heterolog enzimlerin ve dier proteinlerin retiminde kullanlmasnn
avantajlarndan biri proteinlerin dorudan fermantasyon ortamna verilmesidir (12).
Bacillus trleri tarafndan retilen ekstraseller proteazlarn heterolog proteinleri
paralamas ise rekombinant enzim retiminde nemli bir probleme yol amaktadr.
Ekstraseller proteazlarla enzim ykmn engellemek ve enzim verimliliini arttrmak
iin enzim reticileri proteaz retmeyen mutant strainler gelitirmilerdir.

E. coli K12
1990 ylnda FDA E. coli K-12 tarafndan retilen kimosin enzimini GRAS olarak
onaylamtr. E. coli K-12, uzun yllardr laboratuarda kullanlmaktadr. Bu
mikroorganizma sindirildiinde toksin retmemektedir. E. coli K12 almas olduka
maliyetli bir bakteridir. 1997de genom sekans belirlenmitir. E. coli K-12
kimyasallarn ve insanlarda kullanlan ilalarn retiminde gvenilir bir ekilde
kullanlmaktadr (21 CFR 184. 1685; 13; 14).
Pseudomonas fluorescens
Gram negatif toprak bakterisidir ve insanlarda hastalk yapmamaktadr. Yabani tip
strain MB101, Kaliforniyada marullardan izole edilmitir ve -amilaz retiminde
konak organizma olarak kullanlmaktadr. Bu strain 1989dan beri tarmsal
uygulamalarda kullanlan B. thuringiensis insektisidal proteininin retimi iin
kullanlmaktadr (15).
Aspergillus oryzae ve A. niger
Her iki organizma da ekmek retim, mayalama ve dier gda uygulamalar iin
kullanlan enzimlerin kaynadr. Her iki tr de patojenik veya toksijenik deildir. Baz
strainleri, mikotoksinler gibi toksik sekonder metobolitleri dk miktarda da olsa
retmektedirler. Fermantasyon koullar deitirilerek bu trlerin mikotoksin retimi
engellenebilecei bildirilmitir (14).
Dier fungal trler
Fusarium venetatum, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Trichoderma reesei de
rekombinant enzim retiminde kullanlan gvenilir konak mikroorganizmalardr (16,
17, 18)

Rekombinant strainlerin gelitirilmesi ve klonlarn seimi

Rekombinant enzimleri kodlayan genler, ekspresyon vektrleri kullanlarak konak
strainlere aktarlrlar. Ekspresyon vektr ekspresyon kaseti ieren DNA plazmitidir.
Ekspresyon kasetinde temel olarak bulunan bileenler promotor, enzimi kodlayan
gen blgesi ve terminatrdr.
/////////////////
//

I----------------ekil 1: Ekspresyon kaseti

Promotor Gen Terminatr

Promotor ve terminatr enzim-kodlayan genlerin transkripsiyonunu kontrol eden
reglatr sekanslardr.
En yaygn olarak kullanlan plazmitler pUB110, pUC18 ve pUC19dur. pUB110
plazmiti S. aureustan izole edilmitir (19) ve sekans belirlenmitir (20-21). pUC18 ve
pUC19 plazmitleri E. coli de klonlama ilemleri iin gelitirilmilerdir (22). pUB110
plazmiti, neo ve nptII geni olarak da bilinen kanr (kanamisin veya neomisin diren)
3

geni ve ph1 (phleomisin diren) geni tar (23). Bu plazmitin kullanm sonucunda
elde edilen rekombinant mikroorganizmann seimi de bu direnlilik genleri
kullanlarak yaplr. pUC18 ve pUC19 plazmitleri E. colide aktif olan bir replikasyon
orjini ve ampisilin direnlilik (ampr) geni ierirler. pUC18 ve pUC19 plazmitleri belirli
bakteriyel ve fungal ekspresyon vektrlerinin E. colide oluturulmas iin kullanlrlar
ve seici markerlar ampr genidir.
Rekombinant enzim retiminde ekspresyon vektrlerinin oluturulmasnda kullanlan
birok bakteriyel plazmit bulunmaktadr. Baz durumlarda, iki veya daha fazla
plazmitten trevlenen fragmentler birletirilmitir. Ekspresyon vektrlerinin ou kendi
seilebilir markerlarn ierirler. Yine de baz durumlarda, iki ayr vektr oluturulur;
biri ekspresyon kasetini tarken, dieri seilebilir marker tar. Byle bir durumda
konak strain her iki vektrle birlikte transforme edilir (3).
Bakteriyel ekspresyon vektrleri ya konak kromozomuna entegre olurlar ya da
ekstrakromozomal replikasyonla (otonom) oalrlar. Otonom olarak replike olan
bakteriyel ekspresyon vektrleri konak bakteri ile uygun replikasyon orijini ierirler ve
hedef enzimi yksek oranda retebilirler. Mayalarda ve filamentz funguslarda enzim
retimi iin kullanlan ekspresyon vektrleri genellikle konak genomuna entegre
olacak ekilde dizayn edilirler (3).

ENZM RETM
Enzim retimi biyoteknolojinin byyen bir alandr. Dnyada yaplan patent
bavurular ve bu konunun aratrlmas ile ilgili yaynlar yldan yla artmaktadr.
Enzim reticilerinin ou farkl fermantasyon teknikleri ile retimlerini
gerekletirmektedirler (24).
Mikrobiyel enzimler, doal ya da rekombinant olsalar da kontrol altnda tutulan
koullardaki fermantasyon ilemi ile retilirler. Enzim retimini en st seviyeye
karmak iin, scaklk, pH, havalandrma gibi parametreler kontrol altnda tutulurken,
fermantasyon ortamnn ieriindeki bileenler de ok iyi seilmi olmaldr. Dekstroz,
niasta, yeast ekstrakt, amonyum, re ve mineraller bir fermantasyon ortamnda en
sk kullanlan bileenlerdir. Kpk krc ajanlar, pH dzenleyiciler de bir
fermantasyon ortamnda bulunurlar. Tm bu bileenler enzim retimini olumlu ya da
olumsuz ynde etkilemektedir (3).
Natarajan ve Rajendrann 2009da yaptklar almada fermantasyon koullarnn
Lactobacillus plantarumdan tannaz retimi zerine etkisini aratrmtrlar ve kltrn
kompozisyonu, substrat konsantrasyonu ve kltr koullarnn (pH, scaklk,
havalandrma vs.) enzim retimini etkilediini belirtmilerdir (25). Yine Sanchez ve
ark. 1999da Candida rugosadan lipaz retimi zerine fermantasyon koullarnn
etkisini aratrmlar ve farkl koullar altnda enzimin farkl aktivitelere sahip
olduunu belirtmilerdir (26).
Gnmzde retilen rekombinant enzimlerin ou ekstrasellerdir ve fermantasyon
ortamna braklrlar. Enzim, hcresel ktleden ayrlr, zdrlr ve konsantre hale
getirilir. Son rn, organizmann rettii metabolitleri veya fermantasyon veya

proseste kullanlan bileenleri de ierebilir (3). Bu sebeple retimin ardndan

enzimlerin ierii test edilmektedir (27).

SONU
Doada bulunan enzimler gdalarn ilenmesinde yzyllardr kullanlmaktadr. Gda
endstrisinin geliimi ile birlikte ksa srede, yksek verimlilikte, maliyeti dk ve
stabilitesi yksek enzim eldesi nem kazanmtr. Rekombinant DNA teknolojisindeki
gelimelerle birlikte rekombinant organizmalardan enzim elde etme zerine yaplan
almalar artm ve hala artmaktadr. Enzimleri kodlayan genlerin klonlanmas ve
yksek hacimde endstriyel fermantasyon ortamlarna kolaylkla uyum salayan
konak mikroorganizmalarda bu enzimlerin ifade edilmesi sonucunda yksek miktarda
enzim elde edilebilmektedir. Ayn zamanda gdalarn ilem grd scaklk ve pH
koullarna da uygun enzim eldesi salanmtr.
Rekombinant enzim retiminin kilit noktas kullanlan konak hcrenin toksijenik ve
patojenik potansiyelidir. nk bu enzimler gdalarn ilenmesinde kullanlaca iin,
insan salna olumsuz ynde etki etmemesi gerekmektedir. Bu tr bir
olumsuzluun nne gemek iin ya eitli mutasyon yntemleri ile organizmann
patojeniteden sorumlu genleri tahrip edilmi, ya da fermantasyon koullar optimize
edilerek mikroorganizmann toksinler gibi sekonder metabolitleri retmesi
engellenmitir.
Bunun dnda mikrobiyel konak strainleri enzim retimini arttrabilmek iin genetik
olarak modifiye edilebilmektedir. rnein bakteriyel ve fungal trlerin birou hedef
enzime zarar verebilen ekstraseller proteaz retmektedir. Klasik mutagenezle bu
organizmalardan proteaz retmeyen mutantlar elde edilebilmektedir.
Gda teknolojisindeki gelimeler daha etkili ve gvenilir enzim retimine olan ilgiliyi
arttrmakta, istenen zellikleri tayan ifade strainlerinin retilmesiyle ilgili almalar
da tetiklemektedir. Molekler biyoloji, rekombinant DNA teknolojisi ve klonlama ile
ilgili elde edilen bilgilerin artmasyla da hzl, yksek verimde ve endstriyel lekte
enzim retimi salanabilmektedir.
Kaynaklar:
1. Tucker, G. A., Woods L. F. J. (1995). Enzymes in food processing. Blacie
Academic &Professional, Glasgow, U. K.
2. Panesar, P. S., Marwaha, S. S., Chopra, H. K. (2010). Enzymes in food
Processing Fundamentals and Potential Applications. I. K. International Publishing
House Pvt. Ltd. New Delhi, India
3. Olempska-Beer, Z. S. Merker, R. I., Ditto, M. D., DiNovi, M. J. (2006). Foodprocessing enzymes from recombinant microorganisms-a review. Regulatory
Toxicology and Pharmacology 45, 144-158.
4. Hartley, J. L., (2006). Cloning technologies for protein expression and purification,
Current Opinion in Biotechnology,, 17:359-366
5

5. Zeman, N. W., McCrea, J. M. (1985). Alpha-amylase production using a

recombinant DNA organism. Cereal Foods World 30, 777780.
6. Ray, M. W. et al. (2004). Complete genome sequence of the industrial bacterium
Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species. Genome
Biol. 5, R77. 1R77. 12
7. Veith, B. et al. (2004). The complete genome sequence of Bacillus licheniformis
DSM13, an organism with great industrial potential. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7,
204211.
8. de Boer, A. S., Diderichsen, B. (1991). On the safety of Bacillus subtilis and B.
amyloliquefaciens: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol. 36, 14
9. de Boer, A. S., Priest, F., Diderichsen, B. (1994). On the industrial use of Bacillus
licheniformis: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 595598.
10. Pedersen, P. B., Bjrnvad, M. E., Rasmussen, M. D., Petersen, J. N. (2002).
Cytotoxic potential of industrial strains of Bacillus sp. Regul. Toxicol. Pharmacol. 36,
155161
11. Harwood, C. R., (1992). Bacillus subtilis and its relatives: molecular biological and
industrial workhorses. Trends Biotechnol. 10, 247256.
12. Simonen, M., Palva, I. (1993). Protein secretion in Bacillus species. Microbiol.
Rev. 57, 109137
13. Flamm, E. L. (1991). How FDA approved chymosin: a case history.
Bio/Technology 9, 349351.
14. Environmental Protection Agency (EPA), (1997). Biotechnology Program Under
Toxic Substances Control Act (TSCA). 1996 Final Microbial Assessments
(http://www. epa. gov/biotech_rule/rulesupc. htm)
15. Landry, T. D., Chew, L., Davis, J. W., Frawley, N., Foley, H. H., Stelman, S. J.,
Thomas, J., Wolt, J., Hanselman, D. S. (2003). Safety evaluation of an -amylase
enzyme preparation derived from the archaeal order Thermococcales as expressed
in Pseudomonas xuorescens biovar I. Regul. Toxicol. Pharmacol. 37, 149168.
16. Pedersen, P. B., Broadmeadow, A. (2000). Toxicological studies on
Thermomyces lanuginosus xylanase expressed by Fusarium venenatum intended for
use in food. Food Addit. Contam. 17, 739747.
17. van den Berg, J. A., van der Laken, K. J., van Ooyen, A. J. J., Renniers, T. C. H.
M., Rietveld, K., Schaap, A., Brake, A. J., Bishop, R. J., Schultz, K., Moyer, D.,
Richman, M., Shuster, J. R. (1990). Kluyveromyces as a host for heterologous gene
expression: expression and secretion of prochymosin. Bio/Technology 8, 135139.
18. Nevalainen, H., Suominen, P., Taimisto, K. (1994) . On the safety of Trichoderma
reesei. J. Biotechnol. 37, 193200.
19. Keggins, K. M., Lovett, P. S., Duvall, E. J. (1978). Molecular cloning of genetically
active fragments of Bacillus DNA in Bacillus subtilis and properties of the vector
plasmid pUB110. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 14231427.
20. McKenzie, T., Hoshino, T., Tanaka, T., Sueoka, N. (1986). The nucleotide
sequence of pUB110: some salient features in relation to replication and its
regulation. Plasmid 15, 93103.
6

21. McKenzie, T., Hoshino, T., Tanaka, T., Sueoka, N. (1987). A revision of the
nucleotide sequence and functional map of pUB110. Plasmid 17, 8385.
22. Yanish-Perron, C., Vieira, J., Messing, J. (1985). Improved M13 phage cloning
vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors.
Gene 33, 103119.
23. Selinger, L. B., McGregor, N. F., Khachatourians, G. G., Hynes, M. F. (1990).
Mobilization of closely related plasmids pUB110 and pBC16 by Bacillus plasmid
pXO503 requires trans-acting open reading frame. J. Bacteriol. 172, 32903297.
24. Gonzalez- Viniegra, G., Favela-Torres, E., Aguilar, C. N., Romero-Gomez, S. J.,
Diaz-Godinez, G., Augur, C. (2003). Advantages of fungal enzyme production in solid
state over liquid fermentation systems. Bochemical Engineering Journal 13; 157-167
25. Natarajan, K., Rajendran, A. (2009). Effect of Fermentation Parameters on Extra
Cellular Tannase Production by Lactobacillus plantarum MTCC 1407. E-Journal of
Chemistry 6(4); 979-984.
26. Sanchez, A., De la Casa, R. M., Sinisterra, J. V., Valero, F., Sanchez-Montero, J.
M. (1999). Effect of Fermentation Conditions in the Enzymatic Activity and
Stereoselectivity of Crude Lipase from Candida rugosa. Applied Biochemistry and
Biotechnology 80;65-75
27. Pariza, M. W., Johnson, E. A., 2001. Evaluating the safety of microbial enzyme
preparations used in food processing: update for a new century. Regul. Toxicol.
Pharmacol. 33, 173186
28. Andersen, J. R., Diderichsen, B. K., Hjortkjaer, R. K., de Boer, A. S., Bootman,
J., West, H., Ashby, R. (1987). Determining the safety of maltogenic amylase
produced by rDNA technology. J. Food Prot. 50, 521526.
29. MacKenzie, K. M., Petsel, S. R. W., Weltman, R. H., Zeman, N. W. (1989).
Subchronic toxicity studies in dogs and in utero rats fed diets containing Bacillus
stearothermophilus -amylase from a natural or recombinant DNA host. Food Chem.
Toxicol. 27, 599606.
30. de Boer, A. S., Marshall, R., Broadmeadow, A., Hazelden, K. (1993).
Toxicological evaluation of acetolactate decarboxylase. J. Food Prot. 56, 510517.