Rekombinant DNA Teknolojisi

ve
Analiz Yntemleri
MSc Biol. Asl DAER

Rekombinant DNA teknolojisi,

doada kendiliinden olumas mmkn
olmayan, ounlukla farkl biyolojik
trlerden elde edilen DNA molekllerinin,
genetik mhendislik teknolojisiyle
kesilmesine ve elde edilen farkl DNA
paralarnn birletirilmesi ilemlerini
kapsayan bir teknolojidir.

Rekombinant DNA ise; bu ilem

sonucu retilmi olan yeni DNA
moleklne verilen isimdir ve ksaca
rDNA olarak yazlr.

Rekombinant DNA ise; bu ilem

sonucu retilmi olan yeni DNA
moleklne verilen isimdir ve ksaca
rDNA olarak yazlr.

Bu teknoloji 1973de Boyer ve

Cohen tarafndan gelitirilmitir.

Rekombinant DNAnn Genel

Prensipleri
DNA vektr ad verilen farkl bir
DNAya yerletirilir.
Rekombinant vektr kendini oaltaca
uygun bir konak hcreye aktarlr.
Rekombinant DNA molekl konak
hcre ierisinde oalr.

Rekombinant DNAnn Genel

Prensipleri
DNA vektr ad verilen farkl bir
DNAya yerletirilir.
Rekombinant vektr kendini oaltaca
uygun bir konak hcreye aktarlr.
Rekombinant DNA molekl konak
hcre ierisinde oalr.
Gen klonlanmas=DNA klonlanmas

Gen Klonlama Sreci

Gen zolasyonu
zole edilmi genin vektre (plazmid, viral
DNA, kozmid, vb.) aktarlmas
Rekombinant vektrn konak hcreye
aktarlmas (transformasyon,
transdksiyon, konjugasyon)
Rekombinant genlerin tehis edilmesi ve
izolasyonu
Klonlanan genin ekspresyonu

Restiksiyon Endonkleazlar

DNA molekllerindeki belli nkleotit

dizilerini tanyan ve her iki zinciri birlikte
kesen bir enzim trdr.

Restriksiyon Endonkleaz eitleri

Tip I
Tip II
Tip III

Tip I
Bu enzimler tanma blgelerinden en
azndan 1000 baz ifti uzaklktaki farkl
blgeleri keserler.
Kesim blgeleri spesifik olmad iin,
ou karmak yapda ve gen
maniplasyonunda tercih edilmezler.

Tip II
Bu enzimler DNA'y tanma dizisinin iki
tarafndan kesip karrlar.
Genelde tanma blgeleri palindromiktir
ve 4-8 nkleotit uzunluktadr.

Tip III

Tip III restriksiyon enzimleri (rnein

EcoR15) birbirine dnk olan iki ayr,
palindromik olmayan dizi tanrlar. DNA'y
tanma yerinden 20-30 baz uzakta
keserler.

Restriksiyon enzimleri DNAy iki ekilde

keser:
i. Kt ulu
ii.Yapkan ulu

Kt ulu

Restriksiyon endonkleazlar DNAy her

iki zincirde de ayn noktada keser.

Kt ulu

Restriksiyon endonkleazlar DNAy her

iki zincirde de ayn noktada keser.

Yapkan Ulu

Restriksiyon endonkleazlar blnen DNA

segmentinin iki ucunda, birbirleriyle veya ayn
ulara sahip yabanc gen DNA segmentinin
ularyla birlemeye hazr iki yapkan u meydana
getirir.

Yapkan Ulu

Restriksiyon endonkleazlar blnen DNA

segmentinin iki ucunda, birbirleriyle veya ayn
ulara sahip yabanc gen DNA segmentinin
ularyla birlemeye hazr iki yapkan u meydana
getirir.

Restriksiyon Enzimleri

Vektr

Vektrler, kendilerine taklan DNA

parasn nakleden ve replike eden tayc
DNA moleklleridir.

Balca Vektrler
Plasmidler
Bakteriyofajlar
Cosmidler
Bakteri Yapay Kromozomlar (BAC)
Maya Yapay Kromozomlar (YAC)
Memeli Yapay Kromozomlar (MAC)
nsan Yapay Kromozomlar (HAC)
fade Vektrleri

Plazmid

Plasmid, ou bakteri trnde doal olarak

bulunan, bamsz olarak replike olabilen,
bakterinin kendi kromozomu dndaki ift
zincirli halkasal veya sper sarmall DNA
moleklleridir. pBR322, pUC18, pUC19, vb.

nsan nslinin retimi

Rekombinant DNA Analiz

Yntemleri

PCR (Polymerase Chain Reaction):

PCR, DNA ierisinde yer

alan, dizisi bilinen iki
segment arasndaki zgn
bir blgeyi enzimatik
olarak oaltmak iin
uygulanan tepkimelere
verilen ortak bir isimdir.
Denatrasyon, Balanma
ve Uzama aamalarndan
oluur.

PCR Uygulamalar
RT-PCR: Revers Transkriptaz
yardmyla mRNAnn
DNAya evrimini
salanmas sonrasnda,
PCRla gene zg
amplifikasyon
Anchor-primed PCR: Bir
utan sekansa zg
primerlerle, dier uta ise
rastgele primerlerle
amplifikasyonun salanmas.
rn; RACE-PCRda oligodT primerlerle mRNAnn
poli-A kuyruuna balanr
ve spesifik primerle hedef
gene balanr.

Elektroforez

Restriksiyon Fragment Uzunluk Polimorfizmi

(Restriction Fragment Length Polymorphisms
=RFLP)

RFLP: DNAya dayal ilk

genetik haritalama
tekniidir.

Restriksiyon
endonkleazlar,
restriksiyon blgeleri
olarak bilinen ift zincirli
DNA'nn sadece spesifik
baz dizilerini tanmakta ve
diziyi bu blgelerden
kesmektedir.

Restriksiyon Haritalama

Restriksiyon enzimleri ile kesimi yaplan DNAnn jel

elektroforezi kullanlarak fiziksel bir haritas olutulur.

cDNA Synthesis

Hibridizasyon

Denatre edilmi DNAnn komplementer

sekansn ieren DNA (veya RNA) ile birlemesi
salanarak, iaretlenmi DNA molekl ile
hibridizasyon kontrol edilebilmektedir.

Genel Hibridizasyon Uygulamalar

Southern blot: DNAnn RE ile kesimi salanr
ve elektroforez ile ayrmas gzlenir.
Northern blot: Ekspresyon dzeyinin
belirlenmesinde RNAnn jel elekroforezi
yaplr.
Western blot: Antibodylerle iaretlenmi
proteinlerin elektroforezine dayanr.
in situ hybridization: Dokunun probla
iaretlenmesi
colony hybridization: Kolonilerin tespiti
mikroarray

Gen Ktphanesi

Tek bir genomdan klonlanm DNA

sekanslarnn geni bir koleksiyonudur.
Teknik olarak, bir oganizmada bulunan her
bir genin en az bir kopyasn
bulundurmaldr.

cDNA Ktphaneleri
Belirli bir tre, belirli bir dokuya ya da
hcreye ait tm RNAnn nce ift iplikli
cDNAya evrilmesi ve daha sonra
klonlanarak ktphanesinin
oluturulmasdr.

cDNA Ktphaneleri

Klonlama

Teekkrler