(Mikrobiyo! Built, 26: 177-188, 1992) REKOMBINANT DNA TEKNOLOJISi RECOMBINANT DNA TECHNOLOGY Tiilay KOCOGLU’, Tiilay YALCINKAYA® Ozet: Rekombinant DNA teknolojisi, genetik rekombinasyon olaylarmin yapay olarak gereklestirilmesi esasina dayanan ve arzu edilen herhangi bir gen ya da firiiniiniin cogaltsimasim: miimkiin falan bir yontemdir. Cogaltiimas: istenen gen énce orijinal kromozomdan restriksiyon endoniikleaz enzimi yardimiyla kesilerek almir ve plazmid ya da faj gibi bir vektdre integre edilir. Sonra bu vektor transformasyon yoluyla bir bakter! ya da maya icine sokulur ye daha sonra bu mikroorganizmalarm kiiltiirii yapilarak istenen gen veya protein arzu edilen miktarlarda elde edilir. Summary: Recombinant DNA technology is a method depending on realization of genetic recombination events artificially. It became possible to obtain any ordered gene or its product with this method. Before production step, ordered gene is derived from original chromosome by endonuclease enzyme and integrated to a vector as a plasmid or a phage. After that this vector is transformed into a bacterium or a yeast. Then ordered gene or protein is produced in desired amounts by culturing these microorganisms. Terminolaji rDNA: Recombinant DNA DNA: Complementer DNA Restriksiyon endoniikleaz enzimi: DNA’y: dzgiil bélgelerden kesen enzim. Bunlar iginde en cok kullamlanlardan biri E. coli’den elde edilen EcoRV dt. Kimerlk plazmid: Yapisina yabanci plazmid sokulmus plazmid, hibrid plazmid. Chimera, mitolojide insan bagli, aslan, geyik ya da yilan viicutlu yaratiklara verilen isimdir. Vektér: 1DNA’nin bir bakteri ya da maya hiicresine (E. coli, B. subtilis, S. cerevisia gibi) sokulmasinda kullanlan plazmid, faj ve baska viruslar, En cok kullanilan vektér pBR322 plazmididir. + Anadolu Universitesi, Tip Fakiiltesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dab, 17MIKROBIYOLOJi BULTENL Gen klonlanmast: (DNA tekuulojisiyle elde edilen bir genin bir konak hiicrede cogaltilmasi. Gen kitapligi veya bankast: Bir organizmin tim genomu birbirinden bagims DNA parcalart halinde konak hiicrelerde klonlanabilir, iste bu Konak hilere Klonlarinin timiine gen kitaphgt adi verilir. Eger -insan kromozontunun tim genleri bir kitaphkta toplanmak istense, bir genin uzunlugu 20 kb kabul edildiginde yaklagtk 700.000 klonluk bir kitaphk olusacagi hesaplanmustir (1-3). REKOMBINANT DNA TEKNOLOJISiNIN GELiSiMINDE BAZI KILOMETRE TASLARI 1967 DNA zincirlerini birbirine baglayan DNA ligaz enzimi izole edildi. 1970 DNA’y: dzgiil bélgelerden kesen ilk restriksiyon endoniikleaz enzimi izole edildi. 1972 DNA ligaz enzimi, restriksiyon endoniikleaz enzimleriyle kesilen DNA parcalarim birlestirmede kullanildi, ilk rDNA molekiilii Stanford Universitesinde iiretildi. 1973 Yabanc: DNA parealart plazmid DNA’s1 igine sokularak “kimerik plazmid” elde edildi. Bunun E. coli icine konuldugunda islevini koruduge gésterildi, Herhangi bir genin bakterilerde klonlanabile- cegi anlagildi. — Rekombinant DNA caligmalarmin potansiyel tehlike tasiyan yeni mikroorganizmalanm ortaya gikmasina yol agabilecegi konusunda kamuoyunda ilk endigeler belirmeye basladh. 1974 Belli konulardaki rDNA denemeleri icin diinya capinda bir mora- toryum (resmi geciktirme) ilan igin cart yaptldi. 1975 _ingiltere’de hiikiimet dzel Jaboratuvarlarda rDNA caligmalarinda 6nlemler konusunda bir rapor hazirladt. — Asilomar’da (California) bir uluslararasi toplant yapularak DNA denemelerini diizenleyen bir tiizigtin kabul edilmesi énerildi, Laboratuvar digmda tireyemeyecek givenli bakteri ve plazmidle- rin gelistirilmesi cagrist yapildi. 1976 A.B.D'de Ulusal Saghk Enstitiisil, rDNA denemelerini birgok kategoride simrlayan ilk tiizigi yaysulad:, Kamuoyunda bu titzii- iin etkili olamayabilecegi konusunda endiseler ortaya cikti. New York Times Magazine’de yaytmlanan bir makalede rDNA arasur- malarina Nobel verilmesinin yasaklanmasi énerisi ortaya atildi. ingiltere’de Genetik Caligmalar Danigma Grubu kuruldu. 178REKOMBINANT DNA TEKNOLOGISi 1977 1978 1979 1980 1981 Hk genetik mihendistigi sirketi “Genenthec” San Fransisco’da keruldu, Kurulus amact, tibbi Snemi olan ilaclarin rDNA teknikleri kullanilarak diretimiydi. ~ Memeli DNA molekiilerini tastyan ilk rDNA iiretildi. - Uzun DNA bdlimlerinin taban dizilerinin siralamgint hick bir sekilde géziimleyecek sistemler gelistirildi. Hamilton O. Smith, Daniel Nathans ve Werner Arber, restriksiyon enzimlerinin kesfi ve kullanim konusundaki bagarlarindan dolayi Nobel ile ddiillendirildiler. ~ Somatostatin rDNA. teknolojisi ile dretilen ilk insan hormonu oldu. Ulusal Saghk Enstitiisti tizigiindeki genel bir yumusama rDNA caligmalarinda viral DNAlarin da kullanimma yo! acts. ~ Malign hiicrelerden elde edilen DNA, bir fare hiiere kiiltirii sugunu transforme etmek igin kullantldt; bdylece malign hiicreler- deki onkogenleri inceleme olanagi doguyordu. Diamond V. Chakrabarty - A.B,D, Anayasa Mahkemesi, mevcut yasalar cercevesinde rDNA teknolojisinde kullanilacak mikroorga- nizmalara patent verilebilecegini kararlastirdt. Cohen/Boyer, rDNA yapiminda kullanacaklari teknoloji icin patent aldilar. ~ tDNA kullanarak insiilin Gretimini amaclayan bir endiistri kurma galigmalan baslads, ~ lik rDNA molekiikiniin iiretiimesi ve DNA taban dizilerinin incelenmesinde giigli tekniklerin gelistirilmesi nedeniyle kimya dalinda gift Nobel verildi (Paul Berg, Walter Gilbert, Frederick Sanger). ilk otomatik gen sentezleyicisi pazarland.. — Yil sonunda 80’den fazla yeni biyoteknoloji firmast kuruldu (Cetus, Genex, Ely Lilly, Biogen ve digerleri). ~ lik rDNA sirketi olan Genentech piyasaya hisse senetleri siird’. Senetler 20 dakika iginde 35 dolatdan 89 dulara firlayan deger artigina ugradi ki bu bir Wall Street rekoru idi -1DNA molekilllerinin klonlanmasmda E, coli ve mayalarn faboratuvar suslarinin kullanuma Ulusal Saghk Enstitiisimiin tivzii- giinden muaf kilindi, ~ Orak hiicreli anemi, DNA’mn restriksiyon enzimleriyle analizleri yapilmak suretiyle dogum 6ncesi tam konulabilen ilk genetik hastalik oldu. 179MiKROBIYOLOI BULTENi 1982 Ulusal Saghk Enslilitsinin tiziigiinds daha ileri bir yumusama oldu. Bu mutlak bir yetersizlikten cok génulli bir yumugama idi, — Normalin iki katt agirlikta siiper fareler iiretildi, Déllenmig fare ‘ovumlarina siganiari kiontanmas bityiime hormonu geni, indiikle- nebilir bir fare genine baglanarak enjekte edildi. Sonra bu ovumlar bagka farelere (kirahk anne) reimplante edildi. — rDNA ile dretilmis olan insan insitininin Kullanim A.B.D. ve ingiltere’de kabul edilerek “Humulin” adiyla pazarlandi. = ilk rDNA hayvan asisinin (collbacillosis) Avrupa’da kullanimt kabul editdi = Hicrelerine yabancr gen katilmis tiittin bitkisinde yabanet genin, Mendel yasalarina uygun sekilde poten ve yumurtalara gecis gésterdigi bulundu. ~ Insan mesane kanser hlicrelerinden bir kanser geni izole edildi ve E. coli’de klonlandi, Bu kanser geninin taban dizi kargthgindan bir aminoasitte depisikligie yol agacak kadar farkhlk gosterdigi bulundu. 1985 rDNA ile dretilmis insan growth hormonu lisans aldi. 1986 rDNA ile iiretilmig alfa interferon ve Hepatit B asisi lisans aldi (1-4). Rekombinasyon (yenibilesim), farklt iki atasal bireyden gelen DNA segmentlerinden bir yenibilesen (rekombinant) kromozom olugmast islemi olarak tammlanabilir. Bu iglem sonunda her iki atasal kromozom iizerinde yerlesmig bulunan genlerin yeni bir yapt iizerinde bir araya gelmeleri ve yeni baz: dzelliklere sahip olan bireylerin olugmasi sézkonusudur. Bu olay dogal olarak Okaryot ve prokaryotlarda zaman zaman olagelmektedir (3). Rekombinant DNA teknolojisi, genetik rekombinasyon olaylarmin, yapay olarak gerceklestirilmesi esasina dayanan ve bugiin dev adimlarla ilerlemekte olan bir gen mithendisligi Konusudur. Bu teknoloji ile gesithi amaclar igin adeta ismarlama genler ve proteinlerin idretimi mimkiin olmaktadir. Bu ig igin istenen gen orijinal kromozomundan restriksiyon endoniikleaz enzimleriyle kesilip almmakta ve sonra bir vektére takihp konak hiicre igine sokularak cogaltilmaktadir. Yerine gore ya dogrudan cogaltsimig olan bu genler kullanilmakta ya da bunlarin ekspresyonu ile elde edilen proteinler kullanilmaktadir. Bu teknolojide izlenen deney basamakla- ni su sekildedir (1, 2, 5): 180REKOMBINANT DNA TEKNOLGIHSi 1. Cogalutmasi istenen Genin Elde Edilmesi Bu amagla birkag yéntem kullanulabilir. A) Istenen genin yer aldigi kromozom uygun bir restriksiyon endontik- leaz enzimiyle parcalamr ve ileride anlatilacagy bigimde ilgilenilen gen segilir. Cesiti mikroorganizmalardan cok sayt ve ézgilliikte endonikleaz enzimi elde edilmistir (300'den fazla), Endoniikleaz enzimleri DNA’y1, 6-8 taban ciftinden olusan ve “palindrom” adi verilen Gzgiil bdigelerden keser Palindrom, DNA ipliginin 3° ucundan itibaren okundugunda aynt niikleotid- lerin yer aldigi DNA dizileridir. Agagida EcoRI'in palindromu ve kesi yerleri gésterilmektedir. xGlA ATT ce onaiklearin k - CTT A Al GY endoniikleazin kesi yeri Endoniikleaz enzimleri DNA iizerinde iki tiirli kesi yaparlar. Birincisi rDNA teknolojisinde en elverisli olan, yapigkan uclar olusturacak gekilde olan kesilerdir. Bu uglar DNA ligaz enzimiyle kolayca birbirine eklenir. ikincisi palindromlarin tam ortasindan yapilan ve kér ya da kiint uclar olusturan kesilerdir. Bu gekilde elde edilen DNA pargalarinin birbirine eklenmesi daha dogrusu vektére eklenmesi igin énce baz islemlerle yapiskan uclarin olusturulmasi gerekir. Asagida yaprskan ve kiint uclar gésterilmistir. SG{A ATT CS 3G A AT T CS sc T T A AlG3 SC T TIA A G3? 3-G- SGA A TT cs SC TTAA sc TT. + AA GS ve AATT CS 63 yapiskan_ uclar kiint uglar Aym testriksiyon endoniikieaz enzimiyle kesilmig olan fark kékenli DNA pargalari DNA ligaz ile birbirine kolayca eklenir. Endoniikleaz enzimleri, kendi konak hicre palindromlarint kesmezier; korunma bu bélgelerin metilasyonu ile saglanr. B) istenen genler o1 kasyonla elde edilebilir. al kromozomdan mekanik yolla érnegin soni- 181MIKROBIYOLOI! BULTENi C) Sentetik olarak elde edilebilir. Bir genin kodlamig oldugu proteinin aminoasit dizisi biliniyorsa o proteinin geni bugiin gelistirilmis olan otomatik gen sentezleyicilerde sentezlenebilir. Ancak dejenere kodonlar nedeniyle olabilecek degisiklikler dikkate alinmaltdir. D) Istenen gene ait mRNA‘dan revers transkriptaz enzimi yardimiyla cDNA (komplementer DNA) elde edilebilir. Copaltiimas: istenen gene ait mRNA‘nmn bol bulundugu hiicrelerden mRNA elde edilip bu is gerceklestiri- lir, Onegin, hemoglobin geni igin eritrositlerden elde edilen mRNA kullambr. Canké bu hiicredeki mRNA’nm % 90’: hemoglobine aittir. 2. Elde Editen Genin Bir Vektérle Birlestirilmesi Bu igigin daha dnce de belirttigimiz gibi plazmid ya da viruslar kullanthr. Vektér olacak plazmidin bakteriden soyutlanabilmesi igin hiicreler sodyum dodesil siilfat ya da bir bagka deterjania muamele edilir ve patlatilir. Bazt bakterilerde plazmid replikasyonu sayisvkromozom replikasyonu orant Pe esittir. Bazilarinda ise bu oran cok yiksektir. Bakteri hiiereleri kloramfeni- kol ile muamele edilirse kromozom replikasyonu selektif olarak durur ve cok sayida plazmid elde edilebilir. Vektér olarak kullamlacak plazmidin onun daha sonra tammmasim sajlayacak bir isaretleyiciye (marker) sahip olnasi istenir. Bunun icin R plazmidlerj kullamlr. Bugiin en cok kullanilan plazmid olan pBR322, E. coli’ye ait olan bir R plazmididir. Bu plazmid ampisilin ve tetrasikline direng genlerini tasir. Plazmide eklenecek olan gen ve plazmid ayn restriksiyon endoniikleaz enzimiyle kesitip DNA ligaz ile birbirine eklenir (Sekil 1). Vektér olarak kullanian viruslara lambda fajint érnek olarak verebiliri Burada klonlanacak yabanci DNA’ya yer agmak igin énce delesyon yapihr. 3. Vektériin Konak Hiicreye Sokulmas: ve Klonlanmas: Kimerik plazmidin konak hiicreye sokulmast transformasyon yoluyla olmaktadir. Ornegin, Konak hiicre olarak E. coli kullanilacaksa bakteriler dnce CaCl, ile muamele edilip permeabl hale getirilir, sonra plazmidle kangtirilir, Hiicreler 37°C'de 5? tututarak vektor plazmidi inkorpo birakihr. Bundan sonra buyyona aktartlan hicreler kisa bir sir kazannus olduklart kimetik plazmidin kodladigi drinleri ekspresyona hazir hale gelirler. Hibrid plazmidleri tasryan bakteriler 6zel tarama yéntemleriyle segilirler (Sekil 1). Vektor olarak eger faj kullamlyorsa bunlarin hiccreye sokulmalart transdiiksiyon ve transformasyon olaylarinin bir karigim: olan transfeksiyon yoluyla olur. 182REKOMBINANT DNA TEKNOLOGISI 0 %\ idontanmak | istenen gen { plazmid veltOr ile \ birlestirlir & direne geni 4 Garten Kimerik plazmid Q e7., konak bakteri hiteresine sokulup cogattshr transforme olmus hiicre onceden duyarlt oldugu andbiyougin kondugu besiyerinde Gremesiyle aymdedilir ve gogaltuhr Sekit 1 Klonlanmak istenen genin plazmid vektire integre edilmesi ve konak hiicrede cojaltulmas: (1 no’lu kaynaktan atmmustr). 4. Klonlanmg Oian Genin istenen Gen Olup Olmadigimn Aragtrtlmast Bu teknolojideki son agama istenen genin ya da diger deyisle Klonlanms olan genin gereekten o gen olup olmadigimn belirlenmesidir. Bunun igin birgok tarama yéntemi gelistiriimistir, Bunlar: A) Hibridizasyon: ‘Transforme edilmig bakteriler petride tek koloni olusturacak sekilde retilir. Sonra koloniler bir nitroselliiloz filtreye transfer edilir, lizise ugratibr, aciga gtkan gift iplikli DNA 151 ile (80-100°C) denatiire edilmek suretiyle tek iplikli hale getirilir. Daha sonra bunun iizerine elde etmeyi iimit ettigimiz gene komplementer, radyoizotop (genellikle P*) ile isaretli, piirifiye ve tek iplik haline getirilmig olan probe DNA (kalip DNA) eklenir. Bu DNA\lar karigimt renatiirasyon kogullart saglanarak hibridizas- yona birakilir. Bundan sonra filtreler otoradyografik yontemle incelenerek 183MIKROBIYOLOH BULTENi hibridizasyon olup olmadif belirlenir. Eger hibridizasyon olmugsa_yani istenilen genin klontanmast basarilmgsa transformant bakterilerden olugan kolonilerin filtreye degdirildikleri yerlerde siyah Jekeler olugur. Diger bir deyisle otoradyografi sonunda filtre iizerinde siyah lekelerin olugtugu kisimiara kargtltk geten kolonilerdeki bakterilerde transformasyon bagarih ‘olmus ve bunlar biinyelerine vektér plazmidi almislardir. Artik bundan sonra ig bu transforme olmus bakterilerin istenildigi kadar cogaltilmasina gelmistir. Konak hitorede cofaltilan vektér plazmidlerden daha sonra Klonlanmis olan gen tekrar aynt restriksiyon endoniikleaz enzimleriyle kopariir ve kullanima hazit hale getirilir. Ya da genin iiriinit kiitiir ve piirifikasyon islemleriyle elde edilir (Sekil 2). transformasyona ugratilimss (LIZ Dniereler plakta tek koloni CD olusturacak sekilde irctilirler P* igeretli CDNA (prob) eklenir nitroselliloz filtreye bakteriler lizise otoradyografik aktariirlar ugratihp DNA'lan degerlendirme denatiire edilir Sckil 2 Klonlanoag olan genin istenen gen olup olmadigimn arasterdimast (1 no’lu Kaynaktan alnmestit). B) Antibiyotik direng genlerinin arastiriimast: Bu yolla secim yapilacak- sa kullanilacak Konak hiicrenin, vektor plazmidin tasidigi direng geninden yoksun olmasi gerekir. Eger transformasyon gergeklesmisse bakteriler daha énceden duyarl olduklan antibiyotigi igeren besiyerlerine ekil lerinde burada treyebileceklerdir. Direngli koloniler aranan kolonilerdir. ©) imminolojik yontemler: istenen protein iirinlerin sentezlendigi dolayisiyla istenen genle transforme olmug hiicrelerin segiminde kullamltr. Burada istenen genin kodladsgt protein iirtine kargt hazirlanmug ve radyoizo- topla isaretlenmig antikorlar kullanthr. Yukaridaki érneklerde oldugu sekilde transforme olmus kolonilcrin oldugu yerlerde otoradyografik yén- temle siyah bélgeler gériiliir. D) Restriksiyon endoniikleaz analizleri: Burada klonlanmis ofan DNA. molekiilleri restriksiyon endonikleazlan ile kesilip elektroforetik olarak bir agarozda ayristinhr. Sonra istenen DNA molekitli ile bityakluk bakimmdan kargilagtinlir. 184REKOMBINANT DNA TEKNOLOHSI REKOMBINANT DNA TEKNOLOJISININ UYGULAMA ALANLARI 1, Endiistriyel Amach Kullanum Diger yéntemlerle elde edilmesi zor ya da pahah olan cesitli tubbi tiriinlerin sentezi amaciyla bu teknoloji kullamimaktadir. Somatostatin (insan bilyiime hormonu inhibitérd), buyiime hormonu, insilin, faktor VIIL ve IX, interferon, hepatit B asist gibi diriinler bu teknolojinin yaratugr harikalardir, E. coli’nin bir litrelik besiyerindeki kiiltiiriinden miligram diizeyinde insiilin elde edilebilmektedir (5), Okaryot genlerinin klonlanmasinda bazi giiclilkler olmaktadic, Bunlar- dan biri de prokaryot kromozomlarinda bulunmayan, genler igine yerlesmis, protein sentezine gitmeyen anlamsiz taban dizileridir. Bunlara “intron” adi verilir. mRNA, DNA‘nun kopyasint qikarirken bu bélgeleri de transkripte eder. Sonra, daha cekirdek igindeyken RNA processing denen bir iglemle bu kisimlar RNA’nin biinyesinden cikanhir. Prokaryotlarda béyle bir mekaniz- ma bulunmadigt igin intron bulunduran genlerin klonianmast sonucu istenen lirdnlerin elde edilmesinde giiclitkler ortaya cikmaktadir. Her dkaryot geninde intron bulunmamakla birlikte birgogunda vardir ve degigen saytlar- dadir. Ornejfin, insan alfa ve beta interferonunda hig intron buiunmazken gama interferonda tig intron bulunmaktadir. Buradaki giicliikler, proces gecirmig yani intronlarindan arinmig Okaryot mRNA’sim sitoplazmadan elde edip revers transkriptaz enzimiyle cDNA elde edilerek asilmistir (1, 2). 2. Genetik Hastahkiarm Tamsmda Kullanmi Hibridizasyon, restriksiyon analizi ve bunlann bir karigimt olan Sout- hern blot gibi teknikler kullamimak suretiyle cesitli genetik hastaliklar tanmlanabilmektedir (talasemi, orak hilcreli anemi, fenilketontiri vd.). Genetik hastaliklarda prenatal tam ya da tasiyictlifin belirlenmesi cok Snemlidir ve bu teknoloji bu konularda bityiik kolaybklar getirmistir. Ayrica gen tedavisi (cksik olan genin yerine konmasi) ile ilyili umutlan artirmistir (1, 5). 3. Mikrobiyolojide Tam: Yéntemi Olarak Kullanum A) Hibridizasyon Tcknigi: Bu teknikle hastalardan aliman klinik ornek- lerde herhangi bir mikroorganizmanin vathgi arastrilabildigi gibi ayrica bu yontemle izole edilmig bir mikroorganizmanm ona dzgii bir gen lokusuna sahip olup olmadigi test edilerek tammlanmas: da miimkindir. Bundan baska cesitli bakteri cinslerinin birbirleriyle akrabahklart da arasturdabilir. Bu teknigi uygulayabilmek icin Snce arasurilacak mikroorganizmalar- dan prob DNAVlar elde edilir. Problar radyoizotop ya da biotin-avidin ile isaretlenir, 185MIKROBIYOLOJ! BULTENI Hastadan ahnan ornek bir solid matrikse, drnegin bir filtreye si Orekte varolabilecegi digiiniilen mikroorganizmin DNA’si, denatirasyon uygulanarak tek iplikli hale getirilir. Sonra aradigimz mikroorganizmanin igaretli ve tek iplikli probu filtre Uizerine eklenir, renatiirasyona (hibridizas- yon) terkedilir. Eger mekte kuskulanlan mikroorganizma varsa ve prob, Smegin radyoizotop ile igaretlenmisse, deney sonunda yapilacak otoradyog- rafide hibridizasyonun oldugu yerlerde filtre iizerinde siyah Iekeler cektir (Sekil 3). _f. materyal filtreye materyaldeki DNA siirditir tek iplikli hale: getiilir x iizerine igaretli fe SEE —— z es prob konur renatirasyona burakilarak + hibridizasyonun otup olmadije arastunler — Sekil 3 Klinik materyailerde DNA hibridizasyona ite etken mikroorganizmann aranmast (6 no’lu kaynaktan almmistie). Eger biotin-avidin igareteme sistemi kullanilyorsa burada testin okun- masinda bazi secenekler kargimiza cikar. Biotin DNA ipligine baglandiginda vuun Szelliklerini bozmaz. Avidin de biotinc kuvvetle baglanan bir madde- dir. Avidin ayrica radyoizotoplara, enzimlere (horse-radish_peroksidaz, alkalen fosfataz gibi), florosein ve ferritin gibi elektron youn igaretleyicilere baglanabilir. Biotin-avidin bajlanmis olan prob DNA yukaridaki isaretleyici- lerden biri ile isaretlenip deneye sokulur. Sonugta hangi isaretleyicisi kullanilmissa ona uygun bir sekilde otoradyografik, kolorimetrik, florosko- pik vb. olarak degerlendirilir. Son zamantarda bu yéntemi esas alan birkac ticari sistem piyasaya siirilmiigtiir. Enzo Pathogem, Enzo Biochem gibi. Bu 186REKOMBINANT DNA TEKNOLOJIsi sistemler IISV 1 ve 2, CMV, EBV, Hepatil B, adenovirus ve Klamidya tirlerinin yol agtigt infeksiyonlarin tantlarinda kullanilmaktadw (6). Hibridizasyon teknipi ayrica klinik Orneklerde rotavirus, papillomavirus, mikoplazma ve mikobakterilerin tanmlanmasinda kullaniimaktadir (7, 8). Ayrica bu teknik, tant giigligii olmamakla birlikte genis kitle taramala- ninda aynt anda birgok Smegin deneye sokulabilmesi bakimindan uygulama alam bulmustur. P. falciparum ve N. gonorrhoeae bu tiir epidemiyolojik caltsmalara konu olmustur, Uretral eksudalarda prob kullanarak gonokokkal kriptik plazmid arastirilms ve bulgularin standart kiiltiir yontemiyle yiiksek oranda paralellik gésteidigi bildirilmistir. Bundan baska ETEC, toksin geni probu Kullanilarak digki Smeklerinde direkt olarak aragtirildyge gibi izole edilen suslarimm identifikasyonunda da bu teknikten yararlanilmistir (7). B) DNA Profillerinin Cikarimast: Son yillara kadar toplumsal ve nozokomiyal epidemilerde sorumlu bakterinin identifikasyonunda, biyokim- yasal incelemeler, serotiplendirme, faj tiplendirmesi, antibiyotik duyarllik profillerinin gikarimast gibi yontemlere basvuruluyordu. rDNA teknikleri, salginlarda jzole edilen susiarin benzerliklerinin arashrilmast ve kaynak taranmasinda restriksiyon analizi adi verilen yeni bir secenek sunmustur. Bu yéntemde, izole edilen. bakteri suslarmin plazmid ya da kromozomal DNA\lan, restriksiyon endoniikleaz enzimleriyle kesilip parcalanmakta ve agarozda clektroforetik olarak ayrisriimaktadir. Suslarm olugturduklar elektroforetik patern (ya da bantlar) cesitli yéntemlerle gériniir hale getirildikten sonra birbirlerine benzerlik yoniinden karglastirilmaktadir. Bu sekilde adeta bakterilerin parmak izleri (fingerprint) almmaktadyy (9). Bu yéntem V. cholera, ETEC, EHEC, S. munchen, S. typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Pseudomonas tiirleri, L. pneumophila gibi bakterilerin neden_oldugu toplumsal ve nozokomiyal salginlarin epide- miyolojik incelemelerinde kullaniimistir (9, 10). KAYNAKLAR Watson JD, Tooze J, Kurtz DT (eds): Recombinant DNA, A Short Course. p. 58-90, 231-247, Scientific American Books, 1983 W.H. Freeman and Company, New York. Smith JE: Aspects of Microbiology 11, Biotechnology Principles. p. 2438, American Society for Microbiology, 1985. ‘Akman M: Bakteri Genetigi. Cumhuriyet Universitest Typ Fakiiltesi Yayuni, No: 8, Sivas. 5. 1-12, 337-371, 1983. |. Hepatit B ile Savasta Yeni Ufuklar, Smith Kline Biologicals, Abfar Ilag Sanayi ve Ticarct AS.. Bilyikdere’ Cad. 205, Levent, Istanbui 187MIKROBIYOLOJ BULTENT 5. Emery ALH, Mueller RK (cds): Ktements of Medical Genetics. p, 33-53, 1988, 7th ed, Churchill Livingstone, Edinburgh, London, Melbourne, New York. 6, Finegold SM, Baron EJ (eds); Bailcy and Scott’s Diagnostic Microbiology. p. 126-140, 1986, The C.V, Mosby Company, St Louis, Toronto, Princeton. 7. Eisenstein BI, Engleberg NC: Apptied molecular genetics: New tools for microbiologist and clinicians. J Infect Dis, 153: 416-29, 1986, 8. Baas JB, Ferer LS, Hopewell PC, Jacobs RF, Snider DE: Diagnostic standards and classification of tuberculosis. Am Rev Respir Dis, 142: 725-735, 1990, 9. Wachsmuth K: Molecular epidemiology of bacterial infections: Examples of methodology and of investigations of outbreaks. Rev Infect Dis,.8: 682-92, 1986. 10, John JF, Twitty JA: Plasmids as epidemiologic markers in nosocomial Gram negative bacilli: Experience at a university and review of the literature. Rev Infect Dis, 8: 693-704, 1986. 188