Aminoacidos y proteinas PROPIEDADES FISICAS Y QUIMICAS Quimica de los aminoacidos Propiedades dcido-bdsicas. Tal como su nombre lo indica, los aminodcidos son compuestos organicos que contienen grupos amino y carboxilo y por lo tanto poseen propiedades dcidas y basicas. Desde el punto de vista quimico, seria posible la existencia de un gran numero de aminoécidos, sin embargo, en la naturaleza se encuentra sélo una veintena de ellos. De los 22 0 mas aminodcidos encontrados en proteinas, casi todos son a-aminodcidos, es decir, que el grupo amino esté presente en el dtomo de carbono- a. NE Un @-aminodacido r--cooH Los aminoacidos poseen propiedades diferentes a los compuestos organicos de bajo peso molecular y semejan més bien sales inorganicas. En general, son facilmente solubles en medio acuoso, :pero solo ligeramente solubles o insolubles en solventes orgénicos. Sus puntos de fusién son muy altos comparados con los compuestos orgénicos de bajo peso molecular y la mayo- rfa tienen un punto de fusién por encima de 200° C. Para explicar estas observaciones se supone que, en solucién neutra, los aminodcidos existen como iones doblemente cargados, conocidos como zwitteriones, y no como moléculas no ionizadas. Los puntos de fusién altos pueden explicarse en términos de la alta energia requerida para romper los enlaces iénicos en la red cristalina. Los com- 112Aminoacidosy proteinas 113 puestos andlogos tales como dcidos sustituidos 0 aminas sustituidas, lo mismo que ésteres de aminodcidos, son no polares y tienen puntos de fusin mucho més bajos. Algunas otras propiedades fisicas confirman también que casi todos los aminodcidos alifaticos existen como zwitteriones. La fuerte R * I . H3N—-CH—-COO Hy n-tH-cooH zwitterion forma no cargada carga positiva en el grupo NH," induce una tendencia a que el grupo COOH pierda un protén, y, por tanto, los aminodcidos son 4cidos fuertes. Por ejem- plo, el pK; de la glicina es mucho més bajo que el del dcido acético, y otros aminodcidos que contienen una cadena lateral alifatica tienen valores de pK semejantes a la glicina. ! : *H3N-CH-COO” — H-CH—COOH H,N-CH-H Glicina Acido acético Metilamina Estado fisico a 25°C Sélido Liquido Gaseoso Punto de fusion 232-236? C 17°C 94°C pK -COOH 24 48 — pK -NH, 97 = 10.7 Algunos aminodcidos contienen grupos ionizables en la cadena lateral R, Jo cual afecta las caracteristicas fisicas bien sea que el aminodcido se encuen- tre libre en solucién 0 combinado con otros en una proteina, En efecto, la car- ga de las proteinas esté determinada en gran parte por los grupos ionizables de las cadenas laterales de los aminodcidos. En la tabla 5.1 se dan los grupos ionizables presentes en la cadena lateral de los aminodcidos, junto con sus valores de pK. Punto isoeléctrico. Los aminodcidos migran en un campo eléctrico y esta propiedad constituye la base de uno de los métodos para su separacidn. La direccién y magnitud de la migracién depende en gran parte de la forma iénica predominante del aminoécido en solucién, la cual a su vez estd determinada por el pH del amortiguador usado para electroforesis. El pH al cual la carga neta es cero y no ocurre migracién en un campo eléctrico se conoce como el punto isoeléctrico. Para los aminodcidos éste es usualmente el mismo que el punto isoiénico, definido como el pH al cual las cargas positivas y negativas son iguales, cuando se considera solamente el equilibrio de grupos cargados con H*. En el caso de las proteinas estos dos114 Bloquimica practica Tabla 5.1 Los valores de pK para grupos ionizables encontrados en la cadena lateral de algunos aminocidos Grupos ionizables Aminoacidos pK B-carboxilo Acido aspartico 3.9 y-carboxilo Acido glutamico 43 COOH == ~—CO0~+H* Imidazol Histidina 6.0 Oo pees 1 NH === N NH+H* 2 NY Sulfidrilo Cisteina 8.3 —CH,SH === —CH,S" + H* Fendlico Tirosina 10.1 OH Lisina 10.5 Guanidino Arginina 12.5 NH, NH} ¢ NH,* == G—=NH oH NH NH puntos no son siempre los mismos, puesto que a los aminodcidos pueden unirse iones diferentes al H*. Para aminodcidos que contienen solamente un grupo COOH y un -NH, como grupos ionizables, el punto isoeléctrico (pl) se encuentra en la mitad de los valores de pK para estos grupos. Asi, pues, para el caso de la alanina: pl= 4(24+9.7) = 6.1 CH CH oH, Formas ionizadas de HOOC-CH-NH3 “00C-GH-NH} “OOC—CH-NH; Ja alanina pH al cual existen Acido Isoeléctrico —_Alealino Carga + 0 Migracién en un campo eléctrico Al cdtodo Ninguna Al 4nodoAminoéeldos y proteinas 115 Cuando se hallan presentes otros grupos cargados, el cdlculo del pI no es tan simple, pero como regla general, el punto isoeléctrico se encuentra en la mitad de los dos valores de pK correspondientes a grupos similares. Actividad éptica. El tomo de carbono es asimétrico para todos los aminod- cidos excepto la glicina, asi que, fuera de ésta, todos los aminodcidos poseen actividad 6ptica. Por semejanza con el Acido glicérico L(—), (compuesto de referencia para la serie de los azicares L), se puede tomar la serina como compuesto de referencia para los aminodcidos. COOH COOH COOH H0-¢-H H,N-C-H H-O-NH, bu, on ba, on bn, 0% dcido glicérico L(—)__serina L(+) serina D (—) Cuando el -CH, OH es reemplazado por otros grupos, surgen dos familias de aminoacidos, las series D y L. Todos los aminodcidos presentes en las protef- nas tienen configuracién L mientras la forma D se encuentra en antib: cos y en la pared celular de algunas bacterias. Para una mejor explicacin de estos términos y mayor informacién sobre isomerfa éptica, puede leerse la introduccién al capitulo 6, Las letras L y D se refieren a la configuracién absoluta con respecto al carbono asimétrico y no a la actividad éptica. La temperatura, la presenciade electrolitos y el pH afectan la rotacién especifica, el signo y la magnitud de la rotacién pueden llegar a invertirse cambiando el pH. Algunos aminodcidos tales como isoleucina, treonina e hidroxilisina contienen un segundo tomo de carbono asimétrico, y presentan mas de dos configuraciones. Reacciones generales de los aminodcidos. Los aminodcidos dan todas las reacciones tipicas de los compuestos que contienen grupos amino y carboxilo, atin bajo condiciones en las que la forma zwitterion esta presente sélo en cantidades pequefias. Composicién de aminodcidos en las protein: Formulas de los aminodcidos. Asi como los monosacéridos son las unidades basicas de los polisacdridos, los aminodcidos son las unidades estructurales de las proteinas, es decir, los ‘ladrillos’ con los que se construye la ‘casa’ proteica. Los polisacdridos usualmente estan hechos de unidades de pocos monosacari- dos, en cambio las proteinas contienen hasta 22 aminodcidos diferentes. Los nombres y abreviaturas de los aminoacidos més cominmente encontradosen las protefnas se dan en la tabla 5.2. La formula basica de todos los «-aminoéci-116. Bloquimica practica dos es la misma y se diferencian Gnicamente por la naturaleza y el tamafiode la cadena lateral R. Enlace peptidico. Los aminoacidos se encuentran unidos en la molécula de proteina por enlaces peptidicos (-CO—-NH—) que se forman por la condensa- cién del «-COOH de un aminodcido con el «-NH) de otro. Cuando varios aminodcidos se unen para dar un polimero de bajo peso molecular éste se conoce como polipéptido, mientras que el término proteina se usa generalmente para polimeros (de aminodcidos) de peso molecular grande(de varios miles o rds). : NH;—CH,—CO{OH H}NH—CH-COOH oe s Glieina Alanina NH, —CH, -CO-NH—CH-COOH H3 Glicilalanina (dipéptido) Los 4tomos -C-N- del enlace peptidico est4n todos en el mismo plano del esqueleto peptidico, en cambio las cadenas laterales de los aminéacidos usualmente se disponen sobre el esqueleto en posicién trans. R, Oy, H Rs OW Ay ety AL th kh, buh hy Esqueleto peptfdico Estructura de las proteinas Estructura primaria, En las proteinas pueden reconocerse varios niveles de organizacién estructural, el primero de ellos es la estructura primaria, que consiste en la secuencia de los aminodcidos en la molécula. Los aminoacidos que conforman una proteina pura pueden determinarse facilmente separan- dolos por cromatografia o electroforesis después de hidrolizar los enlaces peptidicos mediante procesos quimicos o enziméticos. Se puede obtener una vision cualitativa de los aminodcidos presentes por medio dela cromatografia en papel y el andlisis cuantitativo completo puede hacerse mediante la cromatografia de intercambio iénico, procedimiento que se encuentra ahora completamente automatizado. Un problema de mayor complejidad se presenta cuando se quiere saber, ademas de la cantidad relativa de aminodcidos presentes en una proteinaAminodcldos y proteinas 117 Tabla 5.2 Aminoacidos comunmente encontrados en las proteinas. Grupo Nombre Abreviatura R Alifatico Glicina Gk He Alanina Ala CH:— Valina Val CH; \ / CH— CH Leucina Leu CH; N ) OH CH, CH; Isoleucina le CH; N, : CH— CHs Hidroxilico Serina Ser CH,OH Treonina Tre CH; duion : Azufrado Cisteina cst aw Cistina odat Metionina Met Acidico Acido aspartico Asp COOH fH Acido glutamico Glu COOH dn, én 5 ba) Basico Lisina Lis NH, (Gih)s Arginina Ar HN NH. ‘8! 8 Wr 2 { i118 Bloquimica practica Tabla 5.2 (continuacién) Grupo Nombre Abreviatura R Arométicoy __Fenilalanina Fen heterociclico Tirosina ora ‘Triptéfano Trp Histidina His Imino écido Prolina Pro COOH H Hidroxiprolina _Hipro mT) N COOH H compuesta por cientos o miles de residuos de aminoécidos, el orden en el que se encuentran en la molécula. Afortunadamente, en la actualidad dispone- mos de métodos quimicos que hacen posible la identificacién de los grupos li- bres —COOH y —NH; en proteinas y péptidos; y basados en ellos es posible la determinacién secuencial de los aminodcidos de una cadena peptidica. Las proteinas pueden ser parcialmente hidrolizadas por dcidos, pero este tipo de hidrélisis no es especifico; en cambio mediante el uso de enzimas es posible romper los enlaces peptidicos entre residuos de aminéacidos especificos. La hidrélisis produce péptidos que pueden ser separados por cromatografia o electroforesis y cuya secuencia de aminéacidos puede ser investigada, usando los métodos para determinacién de C y N terminales. A continuacién se trata de ordenar cada uno de los péptidos en la molécula. Esto se hace sobreponiendo los aminodcidos obtenidos en los diferentes fragmen- tos a la manera en que se arman las piezas de un rompecabezas, hasta obtener la secuencia total de la molécula.‘Aminodcidos y proteinas 119 Estructura secundaria. Pauling y Corey basados en estudios de rayos X, sugirieron que la cadena peptidica puede existir en la forma de un resorte 0 hélice. Dichos investigadores consideraron un buen nimero de formas helicoidales, pero encontraron que s6lo la forma 0. -hélice lena los requisitos de maxima estabilidad. E] a-hélice tiene 3.6 residuos de aminodcidos por cada vuelta y se levanta a lo largo de un eje central de 0.15 nm por residuo. La forma de la estructura se mantiene por enlaces de hidrégeno intramolecula- res entre el oxigeno del carbonilo y el nitrégeno amido, de dos aminodcidos que se encuentran separados por tres residuos en el esqueleto peptidico. El enlace de hidrégeno es muy débil, pero debido a que un gran ntimero de ellos participan en la formacién del a-hélice, el conjunto contribuye a dar estabilidad a la estructura. Todas las cadenas laterales de aminéacidos pueden acomodarse en un a-hélice debido a que sobresalen hacia afuera del eje, pero los iminodcidos prolina e hidroxiprolina son rigidos y no pueden acomodarse en el a -hélice normal, por tanto cuando ellos se encuentran presentes ocurre un cambio en la direccién de la cadena. La otra forma de estructura secundaria se conoce como hoja plegada B ,en la cual los enlaces de hidrégeno se encuentran entre dos cadenas peptidicas paralelas cuyos 4tomos de N estan orientados en la misma direccién, 0 antipa- ralelas, donde sélo las cadenas alternas estan orientadas en la misma direceién. La forma B se encuentra en proteinas fibrosas tales como la queratina del pelo, mientras que el a-hélice puede estar presente tanto en proteinas fibrosas como globulares del tipo albimina y mioglobina. Estructura terciaria. La estructura terciaria de una proteina es la disposicion en el espacio de las hélices; 0, en otras palabras, la forma tridimensional dela molécula de proteina. Muchas de las moléculas de proteinas se comportan como si fueran bastante compactas y por lo tanto se conocen como proteinas globulares. Otras proteinas son més rigidas y forman hilos largos y se conocen como proteinas fibrosas. La estructura terciaria se mantiene por los enlaces que se muestran en la pagina siguiente. Los enlaces de hidrégeno son débiles pero numerosos y se pueden formar entre el nitrégeno amida y el oxigeno carbonilo del esqueleto peptidico, asi como en grupos presentes en las cadenas laterales, Las cadenas laterales del Acido asprtico, acido glutamico, tirosina, histidina, serina y treonina pueden formar enlaces de hidrégeno. Cuando un aminéacido bésico y uno dcido se encuentran cercanos y cuando ambos estan ionizados, se puede formar un enlace idnico o electrosté- tico. Este enlace es importante en la unién de protefinas bdsicas con otras macrémoléculas Acidas tal como ocurre en la formacién de nucleoproteinas.SA ye Scene see ctece eee 120 Bloquimica practica T 1 N CH, | | CH; H 0 i x ; | s an i q H poe i i : Hf | i ' Ly i ' ! 4 1 | 7 nH \ ° ¢ | coo" Aa fy} | f Enlaces de hidrégeno Enlace Enlace Enlaces hidrofébicos iénico disulfuro Elenlace disulfuro es un enlace covalente y por lo tanto confiere un cierto grado de rigidez a la molécula de proteina. Ain nose ha podido entender completamente la naturaleza de los enlaces hidrofébicos, pero se sabe que ellos se originan debido a la tendencia de las cadenas no polares de los aminoacidos a asociarse entre si. Los grupos hidrofi- licos se asocian con agua y se encuentran en la superficie de la molécula de proteina, mientras que los grupos hidrofébicos se hallan enterrados en el interior de la molécula, La tendencia a los tipos de asociacién descritos determina la forma de la moléculay por tanto, es de primerisima importancia en la formacién de la estructura terciaria. Estructura cuaternaria. Algunas proteinas poseen subunidades de polipépti- dos, que no se hallan ligados por enlaces covalentes y la asociacién de dichas subunidades para formar la molécula completa confiere una estructura cuaternaria a la proteina. Estas subunidades pueden ser idénticas, comoenel caso de las isoenzimas 1 y 5 de la deshidrogenasa léctica, que estan hechas de cuatro subunidades de peso molecular 34 000. La isoenzima 1 esté compuesta de cuatro subunidades ‘H’, mientras que la isoenzima 5 esta formada por cuatro subunidades ‘M’. Los hibridos contienen proporciones variables de subunidades H y M, originando las izoenzimas 2, 3 y 4. Muchas proteinas de peso molecular por encima de 50 000 parecen tener estructura cuaternaria. Aislamiento de proteinas Lo mismo que cuandose trata de muchos otros materiales biolégicos, se deben evitar condiciones extremas cuando se trata de aislar proteinas y se aconseja el uso de métodos fisicos en vez de quimicos para este propésito. En general, se recomienda el uso de concentraciones altas de proteina, baja temperatura y pH alrededor de la neutralidad, pues de lo contrario, la proteina puede desna- turalizarse.Aminoacidos y proteinas 121 Desnaturalizacién. La desnaturalizacién es cualquier proceso por el cual el , ordenamiento espacial de una proteina cambia de la estructura ordenada de la molécula nativa a una configuracién tridimensional més desordenada. Durante la desnaturalizacién se rompen los enlaces de hidrégeno y los hidrofébicos y hay un incremento en la entropfa o grado de desorden de la molécula con pérdida de la actividad biolégica. La desnaturalizacién puede ser reversible; por ejemplo, la quimotripsina pierde su actividad al calentarla pero puede ganarla de nuevo al enfriarla. Sin embargo, en la mayoria de los casos no es posible restituir la proteina a su estado nativo luego de haber sido desnaturalizada. Después de la desnaturalizacién, la proteina se vuelve menos soluble y pierde su actividad biolégica, bien sea las propiedades hormonales, la capaci- dad de actuar como antigeno 0 la actividad enzimatica. La desnaturalizacién puede ocurrir debido a un buen numero de causas, algunas de las cuales se dan'a continuacién. Fisicas. Calor, presién, congelamiento, fuerzas de superficie, rayos X, rayos ultravioleta, ultrasonido. Quimicas. Extremos de pH, solventes orgénicos, amidas y sus derivados. Biolégicas. Enzimas proteoliticas (la desnaturalizacién parece ocurrir antes de la hidrélisis). La propiedad que tienen las proteinas de desnaturalizarse, constituye él fundamento de uno de los métodos para su determinacjén. Las proteinas desnaturalizadas tienden a formar agregados de moléculas y precipitarse; esto se conoce con el nombre de coagulacién. No todas las proteinas son igualmente susceptibles a los agentes desnaturalizantes y esta propiedad puede usarse para remover ciertas proteinas de una mezcla por medio de la coagulacién. Precipitacién por sal. Cuando se afiade sal a una solucién de proteina ocurre un incremento en la solubilidad y esto se conoce con el nombre de solubiliza- cién por salado (salting in). Este incremento inicial en la solubilidad se debe a la estabilizacién de la proteina efectuada por un descenso en el coeficiente de actividad de los grupos ionogénicos. A medida que se aumenta la fuerza iénica, se obtiene un maximo en la solubilidad seguido por un descenso en la misma que se conoce como insolubilizacién por salado (salting out). Durante la insolubilizacién por salado, ocurre probablemente una competencia entre la proteina y la solucién salina por las moléculas de agua disponibles para su solvatacién, y entonces las interacciones proteina-proteina se hacen més importantes. La relacién entre la solubilidad (S) y la fuerza iénica (I) en laregién dela insolubilizacién por salado es: log S = 6—K,I.122 Bloquimica préctica donde £ es el logaritmo de la solubilidad hipotética cuando I = Oy K, es el coeficiente de insolubilizacién. Un pequefio cambio en I puede, por lo tanto, causar un cambio considerable en S. El valor de K, es semejante para la mayoria de las proteinas en una solucién salina dada, mientras que 8 es dependiente de cada protefna en particular. Por lo tanto, las cuatro proteinas de una mezcla, como se indica en la figura 5.1, pueden ser separadas recogien- do los precipitados que se forman en diferentes intervalos de fuerza idnica. En la practica, no ocurre la separacién completa de las proteinas puesto que hay siempre alguna superposici6n de las curvas de solubilidad de las protei- nas en una mezcla. Sin embargo, la precipitacién por sal constituye un méto- do muy valioso cuando se usa conjuntamente con otros métodos. El sulfato de amonio tiene una solubilidad muy alta y es la sal que se usa més frecuentemente para el fraccionamiento de proteinas. Una solucién completamente saturada de sulfato de amonio a temperatura ambiente se prepara afiadiendo 767 g a 11 de agua; esto se conoce como 100% de saturacién (NB no 100 g/100 ml) y los limites de los intervalos de fraccionamiento se expresan en relacién a esta concentracién (por ejemplo: la proteina x se precipita a 40-50% de saturacién). Temperatura. Generalmente, un aumento en la temperatura causa un descenso en la solubilidad; por lo tanto, es importante anotar si el fracciona- miento se hizo a 0° C 0 a temperatura ambiente. El calentamiento cuidadoso puede usarse para desnaturalizar y separar proteinas indeseadas, pero debe hacerse con cuidado. Por ejemplo, la 05 tog S Figura 5.1 Efecto de la fuerza iénica sobre la solubilidad de las proteinasAminodcidos y proteinas 123 ribonucleasa es estable a 90°C, mientras que la mayoria de las otras proteinas se desnaturalizan a esta temperatura. Si se afiade sustrato a una enzima, la proteina puede calentarse hasta 10°C més que en ausencia de élsin llegar ala desnaturalizacién. pH. La solubilidad de una proteina depende del pH y es minima en el punto isoeléctrico. El pH de la solucién debe ser controlado cuidadosamente puesto que una proteina puede hacerse 10 veces mas soluble con un cambio de pH de sélo una unidad por encima o por debajo del punto isoeléctrico. Al igual que con el color, los cambios en el pH pueden usarse para desnaturalizar proteinas indeseadas. Por ejemplo, al ajustar a 3 el pH de un extracto de malta, se destruye la &-amilasa, pero la -amilasa permanece intacta. Solventes organicos. Muchas proteinas se desnaturalizan por los solventes organicos, especialmente cuando se usan a temperatura ambiente. Por estose recomienda que cuando deban usarse en el aislamiento de proteinas, se haga en frfo. El alcohol, la acetona y el metanol son los solventes que se usan mas frecuentemente y su calidad puede ser critica para los resultados obtenidos, que pueden ser totalmente diferentes con reactivos altamente puros o menos purificados (GPR) y (AR). Probablemente los solventes causan precipitacién de proteinas bajando la constante dieléctrica y por lo tanto aumentando las interacciones proteina- proteina. A diferencia de las sales, es menos probable que los solventes organicos remuevan grupos prostéticos y por lo tanto, en ciertos casos, pueden ser més ventajosos para la separacién de proteinas. La precipitacién con solventes orgénicos debe efectuarse preferencial- mente a concentraciones iénicas bajas (I = 0.030 menos) de modo que llegue a ser necesario dializar previamente la muestra, pero debe tenerse en cuenta que las proteinas no precipitan si los electrolitos son removidos completa- mente. Adsorcién, Otro método de separacién de proteinas es la adsorcién en gel, ya que la captacién de las moléculas puede ser altamente especifica. Sin embargo, las condiciones particulares para separaciones determinadas todavia tienen que encontrarse en forma empirica. Los adsorbentes mas comtnmente usados son la aliimina y el fosfato de calcio, con los cuales la preparacién del gel es bastante critica. La adsorcién se efectia usualmenteen solucién Acida y la elucién se hace con un amortiguador ligeramente alcalino. Etapas finales de purificacién. Durante los varios pasos de purificacién con frecuencia se necesita concentrar la solucién. Algunos de los métodos usados para este fin se dieron en el capitulo 3 en la seccién titulada ‘diAlisis’. Luego de que la solucién de proteina se ha reducido a un volumen conve- niente, se pueden usar métodos de cromatografia y electroforesis para proseguir la purificacién (capitulo 3).124 Bloquimica préctica Cristalizacién y almacenamiento. Siempre que sea posible, las proteinas puras deben obtenerse en forma cristalizada, pero es dificil’ dar una orientacién respecto a este proceso pues el manejo de la cristalizacién es mas un arte que una ciencia. Es més facil obtener cristales si en algun estado de la purificacién se usan solventes orgénicos y la cristalizacién se efectéa , afiadiendo lentamente una solucién de sal a una solucién concentrada de proteina hasta que se observe una ligera turbidez. En algunos casos es conveniente dializar la muestra de un dia para otro contra una solucién de sal de concentracién apropiada. Una vez obtenidos los cristales, se buscan las mejores condiciones para almacenar la muestra sin que pierda su actividad biolégica. Como en el caso de la cristalizacién, las mejores condiciones para la conservacién deben encontrarse por el método de ensayo y error. Pruebas de homogeneidad. El que una proteina cristalice no siempre indica pureza, asi que deben hacerse luego ensayos para saber si la muestra es 0 no homogénea. Si se obtienen picos Gnicos en adsorcién, en columnas de intercambio iénico, en filtrado molecular, en electroforesis y ultracentrifuga- cién bajo diferentes condiciones fisicas, entonces hay una gran probabilidad de que la proteina sea pura. Las propiedades farmacoldgicas y la actividad enzimatica de los cristales pueden ser utiles para establecer la homogeneidad de algunas protefnas. Otro criterio de homogeneidad consiste en la presencia de aminodcidos en proporcién de nimeros enteros. FUNCIONES DE LAS PROTEINAS EN LOS ORGANISMOS VIVOS El nombre proteina deriva del griego ‘proteios’ que significa de ‘primera importancia’, nombre plenamente justificado. La funcién principal de las proteinas consiste en actuar como componentes esenciales del material estructural, en contraposicién con los hidratos de carbono y grasas cuyo papel principal es proporcionar energia. Esto no significa que las proteinas sean Compuestos estaticos; por el contrario, ellas estén en continuo intereambioen cuanto a sintesis y degradacién. Aminoacidos . Los aminodcidos encontrados en las proteinas provienen principalmente dela digestion de las proteinas de la dieta. Algunos aminodcidos pueden ser sinteti- zados por los animales y se conocen con el nombre de aminodcidos no esenciales, mientras que los aminodcidos esenciales no pueden ser sintetiza- dos y se deben suministrar en la dieta. Los q-aminodcidos, ademds de participar en la sintesis de las proteinas, lo hacen también en la sintesis de un gran namero de compuestos biolégicos de importancia, algunos de los cuales se dan en la tabla 5.3.Aminoscidos y proteinas 125 Tabla 5.3 Algunos aminodcidos importantes y sus derivados Nombre y formula Funcién y estado natural 8-Alanina COOH H, Gant y-Acido aminoburitico coon (Gib, NH, Asparagina COOH Cun, du,cont, Acido diaminopimélico cooH dunt (ttt)s dunn, 00H 3,4-Dihidroxifenilalanina CH,CH(NH,)COOH ‘OH Histamina Este aminodcido se produce durante la degradacién de pirimidina y forma también parte de la molécula de coenzima A. Se forma en el cerebro por decarboxilacién del 4cido glutémico y puede actuar en dicho tejido como media- dor quimico en la transmisién del impulso nervioso entre algunas neuronas. Se halla presente en diferentes tejidos vegetales, donde actiia como un depésito de nitrégeno para la sintesis de proteinas durante la germinacién. Este aminoacido es un constituyente importante de los mucopéptidos en las paredes de las células bacterianas. Abreviadamente se conoce como DOPA; es un precur- sor del importante pigmento melanina. Este pigmento es responsable por la coloracién del pelo, la piel y los. ojos. La histamina se obtiene por decarboxilacién de la histi- dina: Es un vasodilatador y participa en las reacciones alérgicas y de shock. :126 Bloquimica practica Tabla §.3 (continuacién) Nombre y formula Funcién y estado natural 5-Hidroxitriptamina (serotonina) HO [,CH,NH, Este aminodcido se sintetiza a partir del triptéfano y se encuentra en el cerebro, en el intestino y en las plaque- tas de la sangre. Estimula la contraccién del musculo liso y es un vasoconstrictor potente. El nivel de 5-HT en el cerebro parece afectar el grado de actividad eléctrica. Tiroxina CH,CH(NH,)COOH I 1 Esta hormona se forma a partir de tiroxina en la glén- dula tiroides y ayuda a controlar el metabolismo basal: influye también en el crecimiento y en la diferencia- cién, 1 I Péptidos Eltérmino péptido se usa generalmente para polimeros que contienen hasta 50 residuos de aminodcidos o que poseen un peso molecular por debajo de 5000. Algunas cadenas peptidicas se encuentran ligadas a hidratos de carbono como en el caso de los peptidoglicanes de la pared celular de las bacterias o las glicoprotefnas halladas en las sustancias de los grupos sanguineos. En el pri- mer caso muchos de los aminocidos son de la forma D y no de la configura- cién L encontrada usualmente. Un buen numero de péptidos pueden también encontrarse en estado libre y son probablemente intermediarios en el recambio de proteinas; sin embargo, algunos péptidos se sintetizan para ejercer funciones biologicas especificas (tabla 5.4). Proteinas En los animales superiores es esencial una ingestion adecuada de proteinas, puesto que s6lo las formas simples de vida son capaces de sintetizar su protef- na a partir de otras fuentes de nitrégeno. Las proteinas estan presentes en todos los tejidos del cuerpo y constituyen una gran parte de la estructura celular. Ademés, muchas de ellas tienen funciones fisiolégicas especializadas.Aminoécidos y proteinas 127 Tabla 5.4 Algunos ejemplos de péptidos biolégicos importantes Nombre y formula Glutatién y-glu—cis—gli Gramicidina S L-Pro, D. f L. \ a) en ae L-Leu L-Om Lm L-Jeu L-Yal D-Fen - L-Pro Oxitocina Cis—Tir—lle § is—Aspvti )—Glu(NH) >—Leu—Gli(NH,) Vasopresina Cis—Tir—Fen 4 dis—Asp(NH )—Glu(NH,) o—Arg—Gli (NH) Funcién y estado natural Es un tripéptido con uno de los enlaces peptidicos for- mados a través del carbono Y en vez del carbono a. El glutatién es una coenzima para la glioxilasa, pero su funcién principal es probablemente proteger los grupos tioles de las moléculas y membranas manteniéndolos en la forma reducida. Existe en dos formas: una oxidada y otra reducida. 2G-SH —— G-S-S-G+2H. Este decapéptido es un antibiético obtenido de la bacte- ria Bacillus brevis. El péptido es ciclico y contiene los aminodcidos poco comunes, D-fenilalanina y L-orniti- na. Otro buen nimero de antibidticos son también péptidos. Este péptido es una hormona sintetizada en el lébulo posterior de la pituitaria y produce contraccién uterina y eyeccién de leche en la hembra de los mamifferos. Otra hormona de la pituitaria posterior es la vasopresi- na la cual tiene una estructura semejante ala oxitocina. Produce una elevacién en la presién sanguinea y reten- cién de agua en los rifiones. El ntimero y tipo de las proteinas presentes en la materia viva son muy amplios y s6lo podemos considerar brevemente unos pocos. Membranas. Las membranas de todas las células y organelas contienen proteinas asociadas con lipidos. Las lipoproteinas de la membrana acttian como una barrera de perméabilidad selectiva y participan en el transporte de materiales dentro y fuera de la célula y sus compartimientos.428 Bloquimica practica Muchas enzimas, incluyendo aquellas que participan en la biosintesis de macromoléculas y en la detoxicacién de compuestos extrafios, forman parte de la membrana celular de algunos tejidos. Las proteinas de membrana incluyen también moléculas transportadoras que participan en el transporte a través de la membrana celular. Proteinas plasméticas. El plasma sanguineo contiene una gran cantidad de proteinas, cada una de las cuales tiene una funcién biolégica especializada. La albiimina del plasma, por ejemplo, acttia como una reserva de aminodcidos; es importante para mantener el pH del plasma y la presién osmética, y transporta una gran cantidad de compuestos en la sangre. Las globulinas & y 8 participan en el transporte de los Iipidos y las -globulinas estan relacio- nadas con los anticuerpos. El fibrinégeno es una proteina soluble que se convierte en fibrina insoluble durante la coagulacién sanguinea. Hormonas, Muchas proteinas tienen propiedades hormonales. La insulina, segregada por las células 8 del pancreas, controla el metabolismo de los hidratos de carbono bajando el nivel de azticar en la sangre, mientras que el glucagon de las células a aumenta el azticar sanguineo. La gastrina estimula la secrecién Acida en el estémago y la hormona paratiroidea participa en la regulacién del metabolismo del calcio y del fésforo. : Enzimas. Todas las enzimas son proteinas, y la importancia y amplia distribucin: de estos catalizadores biolégicos son bien conocidas. Su alta especificidad y actividad catalitica con respecto al sustrato se debe a la disposi- cién de los aminodcidos en el espacio. La estructura de un buen numero de enzimas de bajo peso molecular tales como ribonucleasa y lisozima ha sido dilucidada por métodos quimicos y fisicos. También han sido identificados los aminodcidos que participan en la unién con el sustrato. PRUEBAS CUALITATIVAS Propiedades generales de los aminoacidos EXPERIMENTO 5.1 Solubilidad de los aminodcidos Materiales 100 1. Acido clorhidrico (0.1 mol/1). 11 2. Hidréxido de sodio (0.1 mol/l). 11 3. Etanol. 11 4. Cloroformo. 11 5. Aminodcidos (glicina, Acido glutdmico, 50 gde lisina y alanina). cada unoAminoscidos y proteinase | 129 Método Examine la solubilidad de los anteriores. aminodcidos en agua, en Acido diluido, en Alcali diluido, en etanol y en cloroformo. Interprete los resultados. EXPERIMENTO 5.2 Reaccidn de la ninhidrina Fundamento La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno), un agente oxidante poderoso, reacciona con todos los «-aminodcidos a un pH entre 4 y 8 para dar un compuesto de color purpura. Esta reaccion se efectua también con aminas primarias y amoniaco pero sin desprendimiento de CO,. Losminodcidos prolina e hidroxiprolina también reaccionan con la ninhidrina, pero en este caso se obtiene un color amarillo en vez del purpura. La reaccién es muy sensible y es la ideal para la deteccién de aminodcidos en cromatogramas y su” determinacién cuantitativa en fracciones de columnas. co OH NH; \7 we @ © + R+C-COOH Paks hk cO OH Ninhidrina CO. OH \/ Dt ROHO+ 002 + NH cO H Hidrindantina 10 OH HO Ci Me w+ i . ° c\ : J\ co oH HO CO Hidrindantina Ninhidrina CO co.130 Bloquimica préctica Materiales 100 1, Aminodcidos (glicina, tirosina y triptéfano, 1 g/1). 250 ml 2. Ninhidrina (2 g/l. Preparese fresco). 100 ml Método Coloque 1 ml de solucién de aminodcido en un tubo de ensayo y ajuste el pH cerca a la neutralidad; agregue cinco gotas de solucién de ninhidrina y deje hervir por 2 minutos. Determine los limites de sensibilidad de la reaccién haciendo el ensayo en diluciones seriadas de glicina hasta que se obtengan resultados negativos. EXPERIMENTO 5.3 Reaccién xantoproteica Fundamento Los aminodcidos que contienen un nucleo aromatico forman nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con Acido nitrico concentrado. Las sales de estos derivados son de color naranja. Materiales 100 1. Aminodcidos (glicina, tirosina, triptéfano y 100 ml fenilalanina 1 g/1). 2. Fenol (1 g/l). 100 ml 3. Acido nitrico (concentrado). 500 ml 4, Hidréxido de sodio (10 mol/1). 500 ml Método Agregue volimenes iguales de Acido nitrico a aproximadamente 0.5 ml de solucién de aminodcido, deje enfriar y observe el cambio de color. Agregue suficiente NaOH hasta que la solucién sea fuertementealcalina. El cambio de coloracién, de amarillo en solucién dcida a naranja brillante en solucién Alcali, constituye un resultado positivo. Repita la prueba con fenol. La fenilalanina debe dar una reaccién negativa o débilmente positiva. EXPERIMENTO 5.4 Reaccién de Miilon Fundamento Los compuestos que contienen el radical hidroxibenceno reaccionan con el reactivo de Millon formando compuestos rojos. Los unicos aminodcidos fendlicos son la tirosina y sus derivados y solamente ellos dan una reaccién positiva. El reactivo original de Millon consistia en una solucién de nitrato mercirico en acido nitrico 50% v/v, pero actualmente se usan modificaciones menos susceptibles a la interferencia de las sales inorganicas. Materiales 100 1. Aminoécidos (glicina, tirosina y fenilalanina 1 g/1). 200 ml 2. Reactivo de Millon (solucién de sulfato mercurico 200 ml 150 g/l] en acido sulfurico 15% v/v).Aminoécidos y proteinas 131 3. Fenol (1 g/1). 200 ml 4. Nitrito de sodio (10 g/l). 200 ml 5. Bafios de agua hirviendo. 100 Método Al ml de la muestra afiada cinco gotas del reactivo de Millon y calienteen un bafio de agua hirviendo por 10 minutos. Deje enfriar a temperatura ambiente y agregue cinco gotas de solucién de nitrito de sodio, la aparicién de un color rojo ladrillo indica un resultado positivo. EXPERIMENTO 5.5 Reaccién del acido glioxilico para triptéfano —“ Fundamento El grupo indélico del triptéfano reacciona con Acido glioxilico en presencia del cido sulfarico concentrado dando un color purpura. El acido acético glacial que ha sido expuesto a la luz contiene Acido glioxilico. Materiales 100 1. Aminoécidos (glicina, tirosina y triptéfano, 1 g/1). 500 ml. 2. Acido acético glacial que ha sido expuesto a la luz. 11 3. Acido sulftrico (concentrado). oe Método A2ml de la muestra afiada 2 ml de acido acético glacial, luego deje caer lenta- mente 2 ml de dcido sulfarico concentrado por las paredes del tubo hasta que se formen dos capas. Observe el cambio de color en la interfase. Si se forma un anillo violeta en la interfase de los dos Iiquidos, la reaccién se considera positiva. EXPERIMENTO 5.6 Prueba de Pauly Fundamento El dcido sulfanilico diazotizado se une con las aminas, fenoles e imidazoles para dar compuestos azo fuertemente coloreados. Los compuestos de diazonio se forman unicamente en el frio, asi que las soluciones deben enfriarse en hielo antes de la diazotizaci6n. Materiales 100 1. Aminodcidos (glicina, tirosina, histidina y 500 ml triptéfano, 1 g/l). 2. Acido sulfanilico (10 g/l en solucién de acido 500 ml clorhidrico 1 mol/l). 3. Nitrito de sodio (50 g/1). 500 ml 4. Carbonato de sodio (10 g/1). 11132 Bloquimica préctica (i) nx{_\-soun +HNO, + HCL ——> ak.-{~ )-soun +2H,0 Acido sulfanilico Compuestos diazonio i) CH, CH(NH, )COOH CH, CH(NH, )COOH C + at _\-sosn — Ne YC \-s0.8 1H Ht Tirosina Compuesto diazonio Colorante azo + -HCL Método Mezcle 1 ml de Acido sulfanflico con 2 ml de la muestra; enfrie en hielo, agregue 1 ml de solucién de NaNO, y déjela al frio durante 3 minutos. Alcalinice la solucién afiadiendo 2 ml de solucién de Na,CO, y anote los colores que se han formado. EXPERIMENTO 5.7 Reactivo de Ehrlich Fundamento El reactivo de Ehrlich reacciona con un buen numero de compuestos orgénicos tales como indoles, aminas arométicas y compuestos ureicos para dar complejos coloreados. Materiales 100 1. Reactivo de Ehrlich (p-dimetilaminobenzaldehido 11 100 g/1 en acido clorhidrico concentrado). 2. Aminodcidos (glicina, triptéfano e hidroxiprolina 1 g/l). 100 ml 3. Urea (1 g/l). 100 ml Método Agregue 2 ml del reactivo de Ehrlich a 0.5 ml de la muestra y observe los colores. —“EXPERIMENTO 5.8 Prueba de nitroprusiaté Fundamento Los grupos tioles reaccionan con nitroprusiato de sodio (Na,Fe (CN); NO) en presencia de un exceso de amonjaco para dar un color rojo.Aminodcidos y proteinas 133 Materiales 100 1. Aminodcidos azufrados (cisteina, cistina y 500 ml metionina 1 g/l). 2. Nitroprusiato de sodio (20 g/l. Preparese fresco). 500 ml 3. Hidréxido de amonio. 500 ml Método Mezcle 0.5 ml de una solucién fresca de nitroprusiato de sodio con 2 ml de la muestra y afiada 0.5 ml de hidréxido de amonio. Repita la prueba con cistina después de mezclar voliimenes iguales de cistina y NaCN (venenoso, no pipetee) y deje reposar la solucién durante unos pocos minutos. EXPERIMENTO 5.9 Reaccién de Sakaguchi Fundamento El Unico aminodcido que contiene grupos guanidinos es la arginina; ésta reacciona con @ -naftol y un agente oxidante tal como agua de bromo dando un color rojo. HN. NH SF \ Grupo guanidino Arginina dn btta)s H.NH, 00H Materiales 100 1, Aminodcidos (glicina y arginina 1 g/l). 500 ml 2. Guanidinas (glicociamina, metilguanidina y 500 ml creatinina 1 g/l). 3. Urea (1 g/1). 500 ml 4. Hidréxido de sodio (10 mol/l). 11 5. @-naftol (10 g/l en alcohol). 100 ml 6. Agua de bromo. (Afiada unas pocas gotas de bromo a 250 ml 100 ml de agua y agite. H4galo en un extractor de gases). Cuidado: el bromo produce quemaduras fuertes cuando se pone en contacto con la piel. Método Mezcle 1 ml de dlcali fuerte con 3 ml de solucién de aminoécido y agregue dos gotas de a -naftol. Mezcle fuertemente y afiada cuatroo cinco gotas de agua de bromo. Note el color formado.134 Bloquimica practica Examine también una serie de compuestos relacionados para ver qué grupo es el que produce la reacci6n positiva. H,N NH H,N. NH H,N NH H,N NH, \4 \4 \ A \7 f é f j NH NH N(CHs) $ on, GH, bu, 1OOH OOH Glicociamina Metilguanidina Creatina Urea Reacciones generales de las proteinas EXPERIMENTO 5.10 Prueba del Biuret para enlaces peptidicos Fundamento EI sulfato alcalino de cobre reacciona con compuestos que contienen dos 0 mis enlaces peptidicos dando un complejo de coloracién violeta. La intensi- dad del color obtenido es una medida del numero de enlaces peptidicos pre- sentes en la proteina. El] nombre de la prueba se ha tomado del compuesto Biuret que da una reaccién tipicamente positiva. CONH; Biuret “NH ONH, La reaccion no es absolutamente especifica para los enlaces peptidicos, ya que cualquier compuesto que contenga dos grupos carbonilos unidos por un tomo de nitrégeno o de carbono da un resultado positivo. Materiales 100 1, Sulfato de cobre (10 g/l de CuSO, . 5H,0). 250 ml 2. Hidréxido de sodio (10 mol/1). ral 3. Proteinas (5 g/l albimina, caseina, gelatina y peptona: 500 ml la caseina se disuelve en un poco de NaOH diluido y las otras proteinas en solucién salina). 4, Glutatién (5 g/l). 500 ml Método A 2ml de la muestra agregue cinco gotas de sulfato de cobre y luego 2 ml de NaOH; mezcle vigorosamente y observe los colores formados.Aminoécidos y proteinas 135 EXPERIMENTO 5.11 Desnaturalizacién por calor y pH extremos Materiales 100 1. Proteinas, como en el experimento 5.10. 21 2. Acido clorhidrico (1 mol/l). 500 ml 3. Hidréxido de sodio (1 mol/l). 500 ml 4. Acido nitrico (conc.). 21 5, Bafios de agua hirviendo. 50 Método En tres tubos de ensayo coloque 5 ml de cada una de las proteinas y agregue 0.5 ml de HCI, 0.5 ml de NaOH y 0.5 ml de agua. Coloque los tubos en el bafio.de agua hirviendo durante 10 minutos y enfrie a temperatura ambiente. Ajuste los tubos dcidos y alcalinos hasta la neutralidad. Comente sus observaciones. A2ml de la solucién de proteina, agregue lentamente por las paredes del tubo 2 ml de HNO; concentrado hasta que se formen ‘dos capas; luego mezcle cuidadosamente los dos liquidos. Anote sus observaciones. EXPERIMENTO 5.12 Precipitacién por metales pesados Fundamento A pH 7y por encima de él, las protefnas estén usualmente cargadas negativa- mente, asi que la adicién de metales cargados positivamente neutraliza la carga y la proteinase precipita. La precipitacién por metales pesados es, por lo tanto, més efectiva a valores de pH neutros 6 ligeramente alcalinos, pero la solucién no puede ser muy alcalina porque se corre el riesgo de que se precipiten hidréxidos de los metales. El precipitado es frecuentemente soluble en un exceso de iones de metal pesado ya que tal exceso confiere a las particulas cargas positivas estables, Materiales _ 100 1. Proteinas como en el experimento 5.10. 500 ml 2. Metales pesados (sulfato de cobre, acetato de plomo 21 y nitrato merctrico 0.1 mol/1). Método A 2ml dela soluci6n de las proteinas, afiada unas gotas del metal pesado. ;Qué sucede cuando se afiade un exceso del reactivo? EXPERIMENTO 5.13 Precipitacién por reactivos acidicos Fundamento Algunos compuestos acidos poseen una carga negativa grande que neutraliza una proteina cargada positivamente formando una sal insoluble. Losepee eae oY". Te 138 Bioquimica practica reactivos acidos son, por lo tanto, mas efectivos a valores de pH cido en los que las proteinas poseen carga positiva. Mater! 100 1. Proteinas como en el experimento 5.10. 500 ml 2. Reactivos acidicos (Acido sulfosalicilico 20% p/v, Acido 200 ml picrico saturado,,10% p/v, acido ténico y acido tricloro- acético 20% p/v). Método A ‘1-2 ml de la solucién de proteinas afiada cinco gotas del reactivo acidico. Qué sucede cuando se afiade un exceso de reactivo? Agregue lentamente NaOH diluido y observe el resultado a medida que el pH sube. METODOS DE ENSAYO EXPERIMENTO 5.14 Determinacién cuantitativa de los aminodcidos usando la reaccion de la ninhidrina . Fundamento El aspecto quimico de la reaccién de la ninhidrina se ha considerado previamente y la prueba cualitativa puede modificarse para dar un método de ensayo cuantitativo. No todos los aminodcidos dan exactamente la misma intensidad de color y esto debe tenerse en cuenta para los cdlculos. Los iminodcidos prolina e hidroxiprolina dan un color amarillo, asi que ellos se leen a 440 nm. Materiales 100 1. Aminodcidos (Acido aspértico, arginina, leucina y 11 prolina 0.1 mmol/1). 2. Amortiguador de acetato (4 mol/l, pH 5.5). 500 ml 3, Metilcelosolve (etileno glicol monometil éter). 11 4. Etanol (50% v/v). 21 5, Reactivo de ninhidrina. (Disuelva 0.8 g de ninhidrina 121 y 0.12 g de hidrindantina en 30 ml de metilcelosolve, afiada 10 ml de amortiguador de acetato; preparelo fresco y almacénelo en una botella oscura). Método En un tubo de ensayo pipetee 2 ml de la solucién de aminodcidos, afiada 2m1 de reactivo de ninhidrina en solucién 5 y caliente en un bafio de agua hir- viendo por 15 minutos. Deje enfriar a temperatura ambiente, afiada 3 ml de etanol de 50% y lea la extincién a 570 nm (0 440 nm) después de10 minutos. Prepare los blancos apropiados y compare la equivalencia de color de los aminodacidos investigados.