Universidad De Las Amricas

Ingenieria en Biotecnologia
Biotecnologa en Alimentos
Modificacin gentica de Musa paradisiaca, para retardar su tiempo de oxidacin
Nombres: Humberto Serrano, Daniela Gutirrez

1) Introduccin:
El banano pertenece a la familia Musaceae del gnero musa, existen actualmente ms de
700 variedades de las cuales solo 100 son cultivables. Su crecimiento se da en regiones
tropicales y subtropicales. Los pases con mayor exportacin de banano son Colombia,
Costa Rica, Ecuador, Panam Filipinas entre otros. Los pases de latinoamrica producen
una mayor cantidad de bananos que son de exportacin (Snchez, 2004), esto se debe a
que se tiene una gran cantidad de luz en todos los meses del ao, se dan las condiciones
ideales de clima y suelo para la produccin bananera en el pas. El Ecuador al ser un pas
diverso, posee una gran cantidad de especies tropicales gracias a sus suelos y climas en
las diferentes zonas del pas. El banano del Ecuador es conocido a nivel mundial por sabor
y su gran calidad, siendo muy cotizado en mercados de Asia, Europa, y Norteamrica.
Actualmente el Ecuador cuenta con un territorio cultivable extenso superando las 200.000
ha. (Prez. E, et al. 1994). La produccin de banano en el Ecuador se realiza en 20
provincias, en la costa 89%, oriente 1%, Sierra 10%. La mayor produccin en la regin de la
costa (Imagen 1) se dan en las provincias del Guayas y Los Ros (El Agro, 2013), esta
produccin ha llegado generar fuentes de empleo y de ingresos econmicos hacia el
estado, ya que el pas cuenta con el 30% de la oferta mundial. De acuerdo al Magap el 10%
de la superficie agrcola del Ecuador se encuentra con banano, (Grafico 1) aumentando su
crecimiento anual con un 3% (MAGAP, 2013). En el ao 2012 el Ecuador export
2,078,239.38 millones de dlares en divisas y 5,196,065.09 toneladas y la inversin es
aproximadamente unos 4.000 millones de dlares
El pltano o Musa paradisiaca variedad hartn, es un cultivo perenne debido a que la
planta produce retoos, las plantas de pltano siempre mueren luego de cosecha
(Hernndez, 2009). Muchas frutas incluyendo el banano sufren oscurecimiento enzimtico ,
este factor afecta a los productos procesados ya que al cortarlos sufren oscurecimiento
debido a que la ruptura de las clulas. Este cambio de color se debe a la polimerizacin y
oxidacin de los compuestos fenlicos en donde interviene la enzima polifenoloxidasa
(Varoquaux et al, 1994).
El pardeamiento se da debido a que se realiza una oxidacin que es catalizada por
enzimas, que son derivadas del catecol para dar lugar a las o-quinonas. La principal enzima
que interviene en este proceso es la polifenoloxidasa, esta se encuentra dentro de las
oxidoreductasas, esta tambin se conoce como fenolasa, monofenol oxidasa cresolasa o
tirosinasa. Una caracterstica de la PPO, es que contiene un centro activo con dos tomos
de cobre que se unen a histidinas, y alrededor de los tomos de cobre se encuentran los
aminocidos hidrofbicos, con anillos aromticos unidos a sus sustratos.

Las o-quinonas atacan a los componentes celulares que dan lugar a la formacin de
polmeros, estos son los polmeros que son responsables de oscurecer los tejidos sobre
todo en pltanos y papas (Hernndez, 2009). Cuando la clula est intacta las enzimas se
encuentran separadas en compartimentos como las vacuolas y cloroplastos, pero cuando el
fruto envejece o tiene daos infecciosos o fsicos esta reaccin sucede debido a que las
enzimas se unen con sus sustratos (Boyer, 2000). La polifenoloxidasa se encuentra unida a
las membranas subcelulares, en los vegetales la mayora se unen a la membrana de los
tilacoides. La concentraciones de los iones de hidrgeno dan una seal para que las
enzimas se activan, esto se debe a que el pH tiene un efecto en la estructura de los enlaces
polipeptdicos. En muchos alimentos el pH puede tener variaciones de 2.5 a 7, es por esto
que la inhibicin de algunas reacciones y el crecimiento microbiano se puede dar a la
variacin del pH en el fruto (Hernndez, 2009).
El manejo de cosecha y postcosecha del banano consta de una serie de pasos los cuales
incluye el tiempo y la edad de cosecha, donde es importante cosechar en estado premaduracin. El tamao de cosecha de la fruta debe estar entre los 20 cm y un grosor de 5-6
cm. (Rosales, 2004).
El vector binario pBI121 tiene una secuencia de 14758 bp, es muy usado en
transformacin de plantas, en muchos experimentos se reemplaza la glucuronidasa (GUS)
para la expresin del gen, el plsmido tiene enzimas de restriccin HindIII y EcoRI, el
promotor CaMV (35s) tiene una regin de 835 bp, una regin GUS 1812 bp y un terminador
NOS (235 bp). (Po-yen, 2002).
2) Planteamiento del problema y justificacin
Unos de los grandes problemas al comercializar el pltano (Musa paradisiaca) es su corto
tiempo de vida, ya que da un mecanismo de pardeamiento enzimtico, en el cual actan las
enzimas peroxidasa y polifenoloxidasa, las cuales coloreando la fruta con un color caf o
negro. Esto genera prdidas ya que cuando el fruto se encuentra as el consumidor lo
rechaza, estas son unas de las principales causas de prdida del producto. Este es un
factor limitante ya que su vida til en percha no es muy larga.
Uno de los puntos claves del proceso de produccin de banano es el mtodo de
postcosecha empleado. Los agricultores emplean un tiempo de vida del banano antes de
ser cultivado por lo que es importante cosechar en estado de fruta verde, con sto se evita
la oxidacin temprana y desprendimiento de reguladores de crecimiento como etileno, por
ste motivo el fruto verde permanece ms tiempo para su transporte y comercializacin.
En la exportacin de frutas tropicales, es importante el estado de transporte de envo y
recepcin por lo que el banano al ser un producto de mayor exportacin generando grandes
ingresos al agricultor y el pas. Como se mencion anteriormente, los factores
determinantes del valor y estado de la fruta viene dado por el estado visual causado por
enzimas causantes de la oxidacin del producto. Otros problemas asociados con el
problema de comercializacin es causado por manchas de ltex que a diferencia de la
oxidacin frutal se soluciona con un lavados especficos.
Para solucionar estos defectos en la exportacion y comercializacion local del banano nos
hemos planteado la creacin de un modelo de produccin de banano transgnico con
propiedades antioxidativas mediante la adicin de genes que expresan ciertas protenas
que inhiben el proceso de oxidacin en la fruta. Los genes pertenecen a un grupo llamado

PPOs. Estos genes tienen el propsito de inducir protenas o enzimas capaces de inhibir la
accin de otras enzimas causantes de la oxidacin del fruto por diversas reacciones, con lo
que garantizamos un producto de mejor aceptacin y mejor calidad sin afectar sus
propiedades nutricionales del mismo.
ste producto ser de inters para grandes productores de banano y exportadores por lo
que en primera instancia se realizar la investigacin y desarrollo del producto en escala de
laboratorio para posteriormente implementarlo en el campo. Al ser el banano un producto de
consumo masivo y consumido por una poblacin mundial extensa, la modificacin del fruto
en cuanto a calidad aumentar de forma significativa el consumo del producto.
El proyecto de investigacin ser de gran inversin por lo que est diseado para trabajar
conjuntamente con instituciones como la Universidad de las Amricas y el Centro de
Investigaciones Biotecnolgicas del Ecuador (CIBE). stas dos instituciones contribuirn
con el implemento y capital necesario para la elaboracin del proyecto.
3) Metodologa

Mtodo de transcripcin reversa:

Se realizar una (RT-PCR) de tejidos del pltano Musa paradisiaca, mediante el mtodo
CTAB, luego se construir una biblioteca de cDNA. Se utilizarn los siguientes primers 5AAG CTG GGA GTT GCT CAC GCA ACT GT-3 (sentido) y 5-TTA AGA AGC AAA CTC AAT
CTT GAT ACC ACC-3 (antisentido). Las reacciones se realizarn en las siguientes
condiciones, desnaturalizacin a 94 C, luego 30 ciclos de 30 segundos a 94C, 45
segundos a 62C , un minuto a 72C, con una extensin final a 72C por 10 minutos. El
cDNA amplificado se clonara con un vector pGEM-T y se utilizar el primer T7 (Guiquin, et
al 2011).
-

Vector de expresin:

El DNA del banano con PPO el cual contiene en ambos extremos un sitio BamHI como se
muestra en la Fig 3, luego de que el fragmento se digiera con BamHI, procederemos a ligar
en el plsmido pBI121 (Ver fig. 2) y por consiguiente se introducir en la cepa de E. coli
HB101. El fragmento se insertar corriente abajo del promotor de RNA 35S obtenido del
virus del mosaico de la coliflor (Ver fig. 2). Esta construccin contiene al gen nptII el cual nos
permitir seleccionar aquellas plantas transgnicas resistentes a la Kanamicina. Los
diferentes plsmidos se obtendrn de anlisis a partir de colonias de cepas de E. coli
resistentes al antibitico, y para obtener una correcta insercin se utilizara el mtodo de
corte con HindIII. El plsmido que se obtendr a partir de la construccin con el PPO DNA
antisentido se llamar pBI121-AsPPO. La cepa que se utilizar para la transformacin con
Agrobacterium tumefaciens ser EHA 105 (Murata,2000).

Introduccin del vector en Agrobacterium tumefaciens:

Para la introduccin del plsmido vector pBI121-AsPPO en Agrobacterium tumefaciens EHA

105 se utilizar el mtodo de apareamiento triparental con ayuda de un plsmido
secundario. La cepa de E.coli especfica mencionada anteriormente se encubar en un
medio de cultivo LB con antibitico previamente (50 ug-ml) a una temperatura de 37 C.
adicionalmente Agrobacterium tumefaciens se encubar durante 12 horas en medio LB
aadido 0.3 mg - ml de estreptomicina y 0.1 mg-ml de rifampicilina, ste proceso ser a 27
C. stas tres tipos de cepas se mezclarn en medio agar LB y permanecern en proceso
de incubacin durante 12 horas. Luego de los pasos mencionados, se proceder a recoger
aquellas bacterias con 5 ml de MgSO4 a una concentracin de 10 mM, luego se incubarn
en medio LB por otras 12 horas con la adicin en el medio de 50 mg-ml de KM. Por ltimo
seleccionaremos las colonias y comprobaremos la presencia del plsmido en
Agrobacterium tumefaciens.

Transformacin de Musa spp

La transformacin se realizar con una suspensin de clulas embriognicas, se utilizara un

medio Murashige y Skoog, se le colocara la Agrobacterium tumefaciens para la modificacin
de las clulas embrionarias, en el medio tambien se incluira sucrosa, benzilaminopurina y
agar. Posteriormente se realizarn dos medios mas, uno para para el co-cultivo y el de
seleccin, el medio de seleccin tendr kanamicina. Luego del crecimiento de las clulas
embriognicas se las trasladar a un medio de proliferacin. Para mantener los brotes
transgnicos se los debe trasladar peridicamente (cada seis semanas) a medios nuevos
con kanamicina (50mg/L).
-

Comprobacin de resistencia a kanamicina:

Para la comprobacin de la resistencia de las plantas transgnicas previamente

transformadas con la resistencia al antibitico KM, se proceder a cultivar pequeos
explantes con el fin de producir callos. Estos callos sern pesados en aproximadamente 0.5
g de peso fresco y colocados en frascos con medio de cultivo selectivo con diferentes
concentraciones de KM. Al cabo de 45 das a una temperatura de 27 C. Luego de ste
tiempo se calcular el peso nuevamente de los callos para obtener valores de la
concentracin inhibitoria (IC).
-

PCR y anlisis de ARN

Se realizar una comparacin de DNA de Musa paradisiaca sin transformar con las
transformadas, se usar el modelo de nptII con sus respectivos primers. Se realizar la
extraccin con nitrgeno lquido (-80C), con el mtodo de CTAB, luego de la extraccin de
realizar la PCR y posteriormente se observaran las bandas en geles de agarosa para
observar si las plantas fueron transformadas. El RNA se extraer con el mtodo de CTAB,
este ser separado en geles de agarosa y se pondrn en una membrana de nylon. Se
hibridiza el RNA con sondas del gen PPO a 68 C. Las sondas seran preparadas con PCR
DIG (prove synthesis kit), en donde se realizarn detecciones de quimioluminiscencia
(Guiquin, et al 2011).
- Anlisis de PPO en callos de Banano:

Para el anlisis de PPOs en los callos de banano se pesar aproximadamente 2 a 3 gramos

de masa y se colocar en un frasco tipo Erlenmeyer de 100 ml con medio lquido Murashige
y Skoog y se proceder a incubar durante 3 das a 27 C y 100 rpm. Para continuar con el
anlisis se trabajar a 4 C. Por medio de filtracin se recogern las clulas y se sometern
a homogeneizar en dos volmenes de un tampn fosfato 10 mM con un pH de 7.2 el cual
ser colocado Polyclar SB-100 en un volumen de 10% conjuntamente con Polytron como
homogeneizador durante un tiempo de 2 minutos. El sobrenadante se obtendr como
extracto crudo luego de centrifugar por 30 minutos a una velocidad de 16000 x g.
Para la determinacin de protenas se utilizar un mtodo especfico de deteccin como el
mtodo de Lowry utilizando SBA (Suero Albmina Bovina) como estndar. Para la
estimacin de la cantidad de protena PPO se utilizar un anticuerpo PPO anti-banano por
medio de ELISA y Western blot. Para el Western blot se medir la densidad de la banda
densitomtricamente. Para la actividad enzimtica se utilizar un tampn McIIvaine a un pH
4 con el uso de cido clorognico como sustrato y la absorbancia se medir a 320 nm.
stas mediciones se medirn en dos repeticiones con callos transgnico y callos no
transgnicos y las mediciones sern evaluadas por medio del programa Statview 4.0.
- Determinacin de protocolo de micropropagacin para la especie
vegetal:
Se utilizara un medio Murashige Skoog, el cual tendr sacarosa 40 g/L, BTA 5 g/L, inositol
100 g/L, Tiamina-HCL 1 mg/L, se cultivarn con un fotoperiodo de 16 horas y agitacin 100
rpm. Luego se realizaran subcultivos cada dos das por tres semanas. Para la propagacin
masiva de los brotes se realizan en el mismo medio pero con agar 0.8% y se transfieren
cada semana, para evitar pudricin. Para promover el enraizamiento se transfieren los
brotes a medio MS, suplementado con AIA, cuando aparezcan las races se los transfiere a
semilleros (Angarita, et al 1998).
4) Resultados esperados
La produccin del banano transgnico asegurar una produccin mucho mayor en
comparacin al producto original, aportando las mismas propiedades nutricionales del fruto
pero con mayor aceptacin en el mercado.
Por otra parte, el fruto modificado genticamente brindar un aspecto visual superior al fruto
original por lo que al ser consumido no generara rechazo por parte de la poblacin. ste
producto en general es de masiva produccin por lo que al pas le genera muchos ingresos
en sus exportaciones, de esta manera al ser un producto modificado sin ningn tipo de
riesgos asociados y de mejor calidad por su aspecto, aportara con mayores exportaciones
siendo un pas potencia en exportacin de ste producto y consumo nacional por lo que
beneficiara a productores y comerciantes.
El aspecto y duracin del producto sera de mayor duracin por lo que al inhibir la accin de
enzimas causantes de la oxidacin del fruto ste tendra una mayor duracin en perchas de
comerciantes y a su vez el tiempo de consumo del producto aumentara.
Se espera una correcta insercin de genes modificadores de la produccin de las enzimas
PPOs por lo que es indispensable que los resultados primero sea a escala de laboratorio y
luego aclimatacin al campo por consiguiente el proyecto sera apto para ser adaptado a las
diferentes zonas productoras de banano del pas. stos genes sern aislados de frutos

comestibles ordinarios por lo que al insertar y modificar genticamente el fruto, slo

mejoramos la calidad y funcionalidad para bien y no su calidad nutricional.
Por ltimo esperamos que la insercin de genes se de a nivel de fruto por lo que el uso
especficos de genes para la expresin de protenas es necesario en la parte principal que
es el fruto, con esto garantizamos una correcta transformacin del producto transgnico.

5) Sostenibilidad
El objetivo del proyecto es desarrollar un producto transgnico a nivel de laboratorio por lo
que con ayuda de varias instituciones privadas y pblicas se pretende extender al campo
para su comercializacin.
Contaremos con el apoyo de la Universidad de las Amricas al brindarnos el uso de
laboratorios para la investigacin y parte del presupuesto del proyecto para financiar
reactivos y materiales y pago de investigadores.
El Centro de Investigaciones Biotecnolgicas del Ecuador (CIBE) se suma al proyecto con
su gran aporte en el rea de investigacin en banano transgnico por ser los pioneros en
trabajar en investigar este fruto. Tambin aportarn con el desarrollo del producto con sus
implementos y laboratorios y presupuesto.
El apoyo de instituciones pblicas como el Ministerio de Agricultura (MAGAP) brinda un
financiamiento en capacitaciones para los investigadores en el rea de agricultura y manejo
de cultivos de banano en el pas por lo que se suma al aporte del proyecto.
Por ltimo contaremos con un financiamiento por parte de la Secretara Nacional de
Educacin Superior, Ciencia, Tecnologa e Innovacin (SENESCYT) el cual aportar con un
crdito para la investigacin.
El proyecto se desarrollar en dos fases por lo que la primera fase estar cubierta en su
totalidad por dichas instituciones y la segunda fase tendr una sostenibilidad propia por
aportes de grandes productores de banano del pas con el fin de lograr expandir al campo a
gran escala
6) Presupuesto
CATEGORA

CIBE

UDLA

Implementos
de Laboratorio

4,000

3,000

7,000

10,000

10,000

Pago
a
Investigadores
e investigacin

MAGAP

Crdito
para
investigacin

50,000

Capacitaciones
Desarrollo del 15,000

SENESCYT

10,000
15,000

Total

50,000
10,000
30,000

producto
Total

107,000

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8) Anexos:

Grfico 1: Produccin de banano

Fig 1.: Produccin de banano en Ecuador (Magap,2013)

Fig 2.: vector de clonacin

Fig 3.: Construccin antisentido de CDNa para ser insertado en Plsmido.