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TEMA 45:
La identificacin bacteriana. 1
Esquema:
1. Introduccin.
REV.: 03/05
6. Diagnstico serolgico.
6.1. Tipos de anticuerpos estudiados.
6.2. Mtodos serolgicos
6.2.1. Tcnicas de aglutinacin.
6.2.2. Enzimoinmunoensayo (EIA).
7. Conclusiones.
8. Bibliografa.
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1. INTRODUCCIN.
La identificacin en Microbiologa consiste en la asignacin de una
bacteria microorganismo a un taxn segn una clasificacin
establecida. Permite llegar a determinar la especie, o incluso la cepa de
una bacteria aislada previamente en una muestra. Para ello se
determinan las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas del
microorganismo y se comparan stas con las diferentes categoras de la
clasificacin considerada.
Constituye un procedimiento imprescindible en la investigacin a la hora
de establecer los taxones a los que pertenece una bacteria
recientemente descubierta o que se ha encontrado en un material vivo o
inanimado. Es asimismo primordial para la tipificacin de las especies
patgenas que producen infecciones en el hombre y en los animales. El
diagnstico bacteriolgico de las especies de inters clnico permite
conocer la etiologa de la enfermedad infecciosa e instaurar un
tratamiento antibitico adecuado.
2. TCNICAS PARA LA IDENTIFICACIN BACTERIANA.
En todos los casos es preciso el previo aislamiento del germen en la
muestra, para proceder posteriormente a su identificacin. Los pasos a
seguir para la identificacin de una bacteria son:
1. Conseguir un cultivo puro (axnico) del microorganismo a partir de la
muestra: El mejor mtodo es usar medios slidos selectivos o
diferenciales, ya que cada bacteria que crezca forma una colonia que
es una cepa pura.
2. Observacin microscpica de la bacteria aislada. Para ello se suele
recurrir a una tincin de Gram, y as ya se clasifica como Gram
positivo Gram negativo, a la vez que se determina su forma
(coccea, bacilar, etc.). Tambin es importante determinar la
agrupacin y la presencia de esporas y otras caractersticas
morfolgicas de inters.
3. Aspecto del crecimiento en los diferentes medios. Se observa la
morfologa de las colonias, produccin de pigmentos, etc.
4. Realizacin de diversas pruebas de identificacin. Las ms usuales
son pruebas bioqumicas para determinar la actividad enzimtica y
los metabolitos producidos por la bacteria.
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Se dividen en:
- Pruebas primarias. Determinan la familia o grupo de gneros, y a
veces se puede llegar al gnero. Algunas de ellas son:
Observacin microscpica y aspecto de colonias (vistos), catalasa,
oxidasa,
prueba
OF
(oxidacin-fermentacin),
esporas,
anaerobiosis, movilidad, etc.
- Pruebas secundarias y terciarias. Se utilizan despus de las
primarias, para intentar determinar la especie. Incluyen diversas
pruebas bioqumicas y enzimticas (indol, ureasa, coagulasa, etc.).
5. Determinacin del serotipo de la bacteria. Est indicada para una
identificacin ms rpida, o cuando las pruebas bioqumicas no son
concluyentes.
Sin embargo algunos microorganismos no pueden observarse al
microscopio y otros no crecen en los medios de cultivo, por lo que hay
que recurrir a otras mtodos. stos incluyen las tcnicas genotpicas
(moleculares) y el diagnstico indirecto serolgico, llamado as porque
se realiza sobre el suero del paciente (no confundir con la determinacin
del serotipo).
La identificacin genotpica consiste en la deteccin de secuencias
especficas de especie en los cidos nucleicos del microorganismo, ADN
o ARN. La presencia de genes especficos se interpreta como
identificacin definitiva. Constituyen las tendencias ms avanzadas en
identificacin, junto con los ltimos avances en diagnstico serolgico y
en automatizacin.
Las pruebas bioqumicas y serolgicas de identificacin se pueden
realizar de modo manual, si bien existen hoy en da pruebas
automatizadas que permiten el anlisis de un gran nmero de muestras
y permiten establecer en menos tiempo un diagnstico bacteriolgico.
3. CRITERIOS FENOTPICOS.
Las tcnicas fenotpicas constituyen los tres primeros pasos en la
identificacin descritos en el apartado anterior y se basan en detectar los
caracteres expresados por la bacteria. Adems de la observacin
microscpica y macroscpica de los microorganismos, se realizan las
llamadas pruebas bioqumicas, que engloban tres tipos de estudios:
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diferenciar
especies
de
Campylobacter
de
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reactivo
de
Ehrlich
o
Kovacs
(a
base
de
paradimetilaminobenzaldehdo), que se aade al medio lquido y da un
anillo de color rojo con el indol. Es tpica de E. coli.
b) Produccin de cido sulfhdrico (SH2) a partir de aminocidos
azufrados. Se usan medios en tubo con sales de hierro o plomo, que
con SH2 forman sulfuros de estos metales, lo cual se evidencia como
un precipitado negro en el lugar de crecimiento. Se usa el agar
acetato de plomo, y tambin en medios combinados como el TSI
Kliger (se detallan ms adelante).
c) Fenialalanina desaminasa. Algunas bacterias desaminan la
fenilalanina a cido fenilpirvico, que con FeCl3 en solucin cida
produce un color verdoso.
d) Descarboxilacin
de
aminocidos.
Diversas
especies
de
enterobacterias tienen descarboxilasas, que transforman los
aminocidos en aminas, las cuales en condiciones anaerobias
alcalinizan el medio.
Las bacterias se inoculan en medios que contienen lisina, ornitina o
arginina y un indicador de pH (prpura de bromocresol, que vira a
violeta en medio alcalino).
e) Urea. Muchas bacterias poseen ureasa, que desdobla la urea en
amonaco, agua y anhdrido carbnico. De esta manera se protegen
de sus efectos txicos.
Las bacterias se inoculan en agar urea que es un medio inclinado con
urea y rojo de fenol como indicador. La formacin de amoniaco
alcaliniza el medio y el indicador vira de amarillo a un rosa intenso.
Se usa en la identificacin de algunas especies como Proteus,
Helicobacter pylori y para la caracterizacin rpida de Brucella (vira
en poco ms de una hora).
3.3.8. Ensayos combinados.
a) TSI (Triple Azcar Hierro) y Kliger. Se usan para diferenciar especies
de enterobacterias. Determinan la capacidad de un microorganismo de
atacar un hidrato de carbono especfico, y tambin permite estudiar la
produccin de gases y de SH2.
El medio de Kliger es inclinado e incorpora lactosa al 1% y glucosa al
0,1% y un indicador (rojo de fenol). El TSI es similar, pero tambin lleva
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Test especficos.
El test de la optoquina se usa en la identificacin de Streptococcus
pneumoniae, que es el nico estreptococo sensible a esta sustancia.
Para realizar la prueba se siembra la cepa problema sobre una placa
de agar sangre, sobre la que se coloca un disco impregnado de
optoquina. Si tras la incubacin se produce un halo de inhibicin es
muy probable que se trate de S.pneumoniae. No obstante puede
confirmarse la identificacin con la solubilidad en bilis, ya que. S.
pneumoniae es el nico estreptococo que se lisa en sta.
El test de bacitracina es similar, pero est indicado para
Streptococcus pyogenes.
3.4. Sistemas multitest y automticos.
A la determinacin de la especie se puede llegar mediante las pruebas
manuales que hemos visto, pero a veces pueden ser largos y complejos,
ya que algunas bacterias requieren muchas pruebas para su
identificacin. As, una enterobacteria necesita unos 15 ensayos
distintos para poder determinar su especie.
Por ello, existen bateras comerciales de pruebas agrupadas para cada
tipo de microorganismo. Estos sistemas tienen varias ventajas:
Proponen el mejor conjunto de pruebas bioqumicas para la
identificacin de un grupo bacteriano.
Simplifican la interpretacin de resultados utilizando valores
numricos.
Proveen los reactivos listos para su uso.
Algunas son totalmente automatizables.
Antes de aplicar estos sistemas ha de establecer el tipo de
microorganismo mediante el Gram y las caractersticas de aislamiento,
para as aplicar la batera adecuada.
Las bateras automatizadas de identificacin suelen consistir en unas
placas o tarjetas que contienen una serie de cpulas independientes
cada una con los reactivos necesarios para una o ms pruebas
bioqumicas. Las cpulas contienen sustratos deshidratados o pequeos
medio listos para sembrar.
En todas las cpulas se deposita una suspensin de la bacteria
problema (as se reconstituyen tambin los medios deshidratados) y tras
24 de incubacin se interpretan los resultados mediante los esquemas
de identificacin, normalmente de tipo numrico. Los sistemas ms
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5. MTODOS GENOTPICOS.
Los mtodos genotpicos de identificacin se basan en el estudio del
material gentico de los microorganismos, no en sus caractersticas
externas. Son ms complicados y costosos que los fenotpicos y tienen
el inconveniente (a diferencia de las tcnicas fenotpicas clsicas) de
que no es posible recuperar la cepa usada. No obstante tienen muchas
ventajas:
- Ofrecen una capacidad de discriminacin mucho mayor y son de
utilidad en la precisin del diagnstico cuando la visualizacin y el
cultivo no son suficientemente resolutivos.
- Permiten un diagnstico preciso cuando el patgeno no crece en el
cultivo o se encuentra en bajas concentraciones.
- Son mucho ms rpidas porque no necesitan que crezca el patgeno.
- Adems de la identificacin, se pueden usar en Taxonoma, ya que
permiten establecer relaciones filogenticas.
5.1. Mtodos moleculares basados en cidos nucleicos
La secuencia de nucletidos del DNA o RNA es una caracterstica
propia y especfica de cada especie, por lo que se considera como una
huella dactilar. Las tcnicas moleculares basadas en los cidos
nucleicos son de tres tipos:
- Mtodos de hibridacin de cidos nucleicos.
- Tcnicas de amplificacin gnica.
- Mtodos de digestin enzimtica.
5.1.1. Mtodos de hibridacin.
Se basan en la homologa de los cidos nucleicos. Cada cadena de
cido puede unirse especficamente a su homloga debido a la
complementariedad de sus bases (adenina con timina y guanina con
citosina).
Para ello hay que disponer de una sonda, que es una secuencia de DNA
homloga a otra secuencia especfica de la bacteria a detectar La sonda
se marca previamente para su posterior deteccin unindola a una
molcula fluorescente, radioactiva o enzimtica.
Primero se desnaturaliza el DNA problema (diana) para separar sus dos
hebras y se fija a un soporte slido de nitrocelulosa, aplicando luego la
sonda marcada. Si la muestra contiene la bacteria en cuestin, la sonda
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Libros:
- Davis D.B. Dulbecco, N.H. y Ginsberg, H.S. 1997. Tratado de
Microbiologa 4 ed. Editorial Masson.
- Prescott, L.M., Harley J.P. y Lein D.A. 2002. Microbiologa 5 ed.
Mcgraw-Hill Interamericana.
- Henry, J.B. (1993). Diagnstico y tratamiento clnicos por el
laboratorio. 9 ed. Ed. Salvat.
Internet:
- http://edicion-micro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html
- http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/SeminarioPruebasBioquimicas.ht
m
- http://www.joseacortes.com/microbiologia/pruebasbioq/
- http://www.danival.org
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