PENGANTAR METODA KROMATOGRAFI

(Teori dan Besaran Dasar Kromatografi)

Prof. Dr. Muhamad Bachri Amran, DEA

Kelompok Keilmuan Kimia Analitik
Institut Teknologi Bandung
2015

PENGANTAR METODA KROMATOGRAFI

Kromatografi adalah suatu metoda pemisahan yang penting di dalam analisis kimia
disamping cara-cara lainya seperti teknik ekstraksi dan elektrophoresis. Pemisahan
berbagai komponen dalam campurannya dengan metoda kromatografi dapat
dilakukan dengan berbagai teknik dan mampu memberikan resolusi pemisahan yang
tinggi.

DARI EKSTRAKSI KE KROMATOGRAFI

Bila ditinjau kembali pemisahan dengan metoda ekstraksi, maka diperlukan dua fasa
yaitu dua cairan yang tidak saling campur dan merupakan fasa bawah dan fasa atas.
Hal ini ada kesamaannya dengan metoda kromatografi di mana juga terdapat dua
fasa yakni fasa diam dan fasa gerak. Dalam sistem dua fasa (bifasa) seperti ini, maka
suatu komponen akan terdistribusi/terpartisi ke dalam kedua fasa dengan jumlah
yang berbeda (dikenal sebagai Hukum Distribusi Nernst). Perbandingan konsentrasi
komponen tersebut dalam kedua fasa dikenal sebagai koefisien distribusi, KD yang
secara matematis dapat dituliskan sebagai :

KD =

[A]2
[A]1

, di mana

[A]1 adalah konsentrasi komponen dalam fasa 1

[A]2 adalah konsentrasi komponen dalam fasa 2
Dari hukum Nernst dapat diramalkan partisi suatu komponen dalam suatu proses
ekstraksi semi kontinu seperti proses ekstraksi countercurrent menurut Craig.
pelarut
baru

2
1

Proses Ekstraksi Countercurrent menurut Craig

Pengantar Metoda Kromatografi.

1.amran

Jika KD dari komponen A dalam sistem dua fasa di atas adalah 1, maka :
pada tabung pertama : [A]1 adalah 0.5 dan [A]2 adalah 0.5
setelah pemindahan yang pertama,
pada tabung pertama : [A]1 adalah 0.25 dan [A]2 adalah 0.25
pada tabung kedua : [A]1 adalah 0.25 dan [A]2 adalah 0.25
setelah pemindahan yang kedua,
pada tabung pertama : [A]1 adalah 0.125 dan [A]2 adalah 0.125
pada tabung kedua : [A]1 adalah 0.25 dan [A]2 adalah 0.25
pada tabung ketiga : [A]1 adalah 0.125 dan [A]2 adalah 0.125
setelah pemindahan yang keempat,
pada tabung pertama : [A]1 adalah 0.0625 dan [A]2 adalah 0.0625
pada tabung kedua : [A]1 adalah 0.1875 dan [A]2 adalah 0.1875
pada tabung ketiga : [A]1 adalah 0.1875 dan [A]2 adalah 0.1875
pada tabung keempat : [A]1 adalah 0.0625 dan [A]2 adalah 0.0625
Jika digambarkan dalam bentuk histogram dari konsentrasi A dalam fasa 2 terhadap
nomor tabung maka akan diperoleh :
0.3
3 x pemindahan

konsentrasi A

4 x pemindahan
0.2

0.1

0
1

nomor tabung

Konsentrasi A dalam fasa 2 setelah dilakukan beberapa kali pemindahan pelarut.

Jika diamati secara seksama, histogram di atas ada kemiripannya dengan
kromatogram yang diperoleh dari suatu proses pemisahan dengan metoda
kromatografi. Hal ini menjelaskan pula bahwa dua komponen dengan nilai koefisien
partisi yang berbeda akan dapat dipisahkan.
Untuk kromatografi diperlukan pula dua fasa yang tidak saling campur yakni suatu
fasa diam dan suatu fasa gerak.
Fasa diam disini dapat berupa zat padat yang ditempatkan di dalam suatu kolom atau
dapat juga berupa cairan yang terserap (teradsorpsi) sebagai lapisan tipis pada
permukaan butiran halus zat padat pendukung (solid support material). Fasa

Pengantar Metoda Kromatografi.

2.amran

geraknya dapat berupa gas atau cairan. Campuran yang akan dipisahkan dimasukkan
pada salah satu ujung kolom sehingga akan dibawa bergerak (dielusi) melalui fasa
diam di dalam kolom. Perbedaan antaraksi atau afinitas antara komponenkomponen campuran tersebut dengan kedua fasa akan menyebabkan komponenkomponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda melalui kolom. Dan
seperti halnya pada ekstraksi countercurrent, perbedaan kecepatan migrasi
(differential migration) dari molekul-molekul komponen akhirnya akan
menyebabkan komponen-komponen terpisah satu sama lainnya.

PENGGOLONGAN METODA KROMATOGRAFI

Jika didasarkan pada jenis fasa gerak dan fasa diam yang digunakan maka metoda
kromatografi dapat dibagi menjadi beberapa jenis metoda kromatografi seperti
berikut ini

Fasa
Gerak

Fasa Diam

Jenis
Kromatogr
afi

Mekanisme
distribusi/partisi

Cairan (L)

Padat (S)

Krom. CP
(LSC)

Adsorpsi pada permukaan zat

padat

Cairan (L)

Padat (S)

Krom. CP
(LSC)

Reaksi penukaran ion

(kromatografi penukaran ion)

Cairan (L)

Cairan (L)

Krom. CC
(LLC)

Distribusi akibat perbedaan

kelarutan komponen di dalam
kedua fasa cair

Gas (G)

Padat (S)

Krom. GP
(GSC)

Adsorpsi pada permukaan zat

padat

Krom. GL
(GLC)

Partisi
(distribusi)
yang
ditentukan oleh tekanan uap
parsial komponen dalam fasa
diam yang cair.

Gas (G)

Cairan (L)

Catatan : Kadang terdapat dua atau lebih mekanisme yang terjadi secara
bersama-sama pada suatu proses kromatografi.
Ikhtisar :
(1). Kromatografi Cair-Padat (LSC) atau kromatografi adsorpsi ditemukan
oleh Tswett dan dilanjutkan penelitiannya oleh Kuhn dan Lederer (1931).
(2). Kromatografi Cair-Cair (LLC) merupakan kemajuan terhadap
kromatografi cair-padat. Penemunya Martin dan Synge (1941).

Pengantar Metoda Kromatografi.

3.amran

(3). Kromatografi Gas Padat (GSC) dahulunya hanya digunakan untuk

pemurnian gas-gas. Namun penemuan fasa diam yang baru
memungkinkan perkembangan lebih lanjut.
(4). Kromatografi Gas-Cair (GLC).
(5). Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi (HPLC).
(6). Kromatografi penukar ion, penting untk pemisahan ion-ion logam.
(7). Gel Filtrasi.
Semua cara ini didasarkan atas teknik elusi.
Partisi/distribusi komponen diantara fasa gerak (gas/cairan) dan fasa diam
(padat/cairan) di dalam kolom, secara sederhana dapat diilustrasikan sebagai
berikut:

CAIRAN A

KROMATOGRAFI CAIR-CAIR
Xterlarut dalam A

X terlarut dalam B

CAIRAN B

KROMATOGRAFI GAS-CAIR

penguapan
GAS B
CAIRAN A
pelarutan

Xterlarut dalam A
kecenderungan X
melarut dalam A

Xgas
kecenderungan X
untuk menguap
(tekanan uap parsial dari X)

KROMATOGRAFI GAS-PADAT

penguapan
GAS B

Xteradsorpsi pada A

PADATAN A
adsorpsi

kecenderungan X
teradsorpsi pada A

Pengantar Metoda Kromatografi.

Xterdesorpsi
kecenderungan X
untuk menguap
(tekanan uap parsial dari X)

4.amran

TEORI DAN BESARAN BESARAN DASAR PROSES KROMATOGRAFI

Sukses tidaknya suatu analisa dengan metoda kromatografi banyak ditentukan oleh
pemilihan yang tepat dari berbagai parameter operasional seperti komposisi fasa
gerak, jenis fasa diam, tekanan dalam kolom, temperatur, teknik elusi, jenis detektor,
dan parameter lainnya. Dalam hal ini, pemahaman yang baik mengenai teori
kromatografi akan sangat membantu dalam pengembangan dan penggunaan suatu
metoda kromatografi.

BESARAN-BESARAN RETENSI

Waktu Retensi (waktu tambat, tr)

waktu yang dibutuhkan oleh analit untuk bermigrasi mulai dari saat
penyuntikan hingga diperolehnya maksimum dari puncak kromatogram analit
bersangkutan

tR
injeksi

t0

waktu
Profil kromatogram suatu analit
Volume Retensi (Vr)
Jika adalah kecepatan alir dari fasa gerak maka volume retensi, Vr adalah :
Vr = t r .

Pengantar Metoda Kromatografi.

5.amran

Faktor Kapasitas (k)

Untuk mengkarakterisasi retensi analit, dengan memperhitungkan parameter
geometrik dari kolom, didefinisikan besaran faktor kapasitas yang merupakan
perbandingan kuantitas analit dalam fasa diam dan fasa gerak.

k' =

CsVs

= K

Cm V m

Vs

Vm

(t r - t o
to

Cs : konsentrasi analit dalam fasa diam

Cm : konsentrasi analit dalam fasa gerak
Vs : volume fasa diam
Vm

: volume fasa gerak

Selektifitas suatu kolom ()

Merupakan ukuran daya pisah dari suatu kolom. Digunakan untuk
mengkarakterisasi jarak yang memisahkan dua puncak berdekatan.
= k2 / k1

TEORI DASAR PROSES KROMATOGRAFI

Terdapat dua teori yang telah dikemukakan mengenai proses kromatografi elusi yang
bertujuan untuk lebih memahami apa yang terjadi pada proses tersebut, sehingga
dapat diramalkan kondisi-kondisi bagaimana yang harus dipenuhi agar pemisahan
dua atau lebih komponen dapat berlangsung dengan baik.
Kedua teori tersebut adalah TEORI PELAT (Plate Theory) dan TEORI KECEPATAN
(Rate Theory). Kedua teori ini saling melengkapi dan sangat penting artinya dalam
perkembangan pengetahuan mengenai kromatografi.

Teori Pelat atau Teori Lempeng (Plate Theory).

Teori ini didasarkan pada model ekstraksi countercurrent menurut Craig. Walaupun
ada analogi antara proses ekstraksi Craig dengan proses kromatografi elusi,
sebenarnya terdapat perbedaan pokok antara keduanya. Pada ekstraksi Craig terjadi
kontak bertahap pada setiap kali penyetimbangan, sedang pada kromatografi elusi,
kontak antara fasa diam dengan fasa gerak terjadi secara kontinu. Akibatnya pada
ekstraksi Craig terjadi kesetimbangan sejati (true equilibrium) pada setiap tahapnya,
sedang pada kromatografi elusi prosesnya merupakan suatu proses bukan
kesetimbangan (non-equilibrium process).

Pengantar Metoda Kromatografi.

6.amran

Martin dan Synge, memasukkan pengertian pelat teori (theoritical plate) yang telah
lama digunakan dalam teori tentang destilasi. Pelat teori adalah pelat imajiner dalam
kolom, yang tebalnya sedemikian rupa, sehingga komponen dalam fasa gerak yang
keluar daripadanya mempunyai komposisi yang sama dengan andaikata benar-benar
telah terjadi kesetimbangan partisi antara fasa gerak dengan fasa diam ditengahtengah lapisan tersebut. Dengan demikian, maka pelat teori dapat dianggap analog
dengan satu tabung dari alat ekstraksi countercurrent Craig. Tebal dari pelat imajiner
tersebut dikenal sebagai Height Equivalent of Theoritical Plate (HETP) atau Tinggi
Ekuivalen Pelat Teoritis. Besaran HETP ini mencerminkan efisiensi dari kolom.
HETP = L/N
L : Panjang kolom, N : Jumlah pelat teoritis

t
N = 16 r

t
= 5.54 r

= lebar puncak pada dasarnya, = lebar pada setengah tinggi puncak.

Karena N mencerminkan jumlah kesetimbangan yang dapat terjadi didalam suatu
proses kromatografi maka HETP merupakan ukuran kemampuan kolom untuk
memisahkan komponen-komponen dari campurannya. Semakin kecil nilai HETP
maka semakin besar efisiensi dari kolom.
Suatu besaran kromatografi lain yang juga digunakan untuk mencerminkan daya
pisah dari suatu kolom adalah tingkat pemisahan atau resolusi.
Resolusi, Rs didefinisikan sebagai :
Rs = 2 tR / (A + B)
tR : jarak antara maksimum dua puncak berdekatan
A : lebar alas dari puncak yang pertama
B : lebar alas dari puncak yang kedua
Resolusi bergantung dari berbagai faktor, diantaranya selektifitas () dan jumlah
pelat teoritis (N). Ketergantungan Rs dari berbagai faktor ini dapat dinyatakan
dengan rumus :
Rs = 1/4 ((-1)/) N (k/(1+k)
Walaupun teori ini telah mampu menjelaskan proses yang terjadi pada kromatografi,
namun salah satu kekurangan mendasar dari teori ini adalah bahwa teori pelat tidak
dapat memberikan petunjuk secara bagaimana kondisi-kondisi percobaan
kromatografi harus diatur supaya diperoleh nilai HETP yang kecil agar didapatkan
efisiensi kolom yang optimal.

Pengantar Metoda Kromatografi.

7.amran

Teori kecepatan (Rate Theory)

Suatu pendekatan teoritis lain, telah dikembangkan untuk memberikan pengertian
yang lebih baik mengenai faktor-faktor percobaan yang mempengaruhi kerja dan
efisiensi kolom. Pendekatan ini yang dikenal dengan teori kecepatan (rate theory)
yang dipelopori oleh van Deemter dan kawan-kawan. Oleh sebab itu pendekatan
teoritis ini lebih dikenal dengan teori van Deemter.
Perbedaan pokok antara pendekatan yang dilakukan oleh van Deemter dengan
pendekatan menurut teori pelat adalah bahwa teori ini memandang proses-proses
yang terjadi di dalam kolom tidak atas dasar kesetimbangan, melainkan atas dasar
aspek-aspek kinetika yang menyangkut partisi komponen di dalam kolom. Yakni
kondisi-kondisi yang sesuai dengan kenyataan, di mana fasa gerak mengalir terus
menerus atau kontinu. Teori kecepatan ini khususnya mempelajari faktor-faktor yang
menyebabkan pelebaran pita (band broadening) bila sejumlah kecil komponen
dielusi di dalam kolom. Pelebaran pita ini akan menghasilkan kromatogram yang
lebar pula. Kromatogram/puncak yang lebar bermakna bahwa besar yang berarti N
kecil. Bila N kecil berarti HETP akan besar. Jadi dengan perkataan lain, teori
kecepatan mempelajari faktor-faktor yang mempengaruhi HETP suatu kolom
dibawah kondisi-kondisi yang berlaku. Sebagai kesimpulannya telah disusun sutu
persamaan (persamaan van Deemter) yang menghubungkan HETP dengan tiga
faktor utama yang mempengaruhinya.
Persamaan van Deemter yang disederhanakan diberikan berikut ini,
HETP = A + B/ + C

di mana = kecepatan linier fasa gerak

Suku A atau suku difusi Eddy mencerminkan neka-alur dari isi kolom. Fasa gerak
dan komponen dapat bergerak melalui banyak jalur diantara butiran-butiran isi
kolom. Beberapa jalur lebih panjang dibanding jalur lainnya, sehingga sejumlah
molekul komponen bergeraknya lebih lambat di dalam kolom dibanding molekul lain
dari komponen yang sama. Hal ini akan menyebabkan pelabaran puncak
kromatogram yang berarti pula HETP menjadi lebih besar.
Pengaruh difusi Eddy dapat dikurangi dengan menggunakan isi kolom dengan
butiran yang berbentuk sama, berukuran kecil dan disusun rapat serta rata di dalam
kolom.
Suku B/ atau difusi longitudinal merupakan gaya-gaya difusi molekul yang
menyebabkan molekul-molekul bergerak atau berdifusi dari bagian tengah pita ke

Pengantar Metoda Kromatografi.

8.amran

kedua tepi pita. Dari persamaan van Deemter terlihat bahwa semakin besar
kecepatan linier fasa gerak semakin kecil pengaruh difusi longitudinal. Jadi dari
sudut pengaruh difusi longitudinal, yang besar adalah baik untuk efisiensi kolom.
Suku C atau suku pemindahan massa merupakan cerminan dari partisi komponen
antara fasa diam dan fasa gerak. Bila kecepatan linier fasa gerak membesar maka tak
cukup ada waktu untuk mencapai kesetimbangan partisi. Hal ini menyebabkan
efisiensi optimal dari kolom tak tercapai, sehingga HETP akan membesar. Agar
faktor ini dapat diperkecil maka harus diusahakan agar kesetimbangan partisi lebih
cepat tercapai. Pada kromatografi gas ini dapat dilakukan dengan menggunakan fasa
diam yang lebih tipis, suhu lebih tinggi dan kekentalan fasa diam yang lebih kecil.

HETP

Hubungan antara HETP dengan kecepatan linier fasa diam (sesuai persamaan van
Deemter) dapat digambarkan seperti berikut ini,

B/

A
Kecepatan Linier Fasa Gerak

Dari kurva di atas dapat ditemukan kondisi kromatografi yang diharapkan

memberikan HETP yang kecil. Nilai A biasanya kecil jika kolom dipak dengan baik.
Bila besar suku B/ semakin kecil tetapi suku C semakin besar.
Pada suatu nilai optimum pengaruh ketiga suku setimbang satu dengan lainnya
dan nilai HETP adalah minimum.

Pengantar Metoda Kromatografi.

9.amran

IKHTISAR BESARAN-BESARAN DASAR KROMATOGRAFI

Besaran

Notasi

Hubungan dengan
besaran lainnya

Persamaan

Kecepatan linier
analit

Kecepatan linier
fasa mobil

Faktor kapasitas

k'

Koefisien partisi

Selektifitas

Resolusi

RS

Jumlah pelat

Tinggi pelat

cm/s

tR
L

cm/s

t0
tR t0
t0

RS

KVS
VM

CS
CM

'V
Kk M
VS

(t R ) B t 0
(t R ) A t 0

'
KB kB
K A k 'A

k'

2{(t R ) B ( t R ) A }
A B

t
N 16 x R

RS

k 'B k 'A x N
4
1 k 'B

L
N

Besaran Percobaan
Besaran

Notasi

Sumber

Waktu mati

T0

kromatogram

Waktu retensi

tR

kromatogram

(tR)

(tR-t0)

Lebar alas puncak

kromatogram

Panjang kolom

pengukuran

Laju alir

pengukuran

Volume fasa diam

VS

Konsentrasi

Waktu retensi tereduksi

Pengantar Metoda Kromatografi.

10.amran