Tavonmde bactértenne, A. Decoser, FM pI CLASSIFICATION DES BACTERIES La science du classement des individus est appelée taxonomie (ou taxinomie) ou systématique. Un classement consiste & former des groupes d'individus qui se ressemblent selon des eritéres prédéfinis et a Gliminer ceux qui sten distinguent qui pourront former un autre groupe avec leurs semblables. Ces groupes sont appelés taxons. Deux ou plusieurs taxons peuvent, si on assouplit les critéres en ne tenant plus compte de certains caractéres distinctifS, étre 4 leur tour groupés en un nouveau taxon d'un niveau higrarchique supérieur qui comprendra un plus grand nombre d'individus. De regroupements en regroupements, on arriverait 4 faire rentrer tous les individus dans un méme ensemble. Principae riveau de clasfcation dls tes vivants (agri J.P Regnaul) La taxonomic est essentielle pour identification et la nomenclature des souches bactériennes que l'on isole chez. les malades ou dans leur environnement. Les ségles qu'on applique sont celles édictées par Linné en 1753 pour classer les végétaus ; elles sont également utilisées par les zoologistes pour classer les animaus. Les échelons hicrarchiques sont : régne, embranchement, classe, ordre, famille, genre et espéce. On utilise parfois des échelons intermédiaires : sous-embranchement, tribu (sous famille), ou sous espéce. Ordre, famille, genre et espéce, les plus utilisés en bactériologic médicale, sont exprimés par un terme latin {imprimé en caractéres italiques ou soulignés) dont la terminaison est “ales” pour Vordre, "aceae” pour la “er” (masculin) ou "a" (féminin) pour le genre et Vespéce qui sont accordés famille, "us ‘grammaticalement. En pratique courante, genre et espéce suffisent pour caractériser une souche. Liinitiale du nom du genre s'écrit en caraetére majuscule, le reste de ce nom s'écrit en minuscules comme le nom de lespéce méme si celui-ci provient d'un nom propre de personne ct sans trait d'union, méme sil est formé de deux mots. Ainsi, on doit écrire et prononcer par exemple Haemophilus parainfluenzae, Acinetobacter hwooffi, Staphylococcus aureus, Levinea malonaticaTavonmde Bactérie, A Decower, LM p. 2 Régne Protistes “Animal nbranchement | Procaryote Vertabres Chasse ‘Sehizamysdies Mammiferes Ordre Micrococcales Camassiers Famille Micrococcaceae Falides Genre Staphylococcus Felis Fsptce ‘aureus domesticus Nom vernaculaire — [Staphylocoque doré [chat Tndividu souche imino, ibrarche des taxon L'ESPECE BACTERIENNE Crest lunité fondamentale de la classification en microbiologic médicale. On peut la définir comme "un ensemble dorganismes partageant de nombreux caractéres", le genre étant un groupe d'espéces semblables, la famille, un groupe de genres semblables, Tordre, un groupe de familles etc. jusqu'au régne qui. serait un {groupe d'embranchements. Ces definitions illustrent bien la higrarchie des niveaus taxonomiques mais sont gravement entachées d'imprécisions tenant essentiellement 4 Tinsuffisance de la définition du niveau le plus bas qufest lespéce pour laquelle on dispose: maintenant d'une définition beaucoup plus rigourcuse Les différentes especes sont généralement et actuellement définies par des caractéres phénotypiques c'est 4 dire par lensemble des caractéres apparents (morphologiques, culturaux, physiologiques, antigéniques, nutritionnels, métaboliques ou biochimiques ete, CLONES - SOUCHES - COLONIES A Tintérieur d'une espice bactérienne, les individus nfexistent pas 4 lunité car les bactéries se divisent en permanence : la descendance d'une méme cellule bactérienne, on se divisant, forme un clone, Conerétement, on désigne un clone par le mot souche qui est done la population bactérienne issue d'une ‘méme cellule, Quand on cultive une bactérie isolée sur un milieu solide, on obtient un petit agglomérat de jes qui constitue ce qu'on décrit en technique au laboratoire sous lappellation de colonic. ESPECE TYPE Il existe un Code International de Nomenclature des Bactéries éabli par un comité d'experts et constamment mis a jour ainsi quun répertoire non officiel mais qui fait autorité : le "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology” exclusivement consacré 4 la systématique bactérienne. La description de chaqueTavonmde bactérlene, A Decower, LM p. 3 espace est assortie du dépdt dune souche-type de Tespece considérée dans un "Centre de Collection de Cultures de ‘Micro-organismes" officiellement reconnu. VARIE’ S A lintéricur d'une espéce, il peut exister des variants qui se différencient de l'espece-type par des caractéres mineurs et stables mais n'entrant pas dans la définition de Nespéce. Il peut s'agir de caractéres — biochimiques, définissant un biovar ou biotype antigéniques, définissant un sérovar ou sérotype — pathogéniques, définissant un pathovar disotypie des enzymes, définissant un zymovar de sensibilité 4 des bactériophages, définissant un Iysovar ou lysotype de sensibilité aux antibiotiques, __définissant un antibiotype TAXONOMIE NUMERIQUE Pour former des groupes diindividus, il faut tenir compte de leurs resemblances mais aussi de ce qui les différencie des autres qui ne seront pas inclus dans Ie groupe. Or, deux souches bactériennes ne sont jamais totalement semblables ni totalement différentes... II est done souhaitable de calculer des indices de similitude (ou de différence) pour les comparer a des normes fixées a Vavance qui déterminent le degré de similitude accepté pour entrer dans Ie groupe. On quantifie la similitude afin de former des groupes. En pratique, on se sert plutét d'un indice de distance (d) qui est le complément de V'ndice de similitude (8) + d=(1-s) Ces similitudes ou différences sont calculées en tenant compte des résultats d'une série de tests auxquels sont soumises Ics souches ctudices. On compare deux souches cn tenant compte des résultats différents (D) et doublement positifs (P) et on ne tient pas compte des résultats doublement négatifs qui pourraient n’étre pas discriminants, Lindice de distance entte les deux souches est donné par la formule : d=D/D +P On calcule cet indice pour chacun des couples de souches 4 classer. 8.84.5 S89, $80; Se0S), On dresse alors un tableau en carré avec en abeisses et en ordonnées les souches S; a S, et dans chaque case cn voit classern souces, ot dit caller les indices de dstnces 8,83, 818; -. Sy SiS, 5 S82 Ss Sy les indices correspondants. Si Hindice est égal 4 0, les deux souches sont identiques, sil est égal a 1, les deux souches sont totalement dissemblables pour les tests effectués. Dans la diagonale, les indices sont nuls puisqu’on y compare chaque souche a elle méme.Tavonmde Bactérie, A Decoser, LM p. 4 Les souches ayant les plus faibles indices sont les moins dissemblables et peuvent former un groupe G, dont on calculera, pour chacune des souches non incluses dans le groupe, un nouvel indice qui sera In moyenne des indices des constituants de G, . On forme ensuite un deuxiéme groupe G; constitué des souches ou ‘groupe les plus semblables. On calcule les indices de ce nouveau groupe et de proche en proche on pourra constituer un groupe unique qui contiendra toutes les souches soumises au classement, On peut ensuite dessiner un graphe appelé dendrogramme qui représente les relations de ressemblance entre les sujets et les groupes. Cette méthode, qui nécessite de nombreux ealeuls, a grandement bénéficié des outils informatiques qui en rendu [utilisation plus accessible, Exemple Soi § souches & classer S,,S:, Ss Sy, $:_(Gitution inéaste — on a pas besoin de tzxononie mumrique pour classer cing souches ~ chisie dans pour ne pas alordirl demonstration) soumises 12 tess (eile netemen inssan — iT en fut entre 30 100), ‘On és, pour carmen, les réstatscbtemis pour eiucune des sous en nota 0 Tes résultats négis tT résatats posts pour eaeulerles indies de dseinee d. c (SS) = D/D+P = 218 = 0250 : Hace de distance eae S, eS) est etl 40.250, ‘Quand ous fs alas sot ft, on corse "tablean en ca {00 | 9.380 Siew | 0700 Lindice are les souches Set, ese plus fle ; ce Son done es Souehes es moins dtférentes ox les plus semblables qon va rd en un mée sroupe Gi ‘On alle Tes nouveau indices de distance ene chacane des souchesrestues et Fe neuveau goupe qui sot Ia moyenne des indices de een des ‘onsite db raupe $., 1G aod so ‘0,00 | 0.378 | Cet maintenant 8, «tS; qu'on va reguper en G, 1S LL So aso actise Te ayy oso [os 6, eG, wot ve resoupes en Gy Il est admis que les souches présentant 90% de similitudes (ou 10% de différences) appartiennent 4 la méme espace ct qu‘a 70% , elles sont du méme genre,Tavonmde Bactérie, A Decower, LM p. 5 Sur ce dendrogramme, construit & parti des données de exemple ci- dessus, on pergoit facilement la parenté entre Jes souches Sy et Ss une part, qui appartiennent a la méme espace Gi, et les souches $1 ct Sy, autre part, qui sont du mame genre G, La souche Ss appartient& un genre différent, Ia souche S, serait totalement étrangere. TAXONOMIE MOLECULAIRE La taxonomie moléculaire se fonde sur la structure chimique des composants des bactéries. ‘© constitution chimique de la bactérie, Dans cette méthode, appelée chimiotaxonomie, on analyse les composants de la bactérie. On étudic, par exemple, les profils électrophorétiques des protéines des bactéries provenant soit d'un extrait celfulaire total soit d'un constituant plus simple (membrane, ribosomes). On peut aussi comparer la structure des lipides de la membrane ou, surtout chez les Gram +, du peptidoglycane ou encore les caractéristiques Alectrophorétiques des enzymes telles que deshydrogénases ou estérases. © structure de 'ADN, Comme 1a constitution chimique d'une bactérie dépend de celle des molécules informationnelles, on Gtudic Ia structure du génome lui-méme, clest a dire de Ia séquence des bases le long de I'ADN du chromosome. GC% Le contenu de 'ADN en guanine et cytosine s'est révelé (Chargaff - 1945) étre une caractéristique du gonre. Ce rapport (GC% = (G+C)100 / (A*T+G+C) peut étre déduit de la densité de !'ADN car G ot C sont plus lourds que A et T ou de la température de dénaturation car G et C sont unis par des liaisons H- plus stables que les liaisons H=H qui unissent A et T. Les hactéries de méme espéce ont Ie méme GC% mais un GC% identique peut caractériser des bactéries tras différentes.Taonmde Bactérie, A Decower, LM p. 6 Clostridium tetani 24-28 ‘Staphylococcus aureus 29-33 Enterococcus faecalis 34-38 ‘Streptococcus pyogenes 38-40 Haemophilus influenzae 39 Salmonella sp 48-53 Corynebacterium diphteriae 52-54 Klebsiella pneumoniae 56 - 60 ‘Pseudomonas aeruginosa 7 ‘Mycobacterium tuberculosis 2-70 ‘Micrococcus 62-70 {Le OC de quelques espices ou genres batértens Electrophorése de l' ADN en champ pulsé Aprés action sur 'ADN d'enzymes de restriction, on sournet les fragments a une électrophorése au cours de laquelle on fait varier le sens du courant. Cet artifice permet, contrairement a I'électrophorése habituelle en gel d'agarose, de séparer des fragments d'ADN de grande taille (> 50 kb) et par conséquent d'obtenir un nombre de bandes "raisonnable et de ce fait interprétable, Hybridation ADN-ADN Aprés séparation par chauffage (dénaturation) de deus brins d’ADN, un reffoidissement progressif permet leur réassociation (“renaturation") qui ne s'effectue qu‘entre séquences strictement complémentaires. La renaturation de monobrins d'ADN provenant de deux baetéries aboutira a la formation de "duplex" soit homologues, qui reconstituent les ADN originaux, soit hétérologues ou hybrides, qui sont formés d'une chaine de nucléotides d'un des ADN et d'une chaine de l'autre ADN. Chez ces hybrides, les réassortiments seront d'autant plus complets que les brins d'ADN seront complémentaires, c'est dire que les bactéries seront génétiquement semblables. Si Tun des deux ADN est rendu radioactif, on peut mesurer le taux ‘homologie chez les hybrides : Ia taxonomic modeme est fondée sur ces mesures «’homologie. La température de dénaturation est assez élevée (80°C) et Ia température optimale de renaturation (I) est généralement plus basse de 15 20°C. Si on chauffe 4 nouveau un duplex hétérologue 4 un température supérieure & Ty, on "redénature" Thybride et on congoit quiil faudra d'autant moins chauffer que Thomotogie est plus faible. On mesure le Tye) - température médiane d'lution - qui est la température nécessaire pour éluer 50% de la radioactivité de Ihybride. La différence entre les Tae) des duplex hétérologue et homologue - le ATwye ~ est donc en relation avec le pourcentage d'homologie. On admet 1,6 degré centigrade de différence correspondait 4 1% de paires de bases non appariges.Tavonmde Bactérie, A Decoser, LM p. 7 En faisant référence aux techniques d'hybridation moléculaire, on peut maintenant donner une définition beaucoup plus rigoureuse de lespce. Une espéce peut étre définie relations ADN-ADN qui d'hybridation supérieures @ [des hybrides inférieure om ‘Techniquement, on peut séaliser ces hybridations aveo de ADN en solution ou immobilis sur un support solide. La figure e-contreillustre un hybrdation en mile liquide Les fiagments d'un brin de TADN dune bactéie préalablement dénaturé, cisailé par une enzyme de restriction, shybrident avee un brin dun ADN’marqué provenant) dune autre baetérie sils y trouvent des séquences complémentaires. Aprés mination des fixgments monobrins, la radiosctivité rsiduclle est proportionnelle au degré dhhomologieentze les deux ADN,, done entre les deux bactéries. La deusime figue lustre un technique dbybridation sur ‘un support solide représenté par un film de nitrocellulose quia la proprisé absorber es molécules @ADN smonobrin, Un ADN "fod, est & dire non radiomarqué, qui est tester, est dsnaturé et cisaillé puis soumis clectrophorese sur gel agarose. On_sépare ainsi les flagments selon leur taille et par un simple contact (blotting = buvardage), on Jes transfert sur un filtre de nitrocalulose, Un deuxisme ADN margué, en solution, consttuantla"sonde', est mis 2 contact ave le file sur lequel se touvent les fragments de TADN a éudier. Sila sonde trouve des séquences ‘complémentares sur Ie film de nitrocellulose, elle fixe Les bandes _hybridées sont alors marquées et repsrables par autoradiographic, Cele technique est denommée "Souther blot” dn nom de son inventeur. comme le rassemblement de souches ayant des se traduisent @ ta fois par des valeurs 70 p. cent et une instabilité thermique (AT na) yale a 5°C. Southern blotTavonmde bactériewe, A Decoser, FM p. 8 Hybridation ADN - ARN. Les ARN ribosomaux sont abondants , faciles & purifier et présents dans toutes les cellules vivantes. Ils ont un contenu informationnel élevé puisqu'ils gouvement la synthése des protéines. En utilisant des techniques adaptées, on peut done tenter des hybridations entre une sonde ADN et 'ARN ribosomal d'une baetéric, (Crest généralement Ia technique sur filtre de nitrocellulose qui est adoptée, Séquengage de ARN, L'ARN ribosomial est fragmenté par une ribonucléase en oligonucléotides suffisamment courts pour étre aisément séquencés. On peut ainsi constituer pour chaque micro-organisme un dictionnaire des oligonucleotides caractéristique qui constitue sa "carte d'identité” ribosomale, IDENTIFICATION DES BACTERIES Pour identifier une souche, il faut se référer a un modéle : il s'agit done d'une démarche de comparaison, + Escheroh ‘est conduite par étape successive ; une + Indole eee A ON econ réponse positive 4 un test A oriente vers Lastose un test By tandis qu'une réponse négative : a onsen ae nm oriente vers un test B,. Les réponses a ces fe nouveaux tests déterminent des nouveaux Peppa e-eceoeaoga chemins vers d'autres tests et par bbranchements successifs, on arrive au diagnostic. Ce procédé est imparfait pour plusieurs raisons : le choix des tests et ordre dans lesquels ils doivent étre pratiqués sont déterminants : on ne tient pas compte des résultats incertains ou douteux ; la moindre erreur de lecture conduit immanquablement 4 une fausse identification. Il nest plus ulilisé que dans un objectif didactique. les tables diagnostiques sont des catalogues contenant les réponses d'un lot de souches d'un méme taxon a un grand nombre de tests utiles. Dans le "Bergey's Manual’, les résultats sont ainsi codés ‘+ si 90% des souches possédent le caractére, on code * pour la souche type '* si 90% des souches ne le possédent pas, on code — , # entre 11 of 89%, on code d si le caractére est instable, on code v La souche a identifier est soumisc 4 un maximum des tests du catalogue et les résultats obtenus sont comparés aux résultats de la table diagnostique.Tavonmde Bactérie, A Decoser, FIM, p. 9 Le tableau ci-dessous indique quelques caractéres qui permettent identification et la différenciation de quelques espéces dans les genres Proteus et Morganella, Les caractéres encadrés sont particuliérement utiles. Frotens mirabilis, Proteus vuigaris Froeuspemen | Morgenela morganst souche X Urdase +09) +09) +09) +0) + Videntification numérique utilise une matrice de données qui contient, pour chaque taxon, la valeur de fréquence de positivité (1) des différents tests exprimée en pourcentage (chiflres du tableau ci-dessus), La souche a identifier est soumise aux plus grand nombre de tests possibles : si la réponse est positive, on rotient 1a valeur de fréquence de positivité f de Ia matrice de données, si elle est négative, on retient une valeur calculée en soustrayant f de lunité, Le produit de toutes ces valeurs donne la fréquence théorique du phénotype étudié dans Fespéce. Cette fréquence théorique divisée par la somme des fiéquences théoriques obtenue pour tous les taxons soumis & comparaison fournit un coefficient qui multiplié par 100 donne le pourcentage de chances qu‘a la souche testée d'appartenir a Yespece. On accepte généralement les seuils suivants : > 99, 9% cexcellente identification > 99% trés bonne identification > 90% bonne identification > 80% identification acceptable < 80% identification 4 rejeter Dans lexemple illustrs dans le tableau ci-dessus, on effectue les calculs concemant Ia souche.X => Proteus mirabilis (0.98) (0,83) (0,02) (088) (1 -0,01) (1 - 0,5 0.0068 (68'858)100 = Proteus ulgaris (0,99) (0,83) (092) (001) (1 -0,01) (1-031) 0.9082 (52/858)100 = Proteus penneri 099) 0,17) (0.91) G01) (1-0.01).1-0.02) = 040001 _(1/858)100 => Morganella morganit (099) ( = 0,01) (0.97) (988) = 0.1) 0.08) 0737 (737'858)100 Total Rss identification la plus acceptable pour la souche.1” serait Morgunella morgamit, Un earactre atypique (crate) mite dtr controls ct surtout des tests supplémentaires devraiet sre eflactués ot pris en comple, Des améliorations tenant compte de 1a valeur diagnostique des tests utilisés ont été proposées ; elles sont accessibles grice aux outils informatiques.Tavonaone bactérlewe, A. Decoster, LM. p10 le syste de codage API (nom commercial de galeries miniaturisées) utilise un codage particulier en découpant les résultats des tests par "triplets" et en affectant au résultat positif du premier test la valeur 1, au deuxiéme la valeur 2 et au troisiéme. la valeur 4. Les résultats négatifs sont codés 0. On obtient ainsi un code a 7 chiffies (pour une galerie de 21 tests) qui est répertorié dans une table de codage ou un logiciel informatique. Exemple : rf2}alitatatitcztstifatati tots ti tetas fitz +--+ I-l-[- I-Ie ee ee Ge - 1+0+4=5 1 4 4 5 1 2 Code API: 5 144 512 = Escherichia coli (excellente identification) Marqueurs épidémiologiques Si plusicus cas dinteetions & Pseudomonas aeruginosa par exemple susviennent dans la méme quinzaine dans un service hhospitalor, il importe de savoir sil sugit dune anadémie (contaminations de plusieurs malades & la méme sousce) voite dune {picémie (ransmission entre malades dun méme infection) et, dans ces eas, on partera d nosoeomiale ou de manifestations sporadiques (cas isolés) concomitantes. Dans les premiéres hypothéses, la méme souche bactétienne sera responsable, Il appartient au bactériologiste détudier les souches isolées chez les malades pour alfirmer leur pafuteidentité et pa la leur meme origine quion ‘Selforcera ensuite de déeouvrit pour la supprimer Les marqueurs épidémiologiques sont des caractéristiques variables & lintéricur de espace. Les plus utilisés sont = biotypic, sérotypie, lysotypie, bactériocinotypie (les bactioins sont des sb evbactriernes spciiques dates bacties de meme espace en despéces ciméretes).. existe d'autres marqueurs plus sophistiqués tels que zymotypie (enzymes estracellulaires), PLP cn utilisant de la pénicilline marquée par un composé radioactif, protéines de membrane, par électrophorese ADN chromosomique ou plasmidique } par des techniques de biologie moléculaire ARN ribosomial EN GUISE DE CONCLU On Pour nommer, il faut connattre mais it faut aussi aimer. La taxonomie, qui aide & comnaitre et donc a aimer les actéries, n'est par conséquent pas une science Vain.