laboratoriji

Validacija analitikih
metoda osnovna naela
Katica Lazari

nalitike metode trebaju biti validirane kako bi se osigurala pouzdanost

i tonost analitikih podataka. Tako kae regulativa koja to i zahtijeva
zadnjih dvadesetak godina. Slau se i analitiari koji su temeljna naela validacije metoda primjenjivali i puno prije pojave regulative jer je to jednostavno sastavni dio struke. U meuvremenu objavljeno je puno radova, lanaka,
osvrta, provedeno bezbroj razliitih eksperimenata. U nekim su laboratorijima validacije metoda postale rutina, dok se u drugima one tek poinju provoditi. U ovome e lanku biti predstavljene osnovne postavke za validaciju
analitikih metoda nune analitiarima koji poinju, ali i koristan podsjetnik
za one koji su ve uli u rutinu validacija analitikih metoda.

Osnovna naela validacije

analitikih metoda

Validacija analitikih metoda postupak je kojim dokazujemo da naa metoda slui svrsi, a zahtijeva je
i regulativa i analitika profesija.
Validirane metode u najveoj e
mjeri osigurati pouzdanost i tonost analitikih podataka.

to je to validacija analitikih metoda? Najjednostavnija definicija kae da je

to postupak kojim dokazujemo da naa metoda slui svrsi koju smo joj
namijenili, a najjednostavnija logika kae da je prije svega uistinu potrebno
znati/definirati svrhu metode. Nakon toga se, po struci i logici posla, utvruju postupci, tj. planiraju i provode eksperimenti ije rezultate treba prikupiti
i prikazati kao dokaze o validnosti metode. Sigurno je da se isti postupci nee primjenjivati na sve metode razliito se pristupa validaciji kvalitativnih i
kvantitativnih metoda; razlikuju se postupci validacije metode kojom se odreuje analit koji pretee u uzorku i one kojom se odreuju tragovi u kompleksnoj matrici. Svakoj se metodi pristupa individualno, procjenjuje se to treba
napraviti za dokaz svrhovitosti. I struka i regulativa i zakonodavstvo prihvatili su osam osnovnih parametara, tj. izvedbenih znaajki validacije:
specifinost /selektivnost
linearnost
podruje
preciznost
ponovljivost, eng. repeatability
meupreciznost (eng. intermediate precision)
obnovljivost (eng. reproducibility)
istinitost (eng. trueness)
granica kvantifikacije
granica detekcije
postojanost.
Kombinacijom tih parametara oblikuje se plan validacije za svaku metodu.
Specifinost /selektivnost svojstvo je metode da tono i specifino odredi
eljeni analit u prisutnosti ostalih komponenata u matrici uzorka pod
utvrenim uvjetima ispitivanja. Iako se u praksi esto poistovjeuju, specifinost i selektivnost dva su razliita svojstva metode. Specifina metoda je
ona kojom se moe odrediti samo jedan specifini analit. Metoda kojom se
moe odreivati vie komponenata istodobno, ali pod uvjetom da te komponente pri odreivanju ne smetaju jedna drugoj, naziva se selektivnom.
61

laboratoriji

Selektivnost je nezaobilazan parametar za validaciju veine

metoda. U praksi se dokazuje usporedbom odziva metode na
referencijski materijal i analit u uzorku. Kod kromatografskih
metoda, osim usporedbe kromatograma referencijskog materijala i uzorka, potrebno je dokumentirati i parametre koji
odreuju razdvojenost i simetriju pikova, a kod odreenih
metoda i prikupiti dokaze o istoi pikova.

kad se oekuju uzorci sa irokim rasponom koncentracija,

isplati se definirati maksimalno podruje metode.
Preciznost se odreuje kao izraz slaganja izmeu niza mjerenja izvedenih iz istog homogenog uzorka pod propisanim uvjetima. Ovisno o uvjetima u kojima se odreuje razlikujemo:
preciznost pod uvjetima ponovljivosti ili ponovljivost
pri emu uvjeti ukljuuju jedan laboratorij, istog analitiara, istu aparaturu, kratko razdoblje.

Linearnost je odreena kao mogunost metode da unutar

odreenog podruja daje ispitne rezultate proporcionalne
koncentraciji analita u uzorku.
U praksi se linearnost odreuje mjerenjem odziva metode na
razliite poznate koncentracije referencijskog materijala (preporuuje se najmanje pet koncentracijskih razina uz tri ponavljanja). Procjenjuje se matematiki i grafiki. Matematiki se
preko linearne regresije izrazi jednadba pravca (y = ax + b) i
izrauna koeficijent korelacije (k). Nagib pravca (a) parametar
je koji izravno ukazuje na osjetljivost metode. Odsjeak pravca
(b) moe ukazivati na sustavnu pogreku. Za koeficijent korelacije uobiajeno se postavlja kriterij k 0,99. Za vrlo niske
koncentracije prihvaa se i kriterij k 0,98. Grafiki prikazi
ovisnosti signala o koncentraciji analita vani su zbog mogunosti vizualnog nadzora. Najee se upotrebljavaju dva naina
grafikog prikaza:
Grafiki prikaz odstupanja od regresijskog pravca prema koncentraciji ili logaritmu koncentracije za linearna podruja odstupanja jednoliko rasporeena izmeu pozitivnih i negativnih vrijednosti (slika 1a).
Grafiki prikaz relativnih signala (omjer signala i odgovarajue koncentracije) na osi y i odgovarajuih koncentracija na osi x log skale. Dobivena linija treba biti
vodoravna u cijelome linearnom podruju, a podruje
linearnosti prestaje pri koncentracijama gdje linija relativnog odziva sijee paralelne linije koje odgovaraju
95 postotnoj ili 105 postotnoj koncentraciji (slika 1b).
Podruje je raspon izmeu gornje i donje koncentracijske
granice analita (granice su ukljuene) u uzorku koje se
mogu kvantificirati uz odgovarajuu preciznost, istinitost
i linearnost. Za odreivanje tog parametra nije potrebno
provoditi zasebne eksperimente, nego se zakljuci izvode iz
studije linearnosti.

Preciznost pod uvjetima obnovljivosti ili obnovljivost promjenljivi uvjeti ukljuuju razliite laboratorije. Taj se parametar
odreuje u svrhu normiranja metode i rijetko je sastavni dio
validacije koju provodi sm laboratorij. Eksperimentima preciznosti kvantificiraju se sluajne pogreke metode, a numeriki je pokazatelj standardna devijacija, koeficijent varijacije
ili varijanca. Kod eksperimenata meupreciznosti iznimno je
vano mjerenja koja se ponavljaju provoditi u uvjetima koji
su to sliniji onima pri rutinskoj uporabi metode. U sluaju
rezultata koji ne zadovoljavaju treba otkriti najvaniji izvor
pogreke i pokuati ga ukloniti.
Vano je naglasiti da se eksperimenti preciznosti rade na homogenom autentinom uzorku, odnosno umjetno pripremljenom uzorku, a postupak se ponavlja prema propisu u
metodi upravo onako kako e se ubudue raditi u praksi. Broj
ponavljanja treba zadovoljiti zahtjeve statistike. Najee se
radi po tri ponavljanja na nekoliko koncentracijskih razina
koji se, naravno, poklapaju s podrujem linearnosti. Kriteriji prihvatljivosti ovise o vrsti analize, matrici uzorka i koncentraciji analita koji se odreuje.
Istinitost metode definira se kao stupanj podudaranja izmeu stvarne, tj. prihvaene referencijske vrijednosti, i
srednje vrijednosti dobivene primijenjenim postupkom
odreeni broj puta. Numeriki pokazatelj istinitosti eksperimentalno je utvreno sustavno odstupanje (eng. bias) metode, dobiven je kao razlika aritmetike sredine rezultata i
referencijske vrijednosti ili kao njihov odnos, to se posebno
primjenjuje kod odreivanja iskoritenja. Eksperimenti se
provode nakon odreivanja selektivnosti, linearnosti i preciznosti, najmanje tri puta za najmanje tri koncentracijske ra-

Odziv detektora

Odziv
detektora / koncentracija

U puno sluajeva podruje je odreeno svrhom metode i nema potrebe za ispitivanjem krajnjih mogunosti metode. Naprotiv, suavanjem podruja na koncentracijski raspon uzoraka postiu se bolja tonost i preciznost metode. Meutim,

meupreciznost preciznost koja se ostvaruje unutar

istog laboratorija u duljem razdoblju uz oekivane
promjene nekih uvjeta (razliiti analitiari, instrumenti, kolonereagensi iz razliitih boca i razliitih dobavljaa).

Koncentracija

Slika 1. Dva naina grafikog prikaza linearnosti

62

Logaritam

Istinitost metode mogue je procijeniti na nekoliko naina:

usporedbom rezultata ispitivane metode s rezultatima
dobivenim uhodanom referencijskom metodom
analizom uzorka poznate koncentracije, npr. certificiranoga referencijskog materijala i usporedbom izmjerenih rezultata i certificiranih vrijednosti
cijepljenjem matrice ili uzorka poznatom koncentracijom referencijskog materijala.
Rezultati se mogu prikazati grafiki kao odnos teorijske (oekivane) vrijednosti prema izmjerenoj koncentraciji, ali obvezatno kao srednje iskoritenje. Relativna standardna devijacija i ovdje moe posluiti kao pokazatelj preciznosti.

Ako se zahtijeva da metoda ima zadanu preciznost na granici kvantifikacije, pripremi se vie uzoraka poznate koncentracije u podruju oko mogue granice kvantifikacije, svaki se
izmjeri 56 puta i izraunaju se relativne standardne devijacije za svaku koncentraciju. Zatim se grafiki prikae odnos
RSD-a prema koncentraciji i iz grafa odredi koncentracija na
granici kvantifikacije s tono odreenom preciznou kako
se vidi na 3. slici. U praksi se obino pripremi uzorak tako
odreene koncentracije i potvrdi preciznost viekratnim mjerenjem.

laboratoriji

zine rasporeene unutar radnog podruja metode. Raspon

koncentracija treba odgovarati stvarnom uzorku, ali treba
ukljuiti i koncentraciju na granici kvantifikacije (GK) kada
je ona bitna.

Parametar granice kvantifikacije iznimno je vaan kod metoda kojima se odreuju analiti u tragovima koji i u vrlo niskim
koncentracijama mogu tetno djelovati na zdravlje ljudi i
okoli.

Nekoliko praktinih napomena povezanih s istinitou:

matrica ili uzorak cijepe se dodavanjem (uvagivanjem)
referencijskog materijala na samom poetku postupka
tako da cijepljeni uzorak bude podvrgnut cjelokupnom postupku od pripreme uzorka do mjerenja
iskoritenje ovisi o matrici uzorka, postupku uzorkovanja i koncentraciji analita
kod kromatografskog odreivanja vie komponenta
treba odrediti imbenike odziva za svaku komponentu ako se sve odreuju preko istoga referencijskog
materijala
Granica detekcije/kvantifikacije najmanja je koliina analita u uzorku koja se moe detektirati/kvantificirati uz odgovarajuu preciznost i tonost. Odreuje se razrjeivanjem
osnovne otopine.
Procjena moe biti vizualna, s pomou omjera signal/um ili
statistika. Vizualna se procjena moe primijeniti i kod neinstrumentnih i instrumentnih metoda, uglavnom samo za granicu detekcije, a procjenjuje se najmanji signal koji se nedvojbeno moe prepoznati. Omjer signal/um moe se
primijeniti samo na analitike postupke s baznom linijom, a
prihvatljivi su omjeri 3 : 1 za granicu detekcije i 10 : 1 za granicu kvantifikacije. Statistiki se granice detekcije i kvantifikacije mogu odrediti na bazi standardne devijacije signala i
nagiba prema jednadbama: GD = 3.3 /a, odnosno Kg = 10
s/a pri emu je a nagib, a s standardna devijacija regresijskog
pravca.

Slika 3. Odreivanje granice kvantifikacije sa zadanom preciznou

Robusnost se odreuje kao mjera otpornosti analitikog

postupka na male, namjerne promjene radnih uvjeta metode.
Ispitivanje robusnosti provodi se kako bi se odredilo kako
male promjene radnih uvjeta i provedbe metode utjeu na
rezultat analize. Vaan su dio razvoja metode jer pomau otkriti optimalne uvjete izvedbe metode te upuuju na to to
treba nadzirati. Tijekom eksperimenta mijenjaju se radni
uvjeti unutar stvarnih granica i prati kvantitativna promjena
rezultata. Na primjer kod tekuinske kromatografije ispituju
se utjecaji sastava i pH mobilne faze, temperature, protoka te
razliite are ili dobavljai kolona. Stabilnost otopine takoer je tipian parametar ispitivanja robusnosti metode. Ako
promjena nekog radnog uvjeta ne utjee bitno na rezultat,
kae se da je on u podruju robusnosti metode. Uvjete za koje je utvreno da utjeu na rezultat treba drati pod nadzorom i to jasno naznaiti u opisu metode. Primjeri utjecaja
promjene parametara temperature kolone i pH mobilne faze
prikazani su na 4. slici.
Prema podacima o robusnosti postavljaju se parametri za ispitivanje prikladnosti sustava.
Pri provedbi validacije nije potrebno za svaku metodu odrediti sve parametre. Njihov odabir ovisi o namjeni metode,
kako to je to prikazano u 1. tablici.

NEPRECIZNO I
NETONO

PRECIZNO ALI
NETONO

PRECIZNO I
TONO

Slika 2. Prikaz preciznosti i istinitosti

Razumijevanje znaenja pojedinih parametara i naina na

koji se izvode u laboratoriju, poznavanje znaajka metode i
regulatornih zahtjeva osnova su za postavljanje kriterija pri63

Tablica 1. Validacijski parametri potrebni za validaciju analitikih metoda razliitih namjena

laboratoriji

Analiza tragova
Identifikacijski
Sadraj
testovi
kvantitativna Limit Test
istinitost
preciznost
ponovljivost
meupreciznost
selektivnost
GD
GK
linearnost
podruje
4. slika Postojanost metode utjecaj
temperature kolone i pH mobilne faze

hvatljivosti za svaki parametar, to je takoer neizostavni dio

validacije. Postavljeni kriteriji usporeuju se s dobivenim rezultatima eksperimenata, a zadnji je korak validacije pisanje
izvjea s jasno naznaenim zakljukom o potvrdi da metoda
odgovara namijenjenoj svrsi.

ne

da

ne

da

ne
ne
da
ne
ne
ne
ne

da
da
da
ne
da
da
da

ne
ne
da
da
ne
ne
ne

da
da
da
ne
ne
da
da

Prema: ICH Harmonised Tripartite Guideline Validation Of Analytical Procedures: Text And Methodology Q2(R1)

Zakljuak
Validacijom analitike metode dobit e se obavijesti o njezinoj tonosti i preciznosti, o odnosu izmeu koncentracije
uzorka i odziva metode, o moguim interferencijama iz matrice uzorka, o najmanjim koncentracijama koje e se moi
utvrditi ili kvantificirati tom metodom i doznat e se njezine najslabije, ali i najjae strane. Validacija analitikih metoda je regulatorni zahtjev kao i profesionalna odgovornost
analitiara. Vrijeme i novac uloeni u validaciju investicija
su koja e se viestruko isplatiti tijekom koritenja metode
pruajui sigurnost analitiarima i vjerodostojnost njihovim
rezultatima.

Literatura
[1] The European Community Guidelines: CPMP Committee for Proprietary Medicinal Products (http://
www.eudra.org)
[2] USA Guidelines: US Food and Drug Administration (http://www.fda.gov)
[3] USP (http://www.usp.org)
[4] cGMP (http://www.cgmp.com)
[5] International Committee for Harmonisation (http://www.ich.org) ICH Guidance for Industry Q2(R1)
Validation of Analytical Procedures Methodology
[6] Eurachem (http://www.vtt.fr/ket/eurachem) The Fitness for Purpose of Analytical Methods
[7] AOAC How to Meet ISO 17025 Requirements for Method Verification Prepared by AOAC INTERNATIONAL 481 N. Frederick Ave, Suite 5002007
[8] IUPAC Technical Report: Harmonized Guidelines for Single Laboratory Validation of Methods of Analysis,
Pure Appl. Chem., Vol. 74, No. 5, pp. 835855, 2002
[9] NATA: Technical Note #17 Guidelines for the Validation and Verification of Chemical Test Methods, April
2009

64