Metode molekularne

biologije

Proizvodnja velikog broja identinih kopija

gena ili DNA sekvence (KLONIRANJE)

Nova saznanja o strukturi i funkciji

prokariotskog i eukariotskog genoma

Dijagnostika genskih bolesti i primjena u

njihovom lijeenju

Modificiranje
nekog organizma
da proizvede
protein koristan
ovjeku (inzulin)

Promjena svojstava
biljaka ili ivotinja

Ispitivanje gena i
mutacija
odgovornih za
specifine bolesti
(model mia s
distrofijom)

Zato izoliramo DNA?

Kako izoliramo DNA?

Genomska DNA izdvaja se iz raznih tkiva postupkom koji se odvija u

nekoliko standardnih koraka:

1. Uzimanje uzorka
2. Homogenizacija tkiva
3. Inkubacija uzorka u odgovarajuem puferu s Proteinazom K
4. Izdvajanje proteina (fenol/kloroform, isoljavanjem)
5. Taloenje, ispiranje i otapanje dobivene DNA;

http://www.iupui.edu/~wellsctr/MMIA/htm/animations.htm

ODREIVANJE KVALITETE DNA

- elektroforeza u 1% gelu agaroze i fotografiranje
uzoraka u gelu agaroze
- provjera koncentracije i istoe DNA molekule
spektrofotometrom
istoa DNA:
omjer apsorbance DNA i proteina (260 nm/280 nm) > 1.7.
Koncentracija DNA:
apsorbancija na DNA 260 nm x 50 x razrjeenje

DNA KARE - restrikcijski enzimi reu DNA

DNA SORTERE - gel elektroforeza razvrstava

DNA molekule prema veliini

DNA KOPIRKE - PCR proizvodi mnoge kopije

ciljne DNA

DNA ITAE - DNA probe omoguavaju

vizualiziranje DNA

reu DNA unutar lanca na

mjestima specifinih
sekvenci - RESTRIKCIJSKA
MJESTA (slijed od 4 do 8
nukleotida)
Broj restrikcijskih
fragmenata ovisi o tome
koliko je prepoznatljiva
sekvenca prisutna u DNA.

Neki enzimi reu oba

lanca izmeu istih
nukleotidnih kopija
dajui ravne (tupe)
krajeve, dok drugi cikcak proizvodei
ljepljive krajeve.

IZOSHIZOMERI - razliiti restrikcijski enzimi koji

prepoznaju istu nukleotidnu sekvencu.

ELEKTROFOREZA je proces pokretanja

nabijenih molekula u elektrinom polju.
Molekule se u elektrinom polju kreu u ovisnosti
o naboju, obliku i veliini.
Najee koriteni mediji za elektroforezu:
poliakrilamid i agaroza

Gel je horizontalni
pravokutni sloj
agaroze kroz koji e
prolaziti DNA u
elektrinom polju.

Negativno nabijena DNA

(fosfati) migrira prema
pozitivnom polu

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/electrophoresis.html

Krai DNA fragmenti migriraju bre

od duih fragmenata

208 bp
147 bp
61 bp

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/
electrophoresis.html

Gel se formira kada se mjeavina akrilamida i umreujuih (crosslinker) bisakrilamida polimerizira u duge lance kovalentnim vezama.

Elektroforeza u denaturirajuem
poliakrilamidnom gelu
Smjesa fragmenata DNA razdvaja se elektroforezom u
denaturirajuem poliakrilamidnom gelu

metoda u kojoj se proteini razdvajaju po molekularnoj teini

DNA izolacija

cijepanje DNA pomou

restrikcijskih enzima

ugraivanje DNA
fragmenata u vektor
(REKOMBINACIJA)

uvoenje vektora u
pogodnog domaina
(TRANSFORMACIJA)

kultiviranje na hranljivoj
podlozi pri emu se
identificiraju transformirane
i netransformirane stanice

SEKVENCA ORI - dirigira

umnoavanje plazmida u
stanicama domaina.
2. SELEKTIVNI MARKER doprinosi otpornosti na
toksine supstance; kada
plazmidi transformacijom uu
u stanicu domaina njihova
se prisutnost oituje.
3. JEDINSTVENA MJESTA
CIJEPANJA (MCS) da bi se
ubacile DNA sekvence koje
elimo klonirati.
1.

PCR

http://www.iupui.edu/~wellsctr/MMIA/htm/animations.htm
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html

PCR

Koliina
(za 1 uzorak)

Konana
koncentracija

10x PCR pufer

1,5 l

1x PCR pufer

50 mM MgCl

0,45 l

1 mM

10 mM dNTP

0,3 l

0,05 mM

10x primer YF

0,75 l

0,2 M

10x primer YR

0,75 l

0,2 M

Bidestilirana voda

10,1 l

Taq polimeraza

0,15 l

DNA

1l

1,5 U

100 kopija

500 kopija

Detektira nakupnjanje produkta kroz reakciju

Optimalna za analizu produkata

Kvantifikacija ekspresije gena

Viralna kvantifikacija
Potvrda microarray-a
Djelotvornost lijenja lijekovima
Mjerenje oteenja DNA
Detekcija patogena
Genotipizacija
Detekcija GMO

Hibridizacijska
SONDA ili PROBA

jednolanani DNA
fragment komplementaran
traenom dijelu DNA se
obiljei (radioaktivno ili
neradioaktivno) i vezuje se
za eljenu DNA sekvencu.

Western blot je metoda

detekcije jednog proteina,
u mjeavini puno razliitih
proteina, razdvojenih
SDS-PAGE-om

Nakon SDS-PAGE
proteini se prenose na
membranu na kojoj se
izvodi imunodetekcija

Interfazni FISH
Probe za kromosome
13 zeleno

21 crveno

Fluorescence
in situ
Hybridization
- FISH

Nije prisutna
mikrodelecija 15q11-13

Microarray u biologiji:

u genomici:

Genska ekspresija
SNP

CGH
Metilacijska analiza
siRNA skrining

CHiP

u proteomici

(Science (2002) 295:1443)

Tehnika molekularne
biologije
PCR - RFLP

PCR u dijagnostici:
Hemokromatoza
poremeaj taloenja eljeza u organizmu
poveana crijevna apsorpcija eljeza
prekomjerno odlaganje eljeza u stanicama
oteenja jetre, guterae, srca i hipofize

Tijek hereditarne hemokromatoze

Hereditarna hemokromatoza
(HH)
oblik primarne hemokromatoze
autosomno-recesivna bolest
prevalencija oboljelih u europskoj
populaciji:
od 1/300 do 1/700

Gen za hemokromatozu
Simbol gena: HFE
Genski lokus: 6p21.3
Veliina: - 10000 bp
- 7 egzona
Produkt gena :
hemokromatozni protein

Mutacije HFE gena

C282Y - zamjena AK
cistein s tirozinom na
mjestu 282 HFE proteina

H63D - zamjena AK
histidin s asparaginom
na mjestu 63 HFE proteina

S65C - zamjena AK
serin sa cisteinom
na mjestu 65 HFE proteina

METODE
Izolacija DNA iz limfocita periferne krvi
Analiza mutacija C282Y, H63D metodom PCRRFLP
Provjera restrikcijskih fragmenata elektroforezom
i utvrivanje homozigota divljeg tipa, heterozigota
i homozigota za svaku mutaciju

PCR reakcijska smjesa za C282Y, H63D

mutacije
Koliina
(za 1uzorak)

Konana
koncentracija

10x PCR pufer

1,5 l

1x PCR pufer

50 mM MgCl

0,45 l

1 mM

10 mM dNTP

0,3 l

0,05 mM

10x primer YF

0,75 l

0,2 M

10x primer YR

0,75 l

0,2 M

Bidestilirana voda

10,1 l

Taq polimeraza

0,15 l

DNA

1l

1,5 U

Program PCR temperaturni ciklusi

Korak
PCR
postupka

Temperatura

1.

94

2.

94 C
55,5 C
72 C

3.

72

Vrijeme

Broj ciklusa

5 min.

1x

1 min.
1 min. 20 sek.
1 min.

35 x

10 min.

1x

Restrikcijska smjesa za analizu C282Y, H63D

mutacije
Koliina
(za 1 uzorak)

Konana
koncentracija

PCR produkt

10 l

10 x pufer REact
(Rsa , Mbo )

2 l

1x

Restrikcijski enzim

0,2 l

0,1 U

Bidestilirana voda

7,8 l

Veliina PCR produkta i restrikcijskih fragmenata za

pojedini genotip pri analizi H63D lokusa
PCR
produkt

294 bp

237 bp
138 bp
99 bp
57 bp

normalan homozigotna
heterozigot
homozigot mutacija