PARAMETER KUANTITATIF

1. Gangguan
Presisi pada beberapa pengukuran sinyal (yang berhubungan dengan
hasil pengujian) dipengaruhi oleh ukuran puncak (sinyal) yang berhubungan
dengan gangguan. Gangguan mengacu pada ketidakpastian dalam nilai
sinyal awal tanpa adanya analit. Terdapat 3 macam gangguan, yaitu pada
jangka pendek, jangka panjang, dan pergeseran awal. (diilustrasikan pada
gambar 14.2)
a. Gangguan jangka pendek (juga disebut sebagai high-frequency
noise) menjadi perhatian utama bagi sebagian pengukuran S/N. Jenis
gangguan ini dapat disebabkan oleh beberapa faktor seperti gangguan
pada detector, dorongan pada sistem pompa, dan gangguan elektronik
dalam sistem integrasi. Komponen gangguan ini (biasanya dengan
periodisitas > 1 Hz) dapat membatasi kemampuan pengukuran sinyal
dalam HPLC.
b. Gangguan jangka panjang (variasi sinyal dengan frekuensi < 0.1 Hz)
merupakan indikasi dari luar atau masalah pada sistem. Penyebab
gangguan ini termasuk:

Pencampuran komponen pelarut yang buruk sehingga

menyebabkan sedikit variasi pada fase gerak selama analisis
berlangsung

Variasi suhu

Kebocoran fase diam dari kolom (terutama selama elusi

gradien)

Senyawa akhir yang terelusi dari injeksi sebelumnya

c. Pergeseran awal (baseline drift), dapat dianggap sebgai tipe khusus

dari gangguan jangka panjang, dapat terjadi meskipun dalam metode
yang sudah dikembangkan dengan baik dan divalidasi. Tipe baseline
drift yang paling banyak terlihat adalah pada saat elusi gradien, di
mana komposisi pelarut berubah selama proses running, oleh karena
itu, respon detector (biasanya UV) dapat berubah sesuai fungsi dari
komposisi pelarut. Pengulangan garis dasar (baseline) dapat dibentuk
dan dapat dilakukan pengukuran panjang puncak dan area puncak
meskipun terbukti adanya pergeseran baseline yang disebabkan elusi
gradien.
Late-eluting peaks (puncak dari injeksi sebelumnya) dapat terlihat
sebagai baseline drift. Puncak-puncak tersebut dielusi sebgai pita yang
luas terkadang tidak dikenali dari baseline drift tipe yang lain. Masalah
baseline ini sering terjadi pada pemisahan isokratik ketika senyawa
akhir yang terelusi tidak dibersihkan dari kolom setelah proses
penginjeksian.
Baseline drift juga disebabkan oleh perubahan dalam detector.
Beberapa indeks refraktif detector yang sensitive terhadap perubahan
suhu; perubahan suhu dari sel detector dapat menyebabkan beberapa
pergeseran (drift) pada sinyal output. Selain itu,baseline drift juga
dapat terjadi pada detector UV yang disebabkan oleh erubahan
intensitas lampu atau diode detector atau phototube.
2. Panjang Puncak (Peak Height)
Cara yang paling mudah untuk menentukan respon detektor adalah
dengan melihat panjang puncak dari suatu sinyal. Panjang puncak
merupakan jarak antara dasar dan juga puncak (bagian teratas) dari suatu
puncak, dimana nilai pada dasar adalah rata-rata dari berbagai data dari awal
puncak hingga akhir. Untuk beberapa puncak yang tidak dapat ditentukan,
panjang puncak dapat ditentukan dengan menggunakan metode skimming
tangen. Metode ini hanya digunakan apabila terdapat puncak yang kecil

pada ujung yang berekor dari puncak sebelumnya. Pengukuran panjang

puncak merupakan prosedur yang mudah dan kebanyakan sistem data
terkini juga menghitung panjang puncak.
3. Luas Daerah puncak (Peak area)
Luas daerah puncak adalah teknik yang umum digunakan dalam
kuantisasi hplc. Luas daerah puncak didefiniskan sebagai integral dari
respons sinyal per waktu dimulai dari awal sampai dengan akhir puncak. Hal
ini relatif sejalan dengan teori. Akurasi dan presisi pengukuran luas daerah
puncak dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu :

penentuan dasar yang tepat, khususnya pada keberadaan panjang atau

pendeknya noise.
Penentuan awal dan akhir puncak. Hal ini sedikit sulit ditentukan

untuk daerah puncak yang tidak simetris.

Jumlah data point yang didapat harus cukup besar untuk membantu
akurasi daerah puncak yang sebenarnya.
Luas daerah puncak umumnya ditentukan menggunakan integrator atau

melalui sistem data komputerisasi. Luas daerah puncak juga dapat

ditentukan secara manual. Melalui sistem data komputer, luas daerah puncak
didapat melalui penjumlahan dari sinyal atau waktu perpotongan terhadap
puncak. Metode integrasi ini bisa memberikan hasil yang presisis jika
dilaksanakan dengan baik (biasanya, presisi lebih baik dari 0,2% untuk
puncak dengan S / N 'besar.) Deteksi puncak untuk sistem data ini
kebanyakan didasarkan pada nilai ambang puncak untuk menentukan kapan
puncak dimulai dan diakhiri. Penentuan ambang puncak yang tidak tepat
dapat mempengaruhi akurasi dari kuantisasi. Setiap data sistem hanya
memiliki sedikit perbedaan, oleh karena itu sistem ini harus dipastikan
berjalan sebagaimana mestinya sehingga didapatkan hasil yang baik.
4. Kuantisasi Panjang Puncak vs Luas Daerah Puncak
Panjang puncak dan luas puncak dapat digunakan untuk kuantisasi
dalam HPLC, selama kalibrasi yang tepat dilakukan dalam metode yang

sama. Kuantisasi luas puncak banyak digunakan dalam HPLC namun

metode ini bukanlah yang terbaik. Untuk puncak yang hampir simetris,
panjang puncak lebih tepat dan akurat daripada pengukuran dengan luas
puncak. Seperti contoh : perubahan kecil pada laju alir (F) akan
mempengaruhi pengukuran panjang puncak ( F -0.2) kurang dari itu, akan
mempengaruhi pengukuran luasa puncak (F-1). Perubahan pada kondisi
kolom yang mempengaruhi jumlah plate (N) mempengaruhi pengukuran
panjang puncak tetapi tidak mempengaruhi pengukuran luas puncak. Pada
akhirnya, pengukuran panjang puncak merupakan metode yang lebih sering
digunakan untuk analisis kuantisasi. Semenjak resolusi yang tidak lengkap
dari analit target sering menjadi kendala, maka kuantisasi panjang puncak
lebih akurat karena sedikitnya gangguan yang ada dalam penentuan ukuran
puncak.