Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Formareprofesionalasi
organizationalaaangajatilordin
LaboratoareledeImunologieprin
implementareatehnologiilorde
varfsiamanagementuluicalitatii
IMUNOLAB

POSDRU/81/3.2/S/59497
Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Rolul si responsabilitatile asistentilor medicali

in aplicarea metodelor de diagnostic
molecular
Tehnici si metode moleculare in laboratorul
clinic
Conf. Univ. Dr. Eld NAGY
Societatea de Imunologie din
Romania
Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Metodele de diagnostic molecular n laboratorul clinic

analizeaz ADN, ADNc, ARN izolat/transscris/circulant
Tehnic: sintez/amplificare/digestie enzimatic/separatologie/secveniere

Complexitate i finee biochimic

Faza preanalitic este decisiv pentru calitatea rezultatului

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Faza preanalitic

Faza analitic
Faza postanalitic

Asistent

Specialist

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Probele procesate pot fi:

suspensie de celule cultivate sau prelevate

prin biopsie cu ac fin
celule prelevate prin microdisecie cu laser
esuturi prelevate chirurgical
esuturi parafinate
snge integral
altele

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Tehnici majore de biologie molecular aplicate

n laboratorul clinic
genotipare

ncrcare viral

PCR SNP
PCR - secveniere
PCR RFLP

RT-PCR
qPCR

Expresie genic
RT-PCR
qPCR
Northern blotting

Mutaii genice
PCR
Hibridizare in situ
Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Protocol de lucru

I. Preluate din literatur

sau recomandate de ctre
furnizorul de echipament
sau reactivi

Testare
Validare

II. Protocoale proprii

Elaborare documenatat i verificat
Acuratee, reproductibilitate

Validare
Implementare
Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Izolarea ADN

Izolarea i verificarea calitii ADN-ului

genomic :
- spectrofotometrie UV
- electroforez
Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Izolare ARN
Celule, esuturi: QIAZOL/TRIZOL/ purificare ulterioar cu Rneasy
Snge: ndeprtarea eritrocitelor si a hemoglobinei cu centrifugare
prin gradient de densitate (Ficoll, Lymphoprep)
esuturi parafinate i probe cu coninut sczut de ARN (< 100 ng):
kituri speciale ca RT2 FFPE RNA Extraction Kit sau PicoPure RNA
Isolation Kit

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

IZOLAREA ARN
Izotiocianat de guanidiu inactiveaza ARN-azele, denaturant puternic pentru proteine
Extracie cu Fenol/Cloroform n tampon acid

TRIZOL

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Metod I. Izolare pe coloane de centrifug

Metod II. Izolare cu perle magnetice

ncrcate cu oligo(dT)

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

PRINCIPII APLICATE N IZOLAREA ARN

Izolare ARN: agentul de denaturare trebuie s
intre n contact cu coninutul celular chiar de la
nceput
ARN-ul total sau ARN poliA izolat este foarte
sensibil la efectul ARN-azelor, care lucreaz mai
uor la temperaturi crescute. Congelarea trebuie
efectuat ct mai repede posibil
esuturi calcifiate, microbii cu capsul,
Bacilul Koch se proceseaz greu. Congelarea
acestor probe i mcinarea ultrerioar face
posibil amnarea izolrii ARN, dar este greoaie.

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Control de calitate
Det. concentratiei i puritii ARN prin UV-Spectrofotometrie
Concentraia total prin A260 trebuie s fie mai mare dect 0.5 mg/ml
Raport A260:A280 2.0.
Raport A260:A230 1.7.
Integritatea benzilor ribosomale
Electroforeza ARN pe gel de agaroz denaturant sau
Agilent BioAnalyzer pentru analiza peak-urilor 18 S i
28S rARN.

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Progrese
Soluie de stabilizare ARN
(RNA Later TISSUE storage)
Celulele colectate sau disecate
se introduc n soluie
Permite amnarea izolrii,
Probele se pot stoca la 4C
sau temperatura camerei
ARN prezint stabilitate pn
la o lun

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Procesarea automatizat a probelor biologice multiple

Prelucrare automat, simultan
Ex. TissueLyser II prepar probe prin
agitare n tuburi de plastic cu lame de oel
sau perle de sticl

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Hibridizare de acizi nucleici

Amplificare genic: PCR

Necesar: Taq pol, dNTP, primeri
Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Analiza expresiei genice: RT-PCR (reverse-trascriptase PCR)

ADNc
Bibliotec !

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

PCR varianta real-time principiu i explicaie

(Taq pol, primeri, quencher, reporter, dNTP)

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Diagnosticul molecular n microbiologie

Detecie
Identificare
Analiz epidemiologic

Amplificare genic
(ADN, ADNc, ARN)

Concentraie variabil de microbi n probe biologice !

Limit de detecie 1-100 ampliconi n probe biologice !

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Secveniere genic

Templat ADN
Primeri
ADN polimeraz
(dATP, dGTP, dCTP and dTTP)
Nucleotide modificate (ddNTPs) marcate
fluorescent
Evideniere clasic: 4 reacii , electroforez
PAGE
n prezent: 1 reacie, 4 ddNTP marcate cu 4
fluorofori
diferii, care se pot excita ntr-un singur amestec

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Genotipare prin PCR- RFLP

Testarea rezistenei la azitromicin pentru

T. Pallidum (Morshed et al. 2007)

Amplificare + digestie + electroforez

Polimorfisme, mutaii
Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

PCR: aplicaii
Evidenierea infeciei
B. burgdorferi prin PCR
i Western blotting
Prezena genelor rrf/rrl
atest prezena unei borelii
Prezena genei osp A
indic prezena B. Burgdorferi
(Morshed et. Al, 2007)

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Identificare unor specii de Borrelia pe

Baza secvenelor ARN r 16S

1, B. japonica; 2, B. burgdorferi sensu stricto; 3, B.

garinii; 4, B. afzelii; 5, B. valaisiana; 6, B. lusitaniae; 7,
spirochete /febr recurent spaniol; 8, B. turicatae;
9, B. duttonii; 10,Borrelia anserina; 11, B. hermsii;
12, B. crocidurae; 13, B. recurrentis; 14, B. hispanica;
15, R57.
Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

PCR: aplicaii
Tulpini S. aureus mecA pozitive
1

SM

(E. Szekely si colab., 2011)

1-2: izolate clinice mecA pozitive

3: control pozitiv Staphylococus aureus ATCC 43300 mecA pozitiv
(190 bp)
4: control negativ
SM: scara moleculara 100 bp
Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

PCR: aplicaii
Monitorizarea tratamentului antiviral

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Probleme diagnostice n aplicarea PCR

Contaminarea probei
Ampliconi nespecifici
(ex.flor normal)

Fals pozitivitate

GenBank
BLAST
Se verific specificitatea primerilor

Metode de evitare
HOT START
NESTED PCR
Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Probleme diagnostice n aplicarea PCR

Fals pozitivitate

Fragmentul amplificat al unei gene

din Borrelia burgdorferi (LCR) prezint
aceeai lungime ca i o secven
contaminant, de origine uman
(Morshed et al., 2007)

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Probleme diagnostice n aplicarea PCR

Absena secvenei cutate
Inserie
Deleie

Fals negativitate

Recoltare inadecvat
Condiii improprii de amplificare

Material inhibitor (ADN-aze, ARN-aze) !

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011

Investetenoameni!

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Probleme diagnostice n aplicarea PCR

Fals negativitate

Surse:
1. Recoltare
2. Transport

Snge integral !

Congelare la -20C pentru ADN

- 70C pentru ARN

3. Stocare
inadecvat

Mediu fr ADN-aze, ARN-aze !

(inhibitori)

Activitatea A1.4.:

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011