ELISPOT

A. PERSIAPAN (kondisi steril)

1. Encerkan lapisan antibodi (TNF3 / 4) sampai 15 g / ml Dalam PBS steril,
pH 7,4.
2. Ambil plate ELISpot dari kemasan dan jika menggunakan plate PVDF,
basahi dulu membrane dengan menambahkan etanol. PVDF-plate dari
Millipore Corp., MAIPSWU, harus diberi 50 l etanol 70% per well
selama 2 menit. PVDF-plate, jenis MSIP, harus diberi 15 l ethanol 35%
per well selama maksimal 1 menit.
3. Cuci plate 5 kali dengan air steril, 200 l / well.
4. Tambahkan larutan antibodi 100 l / well dan inkubasi semalam pada 4-8
C.
B. Inkubasi sel pada plate (kondisi steril)
1. Hapus kelebihan antibodi dan bilas plate 5 kali dengan PBS steril, 200 l /
2.

well.
Tambahkan media yang berisi 10% serum yang sama sebanyak 200 l /
well seperti yang digunakan untuk suspensi sel. Inkubasi selama minimal

30 menit pada suhu kamar.

3. Lepaskan media dan tambahkan rangsangan diikuti oleh suspensi sel. Atau
4.

sel dan rangsangan dapat dicampur sebelum ditambahkan ke dalam plate.

Letakkan piring dalam incubator yang dilembabkan dalam 37 C dengan
5% CO2 dan inkubasi selama 12-48 jam. Jangan pindahkan plate selama
waktu ini dan hindari penguapan (misalnya dengan membungkus
menggunakan aluminium foil).

C. Deteksi spot
1. Ambil sel dengan mengosongkan plate dan bilasi 5 kali dengan PBS, 200
2.

l / well.
Encerkan antibodi deteksi (TNF5-biotin) menjadi 0,5 ug / ml di dalam
PBS yang mengandung serum sapi 0,5% (PBS-0,5% FCS). Tambahkan

100 l / well dan inkubasi selama 2 jam pada suhu kamar.

3. Cuci seperti di atas (langkah C1).

4.

Encerkan Streptavidin-ALP (1: 1000) di dalam PBS-0,5% FCS dan

tambahkan 100 l / well. Inkubasi selama 1 jam pada suhu kamar.

5. Cuci seperti di atas (langkah C1).
6. Tambahkan 100 l / well larutan substrat (misalnya BCIP / NBT) dan
biarkan hingga berkembang sampai terbentik titik yang berbeda muncul.
7. Hentikan pengembangan warna dengan mencuci secara ekstensif dalam air
keran. Jika diinginkan, ambil plate dari baki atau cuci dan bilas di bagian
bawah membran.
8. Biarkan plate mengering. Periksa dan hitung bintik-bintik di pembaca
ELISpot atau di mikroskop diseksi.
9. Simpan plate dalam gelap dan pada suhu kamar.

PETUNJUK DAN KOMENTAR

Saran ini didasarkan pada deteksi respon imun-antigen spesifik menggunakan
PBMC. Jika menggunakan cloning sel T, campuran dari fraksi sel terpisah dll,
protokol lain mungkin harus dipertimbangkan.

Plate
Kami merekomendasikan penggunaan plate membran berbasis PVDF. Kapasitas
maksimal ikatan antibodi pada plate ini diperoleh dengan tatalaksana singkat
dengan etanol. Sangat penting bahwa membran tidak dibiarkan kering setelah
dibashai etanol. Jika hal ini terjadi maka langkah (A2-3) perlu diulang sebelum
menambahkan antibodi coating.
Pencucian plate
Selalu hapus plate MAIPSWU dari baki piring sebelum mengosongkan plate
secara manual. Bilas platepiring dapat dilakukan dengan menggunakan
mikropipet multi-channel. Dalam tahap pencucian tidak membutuhkan kondisi
steril (C1- C5), sebuah pencuci palte ELISA biasa juga bisa digunakan, asalkan
kepala bilasannya disesuaikan dengan plate ELISpot. Hndari adanya cairan di

bagian bawah membran karena hal ini dapat menyebabkan kebocoran karena
drainase kapiler.
Sel
Baik sel yang baru disiapkan dan sel cryopreserved dapat digunakan dalam uji ini.
Namun dianjurkan bahwa sel yang sudah dikryopresipitasikan ini dibiarkan dulu
selama setidaknya satu jam untuk memungkinkan penghapusan debris sel sebelum
ditambakhkan ke dalam plate. Triplicates atau
duplikat dari 250.000 sel per well seringkali digunakan untuk menilai responantigen spesifik. Untuk aktivator poliklonal, jumlah sel harus dikurangi untuk
menghindari pembentukan spot konfluen. Protokol dengan waktu inkubasi lainnya
harus ditetapkan oleh pengguna.
Serum
Serum harus dipilih untuk mendukung kultur sel dan menunjukkan latar belakang
pewarnaan rendah. Kami merekomendasikan penggunaan serum fetus sapi. Atau
media bebas serum yang dievaluasi untuk kultur sel. Serum manusia tidak
dianjurkan karena dapat mengandung antibodi heterophilic atau analit intrinsik
yang dapat mengganggu uji ini.
Deteksi Antibodi
Untuk mengurangi latar belakang tidak spesifik dianjurkan untuk menyaring (0,2
m) pengenceran dari deteksi mAb.
Kontrol Uji
Jumlah sel yang merespon rangsangan sering dibandingkan dengan jumlah sel
spontan yang memproduksi sitokin, ditentukan dengan menginkubasi jumlah yang
sama tanpa adanya rangsangan. aktivator poliklonal seperti phytohemagglutinin
(1-10 g / ml) sering digunakan sebagai kontrol untuk viabilitas sel dan
fungsionalitas sistem uji.

Buffer
PBS untuk buffer cuci dan pengenceran harus disaring (0,2 m) untuk hasil yang
optimal. Meskipun dimungkinkan untuk digunakan, kita ttidak menyarankan
oenggunaan Tween atau deterjen lainnya sebagai buffer cuci dan inkubasi.
Pengembangan substrat
Spot yang erkembang sampai titik yang berbeda terlihat di well yang positif
(biasanya 10-30 menit). Membran yang umumbnya menjadi gelap dapat terhadi
namun menghilang setelah kering.