: EDUARDO FERNANDEZ ESCARTIN ro Pe MICROBIOLOGIA SANITARIA AGUA Y ALIMENTOS ; -VOLUMEN | UNIVERSIDAD DE GUADALAJARAEste libro ha sido preparado como parte de! convenio de intercambio académico entre el Instituto Politécnica Nacional, la Universidad de Guadalajara y la Asociacién Nacional de Universidades e Institutos de Ensefianza Superior. Agradecemos el apoyo financiero de la Direccion General de Investigacion y Superacién , Académica de la Secretaria de Educacién Publica . © ,UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA impreso y hecho en México Printed and made in Mexico ~ Guaidstajara, Jalisco, Mexico 1881 ¥ 4 ISBN Titulo 968-57-0057-5 ‘ISBN Tomo | 968-57-0060-5 1 4: PROLOGO Un problema que comunmente se aprecia entre los estudian- tes. dedicados a la preparacion de su trabajo de tesis profesio- nal es la investigacién bibliogréfica. Tal ocurre, tanto durante la fase previa a la planeacion, como durante el desarrollo del estudio y al término de! mismo, ya cuando vaaser escrito. El caso de !a microbiologia sanitaria no es !a excepcion. La publi- cacion de este libro. pretende facilitar el acceso de los estu- diantes a jas fuentes de informacion originales, porque sin duda, se induce asf un interés creciente por profundizar més‘ yimas.en el tema motivo de investigacion. Se nutren y forta-' fecen de esta manera la imaginacion, !a creatividad, la disci- plina y la objetividad, cualidades todas ellas altamente-desea- bles en un microbidlogo. Si, por otra parte, el contenido de este libro resulta de provecho para todos aquellos técnicos comprometidos en la vigilancia y control sanitario de los alimentos, sea en dependencias gubernamentales o en empre- sas privadas, desde jefes de control de calidad hasta inspecto- res y técnicos de laboratorio el objetivo central de esta obra quedaré plenamente satisfecho. 7 Dada la abundancia de material disponible y del que constantemente’ enriquece a esta disciplina, se ha planeado presentarlo en tres volumenes. Los dos primeros estarén referidos a los grupos de microorganismos y bacterias patoge- nas que tienen interés sanitario,en el agua y los alimentos. E18 tercer volumen tratara individualmente cada tipo de alimento Gesde el punto de vista microbiologico, puntualizando los efectos que resultan de la contaminacion y desarrollo de microorganismos, los mecanismos que los determinan, las medios para controlarlos y su papel en la epidemiologra de las ‘enfermedades toxicas e infecciosas asociadas @ su consumo. Se ha incluido al final de este primer volumen un glosa: rio que facilite a los interesados no especialistas en el campo, la comprensién de algunos términos que necesariamente han tenido que utilizarse en casi todos los capitulos. Debe en- tenderse que el significado que se le da a muchos.términos es- ta enfocado al caso particular de la microbiolog/a sanitaria, es decir, en el sentido con el que suele utilizarse en este campo. El autor desea expresar su reconocimiento a! apoyo ma- terial recibido por el doctor Rafael Velasco Fernandez, secre- tario ejecutivo de la Asociacion Nacional de Universidades ¢ Institutos de Educacién Superior, para la preparacion de la obra.: see Stung Ante tent Sten eer Faves ge : INTRODUCCION : La microbiologia sanitaria se ocupa de los microorganismos que pueden afectar la calidad sanitaria del agua y de los alimentos. Esta conceptualizacion territorial exige una clara comprensién del tér- mino sanitaria, y mejor aun de salud, con el cual se encuentra di- tectamente ligado. Tales relaciones no son algo meramente semén- tico. Como Jo veremos a continuacion, constituyen el trasfondo, el principio y: el ‘sentido sobre los cuales la microbiologia sanitaria normaisu aplicacion en el 4mbito de la medicina preventiva. i: Aunque cada vez més objetada, la definicién de salud atin se refiere’ a un estado de completo bienestar frsico, mental y social, y no solo a la ausencia de enfermedad. La parte més débil del con- cepto radica en la pasividad implicita de la palabra estado, como si la salud se tratara de algo completamente configurado y decidido. Por el contrario, se insiste en la actualidad en que la idea de salud, al aplicarse a un individuo en constante cambio, tanto en su medio, interno como en el medio ambiente (inclusive el medio social en el: que se desenvuelve), irremediablemente se torna en algo dindmico, y no es por ello algo que se ha alcanzado como final de una carre- ra, sino el proceso mismo que. pretende lograrla. A mayor eficien- cia de ese proceso, mayor salud. De cualquier manera, los elementos utiles del concepto son: los que destacan el requisito de que el individuo debe disfrutar su condicion de no énfermo para poder calificarlo como sano; la au-! sencia de enfermedad, aunque elemento prioritario, no es suficien-10 te por si solo. Esta premisa es perfectamente transferible al caso particular del agua y de los alimentos. Y si esta transferencia se maneja con acierto, va a procurarnos un principio doctrinario que dard tono y medida a la aplicacion de la microbiologia sanitaria. En efecto, el alimento sano, el alimento de buena calidad sanitaria, implicaré no solo la ausencia de agentes patogenos (microorganismos, téxicos, toxinas, etc.), sino el registro de caracter/sticas organolépticas que proporcionen plena satisfaccion al ser consumido. Lo anterior sig- nifica, y es la parte sustancial de! planteamiento, que en el proceso de control sanitario de! agua y de los alimentos habrdn de progra- marse y ejecutarse acciones que tiendan a lograr productos libres de tales agentes, cuidando a la vez, que lleguen a la poblacién con el Optimo de frescura, atractivo, sabor y digestibilidad. El concep- to de alimento sano queda finalmente delineado al subrayar la con- dicion basica de que su capacidad nutricional se mantenga en el maximo nivel, No hay duda. de que el reconocimiento consciente de este principio, és decir, su aceptacion racional y aplicacién consecuente por parte de todos aquellos elementos que de alguna manera parti- cipan’efi la vigilancia y control sanitario de los alimentos (autorida- des oficiales, jefes de control de calidad, supervisores, quimicos y microbidlogos analistas, inspectores, ingenieros sanitarios, médicos veterinarios, epidemidlogos); conducir‘a a practicas de operacion menos burocratizadas, intrascendentes e innecesariamente costo- sas. Es oportuno sefialar, aunque se reiterara en mas de.una oca- sion, que se generan mas problemas de los que se prétende resolver cuando se ignora la individualidad de cada situacion motivo de es- tudio. Asi; ta alteracion de un alimento en una planta procesado- ra, el aistamiento e identificacion de un agente patogeno en un brote de intoxicacion alimentaria, la deteccién de una fuente de contaminacion, la sobrevivencia de una bacteria en un alimento, etc., constituyen casos especificos que deben abordarse como ta- les..La variedad de factores que finalmerite deciden el destino de un microorganismo en cada substrato, son numerosos, sobre todo | ! | |‘ al considerar las interrelaciones que entre ellos inevitablemente se. establécen. .Experiencias cotidianas pueden ilustrar lo anterior; por; ejemplo, cuando no se establece claramente la naturaleza del pro- blema que se aborda'y en consecuencia no queda definido el tipo de muestra’ mas adecuado que debiera analizarse y/o no se colec- tan las: unidades més. representativas; en otros casos resulta éviden- te-que no es posible manejar del mismo modo el caso de un a mento, cuarido se dispone o se puede disponer de informacion so- bre lag condiciones sanitarias en las que fue elaborado, qué -cuan- do no-existen tales facilidades (frecuente en los productos de im-. portacion).. Asimismo, :los resultados de los exémenes de labora- torio, ,especificamente los de naturaleza cuantitativa, no tienen igual significado en alimentos con contenido alto o medio de, hu- me dad, si él producto ha sido colectado en la planta procesado- ra 0 en un Supermercado, o si se encuentra adulterado con un con- servador. thet : En realidad, el laboratorio de microbiologfa sanitaria alcan- za.el Optimo beneficio cuando entre quien produce'y quien con-: trola (si se jtrata de una industria), o-entre quien ejerce la funcion: administrativa de control como autoridad oficial y el laboratorio, existe _unaicoordinacion armoniosa y ambas partes se identifican, consciente y plenamente con el objetivo central. En el segundo ca, so, en tanto la autoridad competente canalice el grueso de su ope! acini a colectar muestras y muestras, y el laboratorio se dedique! Hanamente: a examinar mas y mas de ellas, el problema del. control sanitatio queda en pie, incluso en situacion mas peligrosa, porque, practicamente sin efecto positivo, se estard ante el concenso de que:se encuentra atendido, creandose asf una falsa sensacion de se! guridad. La consecuencia més directa de ello es una alta probabil! dad, de aceptar y liberar para su consumo, lotes de fabricacién de mala calidad, con dafio para la poblacion o de rechazar productos inofensivos, condafio para el fabricante. Aparece asf una caracte: ristica muy singular de esta especialidad en lo tocante a su ejer; cicio y alanecesidad de disponer de una adecuada preparacion bé! sica en otras disciplinas, segun se ilustra en la figura 1: la micro: bilogfa sanitaria tiene aplicacion directa en la tecnologia de los12 alimentos, por una parte, y en la epidemiologia por otra, en ambos casos apoyandose en diversas ramas de la microbiologia. . FIGURA 1 7 Relacién de la microbiologia sanitaria con otras rames de . Ja microbiologia én la tecnologia de los alimentos y : 7 —en la epidemiologia 7 Tosatren Evicamicgt pie Microbiologia Microbiologia Microbiologia industrial sanitaria médica [Bicovimies rmicrobiana Inmunologia Microbiologia general Gengtica microbiana La microbiologia ‘sanitaria estudia los’ microorganismos del agua y de los alimentos: sus caracteristicas generales, su ecologia, su.resistencia al medio ambiente, su capacidad para sobrevivir y'de- sarrollar en los propios alimentos, las consecuencias de ese des: trollo_y los factores que influyen en todo esto. Esta informacion es fundamental para conocer y explicarse sus fuentes y miecani: mos de contaminaci6n y el destino que pueden tener en un alimen- to bajo una variedad de condiciones y efectos diversos: la compo- sicion quimica del substrato, la actividad de agua, el pH, la ternpe- ratura de conservacion de los tratamientos que -reciba, la presen- cia de sustancias antibacterianas, el potencial de ‘oxidorreduccion, el antagonismo entre los componentes de la flora bacteriana, sus Potencialidades genéticas, tactores que las ‘determinan, y otros. » Tres grandes grupos de microorganismos Ilenan el campo de accion de la microbiologia sanitaria: 1) aquellos que afectan las ca- racteristicas organolépticas de los alimentos; con los cuales se estu- }| i 13 [1 eset, sawiige dian lositipos de procesos que tienen lugar, las causas primarias y : secundatias que os propician y desencadenan, y los medios para evitarlos y controlarlos; 2) el grupo de patégenos, a través de los cuales se entra en estrecha vinculacién con la microbiologfa médi- ca, hasta pisar el mismo terreno en ocasiones, pero manteniéndo- se siempre en la perspectiva del papel e importancia del vehiculo - (agua o aliménto) que determina la aparicion de casos en la pobla- cién;y 3) microorganismos que se agrupan (al margen de las rigi- das lineas taxonémicas) en funcién de ciertas caracter/sticas mor- fologicas, fisiologicas y ecolégicas a través de las cuales adquieren un significado especial; forman tos llamados grupos indicadores, sea de fuentes de contaminacién indeseables 0 de otro tipo de acci- dentes que sugieren la comision de malas practicas de trabajo du- rante él manejo déi agua y alimentos: Como se veré después, la va- lidez deisu aplicacion continua siendo punto de debate en muchos casos; en algunos de ellos, sin embargo, no hay duda de que han : contribuido a resolver importantes cuestiones de seguridad enel “control $anitario del agua y alimentos. : Por otra parte, es practica comin en el campo que nos ocupa, ' dedicar ‘grandes esfuerzos para mejorar las técnicas de muestreo y : analisis : ‘de toda clase de especimenes, tanto para detectar !a pre- sencia como el numero de microorganismos, |o que a su vez obliga a establecer, siguiendo un largo proceso de disefio, desarrollo y evaluacion, tos Ilamados estandares microbianos. Toda la metodo- logfa arlalitica se enriquece cotidianamente con la aportacién de nuevos imedios de cultivo, artificios en la inoculacién’e incuba- cin, disefio de equipo, pruebas de patogenicidad y criterios de ' aceptacion’ y rechazo con base en los resultados de laboratorio. « De hecho, en cada numero de las revistas cientificas especializa- | das aparece ‘al menos un articulo al respecto. El ‘grado de refina- miento ‘alcahzado con.algunas técnicas es notable. Con la meto- dologfa; actual, por ejemplo, es posible poner de manifiesto la pre- sencia de uria salmonela én 1,500 g. de leche en polvo: menos de una patte por mil millones. Y hay ‘que destacar.en este caso par- : ticular, qué se trata de'una célula dafiada durante el calentamiento i y desecacion del producto al ser fabricado. Desde otro angulo, sin ,14 embargo, tal hecho en ciertos casos, nos coloca en posicion harto incémoda: équé criterio establecer para decidir que un alimento se encuentra libre de salmonelas, si aparentemente todo es cuestién de disponer de una técnica de alta sensibilidad o de incrementar {en muchos casos) el tamafio de la al{cuota examinada para llegar a un resultado positivo? ¢Deberd una autoridad sanitaria liberar un producto que sabe, contiene salmonelas? Dentro de la epidemiologia y de la tecnolog(a de los alimen- tos, el laboratorio de microbiologia sanitaria es un valioso recurso ante una diversidad de cuestiones que pueden resumirse en los si- guientes rubros: 1. El control de la calidad sanitaria de materias primase in- gredientes. 2.EI control de la potabilidad y calidad bacteriolégica del “agua. 3. El diagnéstico de la calidad sanitaria de un producto ter- minado. 4, El diagnéstico diferencial de la causa de alteracién de un alimento. 5. La evaluacion de la eficiencia de los procesos de lavado y desinfeccion del equipo, utensilios y superficies de traba- jo. 6. La evaluacion de la eficiencia de sustancias y agentes ger- micidas. : 7, La evaluacion de la eficiencia de !os procesos de pasteuri- zacion y esterilizacion. 8. El diagnéstico de portadores asintomaticos de microorga- nismos patégenos entre el personal que maneja alimentos. 9. El_diagnéstico diferencial de la causa de un brote de gas- troenteritis y otro tipo de infecciones o intoxicaciones asociadas al consumo de agua y alimentos. 10. El rastreo de fuentes de contaminacion. 11,,L@ investigacion. del destino de’ especies microbianas ° grupos en los alimentos y otros substratos. 12, El estudio de la capacidad de autoconservacién de un ali- mento en relacion con la actividad microbiana.15 aie 2 ea 13. El estudio de Ma eficiencia'y ‘optimas condiciones de ope- racion de conservadores en los alimentos. 14.:E1 control. de la pureza y actividad de los cultivos utiliza- J'dos en la fabricacion de alimentos. La lista anterior da una idea de la justificaci6n que asiste a to- das aquellas disposiciones que tienden a involucrar el empleo det laboratorio en el control interno y externo del agua y. de los ali- mentos en las plantas: procesadoras y obviamente como recurso en los laboratorios de salud publica. El papel del laboratorio en estos quehaceres debe entenderse, sin embargo, en sus justos términos. En el proceso de control la accién primaria que se pone en juego, es la inspeccion. De ella puede emerger la necesidad de practicar anélisis de laboratorio en muestras de alimentos, de materias pri- mas, de especimenes humanos, de superficies del equipo, del agua, del producto durante su procesamiento o del medio ambiente. La seleccion del tipo-de muestra, de las pruebas de laboratorio perti- nentes y la interpretacion que se le dard a los resultados, deman- dan de personal-con buena preparacion bésica en 1a microbiolo- gla y experiencia de campo y de laboratorio. Deficientes manejos en la coleccién y transporte de una muestra conducen a resulta- dos ajenos a la realidad que se pretende poner de manifiesto. Los juicios que se elaboren y las acciones que se decida poner en prac- tica, son producto del manejo racional que se haga.de los propios resultados del laboratorio en el légico supuesto de que ellos pro- porcionan informacion del contenido microbiano del alimento en el sitio y al momento de la recolecci6n. La realidad es que (y re- sulta obvio afirmarlo) el reporte de laboratorio refleja justamente la imagén microbiana de! producto al tiempo que se retira la ali- cuota para iniciar el andlisis, no por fuerza la que ten(a la muestra al ser colectada. Dirfase que esa imagen corresponde’a una de las fotografias que constituyen la pelicula de la vida del alimento des- de su generacion hasta su consumo. El escenario es dindmico, y lo ‘ que ocurre en un tiempo determinado queda definido por una se- ! rie de factores-en continua operacion. La velocidad .de cambio puede ser mayor o ménor, pero el cuadro nose repite: algunas bac- terias incrementan su numero, otras !o decrementan y llegan a de- +16 Saparecer, en tanto otras se mantienen inalteradas permanente o transitoriamente, para irrumpir cuando las condiciones lo. propi- cian, en activo desarrollo, afectando con ello a otros grupos micro- bianos en su vecindad. Si las Oportunidades se presentan, nuevos grupos de microorganismos pueden ingresar al. alimento. El pH, el contenido de humedad, la temperatura del medio, el potencial de oxidorreduecién, la acumulacion de productos metabdlicos, el ago- tamiento de nutrientes y otros factores se conjugan fatalmente y a “través de efectos antibioticos, antagénicos, sinérgicos y aun. muta- gEnicos (por sustancias propias del alimento o generadas en él por actividad microbiana u otros Medios), conjugan una constelacién de efectos y mecanismos de los que no puede substraerse la flora microbiana en su conjunto o individualmente considerada. Agré- guese alo anterior, por otra Parte, que desde el punto de vista pu- ramente analitico el. resultado del laboratorio depende de: a) las Condiciones en las que se efectué el muestreo y transporte de la muestra; b) la técnica de andlisis utilizada; c) la calidad de los reac- tivos y medios de cultivo; d) la destreza del técnico que ejcuta el andlisis; e) el apego que observe el analista a la técnica prescrita; f) la presencia de sustancias que interfieran con el desarrollo micro- biano, y g) el estado fisiolégico de los microorganismos presentes, su distribuci6n cualitativa y cuantitativa y el tipo de relacion que establezcan entre si los diferentes grupos que la componen. Asi, el resultado es sdlo la expresion convencional de la imagen microbia- na de un producto, configurada en funcién de todos esos factores. Al intepretar, por otra Parte, el resultado de un andlisis de la- boratorio hay que tomar en consideracian otros elementos. La flo- fa microbiana de un alimento est4 fuertemente condicionada por 'a tecnologia utilizada en su fabricacién y por la proteccién que se le confiera contra el ingreso de Microorganismos y su multiplica- cién. La abundancia y distribucién de esos microorganismos en el medio ambiente a su vez se encuentra muy afectada por las condi- ciones que en él imperen y aun Por los habitos de las comunidades (fecalismo al aire libre, Por ejemplo). La falta de objetividad al in- terpretar el hallazgo y-abundancia de determinados grupos de mi- croorganismos lleva facilmente a Conclusiones errdticas. Este he- | |7 snisdpetigot danske, cho no debe pasarse por alto, ya que la casi totalidad del mate- rial bibliografico que se encuentra en la literatura cientifica, par- te del:cual se manejara en los siguientes capftulos, procede de paises ‘con un nivel de higiene en sus alimentos y por ello (hay razones adicionales), con una epidemiologfa de las gastroenteri- tis y Parasitosis asociadas al consumo de agua y alimentos bien distintas a las que se’ dan en nuestro medio. E! enfoque de los problemas y la naturaleza y magnitud de los riesgos ante un de- terminado resultado no tienen que ser necesariamente los mis- mos. El adentramiento en la microbiologia sanitaria tiende a configurar en el especialista una sensibilidad y una reactividad , singulares ante todas aquellas prdcticas viciosas de trabajo que se traducen en menoscabo de la calidad sanitaria de un alimento. Generalmente, apoyado en el campo que domina, se encuentra : no solo en mejores condiciones de captar la incidencia de esos malos manejos, sino que al realizar una evaluacion mas objetiva del problema, desde sus causas y mecanismos hasta sus manifes- taciones y consecuencias, puede disefiar y sugerir medidas mas eficientes y practicas para corregirlas y prevenirias. Asi, el micro- , bidlogo sanitario es tan indispensable dentro del equipo de pro- ' fesionales responsabilizados del control sanitario de los alimen- tos, como lo es e! anestesista o el propio cirujano en un quirdfa- no. La necesidad de promover la formaci6n de profesionales en la‘ especialidad no parece requerir de gran insistencia. Esta es una; tarea de las instituciones de educacién superior. No es posible ima- ginar siquiera un mejoramiento en la calidad sanitaria de los ali- mentos en tanto las actividades de control se Ileven’ a cabo mecé- nica y empiricamente. Es necesario tecnificar tales operaciones * con el concurso de personal bien adoctrinado en la salud publica. Esta es una tarea que compete primariamente a las autoridades sa- nitarias. El puente esta tendido y las responsabilidades definidas. No se ignoren mas y pasemos a la accion sin regateos de especie alguna. '-’ CAPITULO 1 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Principios 'pasicos para su preparacion La Galidad del trabajo microbioldgico en el andlisis de los alimen- tos se ericueritra vinculada a la idoneidad de los medios de cultivo y reactivos que se utilizan. Esto se aplica tanto a las materias pri- mas como a los productos preparados en el laboratorio. La mejor : instalacion y'equipo disponible y la habilidad del analista, pier- den todo valor si la composicién de los medios de cultivo no co- rresponde a la requerida. Cuando esto Ultimo ocurre las causas pueden ger: | 1..Deficiencias en la medicion o peso de los ingredientes. 2.\Falta de frescura del medio preparado, lo que genera pér- lida: de humedad y concentracién de los componentes, 0 ‘bien’ degradaciones, oxidaciones o reducciones entre ellos. 3.'Presencia de residuos de detergentes en el material de vi- \drierta. ae ‘Efecto germicida del agua utilizada cuando contiene tra- > as de ciertas impurezas. 5.!Deficiencia en-el ajuste del pH arites de la esterilizacion ;Por efecto del calentamiento 0 del recipiente en el cual se tha esterilizado el medio. 6.Sustancias bacteriostaticas dentro de la formulacin, con imés alta o mas baja concentracién a la requerida. 7. ‘Excesiva humedad en la superficie del medio, que favore- ‘ce el desarrollo de colonias extendidas o su confluencia. 8. Sobrecdleritamiento del medio al esterilizar, sea por el13 caenee: Bhtge 20 CAPITULO T empleo de temperaturas mds elevadas 0 de perfodos més prolongados. Se pierde asi el poder nutricional del medio, su capacidad diferenciadora o su consistencia. . 9. Defectos en la preparacién, como ocurre cuando no se es- terilizan por separado ciertos componentes del medio, si- no la mezcla completa (medio de Baird Parker), 0 indebi- « damente se lleva al autoclave un medio de cultivo termo- sensible, como es el agar sulfito de bismuto. 10, Reesterilizacion, por cualquier motivo, de los medios de cultivo. 11. Empleo de medios de cultivo deshidratados, muy viejos o que se han-almacenado en forma inadecuada, de manera que fijan humedad y pierden su condicion de polvo fino. 12. Empleo de medios que se someten a de una vez 4 pro- cesos de licuefaccion. “i 13,.Defectos en la esterilizacion por el empleo de temperatu- ras y/o periodos inferiores’a los prescritos: Todas las-‘medidas que tiendan a impedir estas fallas y defec- } tos se traducirén en un claro mejoramiento en el funcionamiento de Jos medios de cultivo: ES de gran utilidad, por ejemplo, probar el primer lote del medio de cultivo preparado con cada recipiente contra los microorganismos que se espera favorecer en su desarro- Ilo y también contra los que se espera inhibir. : - Los medios de cultivo utilizados en el andlisis de los alimen- ‘tos para su control sanitario pueden Clasificarse en medios de pre- enriquecimiento, enriquecimiento, simples, enriquecidos, indica- dores y diferenciales-selectivos. | Los medios de preenriquecimiento tienen como funcién re- sucitar, reactivar o iniciar la proliferacion de un determinado gru- po de microorganismos. Este efecto permite una recuperacién mas completa de aquellos gérmenes presentes en un. producto que ha si- do sometido a tratamientos que afectan la viabilidad celular; asi ocurre durante la desecacion de la leche en polva, el cocimiento o ahumado de los productos cdrneos o la presencia de conservadores en algunos tipos de queso. La formulacién de estos medios general- mente es sencilla, como es.el caso del agua peptonada, dei caldo ibm aes sa se ? 4MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS oe 21 factosada:y del agua con leche descremada. No suelen llevar agen- tes bacteriostaticos (o acaso en muy baja concentracién) y se uti- lizan sobre todo en productos con baja carga microbiana, o por pe- riodos de incubacion de unas cuantas horas. Los medios de enriquecimiento pretenden favorecer el de- sarrollo de un grupo, género o especie particular de microorganis- mo, que permita con mayor éxito su posterior aislamiento. Este efecto selectivo implica el uso de un agente. bacteriostatico relati- vamente poderoso en tal concentracién, que afecte !o menos posi- ‘ble al germen seleccionado, El caldo selenito y el caldo tetrationa- to para Sa/monella, y el caldo soya con cloruro de sodio para Staphylococcus aureus, son ejemplos de medios de enriquecimien- to. Pueden ser inoculados con el alimento directamente o con el caldo de preenriquecimiento, y a partir de ellos se efectian las siembras a los medios sdlidos, El efecto selectivo también se con- sigue o'se intensifica recurriendo a temperaturas de incubacién mas elevadas, por ejemplo 4 43° para Salmonella, 0a 44,5° para los coliformes fecales. © Los medios de cultivo simples consisten en una mezcla ba- lanceada de nutrientes en agua, con salinidad y pH controlados, sin comp onentes especialmente complejos ni agentes inhibido- res. Se utilizan para aislar, contar y conservar microorganismos de facil desarrollo. A este grupo pertenecen el caldo nutritivo, el agar nutritivo y el agar-cuenta estandar. Los medios enriquecidos se obtienen agregando a un medio simple base uno o mas componentes ricos en nutrientes orgdnicos, tales como sangre, huevo, leche a extractos de visceras o vegetales. Su aplicacion es similar a ta de los medios simples cuando se trata de trabajar con microorganismos especialmente exigentes en sus demandas nutricionales: gelosa sangre parael Streptococcus pyoge- nes, medio de Lowenstein para Mycobacterium tuberculosis 0 ge- losa triptosa para Brucella. : Los medios indicadores estén constituidos por un medio base (simple 0 enriquecido) adicionado de alguna sustancia o de un sis- tema que permite poner de manifiesto un cambio o la generacion de alguna sustancia que es caracteristico de la fisiologia de un mi-22 CAPITULO T croorganismo: fermentar un determinado carbohidrato (caldo lac- tosa), producir acido sulfhidrico (medio “de Kligler), amoniaco, (medio de Surraco), 0 indo! (medio de SIM), desarrollo en presen- cia de algun inhibidor (caldo cianuro}, etc. El medio de cultivo indicador puede tener una funcion multiple, es decir, poner de manifiesto mas de una caracteristica fisiologica del germen. El me- dio de Gillies 2 permite descubrir la fermentacién de la sacarosao_ _ de la salicina, !a movilidad, !a produccion de acido sulfhidrico y la produccién de indol: El empleo de los medios diferenciales, tan va- liosos. en la identificacion de géneros y- especies bacterianas, re- quiere necesdriamente de indculos a partir de un cultivo: puro del microorganismo. Finalmente, los medios de cultivo diferenciales-selectivos son medios sdlidos que permiten obtener colonias de algun microorga- nismo o grupo con aspecto caracteristico, y muestran ademas ca- pacidad para inhibir a la flora asociada. Los medios diferenciales selectivos, ampliamente utilizados en el estudio de las enterobacte- riaceae, pueden ser de baja selectividad (medio de EMB), de selec- tividad-media (agar SS, agar XLD) o altamente selectivos (agar sul- fito de bismuto), segiin el efecto inhibitorio que ejercen sobre la flora asociada; es’de esperar, sin embargo, que conforme se gana en selectividad se pierde en sensibilidad al ser afectada una propor- cidn cada vez mayor de los gérmenes para, cuyo aislamiento se han disefiado estos medios. : Recomendaciones para la preparaci6n, envase, esterilizacion, almacenamiento y empleo de los medios de cultivo: 1. Utilizar reactivos, ingredientes o el producto deshidratado de marcas y proveedores que los prescriban para el fin al cual se van a destinar. Puede ocurrir que la misma sustan- cia, especialmente las destinadas a inhibir grupos o espe- cies de microorganismos (como son tos colorantes), se comporte de manera muy distinta, segin la marca, y en ocasiones un lote en particular de los fabri¢antes. No ha- cer uso de los medios de cultivo deshidratados que mues- tren terrones o una masa solida en su recipiente. 2. Preparar los volumenes de cada medio de cultivo que ha-MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 23 ssqetiyehs) eaiges . bran de consumirse dentro del periodo recomendado para su empleo. Algunos se deben preparar el. mismo dia que van a utilizarse (caldo selenito), en tanto que otros per- manecen estables por uno o mas dias, incluso fuera de re- frigeracion, o semanas dentro de éste. 3. Pesar cuidadosamente el medio y/o los componentes, y tratarlos justo como se indica para cada medio de cultivo _) enda monografia correspondiente. Seguin sea el caso, pue- ' de 'bastar la mezcla de los ingredientes, adicién de agua, ajuste de pH y esterilizacién para preparar el medio, Es : indispensable en otros casos disolver o esterilizar por se- | parado algun ingrediente o darle un tratamiento como , clarificacion, previo a la mezcla. Sise trata de medios co- mercialmente deshidratados, pesar. el polvo en algun lu- : gar alejado de corrientes de aire, efectuando la operacion con cuidado, pero rapidamente y transferir al recipiente ! en donde se -disolverd. El propio frasco que contiene el | polvo sdlo permaneceré abierto el tiempo necesario para ; extraer las porciones requeridas, y entonces, taparlo fir- i memente. 4. Después de adicionar el agua, agitar-vigorosamente y de- * jar-reposar unos minutos para iniciar la disolucién de los } componentes, El medio. de cultivo se encontrara incom- : pletamenite preparado en tanto la disolucién de todos sus i Componentes sea insuficiente. Por ello suele ser necesario ; hervirlo previamente al envasado y autoclaveo; el llevar al autoclave un medio con ingredientes atin no disueltos propicia la caramelizacion con cambio en su color ordina- . rio, pérdida de su capacidad nutricional, acidificacion o . una gelificacion deficiente en aquellos que contienen agar. Por. otra parte, al calentarlo, se debe efectuar la operacion : Sobre rejilla metalica con asbesto o platina caliente y agitacion continua. Al alcanzar la temperatura necesaria, la ebullicion en algunos medios se inicia abruptamente con | proyeccion del liquido; mantenerse alerta para evitar.un accidente. El empleo de matraces favorece esa proyeccion24 CAPITULO T de los medios que contienen agar; resulta mas ventajoso recurrir a vasos de precipitado u otros recipientes seme- jantes. Es aconsejable, ademas, utilizar recipientes con una capacidad al menos dos veces mayor a la del volumen del medio que se va a preparar. . Cuando el medio de cultivo no contiene agar, ajustar el pH después de disolver todos los ingredientes por calen- tamiento suave y enfriar a temperatura de 25°. Si el me dio de cultivo incluye en su formulacién al agar, proce- der en la forma anterior previamente a la adicién de esta sustancia. Por otra parte, cuando el medio de cultivo se encuentra deshidratado con’ todos sus componentes, no suele ser necesario ajustar el pH, pues generalmente se ha fabricado de manera que el medio alcance el valor desea- do al rehidratarse. Es conveniente, sin embargo, realizar su comprobacién en cada lote adquirido. Para ello, el me- dio reconstituido se calentara suavemente 50-60° duran- te unos 5-10 minutos, con agitacion vigorosa, seguido de enfriamiento a 25° para determinar y en su caso ajustar el pH deseado. La medicién del pH a temperaturas superio- res, aun haciendo uso del tornillo compensador, conduce a resultados sensiblemente distintos (tabla 1-1). Hay que tener en cuenta que el pH que exhibe un medio de cultivo a 22-25° se incrementa aproximadamente 0.5 unidades, cuando su temperatura se eleva a 35° en la incubadora.®MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 25 Sutane pH de dos medias dé cultivo determinados potenciométricamente a dos temperaturas, con ajuste del. aparato : al modificar la temperatura Agar cuenta esténdar Agar bilis rojo violeta _Experiménto nim. Temperatura Experimento nim, Temperatura ai 25° 45° 25° 45° ieee eeeeEy 0.36.70. 7.30. 7.00 7.02: 6.72 ? 7.29 6.95 6.72 7.29 6.97 6.69 1. 7.31 6.93 7.32 6.98 7.08 6.82 7.30 6.97 2, 7.00 6.83 7.32 6.90 7.09 6.83 + 7.35 6.98 ; 7.08 6.83 : 7.27 6.92 7.00 6.82 é 7.30 6.93 3. 7.00 6.82 7.30 6.93 i 7.04 6.82 2. 730 6.92 : 7.00 6.87 7.30 6.91 \ "7.31 6.92 i 7.02 6.73 7.30 6.92 4. 7.05 6.77 7.30 6.91 i 7.05 6.78 v4 7.02 6.80 7.42 7.00 740 7.02 . i 7.38 7.01 t 3. 7.43 7.01 : 7.45 7.02 i : 7.50 7.01 ea i 739 7.02 boa : 7.40 7.0026 CAPITULO 1 En los medios de. cultivo comerciales que contienen agar, medir y ajustar el pH después de adicionar el agua necesaria; agitar después vigorosamente, dejar reposar 10 min., calentar suavemente a unos 40° durante 10-15 min. y dejar enfriar a 25°. Efectuar entonces la medicion. No utilizar tiras de papel para decidir el valor del pH de los medios de cultivo, sino en todos los casos, un po- tenciémetro” debidamente ajustado con, las soluciones buffer correspondientes. La temperatura del buffer utilizado y la del medio del cultivo deberd ser la misma. Descuidar el ajuste de! pH del medio de cultivo puede traducirse en errores de variada magnitud. Aun pocas décimas de variacion en el pH del medio que se utilice respecto al indicado causa en muchos casos diferencias significativas en los recuentos microbia- nos’. . La calidad del agua utilizada en la preparacion de los me- dios de cultivo es decisiva para conseguir un producto confiable y de buena solubilidad. Como el mantenimien- to de los materiales desmineralizantes presenta muchas di- ficultades*, la recomendacion general es la de utilizar agua recién destilada. - Todo el material de vidrierfa o acero inoxidable empleado en la_preparacion y envase de los medios de cultivo se en- contraré limpio; observar especial cuidado en enjuagar convenientemente el material lavado a fin de eliminar de él todo residuo de detergente. La presencia de suciedad puede conducir a medios de cultivo con color anormal, turbios, toxicos o con'pH alterado. . Guardar los medios de cultivo deshidratados en lugares frescos, secos y protegidos de la luz. Esto significa que * puede requerirse el empleo del refrigerador, locales para su almacenamiento fuera de las areas de autoclaves, mue- bles o gavetas cerradas, e incluso un desecador. Una vez violado el sello del recipiente pueden iniciarse cambios en el producto, como rehidratacion, oxidaciones, hidrdlisis deMEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 27° 11. componentes; oscurecimiento, pérdida de la solubilidad, cambio en el pH, etc., que afectan adversamente su efi- ciencia, productividad, selectividad 0 capacidad diferen- cial’. El medio rehidratado puede requerir de la adicion de otros componentes antes o después de su esteriliza- cion; en el segundo caso deben, por supuesto, encon- trarse estériles, lo que se consigue mediante un trata- miento que se especifica en la monografia correspon- diente. Incorporar esos componentes seguido de una agitacién adecuada que asegure la uniformidad en todo_ el volumen del medio. Esterilizar el medio antes o después de envasar, depen- ‘diendo del tipo de medio y de la forma en que vaya a ser utilizado, segun se indica en cada caso. Previo, a este tratamiento, ajustar el volumen de medio por la evapo- racion que hubiera ocurrido durante el calentamiento. La esterilizacion. de los medios de cultivo habitual- mente se-realiza por calentamiento en el autoclave a una temperatura y tiempos definidos para cada uno. Otros medios, por su: contenido en agentes inhibitorios, no re-! quieren esterilizacion e incluso su cardcter inhibidor y di-. ferencial suelen verse afectados si se someten a elevadas temperaturas. 7 Es conveniente recordar, al usar el autoclave, que su pro-| posito es lograr una temperatura en el agua, la que nose. alcanza fuera de ella; en otras palabras, elevar el punto de ebullicion del agua al aumentar la presién a la que se so-, mete. La correlacién entre estas dos variables se guarda en los términos que se indican en la tabla 1-2. Esta corre- lacion, sin embargo, sdlo tiene validez en tanto la camara’ de‘esterilizacion se encuentra saturada de vapor, es decir,’ cuando la expulsion del aire ha sido total. El empleo‘de una olla de presion puede suplir al de un, autoclave si; por una parte, se rétira totalmente el aire a través de la valvula de escape antes de permitir el aumen-28 Libras por pulgada® CAPITULO 1 to en la presion, y por otra, si se ha comprobado con el empleo de un termometro de maximas la correlacién en- tre la escala del manémetro y la temperatura interior. El uso de tiras de papel indicador y de suspersiones de es- poras de una cepa bacteriana excepcionalmente termorre- sistente (suele utilizarse Bacillus stearothermophilus), contribuyen a tener un mejor control de la eficiencia de los.procesos de esterilizacion. . Efectuar el envasado de los medios ya estériles en condi- ciones que eviten alguna contaminacién (cémara de flujo laminar o la zona de trabajo bacteriolégico del mechero). La cantidad’mas adecuada de medio de cultivo en una caja de 100 mm. de diémetro para siembra Por estria es_ de unos 15 ml. Vaciar a las cajas cuando su temperatura haya descendido a unos 45-50° para evitar una pérdida de agua que afectaria la concentracion real de los solutos que debe contener. Tabla 1-2 Temperatura interior del autoclave a diferentes presiones con vapor saturado Presion Kg/em? “Atmésteras Temperatura interior HEED 0 + 100.0" 0.3516 0.340 108.4 0.7031 0.680 # 115.2 0.8437 0.816 117.6 1.0547 1.021 net 1.0 1.2656 1.225 124.1 Funnte: Lindemann, C.M.P.W., ref.429 13. Una vez preparados, protegerlos contra el polvo, la luz so- lar y temperaturas por encima de los 16°; tratandose de medios no esterilizados enriquecidos y de aquellos enva- sados en cajas Petri, conservarlos en refrigeracién. Para evitar 1a deshidratacion de los medios envasados en matra- ces, frascos y tubos a un ritmo acelerado, es mejor utilizar tapon de rosca hermético, siempre que las condiciones lo permitan, en lugar de tap6n de algodén. Las cajas con medio se’ guardaran en refrigeracion dentro de bolsas de .plastico bien cerradas con el mismo fin. Todo lote de me- dio de cultivo almacenable, debe llevar indicacién sobre su fecha de preparacion y no se utilizaran més alld de la fecha especificada para cada uno. En general, .el uso de los medios de cultivo demanda condiciones bacteriolégicas en la mesa de trabajo; es ne- cesario observar cuidado al vaciarlos en las cajas, pues cuando se retira el tapdn, los dedos pueden hacer contac- to con el borde del recipiente y al escurrir el medio arras- trar la contaminaci6n. 14. Examinar los frascos, tubos y cajas conteniendo medios de cultivo antes de ser inoculados, a fin de descubrir oportunamente, si fuera ef caso, algun indicio o eviden- cia de contaminacion, vire de los indicadores 0 cualquie- ra otra irregularidad que los hiciera inservibles. Recordar » que como norma de trabajo los recipientes por inocular ya deben encontrarse debidamente rotulados. 15. Los medios de cultivo en las cajas Petri destinados al aisla- miento de colonias, deben encontrarse libres de agua so- bre la superficie a fin de evitar la confluencia del desarro- No bacteriano. En caso necesario secarlos dentro de la in- cubadora a 35° antes de su inoculacién con la tapa ligera- mente removida, durante unas 3 hrs. o a 50° durante 15 min. E 16. Establecer dentro de la disciplina interna del laboratorio un sistema permanente y practico’de control de los me- ‘dios de cultivo que se adquieran del comercio. Algunostere : i i 30 1 CAPITULO.1 microbidlogos* sostienen que este control de calidad de be ser una responsabilidad de los fabricantes, aunque consignan hallazgos de casi 2% de lotes defectuosos en - Su laboratorio. Una norma de este tipo no sélo permite x descubrir un producto inservible, sino que contribuye a estimular y fortalecer la Objetividad que es necesaria en todo técnico de laboratorio para hacer mas confiable y provechoso su trabajo. Eventualmente la Proporcién de lotes defectuosos puede ser notable. Por ejemplo, Read y Reyes® con 8 lotes comerciales de agar verde brillante Procedentes de 2 plantas, encontraron 3 de buena pro- ductividad, 2 en s6lo 25/0 y 3 improductivos en el aisla- miento de salmonelas, Faberbergy colaboradores? sefialan. que corresponde a cada técnico determinar la marca de medio de cultivo que le proporcione los Mejores resulta- dos. Cuando compararon dos marcas de caldo selenito verde brillante sulfas y el mismo medio preparado a par- tir de sus ingredientes respecto a su capacidad Para recu- perar 14 serotipos de Salmonelas, observaron resultados Claramente discrepantes: 91.4, 64.3 Y 34.300 en cada ca- so. . La adicion de cantidades Muy pequefias de algunos com- Ponentes sdlidos a los medios de cultivo (< 50 mg/It) conviene efectuarlas a partir de soluciones previamente Preparadas, empleando alicuotas que contengan la canti- dad de polvo requerido. He EI sistema de control minimo! consiste en inocular los microorganismos 0 especimenes en el medio de cul- tivo prescrito para cada caso y observar su comporta- miento. Tales microorganismos deben formar parte de !a coleccion propia de cada laboratorio, La seleccion de ellos depende del tipo de medio por estudiar. En uri me- dio de cultivo diferencial y selectivo como el agar EMB Probar un microorganismo que fermente la lactosa (E coli), una que-no la fermente (Salmonelta) y uno que sea inhibido. (Staphylococcus aureus). Si el medio pre-i } ! i i i i ! i I ; | | | | ; i i | f MEDIOS DE CULTIVO*Y. REACTIVOS + - +<#a 31 tende inhibir especificamente un cierto microorganismo “ o'grupo de ellos, incluirlos en el ensayo (organismas coli formes en el agar verde brillante o en el agar SS). Se ob- servard en tales casos, tanto la intensidad del desarrollo de los gérmenes deseables y las caracteristicas de sus colonias (tamaiio, color}, como el comportamiento de los gérme- nes~que se espera inhi 1 inéculo puede consistir en una gota ‘de una suspension del germen obtenida por dilu- cién de una asada de un cultivo fresco del microorganis- mo en 100 ml. de solucién salina estéril. La gota se ex- tiendé. con varilla de vidrio doblada en toda la superficie del medio en una caja Petri. Una medida comparativa del grado de inhibicién que exhiba el lote ensayado contra el + microorganismo: en estudio (Sa/monel/a en agar verde brillante) se obtiene al incluir simultaneamente en la * prueba un medio no inhibitorio como el agar cuenta es- tandar, que se inoculara en la misma forma. Los medias indicadores se prueban con cepas cuyo comporta- miento esta bien definido, tanto en sentido positivo como negativo para cada ‘substrato. . Los medios destinados a pruebas cuantitativas deben ensayar- se en relacion con el mismo medio proveniente de un lote de efi- ciencia ya comprobada. Las medias de los recuentos obtenicos con ambos médios‘en una serie de muestras se comparan aplicando de preferencia una prueba de significancia estad(stica, como /a ‘‘prue- ba de t’,ia fin’ de interpretar adecuadamente la diferencia observa- da. - Por. Ultimo,’ la esterilidad de los medios preparados se com- prueba incubando un 3-49/o de las unidades que componen cada lote, ala temperatura que se pretenda utilizarlos, Preparaci6n de material estéril El material de vidrieria y todo aquel'que llegue a entrar en contac- to con‘las muestras: por :arializar o.con los medios de cultivo por utilizar, después de su limpieza requiere.un tratamiento que lo