Molekulinės Biologijos Vadovėlis

Edita Suiedlien
Molekulin biologija
Vadovlis
Vilnius, 2014
UDK 577.2(075.8)

Su-117
Vilniaus universiteto Studij komiteto rekomenduota 2014 12 09.
Recenzavo:
prof. dr. Rimantas Daugelaviius
prof. dr. Rolandas Mekys
Leidinys finansuotas projekto Biotechnologijos ir biofarmacijos sektoriui reikaling auktos kvalifikacijos

specialist rengimo tobulinimas (BIOTEFA-A), Nr. VP1-2.2-MM-09-V-01-009 lomis.
Virelyje naujos DNR II tipo restrikcijos endonukleazs, sumodeliuotos pasitelkus kompiuterin

baltym dizain ir baltym ininerij, struktros dalies, utikrinanios konkreios DNR sekos atpainim,
vizualizacija (autorius dr. . Venclovas). Vaizdas sukurtas kaip iliustracija, apibendrinanti bendro VU
Biotechnologijos instituto ir UAB Fermentas mokslinink darbo rezultatus, paskelbtus JAV nacionalins
moksl akademijos darbuose (Proc Natl Acad Sci USA, 2007; 104:10358-63).
Edita Suiedlien, 2014

Vilniaus universitetas, 2014
ISBN 978-609-417-096-6
TURINYS
PRATARM.................................................................................................................................... 8
I. VADAS. Pamatin molekulins biologijos dogma ir molekulins
biologijos mokslo raida....................................................................................... 11
1.1. Modelins biologins sistemos molekulinje biologijoje.................................16
II. NUKLEORGI IR BALTYM MOLEKULIN STRUKTRA......................... 23

2.1. Nukleorgi molekulin struktra.....................................................................23
2.1.1. DNR ir RNR pirmin struktra................................................................................................... 23
2.1.2. DNR antrin struktra.................................................................................................................. 28
2.1.3. DNR spirali B, A, Z eim ypatybs....................................................................................... 34
2.1.4. Neprastos DNR antrins struktros....................................................................................... 41
2.1.5. DNR tretin struktra. iedin DNR ir superspiralizacija ............................................... 46
2.1.6. Topoizomerazs............................................................................................................................. 52
2.1.7. RNR antrin ir tretin struktra................................................................................................ 57
2.1.8. Pernaos RNR (tRNR) antrin ir tretin struktra............................................................... 60
2.1.9. Ribosomini RNR antrin ir tretin struktra...................................................................... 63
2.1.10. Katalizikai aktyvios RNR (ribozimai)................................................................................... 67
2.1.11. Ribojungikliai............................................................................................................................... 70
2.1.12. Genomai........................................................................................................................................ 72
2.2. Baltym molekulin struktra................................................................................75

2.2.1. Aminorgi savybs................................................................................................................ 75
2.2.2. Peptidinis ryys ir jo savybs..................................................................................................... 80
2.2.3. Aminorgi onins grups ................................................................................................ 84
2.2.4. Baltym erdvins struktros susidarymui svarbs nekovalentiniai ir
kovalentiniai ryiai........................................................................................................................ 86
2.2.5. Baltym pirmin struktra . ...................................................................................................... 89
2.2.6. Baltym antrin struktra.......................................................................................................... 91
2.2.7. spiral............................................................................................................................................ 91
2.2.8. struktra....................................................................................................................................... 95
2.2.9. Kiti baltym antrins struktros elementai......................................................................... 97
2.2.10. Baltym struktros motyvai (superantrin struktra)................................................... 98
2.2.11. Baltym tretin struktra.......................................................................................................100
2.2.12. Baltym erdvins struktros susidarymas.......................................................................101
2.2.13. Baltym tretins struktros domenai ..............................................................................103
2.2.14. Baltym ketvirtin struktra.................................................................................................104
2.2.15. Daugiabaltyminiai kompleksai ...........................................................................................107
3
III. CHROMATINO MOLEKULIN STRUKTRA...................................................109

3.1. Nukleosoma chromatino struktrinis ir reguliacinis vienetas.................... 110
3.1.1. Molekulin nukleosomos organizacija................................................................................112
3.1.2. erdin nukleosomin dalel.................................................................................................113
3.1.3. nukleosomos sudt einani histon savybs............................................................115
3.1.4. Histon aminorgi modifikacijos ir j biologin reikm.....................................119
3.1.5. Histon kovalentini modifikacij kodo hipotez..........................................................128
3.2. 10nm ir 30nm chromatino silai........................................................................ 130

3.3. Chromatino auktesnio lygio struktros............................................................ 133
3.4. Chromatinas ir replikacija..................................................................................... 138
3.5. Chromatinas ir gen transkripcija bei jos valdymas........................................ 140
3.5.1. Histon acetilinimas ir gen transkripcijos valdymas...................................................141
3.5.2. Chromatin pertvarkantys baltym kompleksai ir transkripcijos
valdymas........................................................................................................................................141
3.6. DNR organizacija prokariotuose.......................................................................... 145
IV. DNR BIOSINTEZ (REPLIKACIJA) ...................................................................148

4.1. DNR replikacijos mechanizmo iaikinimas...................................................... 148
4.2. DNR polimerazs pagrindiniai DNR replikacijos fermentai......................... 154
4.2.1. DNR polimerazi bendrosios savybs.................................................................................154
4.2.2. DNR polimerazi katalizuojama reakcija............................................................................157
4.2.3. DNR polimerazi struktra......................................................................................................162
4.2.4. DNR polimerazi vairov.........................................................................................................164
4.3. DNR replikacija prokariotuose............................................................................. 165

4.3.1. Bakterij (E.coli) DNR polimerazs........................................................................................165
4.3.2. E.coli replikacins akuts modelis......................................................................................176
4.3.3. Kiti E.coli replikacins akuts komponentai....................................................................178
4.3.4. E.coli praimaz (DnaG)..............................................................................................................178
4.3.5. E.coli replikatyvin helikaz (DnaB). Kitos DNR helikazs............................................181
4.3.6. Topoizomerazs...........................................................................................................................183
4.3.7. E.coli SSB baltymai.....................................................................................................................183
4.3.8. Replikacijos iniciacija E.coli bakterijose..............................................................................185
4.3.9. DNR grandins elongacija.......................................................................................................189
4.3.10. DNR ligazs.................................................................................................................................189
4.3.11. Replikacijos terminacija bakterijose..................................................................................190
4.3.12. Bakterij DNR replikacija ir lsteli augimas bei dalijimasis.....................................191
4.3.13. Replikonai....................................................................................................................................193
4.4. DNR replikacija eukariotuose............................................................................... 195

4.4.1. Eukariot replikacins akuts komponentai ir j funkcijos ......................................196
4.4.2. DNR polimeraz-praimaz...................................................................................................196
4.4.3. A replikacijos baltymas (RPA)..................................................................................................197
4.4.4. PCNA slystantysis iedas .........................................................................................................198
4.4.5. C replikacijos veiksnys (RFC) iedo uklimo kompleksas........................................199
4.4.6. DNR ir polimerazs..............................................................................................................199
4.4.7. Kitos eukariot DNR polimerazs..........................................................................................200
4.4.8. Okazaki fragment brendimas eukariotuose...................................................................203
4.4.9. Replikatyvins helikazs eukariotuose...............................................................................204
4.4.10. Replikacijos iniciacija eukariotuose...................................................................................205
4.5. Kiti DNR replikacijos bdai................................................................................... 208

4.5.1. Besisukanio rato DNR replikacijos mechanizmas..........................................................208
4.5.2. DNR replikacija mechanizmu..............................................................................................212
4.5.3. DNR replikacija Dkilpos mechanizmu................................................................................214
4.5.4. Linijini DNR replikacija............................................................................................................215
4.5.5. Telomeros ir j funkcijos...........................................................................................................217
4.5.6.Telomer struktra......................................................................................................................218
4.5.7. Telomerazs savybs ir funkcijos...........................................................................................222
4.5.8. Telomer ilgio reguliavimas, senimas ir vys..................................................................224
V. RNR BIOSINTEZ (TRANSKRIPCIJA)................................................................229

5.1. RNR transkripcijos bendrieji bruoai.................................................................. 229
5.2. RNR polimerazi (RNAP) struktra ir savybs................................................... 232
5.3. Transkripcija prokariotuose.................................................................................. 233
5.3.1. Bakterij RNR polimerazs.......................................................................................................233
5.3.2. Bakterij RNR polimerazs erdin dalel . .......................................................................233
5.3.3. Bakterij RNR polimerazi transkripcijos ciklas ..............................................................238
5.3.4. Bakterij promotori atpainimas........................................................................................241
5.3.5. (sigma)veiksnys ir jo reikm bakterij RNAP transkripcijai....................................242
5.3.6. Bakterij promotori tipins sekos......................................................................................243
5.3.7. Transkripcijos terminacija bakterijose.................................................................................245
5.4. Transkripcija eukariotuose.................................................................................... 247

5.4.1. Eukariot RNR polimerazs.....................................................................................................248
5.4.2. RNR Ipolimerazs transkripcijos kompleksas...................................................................249
5.4.3. RNR IIIpolimerazs transkripcijos kompleksas................................................................252
5.4.4. RNR IIpolimeraz........................................................................................................................254
5.4.5. RNR IIpolimerazs transkripcijos preiniciacijos kompleksas .....................................258
5.4.6. RNR PolII transkripcijos preiniciacijos komplekso (PIC) susimontavimas . ...........263
5.4.7. Mediatoriaus kompleksas ir jo vaidmuo RNR PolII transkripcijoje...........................269
5
5.5. Transkripcijos valdymas prokariotuose............................................................. 271

5.5.1. Operonas........................................................................................................................................273
5.5.2. Laktozs operonas......................................................................................................................273
5.5.3. Triptofano operonas...................................................................................................................279
5.5.4. Kiti bakterij operonai...............................................................................................................283
5.5.5. Grietasis atsakas........................................................................................................................284
5.6. Transkripcijos valdymas eukariotuose............................................................... 285

5.6.1. Transkripcijos aktyvikli savybs...........................................................................................286
5.6.2. Transkripcijos aktyvikli atpastami atsako elementai................................................287
5.6.3. Transkripcijos aktyvikli sveikos su DNR motyvai.........................................................288
5.6.4. Maosios RNR ir gen raikos valdymas.............................................................................292
VI. RNR brendimas.................................................................................................302

6.1. Pre-tRNR brendimas............................................................................................... 302
6.2. Pre-tRNR brendimas prokariotuose.................................................................... 303
6.2.1. tRNR 3 ir 5 gal susidarymas.................................................................................................303
6.3. Pre-tRNR brendimas eukariotuose...................................................................... 307

6.3.1. Intron paalinimas i eukariot pre-tRNR........................................................................307
6.3.2. Kovalentins tRNR nukleotid modifikacijos....................................................................313
6.3.3. Eukariot pre-tRNR brendimo etap eilikumas.............................................................313
6.4. Pre-rRNR brendimas............................................................................................... 314

6.4.1. Pre-rRNR brendimas prokariotuose......................................................................................314
6.4.2. Pre-rRNR brendimas eukariotuose.......................................................................................314
6.4.3. Kovalentins nukleotid modifikacijos eukariot pre-rRNR.......................................316
6.4.4. rRNR susimontavimas ribosomas........................................................................................319
6.4.5. Intron alinimas i eukariot pre-rRNR.............................................................................319
6.4.6. Igrups intron isikirpimo mechanizmas........................................................................321
6.4.7. IIgrups intron isikirpimo mechanizmas.......................................................................323
6.4.8. Judrieji I ir II grups intronai....................................................................................................324
6.5. Pre-iRNR brendimas eukariotuose...................................................................... 324

6.5.1. Eukariot pre-iRNR 5galo modifikacijos. Kepurs struktra.....................................325
6.5.2. Pre-iRNR 3galo modifikavimas.............................................................................................328
6.5.3. iRNR splaisingas eukariotuose...............................................................................................330
6.5.4. Pre-iRNR intronai splaisingo reakcij substratas . .......................................................331
6.5.5. Splaisingui reikmingos konservatyvios nukleotid sekos intronuose ir
egzonuose.....................................................................................................................................332
6.5.6. Splaisingo reakcijos....................................................................................................................334
6.5.7. Splaisosomos struktra.............................................................................................................335
6.5.8. Splaisosomos susimontavimas ties pre-iRNR...................................................................337

6.5.9. Splaisosomos katalizinis centras...........................................................................................340
6.5.10. Splaisingo kompleks lokalizacija branduolyje.............................................................342
6.5.11. Alternatyvusis splaisingas.....................................................................................................342
6.5.12. iRNR kokybs kontrol............................................................................................................344
6.6. RNR redagavimas.................................................................................................... 344

6.6.1. Redagavimo tipai........................................................................................................................345
6.6.2. Nukleotido pakeitimas . ...........................................................................................................345
6.6.3. Nukleotid sek terpimas arba paalinimas . .................................................................348
VII. BALTYM BIOSINTEZ (TRANSLIACIJA)......................................................353

7.1. Genetinis kodas ir jo savybs............................................................................... 353
7.2. Pernaos RNR molekuls (tRNR) baltym biosintezs tarpininkai............. 358
7.2.1. Aminorgi aktyvinimas. Aminoacil-tRNR sintetazs...............................................360
7.2.2. Supresorins tRNR......................................................................................................................362
7.3. Ribosom struktra ir funkcijos........................................................................... 363

7.3.1. Ribosomos struktros tyrimai................................................................................................365
7.3.2. Ribosomins RNR........................................................................................................................368
7.3.3. Ribosominiai baltymai...............................................................................................................369
7.3.4. Funkciniai centrai ribosomoje................................................................................................369
7.4. Baltym biosintez prokariotuose...................................................................... 371

7.4.1. Transliacijos iniciacija.................................................................................................................371
7.4.2. Transliacijos elongacija..............................................................................................................376
7.4.3. Elongacijos ciklas........................................................................................................................377
7.4.4. Ikodavimas...................................................................................................................................379
7.4.5. Peptidinio ryio susidarymas..................................................................................................380
7.4.6. Ribosomos peptidiltransferazinis aktyvumas...................................................................382
7.4.7. Perstmimas.................................................................................................................................384
7.4.8. Transliacijos terminacija............................................................................................................385
7.5. Baltym biosintez eukariotuose........................................................................ 388

7.5.1. Transliacijos iniciacija.................................................................................................................389
7.5.2. IRES sritys ir j ypatumai...........................................................................................................392
7.6. Poliribosomos.......................................................................................................... 393

7.7. Transliacijos tikslumo valdymo bdai................................................................ 395
REKOMENDUOJAMOS LITERATROS SRAAS....................................................................397
DALYKIN RODYKL........................................................................................................................398
PRATARM
Molekulins biologijos gana naujo ir spariai besivystanio mokslo vadovli lietuvi

kalba iki iol ileista nebuvo. Vadovlyje Molekulin biologija pateikiami molekulins biologijos
mokslo pagrindai lietuviakalbiams skaitytojams.
Molekulin biologija yra skirta tiems, kurie nori gilintis gyvyb molekuli lygmenyje. Vadovlis gim i paskait, beveik por deimtmei dstyt Vilniaus universiteto molekulins
biologijos ir kit bakalauro studij program studentams, konspekt. Mediag teko nuolat
atnaujinti, papildyti naujomis molekulins biologijos mokslo iniomis. Per t laik buvo iaikinta mogaus genomo nukleotid seka, o genom sekoskaita tapo prastu reikiniu. Buvo
nustatyta ribosomos vienos didiausi biologini makromolekuli erdvin struktra, kurios
viena atradj, 2006m. Nobelio premijos chemijos srityje laureat profesor Ada Jonat (Ada
Yonath) 2010m. lanksi Lietuvoje Gyvybs moksl forume. Buvo sukurtas pirmasis sintetinis
genomas, i lsteli iauginti audiniai ir organai. Nelengva uduotis buvo bent dal i mokslo
pasiekim perteikti knygoje, nes gyvybs mokslai ir j iniomis grindiamos technologijos vystosi stulbinamai greitai.
Knygoje pirmiausiai siekta supaindinti su pagrindini lstels biomolekuli nukleorgi ir baltym struktra ir funkcijomis, taip pat su svarbiausiais molekuliniais vyksmais, kuriuose dalyvauja nukleorgi ir baltym molekuls. ie molekuliniai vyksmai lemia gyvyb.
Biologin informacija, ukoduota ir saugoma DNR molekulje, perduodama palikuonims susintetinus ios molekuls kopijas replikacijos proceso metu. Tolesnis biologins informacijos
perdavimas apima transkripcijos proces, per kur susintetinamos gen kopijos RNR molekuls. Tada vyksta sudtingas RNR molekuli brendimas, susidaro funkcionalios RNR, kuri
vairov yra didiul, o funkcijos labai vairios. Galiausiai, dalis toki RNR molekuli tos, kurios koduoja baltymus, dalyvauja transliacijos procese. Transliacija yra paskutinis biologins
informacijos perdavimo etapas. Jos metu susintetinami tkstaniai lstels baltym, kuriems
bdingos paios vairiausios funkcijos.
Knyg sudaro septyni skyriai, kuriuose aptariami pagrindiniai biologins informacijos saugojimo, perdavimo ir raikos vyksmai DNR biosintez, RNR biosintez, RNR brendimas ir baltym biosintez. Aptariant iuos vyksmus stengtasi atidiau pavelgti juose dalyvaujani
biologini makromolekuli struktr ir funkcijas, atskleisti molekulini main sudtingum.
Vadovlio mediaga gausiai papildyta iliustracijomis, atspindiniomis svarbiausias molekulins biologijos inias ir pasiekimus. Orientuojantis studentus kiekvieno skyriaus pabaigoje
pateikiama analitini klausim ir udavini, kurie, tikimasi, pads sisavinti vadovlyje pateikiam mediag. Knygos pabaigoje pateikiama dalykin tekste vartojam molekulins biologijos
termin rodykl ir rekomenduojamos literatros sraas.
Autor nuoirdiai dkoja kolegoms, ypa profesoriui Jurgiui Kadziauskui u vertingas pastabas ir patarimus, studentams j dka klaid ir netikslum tekste liko maiau ir atsirado grai lietuvik termin. Taip pat redaktorei Giedrei u didel ir nuoirdi pagalb redaguojant
kalb, ygimantui u technin teksto tvarkym.
Edita Suiedlien
I. VADAS. Pamatin molekulins biologijos dogma ir molekulins biologijos mokslo raida
I. VADAS.
Pamatin molekulins biologijos dogma ir
molekulins biologijos mokslo raida
Dabar mes jau pripastame, kad
molekulin biologija nra eilinis aspektas,
kuriuo tiriamos biologins sistemos. Ji
yra reikalo esm. Beveik visi gyvybs
aspektai turi molekulin pagrind, ir jeigu
nesuprasime molekuli, labai miglotai
suvoksime gyvyb... Bet kokie tyrim
rezultatai auktesniame biologini
sistem lygmenyje tra spjimai, kol jie
nepatvirtinti molekuliniame lygmenyje.1
F.Crick, What Mad Pursuit (1988)
1.1pav. D.Votsonas ir F.Krikas prie DNR dvigubos spirals modelio 1953m. (http://www.sciencesource.com/
collections/science_photo_library.html)
Studijuojantiems ar norintiems painti molekulin biologij dabartinis ios mokslo srities

vystymosi tarpsnis yra itin palankus: molekulin biologija pastaraisiais deimtmeiais vystosi
taip spariai, kaip n vienas kitas mokslas, ir skatina nauj
atradim lkesius. Tai yra labai jaunas mokslas, taiau
Molekulin biologija tiria genedarantis tak beveik visoms iuolaikins biologijos sritins informacijos saugojimo,
tims nuo tradicini taksonomijos bei sistematikos iki gen
dauginimo, perdavimo ir raifunkcijas tiriani srii. Nauj didel postm molekulins
kos mechanizmus, biopolimebiologijos vystymuisi paskutiniajame deimtmetyje suteir baltym ir nukleorgi
k naujomis technologijomis grindiam mokslo srii
struktr ir funkcijas.
genomikos, proteomikos, kit omik (transkriptomikos,
metabolomikos, kt.) sukrimas.
Ankstyvasis molekulins biologijos vystymosi tarpsnis. XXa.pradia1953m.

Molekulin biologija isivyst i atskir moksl, pirmiausiai biochemijos ir genetikos,
taip pat lstels biologijos, bakteriologijos. Pirm kart termin molekulin biologija pavartojo Rokfelerio fondo gamtos moksl skyriaus direktorius Varenas Vyveris (Warren Weaver).
1938 m. ataskaitoje fondui praydamas finansins paramos jis ra: Palaipsniui formuojasi
nauja mokslo sritis molekulin biologija, kuri pradeda mums atverti daugel paslapi apie
gyvos lstels atskirus komponentus.
Vertimas autors.
11
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Tuo metu biochemikai atrado daug svarbi vidulstelini chemini reakcij, m aikti i
reakcij ir baltym bei ferment svarba lsteli savybms. Deja, biochemikams ne itin rpjo
genai, j funkcijos jie tyrinjo lstels metabolinius procesus. Buvo manoma, kad genai yra
baltymai. To meto biochemijos vadovliuose DNR (deoksiribonukleorgiai) buvo skiriamas
maas skyrelis. Tik 1930m. buvo nustatyta, kad DNR yra didel molekul, kurios sudtyje yra
keturios skirtingos chemins bazs. Taiau DNR daug kam atrod pernelyg nuobodi palyginti
su baltym molekulmis, sudarytomis i 20-ies skirting aminorgi!
Ketvirtajame amiaus deimtmetyje genetikai siek iaikinti paveldimumo (gen) prigimt. Jie nustat ry tarp paveldimumo ir chromosom. Amerikiei mokslininkas Tomas
H.Morganas (Thomas Hunt Morgan) ir jo bendradarbiai rod, kad genas yra chromosomos
dalis. Taiau gen chemini bei kit savybi genetikai itirti negaljo. ia problema susidomjo fizikai. 1944m. austr fizikas Ervinas rdingeris (Erwin Schrdinger) knygoje Kas yra
gyvyb? (E.Schrdinger, What is life?, 1944; 1.2pav.) idst, kad gyvybs esm yra biologins
informacijos saugojimas ir perdavimas, o chromosomos gali bti ios informacijos saugyklos.
Lstelje, anot rdingerio, didiuliam biologins informacijos kiekiui sutalpinti turi egzistuoti
paveldimumo kodas. E.rdingeris ra: Genas galt bti nereguliarus, aperiodikas kristalas, svarbus paveldimumo kodui. Taigi, E.rdingeris pasil paveldimumo kodo koncepcij.
1.2pav. E.rdingerio knyga Kas yra gyvyb? (1944) (http://www.whatislife.ie/schrodinger.htm)
i nedidel knyga padar didiul tak to meto fizikams, biologams, kit srii mokslininkams ir atvr nauj poir biologinius procesus. Vienas i fizik, tuo metu susidomjs
biologija, buvo britas Frensis Krikas (Francis Crick). eksperimentin biologij taip pat pasuko amerikiei mokslininkai vokiei kilms fizikas Maksas Delbriukas (Max Delbrck), ital kilms gydytojas Salvadoras Lurija (Salvador Luria). Jie pradjo eksperimentus su bakteriofagais, siekdami itirti, kas utikrina j dauginimsi bakterijose. Netrukus j laboratorijos
bendradarbiai Alfredas Heris (Alfred Hershey) ir Marta eiz (Martha Chase) rod, kad su
paveldimumu (genais) yra susij ne baltymai, o DNR. ie tyrimai tikinamai patvirtino anksiau
atliktus ir mokslins visuomens gana skeptikai sutiktus Osvaldo Eiverio (Oswald Avery), Ko-
12
lino Makliaudo (Colin MacLeod) ir Maklyno Makkario (Maclyn McCarty) eksperimentus su

pneumokokais. Deimsas Votsonas (James Watson), tuometinis S.Lurijos doktorantas, spjo,
kad ryys tarp DNR ir gen slypi DNR molekuls cheminje struktroje. Tolesniems savo mokslinams tyrimams jis pasirinko btent DNR struktros tyrimus.
Tuo metu (1939m.) amerikiei chemikas Linusas Polingas (Linus Pauling) iaikino cheminio ryio prigimt. Tai leido suprasti biologini makromolekuli stabilumo prieastis. Netrukus Polingas nustat baltym a spirals struktr vien pagrindini baltym struktros element. Tuo metu makromolekuli tyrimams buvo pradta naudoti rentgeno spinduli analiz,
kuria austr kilms brit biologas Maksas Perucas (Max Perutz) patvirtino a spirals struktr.
Rentgenostruktrins analizs metodas buvo pradtas naudoti ir DNR tyrimuose. Tai turjo
ypa didels reikms iaikinant DNR erdvin struktr.
Klasikinis molekulins biologijos vystymosi tarpsnis (19532000m.)

Bendradarbiaudamas su F.Kriku, D.Votsonas sukr ir 1953m. paskelb DNR erdvins
struktros model bei pasil galim DNR biosintezs replikacijos bd. is atradimas padar esmin tak molekulins biologijos mokslo vystymuisi ir laikomas faktine io mokslo pradia. Kurdami DNR struktros model D.Votsonas ir F.Krikas panaudojo to meto inias apie DNR
struktrinius komponentus, taip pat DNR rentgenostruktrins analizs duomenis, kuriuos
gavo brit mokslininkai Morisas Vilkinsas (Maurice Wilkins) ir Rozalinda Franklin (Rosalind
Franklin). D.Votsonui, F. Krikui ir M.Vilkinsui (R. Franklin tuo metu jau buvo mirusi) u DNR
struktros iaikinim 1962m. skirta Nobelio premija.
Iaikinus DNR molekuls erdvin struktr ir supratus, kad ji yra informacin molekul,
toliau buvo siekiama itirti, kaip genetin mediaga funkcionuoja. Rus kilms amerikiei
mokslininkas Dordas Gamovas (George Gamow) 1954m. pirmasis ikl idj, kad baltym
aminorgtis lemia DNR struktriniai komponentai nukleotid trejetai. Taiau kaip vyksta genetins informacijos perdavimas i DNR baltymus, nebuvo aiku. D.Votsonas ikl hipotez,
kad tarpininku iame procese galt bti RNR molekuls. iai problemai sprsti net buvo kurtas garsusis RNR kaklaraii klubas, vienijs 20 garsiausi to meto mokslinink, kuri kiekvienas turjo po kaklaraiio sag su kurios nors aminorgties pavadinimo monograma.
F.Krikas ikl mint, kad aminorgtis baltym biosintezs viet galt neti maos RNR
molekuls. Netrukus tokios molekuls pernaos RNR (tRNR) buvo atrastos. 1960m. buvo
atrastos ir informacins RNR (iRNR). Tai pagaliau sudar prielaidas genetinio kodo iaikinimui.
Galiausiai 1966m. Heinrichas Matajus (Heinrich Matthaei), Maralas Nirenbergas (Marshall
Nirenberg) ir Haras Gobaindas Korana (Har Gobind Khorana)nustat, kuris DNR nukleotid
trejetas kuri aminorgt koduoja.
1957m. F.Krikas suformulavo pamatin molekulins
Pamatin molekulins biologibiologijos dogm (angl. the central dogma of molecular
jos dogma teigia, kad genetins
biology), anot kurios, biologin informacija yra saugoma
informacijos pernaa i DNR
deoksiribonukleorgi (DNR) molekulje (genuose).
baltym yra galima, o atvirkBiologins informacijos pernaa vyksta DNR kopijuojant
iai ne. DNR yra genetins
ribonukleorgi (RNR) molekul transkripcijos metu, o
informacijos saugykla.
vliau RNR naudojant kaip matric baltym molekuli
13
MOLEKULIN BIOLOGIJA
biosintezs metu. Pamatin molekulins biologijos dogma teigia, kad genetins informacijos
pernaa i DNR baltym yra galima, o atvirkiai ne.
Pamatin dogm iliustruojanioje schemoje (1.3pav.) galime matyti, kad biologini molekuli hierarchijoje DNR uima aukiausi viet. DNR molekulse yra saugoma genetin informacija ir ukoduota bsim baltym aminorgi seka. Prieingai, baltymai nelemia DNR
nukleotid arba aminorgi sekos.
Nors prajo nemaai laiko nuo tada, kai buvo suformuluota pamatin molekulins biologijos dogma biologins informacijos virsmo modelis, gausyb pastaraisiais metais sukaupt
ini apie biologines molekules ir j funkcijas, F.Kriko nuomone, jos nepakeit. Taiau teko j
iplsti remiantis fundamentaliais molekulins biologijos atradimais.
Buvo nustatyta, kad RNR molekuli sintez gali vykti nuo RNR matricos, o DNR molekuls
sintez nuo RNR matricos (1.3pav.). Pvz., retrovirus DNR sintez vyksta atvirktins transkripcijos bdu kaip matric naudojant RNR. Eukariot genuose buvo atrasti intronai sekos,
kurios paalinamos i RNR jai brstant. Be to, atradus RNR redagavimo fenomen, paaikjo,
kad genas gali ir nekoduoti baltymo aminorgi sekos: ji programuojama keiiant transkripto nukleotid sek, t. y. RNR redagavimo metu. Redagavimas, anot F.Kriko, yra pats didiausias
nuokrypis nuo jo dogmos modelio.
1.3pav. Schema, iliustruojanti pamatin molekulins biologijos dogm

Molekulins biologijos tyrimai atskleid nauj fakt, koreguojani pamatin dogm. Atrasti
prionai (angl. prion proteinaceous infectious particle) baltymai, sukeliantys neurodegeneracines ligas gyvn spongioformin encefalopatij ir mogaus Kreucfeldo-akobo (angl. Creutzfeldt-Jacobs)
sindrom. Siekiant iaikinti ligos suklj, lig sukelianiuose mginiuose buvo suardyti DNR, RNR ir
baltymai. Suleidus tokiu bdu paveikto nesveik gyvn lstelinio skysio sveik laboratorini gyvn smegenis, pastarieji vis tiek susirgdavo. Paaikjo, kad ligos sukljas yra ne virusas, kaip manyta,
o gyvn bei mogaus neuron paviriuje esantis baltymas PrP. Sergani moni ir gyvn lstelse baltymas yra netikslios erdvins struktros (konformacijos) PrPSc. Netikslios struktros baltymas
yra ne neuron paviriuje, bet j viduje, ten sudaro netirpius agregatus, todl juos sunku sunaikinti
14
prastais baltym ardymo metodais, pvz., veikiant peptidazmis. Pakliuvs sveiko gyvno ar mogaus
organizm toks baltymas slygoja, kad toki pai konformacij gyt eimininko gamtins konformacijos baltymas PrPC, kuris prastomis slygomis nesukelia jokios patologijos. Taigi, baltymas baltymui
perduoda informacij apie savo konformacij.
Epigenetini pokyi paveldjimo nustatymas eukariot organizmuose atskleid, kad informacija
gali bti perduodama i kartos kart ne tik DNR nukleotid sek (gen) pavidalu, bet ir DNR bei baltym histon modifikacij pavidalu.
Atradimai RNR biologijos srityje leido ikelti hipotez, kad RNR galjo bti molekul, kuri gebjo
save kopijuoti ir dav pradi gyvybs vystymuisi. Anot ios hipotezs, pirmykiame pasaulyje btent
RNR buvo genetins informacijos saugykla, ji gebjo katalizuoti savo replikacij ir dalyvavo kituose
biologiniuose vyksmuose. Iaikinus ribosomos struktr ir nustaius, kad peptidinis ryys baltym
biosintezs metu susidaro ribosomos srityje, kurioje yra tik ribosomins RNR molekuls (r. skyri Baltym biosintez), ikelta hipotez, kad ribosoma gali bti didiausia gamtin RNR molekul ikasena, pasiyminti katalizinmis savybmis.
Vykstant evoliucijai, chemikai stabilesn DNR buvo atrinkta genetins informacijos saugojimui,
o vairiomis cheminmis savybmis pasiyminios baltym aminorgi funkcins grups evoliucionavo vairiomis katalizinmis savybmis pasiyminias baltym molekules.
Iaikinus genetin kod, 7-ajame prajusio amiaus deimtmetyje buvo spariai engiama toliau siekta suprasti, kaip funkcionuoja genai. 1961m. prancz mokslininkai Fransua
akobas (Franois Jacob) ir akas Mono (Jacques Monod) atrado, kad bakterij (E.coli) gen,
svarbi laktozs metabolizmui, veikla gali bti koordinuotai valdoma pasitelkiant baltym represori. Netrukus toks baltymas represorius buvo nustatytas ir apibdintas. Iaikinta, kad jis
sveikauja su DNR ir tokiu bdu valdo gen veikl. Ilgainiui tapo aiku, kad gen veiklos valdymo bdas, dalyvaujant su DNR sveikaujantiems baltymams aktyvikliams bei represoriams,
bdingas visiems organizmams.
7-asis prajusio amiaus deimtmetis buvo labai svarbus tolesnei molekulins biologijos
raidai: buvo sukurti rekombinantins DNR krimo bei DNR nukleotid sekos nustatymo
(sekoskaitos) metodai. J pagrindu nepaprastai greitai vystsi eksperimentin molekulin
biologija. ie metodai dav pradi naujai pramons akai biotechnologijai. 1972m. amerikiei mokslininkai Herbertas Bojeris (Herbert Boyer) ir Stenlis Kojenas (Stanley Cohen),
panaudoj restrikcijos endonukleaz ir DNR ligaz, sukr pirmj rekombinantin DNR molekul plazmid, turini genus, kurie lemia atsparum antibiotikams kanamicinui ir tetraciklinui. Tuo pat metu, nepriklausomai vienas nuo kito, amerikietis Volteris ilbertas (Walter
Gilbert) ir britas Frederikas Sengeris (Frederick Sanger) sukr DNR nukleotid sekoskaitos
chemin ir fermentin bdus. F. Sengerio fermentinis DNR nukleotid sekoskaitos bdas ilgai
naudotas organizm genom nukleotid sekai nustatyti. Juo 2000m. buvo nustatyta mogaus
genomo nukleotid seka (r. 1.1lentel). iuo metu DNR sekoskaitai naudojamos itin sparios
naujos kartos technologijos.
Pogenominis molekulins biologijos vystymosi tarpsnis (nuo 2000 m. iki dabar)

2000m. beveik buvo baigtas ne tik iniasklaidos plaiai igarsintas mogaus genomo projektas (GP) (angl. Human Genome Project), bet taip pat buvo nustatytos ir kit eukariotini
bei prokariotini organizm genom sekos. Taigi, dabartin molekulins biologijos vystymosi
laikotarp pagrstai galima vadinti pogenomine era. Pogenomins eros pirmj deimtmet itin
15
MOLEKULIN BIOLOGIJA
spariai vystsi DNR sekoskaitos technologijos: nors GP prireik beveik deimties met nustatyti pirmj genom ir tai kainavo ~3milijardus JAV doleri per artimiausius kelerius metus
tai bus galima padaryti per dien vos u 1000 JAV doleri.
Vienas pirmj pogenomins eros netiktum daugel GP entuziast nuvyls faktas, kad
mogaus genome yra tik ~30000 gen, o visas haploidinis genomas sudarytas i kiek daugiau nei
3,4x109 nukleotid por. Pasirod, kad mogaus genome yra maiau nukleotid nei, pvz., pels, puies (Pinus) ar pirmuonies amebos (Amoeba dubia) genomuose. ie faktai ne vien apstulbino ir nuvyl,
kartu liudydami, kad ne genomo dydis lemia organizm ir juose vykstani biologini vyksm sudtingum. Palyginus mogaus ir impanzs gen sekas, nustatyta net 99% identik nukleotid sek,
o didiausi skirtumai aptikti kvap ir klausos genuose, kuriais sunku paaikinti akivaizdius skirtumus
tarp i organizm.
Taigi, pogenomins eros tyrim rezultatai leido daryti gal ir nuviliani ivad, kad ne genomo
dydis ir struktra lemia biologinius vyksmus. Taiau ie tyrimai leido dar kart sitikinti gen raikos valdymo svarba biologijoje. Dar daugiau pogenominje eroje sukurtos labai naios biologini molekuli ir vyksm analizs technologijos (proteomika, transkriptomika, metabolomika ir t. t.), leidianios
analizuoti visus lstels baltymus, viso genomo sudtini dali ir genomo raikos pokyius.
Naujai sukurtos pogenomins technologijos sudar slygas lyginti vairi patologij audini gen
raik. Tyrim rezultatai leidia manyti, kad patologijas (pvz., vinius susirgimus, Alzhaimerio lig)
lemia nedidels genomo dalies (100-200 gen) raikos pokyiai.
Pogenomins eros tyrim rezultatai dar nra nuodugniai patikrinti, todl dar anksti dabartin biologijos moksl, tarp j ir molekulins biologijos, vystymosi tarpsn vadinti biomedicinos amiumi.
Taiau laikotarp galime drsiai laikyti iskirtiniu biologijos moksl raidos etapu dl to, kad jame
pamatin molekulins biologijos dogma atsiskleid naujai. iuolaikinei molekulinei biologijai ne tiek
svarbu nustatyti biologini molekuli (DNR, RNR, baltym) hierarchij, kiek svarbu suprasti, kaip ir
kokia genomo koduojama informacija veikia kiekvienoje organizmo lstelje.
1.1. Modelins biologins sistemos molekulinje

biologijoje
Gyvieji organizmai yra labai sudtingi. Kuo daugiau suinoma apie vien organizm, tuo
patrauklesnis jis tampa tolesniems tyrimams. Kiekvienas atradimas kelia nauj klausim, o
gautos inios pasitelkiamos gilesniam supratimui, kaip funkcionuoja konkretus organizmas.
Molekulins biologijos tyrimams pasirenkami modeliniai organizmai, kurie daugelio pasaulio
laboratorij ir mokslinink tyrinjami vairiais aspektais. Prajusiame amiuje labai svarbs atradimai molekulins biologijos srityje buvo padaryti tiriant bakterijas ir virusus (bakteriofagus).
Tuo pat metu buvo sukurta daug molekulins biologijos tyrimo metod. J dka suinota
apie lsteli svarbiausi makromolekuli chemines ir fizines savybes. Kai kurie i j, pvz., nukleorgi ir baltym sekoskaitos metodai, polimerazs grandinins reakcijos (PGR) metodas,
buvo tokie reikmingi molekulins biologijos bei gretutini moksl ir biotechnologij raidai,
kad j krjai vertinti Nobelio mokslo premijomis. iandien siekiama suprasti, kaip funkcionuoja vienalsiai ir daugialsiai eukariotiniai organizmai. Spariai vystantis technologijoms,
eukariotini organizm molekulini tyrim galimybs labai iaugo.
16
Paprasiausia gyvybs forma yra virusas. J sudaro DNR arba, kai kuriais atvejais, RNR molekul, gaubiama baltym apvalkalo. Virusas yra paprastas, nes yra parazitas, inaudojantis lstels eimininks funkcijas. Virus lstels eimininks gali bti bakterijos, archjos, augal ir
gyvn lstels. Bakterijos tarp i lsteli yra paprasiausios.
Bakterijos yra laisvai gyvenantys vienalsiai organizmai (1.4pav.). J yra daugyb ri.
Bakterijos yra prokariotai jos turi chromosom, neatskirt branduolio, ir, palyginti su eukariotais, kuri chromosomos yra branduolyje, yra paprastesns struktros. Taiau bakterijos turi
daugel savybi, dl kuri patogu tirti j biologinius procesus. Jas gana paprasta auginti, jos
greitai dalijasi ir nra reiklios. Pvz., maa, lazdels formos moni ir gyvn arnyno bakterija
Escherichia coli (E.coli) 37C temperatroje pasidalija madaug kas 20min. is mikroorganizmas buvo vienas labiausiai molekulins biologijos tiriam objekt prajusiame imtmetyje.
Apie E.coli vykstanius molekulinius procesus inoma daugiausiai i vis tyrint organizm.
1.4pav. Escherichia coli bakterijos (http://textbookofbacteriology.net/procaryotes.html)
Bakterijos gali augti skystoje mitybinje terpje ir ant kietos terps. Bakterij populiacija,
auganti skystoje terpje, yra vadinama bakterij kultra. Jeigu mitybin terp yra sudtingas biologini mediag ekstraktas, ji vadinama turtinga mitybine terpe. Jeigu augimo terp
sudaro tik organins mediagos (pvz., gliukoz ar glicerolis), kurios bakterij naudojamos kaip
anglies altinis, augimo terp vadinama minimalia. Be anglies altinio, minimalioje terpje
bakterij augimui yra btini Na+, K+, Mg2+, Ca2+, NH4+, Cl-, HPO42-, SO42- jonai. Jeigu bakterijos
auga minimalioje terpje, reikia, kad jos geba sintetinti visas reikalingas organines mediagas,
pvz., aminorgtis, vitaminus, lipidus ir t. t. Tokios bakterijos yra prototrofai. Bakterijos, nesugebanios sintetinti vis reikaling organini mediag, yra auksotrofai. Bakterijos danai
auginamos ant kietos terps. Pirmoji j augimui panaudota kieta terp buvo bulvs riekel. Vliau j pakeit agaras gel panai mediaga, gaunama i jros dumbli. Agaras yra atsparus
bakterij ferment poveikiui, todl naudojamas terpms kietinti.
Bakterij metabolizmas yra grietai valdomas. Jos yra vieni efektyviausi iki iol atrast organizm. Bakterijos retai sintetina mediagas, kuri joms nereikia. Pvz., jos nustoja sintetinti
aminorgt triptofan, jeigu augimo terpje yra triptofano. Inaudojus terpje esant triptofan, bakterijose tuoj pat jungiama jo sintezei reikaling komponent gamyba. Tokie lstelje
vykstantys procesai yra vadinami metaboliniu valdymu (angl. metabolic regulation).
Dl palyginti nesudting auginimo slyg laboratorijoje bakterijos buvo vienas daniausiai naudojam objekt tiriant biologini makromolekuli fizines bei chemines savybes ir pa-
17
MOLEKULIN BIOLOGIJA
sitarnavo gaunant daugel molekulins biologijos ini. Pvz., informacija apie nukleorgtis ir
baltymus buvo gauta tiriant bakterij lsteli sudtinius komponentus. Pirmosios inios apie
metabolin valdym taip pat buvo gautos tiriant bakterijas, tik vliau augal ir gyvn lsteles.
1.5pav. Vilniaus universiteto Biochemijos instituto mokslinink atrastas Klebsiella bakterijas infekuojantis bakteriofagas RaK2 (PLOS One, 2013, DOI: 10.1371)
Bakteriofagai. Imokus kultivuoti bakterijas ir ityrus j metabolinius procesus, buvo pradti tyrinti bakterij virusai bakteriofagai (1.5pav.). Bakteriofagai yra ymiai paprastesns
struktros negu bakterijos, juos gana lengva tyrinti. Panaudojus bakteriofagus, buvo pirm
kart suinota, kad genetin informacija yra saugoma ne baltymo, o DNR molekulje.
1.6pav. Archja Methanococcus jannaschii (http://textbookofbacteriology.net/procaryotes.html)
Archebakterijos. Archebakterijos yra prokariotai, evoliucikai artimiausi pirmosioms emje atsiradusioms lstelms (1.6pav.). Priklauso archj gyvybs domenui. Daniausiai gyvena ekstremalioje aplinkoje. Archebakterij gen raika, dalijimosi mechanizmai yra labai saviti,
tarpiniai tarp prokariot ir eukariot.
18
1.7pav. Miels Saccaromyces cerevisiae (http://rushartsbiology.wikispaces.com/Visuals+-+Unit+5)
Miels. Miels (1.7pav.) yra eukariotinis organizmas (chromosomos yra branduolyje), taiau kai kuriomis savybmis jos panaios bakterijas greitai dalijasi, nra reiklios, jas patogu
auginti laboratorijoje. Miels yra naudojamos sintetinti rekombinantin DNR (dirbtins mieli
chromosomos), turini terptus kit organizm (pvz., mogaus) genus. Genetikai modifikavus Pitchia pastoris mieles, sukurtos vadinamosios humanizuotos miels, kuriose vyksta susintetint rekombinantini mogaus baltym modifikacijos (glikozilinimas). Tokiu bdu dideliais
kiekiais gaunami terapiniams tikslams reikalingi funkcionals mogaus baltymai.
Gyvn lstels. Daugel gyvn lsteli tip, tarp j ir kai kuri tip mogaus lsteles,
galima auginti laboratorijoje panaiais metodais kaip ir mieli bei bakterij lsteles. Pirmins
lsteli kultros yra normalios neriuotos gyvn lstels (pvz., odos lstels arba embrionins lstels), iskirtos tiesiai i audinio ir perkeltos lktel su mitybine terpe. I pradi jos
auga gerai, taiau greitai va. Vins lstels, prieingai, dalijasi neribotai, jas patogu auginti
kultroje, kur jos auga vienu sluoksniu monosluoksniu. iuo metu jau pltojami tyrimai su
lstelmis, kurios auga trimatje erdvje, t. y. panaiai kaip audinyje (1.8pav.).
1.8pav. Luiso (Lewis) plaui karcinomos lstels, Nacionalinio vio instituto mokslinink uaugintos trimatje erdvje (V. Stankeviiaus nuotr.)
19
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Ankstyv stadij induoli embrion (pvz., pels) lstels taip pat yra geras biologini sistem tyrim modelis. Ankstyvojo embriono lstels, auginamos tam tikroje terpje, diferencijuoja vairi tip lsteles. Tokios lstels dar vadinamos pirminmis kamieninmis lstelmis.
Pvz., kai terpje yra tam tikr mediag, pirmins kamienins lstels vystosi nerv, raumen,
kepen ir kt. lsteles. Kamienins lstels yra perspektyvus molekulins ir lstels biologijos
tyrim objektas: naudojant kamienines lsteles kuriami reikalingi audiniai bei organai.
Augal lstels. Pastarj deimtmet molekulins biologijos, molekulins genetikos, lstels biologijos tyrim modeliniu organizmu tapo nedidelis krymaiedi eimos augalas baltaiedis vairenis (Arabidopsis thaliana) (1.9pav.). is augalas yra patogus tyrim objektas: j galima
auginti laboratorijoje, jo DNR yra nedidel (135x106 nukleotid por, koduoja ~27000 gen),
pasiskirsiusi 5 chromosomose. 2000m. nustatyta Arabidopsis thaliana DNR nukleotid seka.
1.9pav. Baltaiedis vairenis (Arabidopsis thaliana) (http://en.wikipedia.org/wiki/

Arabidopsis_thaliana)
1.1lentel. Reikmingiausi atradimai, padar tak molekulins biologijos mokslo gimimui ir tolesnei jo raidai
Metai
Autorius
Atradimas
1865
G.Mendelis (G.Mendel)
Atliko ir apra paveldimumo fenotipinius tyrimus
1869
F.Mieris (F.Miescher)
Atrado nuklein (pliuose ir uv spermoje)
1887
A.Veismanas (A.Weismann)
Apra chromosom dalijimsi
1899
R.Altmanas (R.Altman)
Iskyr i nukleino baltymus ir nukleorgtis; sukr termin nukleorgtis
1900
Chemikai apra visas heterociklines bazes
1902
V.Sutonas (W.Sutton)
Apra mejoz ir spermatogenez vabzdi organizmuose; sukurta chromosomin paveldimumo teorija
20
Metai
Autorius
Atradimas
1911
T.H.Morganas (T.H.Morgan)
Atrado chromosom sukibim ir krosingover drozofiloje
1913
A.Stiurtevantas (A.Sturtevant)
Nustat gen padtis chromosomoje
1924
R.Fuelgenas (R.Fuelgen)
Citochemikai nuda DNR
1928
F.Grifitas (F.Griffith)
Naudodamas pneumokokus atrado DNR transformacij
1930
P.Levenas (P.Levene)
Atrado deoksiriboz
1941
D.Bidlis ir E.Tatumas (G.Beadle & E.Tatum)
Suformulavo teigin vienas genas vienas fermentas
1944
O.Eiveris, M.Makliaudas ir K.Makkartis

(O.Avery, M.MacLeod & C.McCarty)
rod genetin DNR vaidmen, t. y. kad DNR yra genetin

mediaga
1949
E.argrafas (E.Chargaff )
Ityr DNR nukleotid sudt (argrafo taisykls)
1952
A.Heris ir M.eiz (A.Hershey & M.Chase)
Naudodami 32P izotop, ityr viruso DNR replikacij
1953
D.Votsonas ir F.Krikas (J.Watson & F.Crick)
Sukr DNR erdvins struktros model
1950
P.Mitelas (P.Mitchell)
Ityr chemiosmoz, t. y. kaip lstels gamina ATP, ir suformulavo chemiosmozin hipotez
1952
L.Polingas ir R.Koris (L.Pauling & R.Corey)
Atrado baltym spiral
1953
F.Sengeris (F.Senger)
Pirm kart nustat baltymo insulino aminorgi

sek
1954
D.Gamovas (G.Gamow)
Pasil teigin, kad DNR koduoja baltymus
1957
F.Krikas (F.Crick)
Ikl sekos hipotez ir suformulavo pamatin molekulins biologijos dogm
1958
M.Mezelsonas ir F.talis (M.Meselson &

F.Stahl)
Eksperimentikai rod pusiau konservatyvj DNR replikacijos bd
1959
A.Kornbergas (A.Kornberg)
Igrynino RNR polimeraz ir nustat jos veikimo principus
1960
D.Kendriu ir M.Perucas (J. Kendrew &

M.Perutz)
Pirm kart nustat baltymo (hemoglobino ir mioglobino)

erdvin struktr
1961
S.Breneris, F.akobas, M.Mezelsonas

(S.Brenner, F.Jacob & M.Meselson)
Atrado informacin RNR (iRNR)
1961
A.Lvovas, F.akobas, .Mono (A.Lvov, F.Jacob, J.Mono)
Atrado ferment biosintezs reguliacijos mechanizm
1963
D.Vinogradas (J.Vinograd)
Atrado DNR superspiralizacij
1965
R.Holis, H.G.Korana, M.Nirenbergas ir

H.Matajus (R.Holley, H.G.Khorana, M.Nirenberg, H.Matthaei)
Iaikino genetin kod
1968
S.Kojenas (S.Cohen)
Atrado plazmides ir j atsparum antibiotikams
1970
H.Smitas (H.Smith)
Atrado restrikcijos endonukleaz
1970
H.G.Korana (H.G.Khorana)
Cheminiu bdu susintetino DNR
1970
D.Baltimor ir H.Teminas (D.Baltimore &

H.Temin)
Atrado atvirktin transkriptaz ir atvirktin transkripcij
1972
H.Bojeris (H.Boyer), S.Kojenas (S.Cohen)
Sukr pirmj rekombinantin DNR
1975
V.ilbertas, A.Maksamas, F.Sengeris (W.

Gilbert, A.Maxam, F.Sanger)
Sukr DNR sekoskaitos chemin ir fermentin metodus
1975
C.Milteinas, D.Koleris ir N.Dimis (C. Milstein, G.Kohler & N.Jeme)
Susintetino monokloninius antiknus
21
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Metai
Autorius
Atradimas
1977
R.Robertsas ir F.arpas (R.Roberts

&P.Sharp)
Atrado splaising (intronus ir egzonus)
1981
S.Altmanas ir T.echas (S.Altman & T.Cech)
Atrado ribozimus
1983
K.Mulis (K.Mullis)
Sukr polimerazs grandinins reakcijos (PGR) metod
1981
S.E.Liftas, M.G.Rozenfeldas ir R.M.Evansas

(S.E.Left, M.G.Rosenfeld & R.M.Evans)
Atrado alternatyvj splaising lsteliniuose organizmuose
1990
mogaus genomo projektas (GP)
Prasidjo projektas mogaus DNR nukleotid sekai

nustatyti
1992
H.Noleris (H.Noller)
Ikl hipotez, kad peptidiltransferaz yra ribozimas
1994
Kompanija Calgene
Sukr pirmj transgenin augal (pomidor)
1996
J.Vilmutas (I.Wilmut)
Pirm kart klonavo induol (av Doli)
1998
D.Tompsonas ir D.Gerhartas (J.Thompson &

J.Gearhart)
Sukultrino daugiagales kamienines lsteles
1999
K.Venteris ir kompanija Celera (C.Venter &

Celera)
Nustat vaisins musels (Drosophilla melanogaster) DNR

nukleotid sek
2000
JAV mogaus genomo projektas, K.Venteris

(kompanija Celera)
Nustat mogaus DNR nukleotid sek (juodrat)
2003
JAV mogaus genomo projektas, K.Venteris

(kompanija Celera)
Nustat vis mogaus DNR nukleotid sek
2005
JAV Nacionalinis mogaus genomo tyrim

institutas
Nustat impanzs (Pan troglodytes) DNR sek
2006
JAV Nacionalinis mogaus genomo tyrim

institutas
Nustat rezus makakos (Macaca mulatta) DNR sekos

juodrat
2007
K.Venterio institutas
Nustat diploidinio mogaus genomo DNR sek
2008
K.Venterio institutas
Sukr pirmaj sintetin genom (bakterijos Mycoplasma

genitalium)
2010
Tarptautinis konsorciumas
Nustat pirmykio mogaus DNR nukleotid sek
2012
F.Holigeris (P.Holliger) ir bendradarbiai
Sukr sintetin DNR (XNR), kurioje cukraus molekuls yra

kitokios nei gamtinje DNR (tokia DNR koduoja informacij ir gali bti replikuojama)
2013
Panaudojus daugiagales kamienines lsteles, iauginti

miniorganai: kepenys, inkstai, kt.
22
II. NUKLEORGI IR BALTYM MOLEKULIN STRUKTRA
II. NUKLEORGI IR BALTYM

MOLEKULIN STRUKTRA
2.1. Nukleorgi molekulin struktra
Biologinse sistemose nukleorgtys uima iskirtin viet. Struktriniai elementai, i kuri
sudarytos nukleorgtys, nukleotidai yra palyginti paprasti, taiau nukleorgi molekuls dalyvauja daugybje sudtingiausi lstels funkcij.
Gyvuose organizmuose yra dviej tip nukleorgtys: deoksiribonukleorgtys (DNR) ir
ribonukleorgtys (RNR).
Deoksiribonukleorgtyse esanti genetin informacija yra saugoma, pasiekiama ir dauginama replikacijos proceso metu. Toliau, dalyvaujant ribonukleorgtims, ribosomose ji yra
aminorgi pavidalu perduodama sintetinamiems baltymams, kuri savybs bei funkcijos
lstelje ir yra galutin jos iraika. Kai kurios ribonukleorgtys taip pat pasiymi struktrinmis ir katalizinmis funkcijomis.
2.1.1. DNR ir RNR pirmin struktra

DNR ir RNR molekuls yra nereguliars polimerai, sudaryti i struktrini monomer
nukleotid (2.1 pav., b), kovalentikai sujungt tarpusavyje 3, 5-fosfodiesteriniu ryiu
(2.3pav.). Taip sujungti nukleotidai sudaro polinukleotidus. Nedideli polinukleotidai, sudaryti i keli arba kelioPolinukleotidin grandin yra
likos monomer, yra vadinami oligonukleotidais. Ilgi
nukleorgi pirmin struktra.
polinukleotidai dar vadinami polinukleotidinmis grandinmis. Polinukleotidins grandins yra nukleorgi
pirmin struktra.
Norint suprasti nukleorgi funkcijas, btina inoti jas sudarani monomer nukleotid savybes. Nukleotidus sudaro:
zz Monosacharidai (pentozs):
99 2-deoksi-D-riboz (yra deoksiribonukleotiduose DNR sudtyje) (2.1pav., b);
99 D-riboz (yra ribonukleotiduose RNR sudtyje) (2.1pav., b).
23
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Monosacharid anglies atomai ymimi 1, 2, 3 ir t. t. 2-deoksi-D-riboz skiriasi nuo D-ribozs tuo, kad ties C2 atomu neturi hidroksi- (OH) grups. Vietoje jos yra vandenilio (H) atomas.
I sacharid molekuli pavadinim yra kil ir DNR bei RNR pavadinimai deoksiribonukleorgtis (DNR) ir ribonukleorgtis (RNR).
zz Heterociklins bazs:
99 Heterociklins bazs DNR sudtyje:
purinai (turi purino ied): adeninas (A) ir guaninas (G) (2.1pav., a);
pirimidinai (turi pirimidino ied): citozinas (C) ir timinas (T).
99 Heterociklins bazs RNR sudtyje:
purinai: adeninas (A) ir guaninas (G);
pirimidinai: citozinas (C) ir uracilas (U).
Purino ir pirimidino bazs yra plokios struktros, kuri lemia elektron debesli konjugacija. Purino iedas purino molekulje yra sudarytas i dviej kondensuot pirimidino ir
imidazolo ied.
Adeninas, guaninas, citozinas, timinas ir uracilas yra daniausiai nukleorgtyse randamos
heterociklins bazs. Jos vadinamos pagrindinmis heterociklinmis bazmis. Nukleorgi
sudtyje taip pat yra randamos vairios maiau paplitusios minorins heterociklins bazs. J
yra prokariot, archj, eukariot DNR, iRNR, itin gausu pernaos RNR (tRNR) molekulse (r.
skyri Baltym biosintez).
Kodl RNR sudtyje yra timino heterociklin baz, o RNR uracilo? Dl keli prieasi. Pirmoji yra
susijusi su DNR apsauga. Timino heterociklin baz yra metiluracilas (2.1pav.). Heterociklini bazi
metilinimas DNR atlieka apsaugin funkcij. vykus DNR sintezei, naujose DNR molekulse metilinamos adenino ir citozino heterociklins bazs, bet dTTP (metiluracilas) susintetinamas i dUMP dar iki
DNR sintezs ir traukiamas DNR molekul replikacijos metu. Antra, timino heterociklin baz dl savo
chemini savybi DNR molekulje sudaro por su adenino heterocikline baze, o uracilo heterociklin
baz gali sudaryti poras su G ir C bazmis bei su kita uracilo baze. Taigi, kai T yra DNR sudtyje, replikacijos metu sumaja tikimyb susidaryti ne Votsono-Kriko tipo poroms. Treia, jeigu DNR sudtyje
bt ne T, o U, lstels reparacijos mainai bt sunku atskirti tikruosius U nuo t uracilo heterociklini bazi, kurios atsiranda DNR dl citozino deamininimo (CU).
Heterociklins bazs b-N-glikozidiniu ryiu yra susijungusios su monosacharido iedu, kuris yra furanozs formos, per C1 atom. Purinai yra sujungti per j N9 atom, o pirimidinai per
N1 atom (2.1pav., b).
zz Fosforo rgties liekana (viena arba kelios):
Nukleozidai su fosforo rgties liekana sudaro nukleotidus. Fosforo rgties liekana (fosforilgrup) yra prijungiama prie nukleozido monosacharido vienos i hidroksigrupi esterinant
nukleozidus fosforo rgtimi. Kitaip tariant, nukleotidai yra nukleozid fosforo rgties este-
24
2.1pav. Nukleorgi struktriniai komponentai. Heterociklini bazi, einani DNR ir RNR nukleotid sudt, struktra (a); deoksiribonukleotid (DNR) ir ribonukleotid (RNR) struktra (b) (D. L. Nelson,
Cox M. M. Lehninger. Principles of Biochemistry, sixth edition, 2012)
riai, arba fosforilinti nukleozidai. Esteriai yra alkoholi (monosacharidai yra polialkoholiai) ir
rgi (fosforo rgtis H3PO4) reakcijos produktai.
Laisvuose nukleotiduose fosforilgrups gali bti prijungiamos prie monosacharid 5, 3,
2 hidroksigrupi (2.1pav., b). Daniausiai esterinama OH grup, esanti prie ribozs (deoksiribozs) C5 atomo. Fosforilgrups padtis nukleotido molekulje nurodoma skaiiumi, o pavadinime naudojamas odis fosfatas. Pvz., nukleozidas adenozinas, prie kurio deoksiribozs C5
atomo yra prijungta viena fosforilgrup, vadinamas deoksiadenozino 5 monofosfatu (sutrumpintai dAMP). Nukleozidas adenozinas, prie kurio ribozs C3 atomo yra prijungta viena fosforilgrup, vadinamas adenozino (adenozidas adenino heterociklin baz turinio nukleozido
pavadinimas) 3 monofosfatu (sutrumpintai 3-AMP).
5 padtyje esanios fosforilgrups neymimos (ATP), o esanios 3 padtyje ymimos
(3-AMP).
Nukleotidai dl fosforo rgties liekanos dar yra vadinami ir rgtimis. Pvz., AMP adenilo
rgtis (adenilatas), UMP uridilo rgtis (uridilatas) ir t. t. (2.1lentel).
Prie vienos fosforilgrups nukleotiduose gali bti jungiama dar viena arba dvi fosforilgrups. Fosforilgrups jungiamos anhidridiniu ryiu (2.2pav.). Ariausiai monosacharido esanti
25
MOLEKULIN BIOLOGIJA
fosforilgrup yra a padtyje. Toliau esanios grups atitinkamai b ir g padtyse. Anhidridiniai

ryiai turi daug potencins energijos. Tokius ryius turintys junginiai yra didiaenergiai, t. y.
suskaidius anhidridinius ryius, isiskiria energija, kuri naudojama biologiniuose procesuose.
2.2pav. Adenozino
mono-, di-, trifosfato
struktros (https://
www.rpi.edu/dept/
bcbp/molbiochem/
MBWeb/mb1/part2/
bioener.htm)
2.1lentel. Heterociklini bazi, nukleozid, nukleotid pavadinimai ir trumpiniai

Heterociklin
baz
RNR
(mono
fosfatas)
DNR
(mono
fosfatas)
Vienraidis
simbolis
(deoksi-) adenilo rgtis, arba

(deoksi-) adenozino monofosfatas
AMP
dAMP
Guo
(deoksi-) guanilo rgtis, arba

(deoksi-) guanozino monofosfatas
GMP
dGMP
(deoksi-)
citidinas
Cyd
(deoksi-) citidilo rgtis, arba

(deoksi-) citidino monofosfatas
CMP
dCMP
Timinas
(deoksi-)
timidinas
Thd
(deoksi-) timidilo rgtis, arba

(deoksi-) timidino monofosfatas
TMP
dTMP
Uracilas
(deoksi-)
uridinas
Urd
(deoksi-) uridilo rgtis, arba

(deoksi-) uridino monofosfatas
UMP
Nukleozidas
Nuklezido
ymjimas
Adeninas
(deoksi-)
adenozinas
Ado
Guaninas
(deoksi-)
guanozinas
Citozinas
Nukleotidas
Nukleotid struktra yra polin: jie turi 5 gal (fosforo rgties liekana arba hidroksigrup
grup) ir 3 gal (hidroksigrup arba fosforo rgties liekana). Per monosacharid C5 ir C3
atomus nukleotidai fosfodiesteriniais ryiais yra sujungiami polinukleotidin grandin.
Nukleotidai, sudarantys DNR ir RNR molekules, lemia j chemines savybes. N-glikozidinis
ryys yra chemikai stabilus todl, kad nukleorgi sudt einanios heterociklins bazs
pasiymi hidrofobinmis savybmis. DNR molekul chemikai yra daug stabilesn nei RNR: i
DNR savyb didele dalimi nulemia tai, kad ties ribozs C2 atomu nra OH grups. O RNR molekuls, turinios ribozs sudtyje hidroksigrup, yra itin jautrios arminei hidrolizei.
26
Tiek RNR, tiek DNR polinukleotidinms grandinms bdingos dvi bendros savybs:
zz Polinukleotidin grandin pasiymi kryptingumu. Fosfodiesteriniai ryiai per fosforilgrup sujungia vienos pentozs C5 atom su kitos pentozs C3 atomu (53 fosfodiesterinis ryys). Kiekvienos polinukleotidins grandins vienas galas turi laisv 3 OH
(hidroksi-) grup, o kitas galas 5 fosforilgrup (grupes).
Nukleotid sekas priimta rayti 53, t. y. j sintezs kryptimi (2.3pav.).
zz Polinukleotidin grandin pasiymi individualumu, kur lemia heterociklini bazi, einani nukleotid sudt, seka. i seka yra vadinama nukleotid seka. Genetin informacija yra saugoma ioje sekoje. Genas yra tam tikra nukleotid seka.
2.3pav. RNR ir DNR polinukleotidins grandins (D. L. Nelson, Cox M. M. Lehninger. Principles of Biochemistry, sixth edition, 2012)
Nukleotid seka polinukleotidinje grandinje (DNR arba RNR) gali bti uraoma ir keliais
paprastesniais bdais, nei pavaizduotieji 2.3pav. Toliau pateiktoje schemoje (2.4pav.) DNR ir
RNR nukleotid seka paymta j raidiniais simboliais (A, G, C, T, U). Parodyti fosfodiesteriniai
27
MOLEKULIN BIOLOGIJA
ryiai tarp 3 hidroksigrups ir 5 fosforilgrups. Viename polinukleotidins grandins gale yra

5 fosforilgrup, o kitame 3 hidroksigrup. RNR sudtyje ties 2 anglies atomu esanti hidroksigrup paymta.
2.4pav. Vienas i DNR ir RNR nukleotid sek ymjimo bd
Dar glaustesnis nukleotid sekos ymjimas yra sekos uraymas vienraidiais simboliais
paymjus fosforilgrupes (p):
pGpCpApT.
Anksiau uraytoje sekoje 3 gale yra laisva OH grup (ji neymima), o 5 gale fosforilgrup (ymima).
Pats paprasiausias ir daniausiai naudojamas DNR ir RNR nukleotid sek uraymo bdas
yra sekos uraymas vienaraidiais simboliais:
GCAT.
Tokiu bdu uraomos ilgos organizm genom DNR nukleotid sekos, kurios talpinamos
nukleotid sek duomen bazse.
2.1.2. DNR antrin struktra

DNR molekul sudaro dvi polinukleotidins grandins, komplementarios tarpusavyje. Dvigrandins DNR erdvin struktra yra antrin ios molekuls struktra. DNR antrins struktros model 1953m. pasil D.Votsonas ir F.Krikas. Tuo metu buvo siekiama suprasti
DNR molekuls biologin funkcij. Tam reikjo inoti molekuls erdvin struktr. Votsonas ir
Krikas rmsi to meto eksperimentiniais duomenimis apie DNR molekuls chemines bei struktrines savybes. Prajusio imtmeio etojo deimtmeio pradioje buvo inoma, kad:
zz DNR sudaro nukleotidai, o kiekvien nukleotid sudaro fosforo rgties liekana, deoksiriboz ir viena i keturi heterociklini bazi;
zz heterociklins bazs nukleotiduose yra sujungtos su ribozmis;
zz susijungiant ribozms-fosfatams su heterociklinmis bazmis gali susidaryti ilgos nukleotid grandins;
28
zz keturi heterociklini bazi kiekiai DNR skiriasi, taiau adenino visada yra tiek pat kiek
timino (A/T = 1), o guanino tiek pat kiek citozino (G/C = 1). is teiginys yra inomas kaip
argrafo taisykls (2.2lentel);
zz DNR gali bti sudaryta i dviej grandini tai paliudijo DNR molekuls tankio matavimai.
1952m. mokslinink R.Franklin ir M.Vilkinso gauti DNR pluoto rentgeno spinduli difrakcijos analizs duomenys paliudijo, kad DNR turt bti reDvigrandins DNR erdvin
guliarios spiralins struktros. DNR spirals kiekvienas sstruktra yra antrin ios molekis sudaro ~34, o spirals diametras yra ~20. Taigi,
kuls struktra.
kiekvien dvigubos DNR spirals sk tilpt ~10 nukleotid por.
2.2lentel. Pagrindini heterociklini bazi santykis vairi organizm DNR
Organizmas
Bakteriofagas X174
Heterociklins bazs, mol %
% GC
A/T
G/C
24,0
23,3
21,5
31,2
0,77**
1,08
44,8
Kukurzas
26,8
22,8
17,0*
27,2
0,99
0,98
46,1
Atuonkojis
33,2
17,6
17,6
31,6
1,05
1,00
35,2
Viiukas
28,0
22,0
21,6
28,4
0,99
1,02
43,7
iurk
28,6
21,4
20,5
28,4
1,01
1,00
42,9
mogus
29,3
20,7
20,0
30,0
0,98
1,04
40,7
* Augal DNR yra nuokrypis nuo argrafo taisykls, nes joje gausu metilint citozino heterociklini bazi.
** Bakteriofago DNR yra viengrandin, todl heterociklini bazi santykis nepaklsta argrafo taisyklms.
Ianalizav R.Franklin gautus itin geros kokybs DNR pluoto rentgeno spinduli difrakcijos vaizdus ir apibendrin tuo metu turtas inias apie DNR savybes, D.Votsonas ir F.Krikas
pasil teigin:
DNR molekul yra sudaryta i dviej prieing krypi deiniojo sukimo
polinukleotidini grandini (DNR duplekso), kurios erdvje sudaro dvigub spiral, susukt apie tariam a.
Dvigubos DNR spirals struktra ir galimas DNR replikacijos mechanizmas paskelbti 1953m.
moksliniame urnale Nature.
Kaip susidaro DNR spiral? Votsonas ir Krikas pasil, kad DNR molekul sudaraniose polinukleotidinse grandinse nukleotid heterociklins bazs yra nukreiptos spirals vid, o
fosforo rgties liekanos spirals ior. Toks heterociklini bazi ir fosforilgrupi isidstymas yra palankiausias paslpti hidrofobikas heterociklines bazes nuo vandens molekuli, o
spiralinis polinukleotidini grandini isidstymas turt dar labiau apsunkinti vandens molekuli patekim molekuls vid. Tai yra labai svarbi DNR struktrin savyb, apsauganti DNR
29
MOLEKULIN BIOLOGIJA
nuo galimos hidrolizs. Tam, kad DNR spiral ilaikyt vienod skersmen, prie purino heterociklin baz turi bti pirimidino heterociklin baz. Jeigu prie purino heterociklines bazes
bt purino bazs, DNR spirals skersmuo tose vietose bt didesnis, o jeigu prie pirimidino
heterociklines bazes bt pirimidino bazs maesnis.
Votsonas ir Krikas, dliodami vairias heterociklini bazi modeli kombinacijas, taikliai
numan galim bazi tarpusavio isidstym DNR molekulje. Jie pasil, kad tarp adenino
ir timino bei tarp guanino ir citozino heterociklini bazi susidaro vandeniliniai ryiai. Du
vandeniliniai ryiai susidaro tarp A ir T, trys vandeniliniai ryiai tarp G ir C. Sveika tarp
btent toki heterociklini bazi por, anot Votsono ir Kriko, turjo bti stipriausia.
Vandeniliniai ryiai tarp heterociklini bazi susidaro dl dalini krvi, susikaupiani ties
azoto (N), deguonies (O) ir vandenilio (H) atomais: teigiamas krvis susikaupia ties azoto atomais, prie kuri prijungtas vandenilio atomas, o neigiamas krvis susikaupia ties azoto atomais,
prie kuri nra prijungto vandenilio atomo, ir prie deguonies atomo. Vliau eksperimentais i
numanyta sveika tarp heterociklini bazi buvo patvirtinta. Ji yra vadinama Votsono-Kriko
sveika1 (2.5pav., a).
Dvigrandinje DNR prieingos DNR polinukleotidins grandins turi bti antilygiagreios,
kad molekul ilaikyt pastovi struktr, t. y. viena polinukleotidin grandin turi bti orientuota 35 kryptimi, o kita prieinga, t. y. 53, kryptimi:
5'
3'
3'
5'
Votsonas ir Krikas taikliai numat ne tik heterociklini bazi sveik DNR molekulje. Jie
apibr ir dviej DNR grandini komplementarumo princip, kuris yra genetins informacijos perdavimo ir kartu gyvybs tstinumo esm:
Dvigrandinje DNR molekulje A visuomet sveikauja su T,
t.y. A yra komplementarus T, o G visuomet sveikauja su C,
t.y. G yra komplementarus C. Atskyrus DNR grandines, naujos
grandins gali bti kopijuojamos pagal komplementarumo
princip kaip matricas naudojant atskirtas grandines.
I ties netrukus buvo patvirtinta, kad nepaprastai svarbs lstels procesai, kuriuose sintetinamos nukleorgtys, t. y. replikacija, transkripcija ir reparacija, yra pagrsti bazi komplementarumo principu.
D.Votsonas ir F.Krikas 1953m. pasil tik du vandenilinius ryius tarp G ir C. Vliau (1956m.) tris ryius
nustat L. Polingas ir Robertas Koris (Robert Corey).
30
2.5pav. Sveika tarp heterociklini bazi DNR molekulje. Votsono-Kriko sveika (a); Hugstyno sveika (b) (C. Calladine, H. R. Drew, A. A. Travers. Understanding DNA, third edition, 2004)
Dvigrandinje DNR molekulje guanino heterociklini bazi yra tiek pat, kiek ir citozino, o adenino tiek pat, kiek timino. fakt, dar iki DNR antrins struktros paskelbimo,
nustat Ervinas argrafas (Erwin Chargraff ), taiau jo gaut rezultat prasm tapo aiki tik sukrus DNR struktros model.
Heterociklins bazs gali sveikauti DNR molekulje ir kitu bdu: purinai sudaro vandenilinius ryius ne tik su pirimidino iedo atomais (kaip Votsono-Kriko sveikoje), bet ir su imidazolo
iedo atomais (2.5pav., b). i sveika tarp heterociklini bazi vadinama Hugstyno sveika. Po
to, kai Votsonas ir Krikas paskelb DNR struktros model, Karstas Hugstynas (Karst Hoogsteen)
10 met band rodyti Votsono-Kriko sveik eksperimentais su heterociklinmis bazmis. Jis
siek gauti j kristalus ir rodyti j struktr. Taiau gautame kristale jis nustat kito tipo sveik, kuri ir buvo pavadinta jo vardu.
Hugstyno sveika tarp A ir T yra panaaus stabilumo kaip ir Votsono-Kriko sveika tarp A ir
T, o Hugstyno bazi pora tarp G ir C gali susidaryti esant protonuotam citozinui (C+) (2.5pav.,
b). Fiziologinmis slygomis DNR molekulje tarp heterociklini bazi vyrauja Votsono-Kriko
sveika.
Heterociklini bazi atomai, dalyvaujantys Hugstyno sveikoje, susidarant Votsono-Kriko
poroms nedalyvauja. Taigi, purinai gali dalyvauti sudarant ir dvigubas sveikas (ir Hugstyno, ir
Votsono-Kriko) su dviem heterociklinmis bazmis. Toki sveik pavyzdius aptarsime vliau.
Laisv nukleotid konformacija yra panai j erdvin geometrij nukleorgi sudtyje.
31
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Nukleotid isidstym erdvje nusako kelios pagrindins savybs:

zz ribozs iedo (ribofuranozs) konformacija (2.6pav., a);
zz heterociklins bazs, kuri su riboze jungia b-N-glikozidinis ryys, orientacija ribozs atvilgiu (glikozidinio ryio konformacija);
zz fosfodiesterinio ryio konformacija;
zz C4-C5 ryio konformacija.
Nukleozid bei nukleotid ribozs iedas nra plokios struktros: daniausiai vienas ar
du atomai yra ne ploktumoje. Reikinys vadinamas ribozs raukle (angl. pucker). Ribozs
iedo konformacijos daniausiai yra arba voko, E (angl. envelope), arba tvist, T (angl. twist).
Esant voko konformacijai, keturi ribozs ciklo atomai yra vienoje ploktumoje, o vienas
pakryps vir arba apai C-5 atomo atvilgiu (2.6pav., a).
Esant tvist konformacijai, trys ciklo atomai yra vienoje ploktumoje, o lik du greta esantys
atomai nukryp nuo iedo ploktumos prieingas puses (2.6pav., ab).
2.6pav. Ribozs (ribofuranozs) iedo konformacijos. Voko (a); tvist (b)
Kai ribozs iedo atomas yra nukryps nuo monosacharido iedo ploktumos t pai
pus kaip ir C5 atomas, jo padtis vadinama endo, o kai prieing pus egzo.
Nukleorgi sudtyje daniausios monosacharid E tipo C2 ir C3endo konformacijos. B spirals formos DNR deoksiriboz yra C2 endo konformacijoje.
Heterociklins bazs, kovalentikai sujungtos su monosacharidu per b-N-glikozidin ry,
gali suktis apie ry. Sukimasis nra visikai laisvas. Heterociklins bazs DNR molekulje,
taip pat nukleotiduose bei nukleoziduose gali bti orientuotos energetikai palankiausioje sin
konformacijoje arba anti konformacijoje (2.7pav., a).
32
ios konformacijos skiriasi torsinio kampo c (chi) (2.7pav., b), kur sudaro O4-C1-N9-C4
(purinuose) ir O4-C1-N1-C2 (pirimidinuose) atomai, dydiu. Gamtoje B formos DNR molekulse heterociklins bazs daniausiai yra anti konformacijoje (2.7pav.). i konformacija yra palankesn susidaryti komplementarioms poroms tarp purino ir pirimidino heterociklini bazi.
Taiau, pvz., Z formos DNR molekulje deoksiguanozinas yra sin konformacijoje (2.3lentel).
2.7pav. -N-glikozidinio ryio konformacija nukleotiduose ir nukleoziduose. Heterociklini bazi

anti ir sin orientacija ribozs atvilgiu nukleoziduose (a); sukimo kampai nukleotide ir j pavadinimai (b)
(http://nptel.ac.in/courses/104103018/module4/lec2/3.html)
33
MOLEKULIN BIOLOGIJA
I pirmo vilgsnio DNR ir RNR pirmins struktros atrodo labai panaios. Taiau tai, kad RNR
molekuls sudtyje esanti riboz turi 2 OH grup (riboz daniausiai C3 endo konformacijoje), lemia, kad RNR molekuls gyja kitoki erdvin struktr nei DNR molekuls. Tai yra vienas
esmini RNR ir DNR struktrini skirtum.
Madaug tuo pat metu, kai Votsonas ir Krikas sukr DNR erdvins struktros model, Franklin DNR rentgeno spinduli difrakcijos analize nustat, kad gamtins DNR pluoto (j sudaro
viena kryptimi orientuotos ilgos DNR molekuls), esant dideliam drgniui (hidratuota DNR),
difrakcijos vaizdas skiriasi nuo DNR, gautos maesnio drgnio slygomis (DNR dehidratacija,
pvz., etanoliu), vaizdo.
Pasilyta, kad DNR gali gyti kelet skirting erdvini struktr tip. Vliau paaikjo, kad
DNR struktra lokaliai gali kisti priklausomai nuo aplinkos ir paios DNR savybi.
2.1.3. DNR spirali B, A, Z eim ypatybs

B formos DNR spiral. DNR molekuls spirals tipas, vyraujantis in vivo, yra vadinamoji
Bformos DNR spiral. Votsonas ir Krikas erdviniui DNR modeliui konstruoti pasirinko btent
B formos DNR, teisingai numanydami, kad i molekuls forma yra pagrindin lstelje. Taiau
reikia pastebti, kad DNR struktra yra dinamika, ir tam tikrose vietose ji gali pereiti i vienos
erdvins konformacijos kit.
B formos DNR molekul sudaro dvi antilygiagreios polinukleotidins grandins, kurios sudaro deinio sukimo DNR spiral. Spirals viduje yra isidsiusios heterociklins bazs
(2.8pav. ir 2.9pav., a). Prieingose polinukleotidinse grandinse esanios komplementarios
heterociklins bazs yra beveik statmenos tariamai spirals aiai.
2.8pav. Dviguba DNR spiral (R. F. Boyer. Concepts in Biochemistry, third edition, 2006)
34
Vandeniliniai ryiai, susidarantys tarp komplementari bazi por, stabilizuoja DNR dupleks. Atstumas tarp kiekvienos bazi poros dvigubos DNR spirals viduje yra 3,4 (0,34 nm)
(2.9pav., b). Tarp greta esani komplementari heterociklini bazi por aromatini ied
ploktum susidaro vadinamoji stekingo sveika (vadinamasis p stekingas; tokia sveika susidaro tarp molekuli,
Stekingo sveika tarp heterociturini aromatin ied su p elektronais). Stekingo sveika
klini bazi vaidina svarbiausi
tarp heterociklini bazi yra viena svarbiausi DNR erdvivaidmen stabilizuojant B forns struktros stabilumo dali. Stekingui yra svarbi hidromos DNR erdvin struktr.
fobin sveika ir heterociklini bazi krvis, tad skirting
nukleotid sek DNR molekulse stekingo sveika skiriasi.
2.9pav. B formos DNR spirals ir jos struktrini komponent savybs. Vaizdas i viraus (a); vaizdas
i ono (b)
Kiekviena heterociklini bazi pora B formos DNR spiralje yra pasisukusi kitos bazi poros
atvilgiu ~36 kampu (2.9pav., a). Kiekviename tokios formos DNR spirals skyje (360) telpa
~10 heterociklini bazi por (danesnis spirals periodas 10,5 heterociklini bazi). Vienas
skis yra ~34 aukio (3,4x~10 heterociklini bazi) (2.9 pav., b).
B formos DNR spirals iorje yra 2 deoksiribozs kartu su neigiamo krvio fosforo rgties liekanomis. Fosforilgrup, esanti nukleorgi sudtyje, pasiymi stipriomis rgtinmis
savybmis (pKa~1, todl ir pavadinimas nukleorgtis). Taigi, DNR fiziologinmis slygomis
yra neigiamo krvio. DNR pavirius yra hidrofilikas. Greta esanios neigiamai krautos fosforilgrups i ties stumia viena kit. Toks atostmis turt destabilizuoti DNR molekul. Kodl jos
struktra lieka stabili? Neigiam DNR krv in vitro neutralizuoja Na+ ir K+ jonai, o in vivo taip pat
drusk jonai ir baltymai, sveikaujantys su DNR. Dauguma toki baltym yra teigiamo krvio.
DNR spirals pavirius yra ne lygus kaip cilindro, bet turi griovius. B formos DNR spirals iorje
yra iskiriami du grioviai: didysis ir maasis (angl. major groove, minor groove) (2.10pav.). Pagal
B formos DNR spirals struktr platesnis griovys yra pavadintas didiuoju, o siauresnis mauoju
(2.3lentel), nors grioviai DNR struktroje skiriami pagal tai, kokios heterociklini bazi por puss
35
MOLEKULIN BIOLOGIJA
juos sudaro. Z formos DNR didysis griovys beveik neirimas. Didiojo griovio puse laikoma ta
bazi poros pus, kurioje yra purino C5C8 atomai bei pirimidino C4C6 atomai. Maojo griovio
puse laikoma ta bazi poros pus, kurioje yra purino C2 bei N3 ir pirimidino C2 atomai (2.11pav.).
Grioviai yra labai svarbi DNR struktrin savyb: jie sukuria mikroaplink prie DNR prisijungti
vairiems ligandams, taip pat vandens molekulms. Ties didiuoju DNR molekuls grioviu jungiasi dauguma su DNR sveikaujani baltym. Ties mauoju B formos DNR grioviu prisijungia vandens molekuls. Jos suformuoja nugarkaul , kuris dar papildomai stabilizuoja DNR struktr.
2.10 pav. DNR B, A ir Z eim spirali schematinis vaizdas. Viena rodykle paymtas DNR didysis griovys (DG), dviem rodyklmis DNR maasis griovys (MG) (Cold Spring Harbor Symposium in Quantitative
Biology, v. 47, 1982). Viruje parodytas spirali sukimosi krypties nustatymas (J. D. Watson, T. A. Baker,
S. P. Bell, A. Gann, M. Levine, R. Losick. Molecular Biology of the Gene, seventh edition, 2013)
36
DNR erdvins struktros modelis buvo sukurtas remiantis tuo metu atlikta DNR pluoto rentgeno
struktrine analize. Ilgos DNR molekuls nra geriausias objektas rentgenostruktriniams tyrimams,
nes DNR pluotas nra kristalai, todl i tyrim analiz pateikia tik apytikrius duomenis apie molekuli erdvin struktr. DNR B formos struktra, aprayta remiantis DNR pluoto analize, yra, galima
sakyti, idealizuota. 1980m., gav 12 nukleotid por dvigrandins DNR fragmento kristalus, Riardas
Dikersonas (Richard Dickerson) ir Horasas Driu (Horace Drew) atliko j rentgenostruktrin analiz,
kuri suteik tikslios informacijos apie B formos DNR struktr. Paaikjo, kad DNR B struktroje tam
tikrose vietose yra nuokrypi. Pvz., nustatyta, kad tos paios bazi poros heterociklins bazs ne visuomet yra vienoje ploktumoje, viena j, pvz., gali bti pasisukusi kitos atvilgiu (propelerio skis, angl.
propeller twist) ir pan. Taip pat nustatyta, kad spiral tam tikrose vietose ilinkusi (angl. bent). Ilinkimo
kampas ir vieta sudtingu bdu priklauso nuo DNR nukleotid sekos.
2.11pav. DNR heterociklini bazi por atom isidstymas didiajame ir maajame grioviuose
(http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Deoxy_Ribonucleic_Acid2-Structure.htm)
Ties mauoju DNR grioviu neatrankiai jungiasi sintetiniai daai DAPI, Hoechst, berenilas,
kiti (2.12 pav., a). Da molekuls yra teigiamo krvio, jos yra ilenktos, pusmnulio formos
struktros. ie daai plaiai naudojami eksperimentins molekulins ir lstels biologijos tyrimuose vizualizuoti DNR in situ lstelse, audiniuose. Inkubuojant lsteles daais, jie prisijungia prie DNR, o apvietus tam tikro ilgio banga fluorescuoja (2.12 pav., b).
A formos DNR spiral. DNR pereina i B formos A form, kai aplinkoje santykinis drgnis
sumaja iki 75% (dehidratacija), o NaCl koncentracija tampa maesn nei 10%. Palyginti su B formos DNR, A formos DNR yra kampuota ir isiptusi struktra (2.13 pav.). ios konformacijos DNR
spiral yra deinio sukimo, viename spirals skyje yra ~11 nukleotid (2.3lentel). Bdinga ios
DNR formos savyb ta, kad heterociklini bazi ploktumos spirals aies atvilgiu yra pakrypusios
ir nutolusios nuo tariamos aies (2.13pav.). A formos DNR spiralje ribozs yra C3 endo konformacijoje. A formos DNR turi gil ir siaur didj griov, bet sekl ir plat maj griov (2.10pav.).
37
MOLEKULIN BIOLOGIJA
2.12pav. Sintetiniai daai, prisijungiantys ties mauoju DNR grioviu, naudojami eksperimentinje
biologijoje vizualizuoti DNR. Hoechst 33258 ir DAPI molekuli struktros (a); lstels, inkubuotos DAPI
dau ir fluoroforu konjuguotais antiknais prie kitus baltymus. Branduoliuose mlynai fluorescuoja
DAPI (b) (http://en.wikipedia.org/wiki/DAPI)
2.3lentel. Struktrins B, A ir Z DNR spirali ypatybs

Savybs
Spirals sukimosi kryptis
Dein
Dein
Kair
Heterociklini bazi por skaiius 1-ame

spirals skyje
10,5 (9,710,6)
10,7 (~11)
12
b-N-glikozidinio ryio konformacija
Anti
Anti
Anti ties pirimidinais

Sin ties purinais
Deoksiribozs iedo konformacija
C2 endo
C3 endo
C2 endo pirimidinams
C3 endo purinams
Spirals skersmuo
20
26
18
Atstumas tarp greta esani bazi por
3,33,4
2,6
3,8
Didysis griovys
Platus ir gilus
Siauras ir gilus
Seklus (beveik neirimas)
Maasis griovys
Siauras ir gilus
Platus ir seklus
Siauras ir gilus
Nukleorgi erdvin A forma yra biologikai svarbi ios formos gamtoje yra DNR-RNR
heterodupleksai ir dvigrandin RNR. RNR bei DNR-RNR heterodupleksai gyja A formos
struktr dl ribozs 2 OH grups RNR molekuleje. i hidroksigrup erdvikai trukdyt susidaryti B formai, nes yra
DNR-RNR heterodupleksai ir
per arti fosforilgrups ir gretimos heterociklins bazs C8
dvigrandin RNR gamtoje yra
atomo. Todl dvigrandin RNR negali gyti B formos, net
Aformos.
jeigu vandens molekuli kiekis yra pakankamas.
38
Kodl in vivo DNR molekul yra ne A, bet B formos? Atsakymas klausim gautas atlikus
DNR rentgenostruktrin analiz. Prieingai nei A formos DNR, B formos DNR gali talpinti savo
struktroje jau mint vandens molekuli karkas, kuris isidsto maajame griovyje. Vandeniliniai ryiai tarp vandens molekuli ir DNR struktrini element daro tak B formos molekuls
stabilumui. Kai vandens molekuls i DNR atimamos, kaip tai atsitinka gryninant DNR maesnio drgnio slygomis, DNR sudaro A formos spiral.
2.13pav. B ir A form DNR spirals. DNR molekuli struktrinis vaizdas i viraus ir i ono (kairje); B ir A formos DNR rentgeno spinduli difrakcijos vaizdai (deinje) (http://en.wikipedia.org/wiki/
Molecular_models_of_DNA)
Z formos DNR. Z formos DNR spiral 1979m. aptiko lietuvi kilms mokslininkas Aleksandras Rias (Alexander Rich), atliks nedidelio dvigrandinio oligonukleotido rentgenostruktrin analiz. Pati bdingiausia Z formos DNR savyb yra ta, kad DNR spiral yra ne deinio sukimo, o kairiojo (2.10pav.). Taiau ji nra vien A ar B form DNR veidrodinis atspindys. Z formos
DNR spiral yra ilgesn palyginti su A ir B formomis viename jos skyje telpa 12 nukleotid.
Z formos DNR pasiymi plaiu ir sekliu didiuoju grioviu (jis beveik neirimas) ir siauru bei
labai giliu mauoju grioviu (2.10pav.) Ribozs konformacija Z formos DNR molekulje yra C2
endo pirimidin ir C3 endo purin nukleotiduose, o glikozidinio ryio konformacija yra anti
pirimidin ir sin purin nukleotiduose (2.3lentel ir 2.14pav.). ios savybs lemia tai, kad
onins DNR fosforo rgties liekanos isidsto zigzagu (i ia kils pavadinimas Z forma).
DNR Z formai tirpale susidaryti reikalinga didel drusk koncentracija (34M NaCl) ir periodika pirimidin ir purin, daniausiai dinukleotid (pvz., (CG:CG)n, CA:TG)n), nukleotid sekoje kaita. Citozino metilinimas C5 padtyje, neigiama DNR superspiralizacija taip pat stabilizuoja
Z form. ie veiksniai svarbs Z formos DNR susidarymui lstelje, nes be j Z formos DNR yra
energetikai nestabili ir trumpaam.
39
MOLEKULIN BIOLOGIJA
2.14pav. Z formos DNR struktrini

element ypatybs. C ir G nukleotid,
sudarani Z DNR, ribozs ir N-glikozidinio
ryio konformacijos (a); C-G nukleotid
poros struktra Z formos DNR molekulje,
nustatyta 0,5 skyros rentgenostruktrine
analize. Punktyru paymti vandeniliniai
ryiai, skaiiais atstumas tarp atom
angstremais (b) (Nucleic Acid Research, v. 39,
p.6245, 2011)
Ilgai buvo manyta, kad kairiojo sukimo Z formos DNR spirals susidaro tik in vitro. iuo metu
gausu fakt, liudijani, kad tokia DNR forma egzistuoja in vivo ir yra biologikai svarbi. Toki
struktr bakterijose gyja kai kuri gen promotori sritys. Nors mogaus genome G ir C skaiius maesnis nei prokariotuose, bioinformatiniais metodais nustatyta, kad Z formos DNR potencialiai gali susidaryti kas 3000bp. Nors Z DNR funkcijos dar nra iki galo itirtos, manoma,
kad ji svarbi gen veiklos valdymui. Z formos biologin reikm taip pat patvirtina rasti virus
ir lsteli baltymai, atrankiai sveikaujantys su Z DNR: RNR redagavimo fermentas ADAR1, interferonu indukuojamas mogaus DLM baltymas, pox viruso baltymas E3L ir kt. Tokie baltymai
turi domen, kuriais atrankiai jungiasi prie Z DNR. Nustatyta Z formos DNR svarba ir eukariot lsteli gen aktyvumui: dalis imunins sistemos geno CSF1 DNR, dalyvaujant chromatin
pertvarkaniam kompleksui (r. skyri Chromatino molekulin struktra), gyja Z form, kad
galt vykti geno transkripcija. Taigi, Z formos struktr DNR lstelje gali gyti tam tikru metu.
mogaus navik lstelse Z DNR susidaro chromosom trki vietose; manoma, kad ji sukelia
dvigrandinius DNR trkius ir dideles chromosom ikritas, taigi, lemia genomin nestabilum.
Kaip lstelje tam tikrose DNR molekuls vietose susidaro Z formos struktra? Perjimas i
deiniojo sukimo B formos kairiojo sukimo Z form turt smarkiai destabilizuoti DNR molekuls struktr. Atlikus 15 bp ilgio in vitro suformuoto DNR duplekso, kuriame B formos DNR
spiral perjo Z formos DNR spiral, 2,6 skyros rentgenostruktrin analiz, paaikjo, kad
perjimo vietoje abi komplementaris pors heterociklins bazs yra isuktos (angl. flipped
out) spirals ior (2.15pav.). Tokiu bdu, susidarant DNR Z formai, perjimo vietoje yra suardoma tik vienos bazi poros struktra, kitose vietose ilaikant spirals pavidalo struktr.
40
2.15pav. DNR B spirals,

pereinanios Z spiral,
erdvin struktra. DNR
B-Z-B spirals schema (viruje); DNR fragmento su isuktomis T ir A heterociklinmis
bazmis ties perjimo i Z B
form riba erdvin struktra
(apaioje) (Nature, v. 437,
p.1183, 2005)
2.1.4. Neprastos DNR antrins struktros

Pastarj met eksperimentiniai tyrimai atskleid, kad DNR molekuls erdvin struktra
yra gana dinamika ir kinta. Be apraytj A, B ir Z DNR spirali tip, yra ir kit neprast DNR
struktr, tarp j yra ir biologikai svarbi. Tokios struktros daniausiai susidaro tik tam tikras
savitsias nukleotid sekas turiniose DNR vietose, arba joms susidaryti reikia toki slyg, kur
nevyraut prasta B tipo DNR spiral.
Trigub DNR spiral (angl. triplex DNA) sudaro trys DNR grandins arba DNR dupleksas ir
RNR grandin. Gana seniai buvo inoma, kad RNR, kurios seka yra poli (U), poli (A), poli (U), gali
sudaryti struktr i trij komplementari grandini. Vliau buvo nustatyta, kad ir deoksinukleotid tripletai, pvz., dT.dA.dT arba dC+ dG dC+ (C+ protonuota citozino forma), taip pat gali
sudaryti DNR spiral i trij grandini. Tokioje triguboje spiralje susidaro ne tik Votsono-Kriko,
bet ir Hungstyno sveika.
Triguba DNR spiral gali susidaryti ne tik i trij atskir polinukleotidini grandini (tarp
molekulinis tripleksas), bet ir vien tik i dvigrandins DNR (vidumolekulinis tripleksas). Tokia
triguba DNR spiral dar vadinama H forma (2.16pav., a). H spiralje yra trys DNR grandins,
kuri vienoje yra vien tik pirimidin heterociklins bazs (homopirimidinin grandin), o kitoje vien tik purin heterociklins bazs (homopurinin grandin). Tokioje triguboje spiralje
susidaro ne tik Votsono-Kriko, bet ir Hungstyno sveika (2.16pav., a). Treioji grandin isidsto
didiajame DNR duplekso spirals griovyje. Tripleksus gali sudaryti ir DNR dupleksas su RNR
(heterotripleksas).
Tripleksai danesni eukariot nei prokariot lstelse. J gausu svarbi gen, dalyvaujani vystymosi ir signal perdavimo procesuose, intronuose. Tripleksai yra imonugeniki prie
juos gauta antikn. Aptiktos atrankios helikazs, iskirianios DNR tripleks. Taip pat manoma, kad tripleksai, sukeldami dvigrandinius trkius, gali daryti tak genominiam stabilumui.
Kryiaus formos DNR (angl. cruciform DNA) susidaro atvirkiai pasikartojani sek (palindrom, sudaryt i 6 nukleotid) turinioje DNR (2.16 pav., b). Toje paioje grandinje
41
MOLEKULIN BIOLOGIJA
2.16pav. Neprastos DNR struktros. DNR dupleksas, galintis sudaryti trij grandini DNR spiral
(H DNR). Pur purinas; Pyr pirimidinas. Trigubosios DNR spirals schematinis vaizdas ir sveika tarp heterociklini bazi por (a); kryiaus formos DNR susidarymas (b); paslinktosios DNR (S DNR) susidarymas
ir DNR sekos, palankios tokiai struktrai susidaryti (c) (Trends in Biochemical Sciences, v.32, p.271, 2007)
42
esanios komplementarios sritys sveikauja tarpusavyje susidaro segtuko pavidalo atakos

(2.16pav., b). Kryiaus formos DNR susidarymas, palyginti su B formos susidarymu, yra energetikai nepalankus. Istumti tokias struktras i DNR spirals reikia energijos, kuri yra neigiamai
superspiralizuotoje DNR. Kryiaus formos DNR lengviau susiformuoja daug A ir T nukleotid
por turinioje DNR. In vitro tokios struktros stebtos iedinje plazmidi ir bakteriofag
DNR. Nustatyta, kad kryiaus formos struktros susidarymas, pvz., ties bakterij promotoriais,
daro tak gen transkripcijai.
Paslinktoji DNR, S DNR (angl. slipped DNA). Paslinktosios DNR struktra gali susidaryti, kai
nukleotid sekoje yra vadinamj tandemini arba tiesiogini pasikartojim (angl. tandem or
direct repeats), pvz., 5TCGGTCGGTCGG3 (2.16pav., c). Susidaro neprastos antrins struktros,
turinios i DNR struktros istumt kilp. Kilp susidarymas nustatytas viengrandin DNR veikiant skaidaniomis nukleazmis. Su paslinktosios DNR kilp susidarymu siejama grup paveldim neurologini lig.
Apie dvi deimtys mogaus neurodegeneracini lig siejama su nukleotid pasikartojimu, pvz.,
(CTG)n siterpimu DNR. Sekos gali bti siterpusios gen reguliacinse, koduojaniose srityse, intronuose. Dl to keiiasi arba geno raika, arba jo koduojamo baltymo savybs. Beveik visiems atvejams
yra bdingas dsningumas slenkstinis siterpusi pasikartojim (n) skaiius, kur virijus siterpim
labai greitai daugja (didja genominis nestabilumas), pasireikia liga. Pvz., Hantingtono liga susergama, kai siterpusi CAG pasikartojim skaiius IT15 gene virija 36. domu, kad esant ~32 pasikartojimams, liga nepasireikia.
Kitas pavyzdys yra Fridricho ataksija reta paveldima neurologin liga. Sergant prastja raumen koordinacija (pasireikia ataksija) ir pleiasi irdis. Liga nustatoma vaikystje. Lig lemia padidjs 5 (GAA)n(TTC)n-3 kopij skaiius Fridricho ataksijos geno (9 chromosoma) pirmame i septyni
intron. prastai gene yra 830 kopij, ataksijos atveju daugiau nei 1000. Kuo daugiau kopij, tuo
anksiau susergama ir greiiau mirtama. Yra inoma, kad dl pasikartojim Fridricho ataksijos geno
(FRDA) DNR sudaro ne B formos struktras, bet paslinktj DNR arba trigubj DNR, ir ios DNR formos
dalyvauja geno raikos slopinimo procesuose. Tai sumaina geno produkto baltymo frataksino (210
aminorgi) kiek mogaus mitochondrijose. Frataksinas yra gele prijungiantis baltymas, teikiantis
gele geleies-sieros (Fe-S) kompleksui mitochondrijose. Sutrikus komplekso funkcijai, daugiau geleies susikaupia mitochondrijose nei citozolyje, dl to kaupiasi oksidacins paaidos ir keiiasi ferment
aktyvumas. Kol kas nra aiku, kodl irdies raumen lsteli mitochondrijos ir sensoriniai neuronai
tokie jautrs sumajusiam baltymo frataksino kiekiui.
DNR kvadrupleksas (angl. quadruplex DNA). Seniai buvo inoma, kad milimoli ar didesns koncentracijos guanozino bei jo darini tirpalai yra klamps, panas gelius. Vliau, gavus
kristalus ir atlikus j rentgenostruktrin analiz, paaikjo, kad guanino heterociklins bazs
tirpale sudaro savitas struktras guanino (G) tetradas, arba guanino (G) kvartetus (angl.
G-quartet). Guanino tetrada susidaro, kai vienoje ploktumoje isidsto keturios guanino heterociklins bazs (2.17pav., a).
Tarp i heterociklini bazi susidaro vandeniliniai ryiai ne Votsono-Kriko, bet Hugstyno
sveika. Kiekviena heterociklin baz tetradoje tuo paiu metu yra dviej vandenilio ryi donoras ir akceptorius. iuos ryius sudaro kiekvienos guanino heterociklins bazs N1, N7, O6
ir N2 atomai (2.17 pav., a). Tokia sveika vyksta iskirtinai tik tarp guanino heterociklini bazi
43
MOLEKULIN BIOLOGIJA
2.17pav. DNR G kvadrupleks struktra. Guanino tetrada (G kvartetas), susidaranti tarp keturi guanino heterociklini bazi (centre vienvalenio metalo jonas) (a); G kvadrupleksai, susidarantys G turiniose polinukleotidinse grandinse: vienoje grandinje, tarp dviej grandini ir tarp keturi grandini
(b); sumodeliuotos kvadrupleks erdvins struktros (c) (Frontiers in Bioscience, v.12, p.4595, 2007)
(jos turi aminogrup, dalyvaujani susidarant vandeniliniams ryiams). Tetrad susidarym

stabilizuoja vienvaleniai katijonai, pvz., Na+ arba K+.
Poli (G) homopolimerai taip pat gyja savit erdvin struktr. Rentgeno struktrin analiz
atskleid, kad j gali sudaryti keturios grandins, kuriose tarpusavyje sveikauja guanino heterociklini bazi tetrados. Tokia greta esani tetrad sveika vadinama G kvadrupleksu, arba
DNR tetrapleksu.
G kvadrupleksas in vitro gali susidaryti i vienos, dviej arba keturi DNR grandini, kuriose
gausu G nukleotid (2.17pav., b). G kvadrupleks susidarymui in vitro utenka slyg, panai fiziologines (100 mM KCl, pH 7,5). Galimos vairios erdvins G kvadrupleks struktros
(2.17pav., c).
G kvadrupleksai susilauk didelio tyrj dmesio, nes j susidarymas buvo patvirtintas eksperimentais fiziologinmis slygomis in vitro su mogaus telomer DNR, kuriai bdingos daug
G turinios pasikartojanios sekos (2.18 pav., a). Vidumolekulini DNR kvadrupleks susida-
44
2.18pav. G kvadrupleksai telomerinje DNR. mogaus chromosom gal telomerin DNR (a)
(L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012); schema, iliustruojanti, kaip viengrandinje telomerins DNR ikyoje galt susidaryti G kvadrupleksai (b) (Bioessays, v. 29, p.155, 2007);
G kvadrupleksai, nustatyti su kvadrupleksams savitais raudonai fluorescuojaniais antiknais mogaus
vinse HeLa lstelse. DNR vizualizuota DAPI dau (c) (Nature Chemistry, v. 5, p. 182, 2013)
rymas tokioje DNR manomas, nes telomeros struktros, esanios eukariot chromosom
galuose, DNR turi viengrandin 100200 nukleotid 3 iky (2.18pav., b). Tada imta iekoti
rodym apie kvadrupleks egzistavim lstelse. J gauta daugiau nei pakankamai. Kvadrupleks susidarymas chromosom telomer galuose lstelse patvirtintas eksperimentais su
savitaisiais antiknais prie G kvadrupleksus (2.18pav., c). Rasta ir kita molekuli grup, galinti
sudaryti kvadrupleksus, oligonukleotid aptamerai, prisijungiantys prie lstelini taikini
ir slopinantys signalo perdavim ar transkripcij. Dar viena DNR sek, galini formuoti kvadrupleksus, grup yra daug G turinios sekos gen promotoriuose. Nuodugniai analizuota G
kvadrupleks svarba mogaus c-myc onkogeno transkripcijai nuo vieno i geno promotori:
suardius G kvadrupleks sudarani struktr mutacijomis, geno transkripcija buvo aktyvinama. Atvirkiai, esant chemini jungini (pvz., da porfirin), kurie stabilizavo struktr,
transkripcija buvo slopinama.
Bioinformatiniais metodais nustatyta, kad mogaus genome gali bti ~370000 potenciali
nukleotid sek, galini sudaryti kvadrupleksus; j daniausiai yra promotoriuose, intronuose, daug G turinioje mikro- ir minisatelitinje DNR. ~40% mogaus gen promotori potencialiai galt turti bent vien toki struktr.
45
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Kvadrupleksai, susidarantys lstelje, pvz., telomer galuose arba onkogen promotoriuose, yra
patrauklus taikinys prievinei terapijai. Kuriamos molekuls ligandai, kurie stabilizuot kvadrupleksus telomerose ir trukdyt juos ilginti, taip sukeldami vini lsteli senjim ir apoptoz. Klinikini bandym etape yra sukurti prieviniai vaistai, kuri molekulinis veikimas paremtas G kvadrupleks ties onkogen promotoriais stabilizavimu.
2.1.5. DNR tretin struktra. iedin DNR ir superspiralizacija

I pradi manyta, kad visos DNR molekuls yra linijins ir turi du laisvus galus. I ties,
kiekvienos eukariot chromosomos DNR yra labai ilga linijin molekul. Tobuljant DNR iskyrimo ir nustatymo metodams paaikjo, kad kai kurios DNR yra udaro iedo pavidalo. Tokios
yra mitochondrij, prokariot, daugumos plazmidi, kai kuri virus DNR. iedini DNR yra
vairiausi dydi: nuo labai ma, pvz., bakteriofago X174, iki milinik, pvz., bakterijos E.
coli chromosoma.
Ilgainiui paaikjo, kad ir ilg linijini chromosomini DNR galai lstelje negali laisvai suktis, nes yra fiksuoti prie savit lstels struktr branduolio pamato baltym (pastoli) arba
prie membranos. Kaip iedins DNR ir fiksuot gal linijins DNR bsena veikia DNR molekuls
erdvin isidstym? Gamtoje DNR molekuls yra ne tiesios, bet susilanksiusios. Tai yra btina
slyga joms tilpti eukariotins lstels branduolyje, taip pat bakterij lstelse.
Atliekant nedideli viruso SV 40 ir poliomos viruso DNR molekuli elektronin mikroskopij
bei sedimentacin analiz, buvo aptiktos keli form virus DNR: iedin ir susisukusio iedo
formos (2.19pav., ab). Pastarasis fenomenas pavadintas DNR superspiralizacija. DNR super
spiralizacija yra gyvybikai svarbi lstelms.
Dviguba DNR spiral gali erdvje sudaryti tretin struktr superspiralizuot DNR, kurioje dviguba spiral dar sudaro papildomas spirales. Toki bsen gali gyti udara iedin dvi-
2.19pav. iedins DNR superspiralizacija. Relaksuotos

(a) ir superspiralizuotos (b) plazmids pBR322 DNR nuotraukos, gautos atomins jgos mikroskopijos metodu.
Apaioje molekuli schemos (Nucleic Acids Research,
v.38, p.2120, 2010)
46
2.20pav. Vidins (torsins) tempties sukeliama

grandins superspiralizacija (http://www.maths.
uq.edu.au/~infinity/Infinity7/supercoiling.html)
grandin DNR, taip pat linijin DNR, jeigu jos galai tam tikru bdu fiksuoti. Tai yra btina slyga
superspiralizuotai DNR susidaryti. Jei galai laisvi, DNR molekul yra relaksuota.
Superspiralizacijai struktroje atsirasti reikalinga vidin temptis, dar vadinama torsine
temptimi. Relaksuotoje struktroje jos nra, tokiai struktrai superspiralizacija nebdinga
(2.19pav., a).
Superspiralizacij galime stebti taip: sukime vien silo gal, laikydami kit jo gal ir neleisdami jam isisukti. Sukime tol, kol sukti taps vis sunkiau taip susuktame sile atsiras temptis. Jeigu dabar, neleisdami laisvai isisukti, susukto silo galus suartinsime, silas dar papildomai susisisuks apie save, t. y. gis superspirales (2.20pav.).
Kaip atsiranda temptis DNR molekulse? Pvz., viename linijins DNR molekuls gale atskiros jos grandins yra fiksuotos ir negali laisvai atsisukti, o kitame gale grandins papildomai
apsisuka tarpusavyje kelet kart. Dabar sujunkime DNR
galus, arba juos ufiksuokime taip, kad grandins negalt
Superspiralizuota DNR yra
laisvai atsisukti. DNR grandins molekulje dabar apsisustruktra, kuri ilgio vienete turi
kusios viena apie kit daugiau kart, nei buvo iki tol. Modaugiau nukleotid nei prasta
lekulje atsiranda vidin temptis. DNR, kurioje atsiranda
standartin DNR struktra.
temptis, panaiai kaip jau mintas susuktas silas, negaldama laisvai atsisukti, sukasi apie save pai taip susidaro
DNR superspirals.
prasta standartine DNR struktra laikome dvigrandins DNR tam tikros formos (A, B arba
Z) spiral, kurios viename skyje telpa tai formai bdingas skaiius bazi por (pvz., B formos
~10,5). Tokia DNR yra relaksuota2.
DNR tirpale gyja relaksuot B struktr, nes jai palaikyti reikia maiausiai energijos. Bet
koks nuokrypis nuo relaksuotos struktros, pvz., lankstymasis erdvje, didina molekuls vidin
energij.
P
aymtina, kad relaksuotos formos DNR spirals skiai (kuomet polinukleotidins grandins yra viena apie kit apsivijusios) nra DNR superspiralizacija. Superspiralizacija molekulje (torsin temptis
DNR) atsiranda tik vedus papildomus skius arba panaikinus skius.
47
MOLEKULIN BIOLOGIJA
DNR superspiralizacij galima aprayti matematikai naudojant tris dydius:

zz sankibos laipsn, Lk (angl. linking number);
zz ski skaii, Tw (angl. twist);
zz superspiralikumo laipsn, Wr (angl. whrite).
ie dydiai tarpusavyje yra susij tokiu bdu:
Lk=Tw+Wr.
Lk dydis yra sumin dviej dydi iraika ir yra visos DNR molekuls topologin savyb3,
apraanti, kiek kart DNR grandins apsuka viena kit (sukimba viena su kita) 360 (kitaip tariant, kiek kart reikia visikai atsukti grandines, kad jos isiskirt).
Jeigu grandins sukasi viena apie kit dein, tuomet sukibimas (Lk) laikomas teigiamu
(ymima +), jeigu sukasi kair neigiamu (ymima ):
Lk=+1
Lk=-1
B ir A formos DNR molekulse, kur viena grandin apsisukusi apie kit deiniuoju sukimu, Lk
yra teigiamas, o kairiojo sukimo DNR (pvz., Z formos) Lk yra neigiamas.
Udaroje iedinje DNR arba linijinje DNR, kurios galai yra fiksuoti, Lk skaiius nekinta. Lk gali kisti tik tuo atveju, jeigu DNR grandin yra
nutraukiama ir sukibimai naikinami (Lk) arba vedami paLk yra visos DNR molekuls, o
pildomi sukibimai (+Lk) (2.21pav.). Jeigu po to DNR galai
ne kurios nors jos dalies, topovl sujungiami arba fiksuojami, Lk vl tampa pastovus, gali
login savyb.
kisti tik Tw ir Wr geometriniai parametrai.
Tw dydis ireikiamas taip: DNR sudarani nukleotid por skaiius padalijamas i tai DNR
bdingo spirals ingsnio (pvz., B formos DNR jis yra ~10,5, todl, pvz., 1050 bp ilgio B formos
DNR Tw=1050/10,5=100).
DNR molekulse, kur viena grandin apsisukusi apie kit deiniuoju sukimu (pvz., B ir A form spiralse), Tw yra teigiamas, o kairiojo sukimo DNR (pvz., Z formos spiralje) Tw neigiamas.
Relaksuotoje DNR, kurioje nra superspiralini vij:
Lk=Lk0.
Topologija tai objekto savyb, kuri, vykstant jo deformacijai, nekinta, jeigu nepaeidiamas objekto
integralumas.
48
Relaksuotoje DNR molekulje sankibos laipsnis Lk0 yra lygus DNR spirals ski skaiiui Tw:
Lk0=Tw.
Tokioje DNR torsin temptis yra minimali.
Pvz., relaksuotoje B formos DNR, kuri sudaro 1 050 nukleotid por, sankibos laipsnis
Lk0=Tw=100 (1050/10,5=100). Relaksuotoje Z formos DNR, kuri sudaro 1200 nukleotid por,
o spirals ingsnis yra 12, sankibos laipsnis Lk0=Tw=100 (1200/12=100).
Superspiralikumo laipsnis Wr nusako, kiek kart DNR dupleksas dar papildomai sukasi
erdvje. Relaksuot molekuli superspiralikumo laipsnis Wr=0.
Inagrinkime 2.21pav. pateikt pavyzd. Turime relaksuot 250 nukleotid por dvigrandin DNR (B formos molekul, kurios viename skyje yra ~10,5 nukleotid por). Tokios DNR
2.21pav. DNR
superspiralizacija
(M. B. Berg,
J. L. Tymozcko,
L. Stryer.
Biochemistry,
seventh edition,
2012)
49
MOLEKULIN BIOLOGIJA
sankibos laipsnis: Lk=Lk0=25, Tw=25, superspiralikumo laipsnis Wr=0. Dabar viename gale atsukime DNR grandines, panaikindami du DNR sukibimus, paskui sujunkime molekuls galus.
DNR atsiranda vidin temptis. Udara molekul stengiasi gauti relaksuotai DNR bding ski
skaii (Tw=25), taiau sankibos laipsnis, panaikinus du sukibimus, jau yra Lk=23, jis turi ilikti
pastovus. DNR molekul superspiralizuosis DNR spiral suksis apie save pai, susidarys dvi
neigiamos superspirals (23=25+(2), nes Lk=Tw+Wr). Tokia superspiralizuota DNR yra topologikai lygiavert DNR, kurioje nra superspiralini vij (Wr=0), trksta dviej ski (Tw=23)
ir kuri gali lengvai tokia virsti (2.21pav.). i savyb inaudojama biologiniuose procesuose (replikacijoje, transkripcijoje, raparacijoje), kai reikia iskirti DNR grandines nedidelje srityje tai
yra lengviau padaryti, kai DNR toje srityje yra superspiralizuota neigiamai.
Dabar panagrinkime kit superspiralizacijos pavyzd, pasitaikant gamtoje. iedin dvigrandin viruso SV40 DNR yra sudaryta i ~5200 bp. Galima tiktis, kad i molekul lstelje
yra relaksuota ir jos Lk=Lk0=~500. Taiau viruso DNR, iskirta i virion, yra superspiralizuota neigiamai. Tokia superspiralizacija manoma, jeigu DNR spiral yra ne visikai susisukusi
(angl. underwound). I ties, SV40 viruso DNR yra ne visikai susisukusi joje trksta ~25 ski.
Siekiant ilaikyti nekintant Lk, trkum kompensuoja neigiama viruso DNR superspiralizacija (475=500+(25), nes Lk=Tw+Wr). Prieingu atveju, kai DNR yra persukta, t. y. turi daugiau
ski nei relaksuota molekul (angl. overwound), pertekli kompensuoja teigiama molekuls
superspiralizacija.
Etidio bromido (EtBr) molekul yra didelis, plokias, kelet aromatini ied turintis katijonas
(2.22pav., a). Dl plokios struktros etidio molekuls siterpia (interkaliuoja) dvigrandin DNR
molekul tarp gretim heterociklini bazi por ploktum (2.22 pav., b). Apviestas ultravioletine
viesa etidio bromidas fluorescuoja. Fluorescencija yra stipresn daui siterpus DNR, todl etidio
bromido daas naudojamas DNR vaizdinimui. DNR mginyje esant etidio bromido, daas siterpia
dvigrandins DNR molekules. Iskirsius DNR molekules pagal j dyd agaroziniame gelyje ir apvietus j ultravioletine viesa, DNR molekuls, kuriose siterps daas, fluorescuoja stipriau (2.22pav., c).
siterpusios DNR, etidio bromido molekuls padidina atstum tarp greta esani bazi por, todl
Tw maja. Udaroje iedinje molekulje, pvz., plazmids DNR, kurios Lk yra pastovus, tai kompensuojama superspiralizacijos (Wr) pokyiu. Majant Tw, Wr turi didti. neigiamai superspiralizuot
dvigrandin iedin DNR (daniausiai ji tokia yra igryninus i lsteli) siterpus EtBr molekulms, Wr
didja, molekul tampa labiau relaksuota. Jeigu EtBr sveikauja su relaksuota iedine DNR, i superspiralizuojasi teigiamai. Relaksuotos iedins DNR yra maiau judrios elektriniame lauke nei superspiralizuotos. Etidio bromido ir kit da gebjimas interkaliuoti dvigrandin DNR plaiai naudojamas ir
DNR superspiralizacijai tirti. Tam taip pat naudojami ir fermentai topoizomerazs.
DNR superspiralizacija gali bti dvejopa: plektonemin ir toroidin. Plektoneminio tipo

superspiralizacija yra DNR duplekso apsisukimas apie save pat. Plektoneminiu bdu super
spiralizuojasi iedin DNR (pvz., bakterij), taip pat DNR, kurioje susidaro torsin temptis dl
biologini proces (replikacijos, transkripcijos) (2.23pav., a). Deiniojo sukimo krypties plektonemin superspiralizacija yra neigiama, o kairiojo teigiama.
Toroidinio tipo superspiralizacija yra DNR duplekso aies sukimasis iedais sudarant cilindr panai struktr (2.23pav., b). Tokiu bdu DNR yra superspiralizuota eukariot chromatine: ji kairuoju sukimu apsisukusi nukleosomose aplink baltymus histonus 1,65 karto. Nu-
50
2.22pav. Etidio bromidas ir DNR

vaizdinimas. Etidio brimido struktra (a); agarozs gelis su EtBr ir
iskirstytomis DNR molekulmis, apviestas ultravioletiniais spinduliais
(b) (http://en.wikipedia.org/wiki/
Ethidium_bromide)
kleosomose DNR superspiralizuota neigiamai. Abiej tip superspiralizacija topologikai yra

lygiavert. Vieno tipo DNR molekuls superspiralizacija gali pereiti kito tipo (2.23pav., c) Taigi,
DNR supakavimas nukleosomas chromatine sukuria neigiam superspiralizacij.
Kiek DNR molekul yra superspiralizuota (Lk), palyginti su relaksuota struktra (Lk0), galima
ireikti savituoju sankibos skirtumu, Lk:
DLk=LkLk0.
Kuo labiau DLk skiriasi nuo nulio, tuo DNR yra labiau superspiralizuota.
Jeigu Lk<Lk0, tai DLk<0, o DNR yra superspiralizuota neigiamai;
jeigu Lk>Lk0, tai DLk>0, o DNR yra superspiralizuota teigamai.
DLk ir Lk0 priklauso nuo DNR molekuls ilgio, todl DNR superspiralizacija apibdinama ir
superspiralizacijos tankiu, (sigma), kuris ireikiamas:
s=DLk/Lk0.
iedo pavidalo DNR, iskirtos i bakterij, superspiralizacijos tankio s dydis yra ~ 0,06.
Neigiama superspiralizacija gamtoje yra bdinga daugumos organizm DNR ne tik maoms, iedinms DNR (mitochondrij, virus, bakterij DNR), bet ir didelms DNR molekulms.
Dl neigiamos superspiralizacijos DNR supakuojama nukleosomose. Tokia DNR topologikai
lygiavert DNR, kurioje trksta ski tam tikroje srityje grandins yra iskirtos. Tai lemia, kad
51
MOLEKULIN BIOLOGIJA
2.23pav. Plektonemin ir toroidin DNR superspiralizacija. Plektonemin superspiralizacija (a); toroidin superspiralizacija (b); eukariot DNR superspiralizacija prisijungus baltymams (histonams) (c)
(J.D.Watson, T. A. berg, S. P. Bell, A. Gann, M. Levine, R. Losick. Molecular Biology of the Gene, seventh
edition, 2013)
per replikacij ir transkripcij lokaliai iskirti grandines sunaudojama maiau energijos nei,
pvz., relaksuotoje DNR.
Vieni i organizm, kuriuose DNR superspiralizuota teigiamai, yra kai kurios termofilins
archebakterijos, gyvenanios kartuosiuose altiniuose. iuo atveju laisvosios energijos saugykla yra teigiama DNR superspiralizacija. Energija naudojama apsaugoti DNR molekul nuo
denatracijos auktoje temperatroje.
Eukariot chromosom centromerose DNR taip pat superspiralizuota teigiamai ji susisukusi aplink baltymus histonus deiniuoju sukimu (toroidin superspiraliacija).
2.1.6. Topoizomerazs
Gamtini DNR sankibos laipsnis (Lk) lstelse keiiamas pasitelkiant savit grup ferment topoizomerazes. Topoizomerazs lstelje palaiko tam tikr DNR topologin bsen.
Topoizomerazi yra bakterij, archj ir eukariot lstelse, virusuose. ie fermentai pagal
j struktr ir veikimo mechanizm skirstomi I tipo ir II tipo. I ir II tipo topoizomerazs dar
52
skirstomos penkias eimas: IA, IB, IC, IIA ir IIB (2.4lentel). Maiausiai penkios skirtingos DNR
topoizomerazs aptiktos auktesnij eukariot, tarp j ir mogaus, lstelse.
Topoizomerazs laikinai sukuria laisvus DNR galus, kuriuos atsukant arba susukant sumainamas arba padidinamas Lk. Visos topoizomerazs skelia DNR grandin, sudaro su
ja laikin kovalentin ry, vliau perskeltj grandin sujungia, pakeisdamos DNR molekuls
Lk. Tokiu bdu superspiralizacija, kai ji trukdo judti baltymams arba j kompleksams, yra
panaikinama.
I tipo topoizomerazs keiia DNR molekuls Lk vienetu (DLk=1) arba n (DLk>1). II tipo topoizomerazs keiia DNR molekuls Lk dvejetu (DLk=2). Skiriasi I ir II tipo topoizomerazi struktra ir veikimo mechanizmas.
2.4lentel. DNR topoizomerazi savybs
Savyb
I tipas
II tipas
eima
IA
IB
IC
IIA
IIB
Lk
Fosfotirozininis ryys
5-tyr
3-tyr
3-tyr
5-tyr
5-tyr
Panaikina superspirales
()
(+)/()
(+)/()
(+)/()
(+)/()
Sukuria superspirales
(+)
atvirktin
giraz
Ne
Ne
()
giraz
Ne
Sukuria / iskiria
katenanus
Vngr. DNR
Vngr. DNR
Dvigr. DNR
Dvigr. DNR
Metalo jonai
Mg2+
Ne
Ne
Mg2+
Mg2+
ATP
Ne (taip)
Ne
Ne
Taip
Taip
Ketvirtin struktra
Mono/AB
dimeras
Monomeras
Monomeras
AB, A2B2,
A2B2C2
A2B2
Dydis (kDa)
~90130
3380
320400
220250
Ikya
Nenustatyta
Nenustatyta
Nenustatyta
4 nukleotidai
2 nukleotidai
Mechanizmas
Grandins
tempimas
Isukimas
Isukimas (?)
Grandins
tempimas
Grandins
tempimas
I tipo topoizomerazs daniausiai yra vieno polipeptido kelis funkcinius domenus turintys
baltymai. ie fermentai skelia vien DNR grandin. Ferment aktyviajame centre esanti tirozino aminorgties liekana sudaro laikin kovalentin fosfotirozinin ry su skeltos DNR grandins 5 galu (IA eimos topoizomerazs) arba 3 galu (IB ir IC eimos topoizomerazs). I tipo
topoizomerazi veikimui, iskyrus kai kuri eim atstovus, ATP nereikia.
IA eimos topoizomerazs per skeltosios grandins ply tempia sveikj grandin, tada sujungia perskeltosios DNR galus. Rezultatas Lk pakeiiamas vienetu (2.24pav., a). Toks veikimo
mechanizmas vadinamas vieneri vart mechanizmu (angl. one gate). IA eimai priklauso atvirktin giraz, randama visose hipertermofilinse bakterijose ir archjose. Fermentas unikalus tuo, kad sukuria DNR teigiamas superspirales (2.4lentel). Atvirktin giraz turi savo struktroje topoizomerazms nebding helikazs domen, o topoizomerazs veikimui reikia ATP.
53
MOLEKULIN BIOLOGIJA
2.24pav. IA eimos topoizomerazi vieneri vart veikimo mechanizm iliustruojanti schema.

Fermentas prijungia dvigrandin DNR (1); fermentas skelia vien DNR grandin, susidaro fosfotirozininis
ryys tarp topoizomerazs aktyviojo centro Tyr ir DNR 5 fosfato (2); fermento domenas atsilenkia (atviroji konformacija), per skeltj grandin traukiama sveikoji grandin (3); skeltoji grandin sujungiama
(45) (D. L. Nelson and M. M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry, sixth edition, 2012)
IB ir IC eim topoizomerazi veikimas kitoks: kai io tipo topoizomerazs perskelia DNR

ir sudaro kovalentin ry su 3 galu, laisvasis 5 galas isisukioja. Rezultatas Lk keiiamas n
kart. Isisukimo (angl. swivel) valdymo mechanizmas nra iki galo iaikintas. IC eimos topoizomerazs rastos tik Methanopyrus genties archjose.
II tipo topoizomerazs yra homodimerins arba heterotetramerins struktros baltymai
(2.25pav.). J funkcijos yra gyvybikai svarbios utikrinant struktrin chromosom bsen
lstelje bei DNR struktrin bsen replikacijos, transkripcijos, reparacijos proces metu. Visi
gyvieji organizmai turi bent vien II tipo topoizomeraz, induoli lstelse j yra dvi (IIa ir IIb
topoizomerazs). II tipo A eimos topoizomerazi yra visuose lsteliniuose organizmuose, j
taip pat rasta virusuose, organelse. II tipo B eimos topoizomerazi rasta archjose, augaluose, kai kuriose bakterijose, pirmuonyse, dumbliuose.
II tipo topoizomerazs naikina teigiamas ir neigiamas DNR superspirales, iskiria sukibusius
DNR iedus katenanus. Kai kurios i topoizomerazi pasiymi neprastomis savybmis, pvz.,
bakterij ir archj IIA topoizomerazs girazs sukuria neigiamas superspirales.
II tipo tipoizomerazi veikimas kitoks nei I tipo. II tipo topoizomerazs skelia abi DNR grandines, palikdamos nukleotid ikyas kiekvienos skeltos grandins 5 gale. Kiekvienas fermento protomeras su skelt grandini 5 galais sudaro po kovalentin fosfotirozinin ry. II tipo topoizomerazi veikimui reikia ATP, jis naudojamas fermento konformaciniams virsmams.
54
2.25pav. I ir II tipo topoizomerazi erdvins struktros. I tipo A eimos topoizomerazs (E. coli III
topoizomerazs) komplekso su DNR erdvin struktra (a); II tipo topoizomerazs (S. cerevisiae II topoizomerazs) erdvin struktra, kur Y katalizikai aktyvi tirozino liekana, ADPNP ATP nukleotido analogas
(b) (Quaterly Reviews of Biophysics, v.41, 2008)
II tipo A eimos topoizomerazs skelia abi DNR grandines, per susidarius laikin ply tempia sveikj DNR, tada skeltj DNR sujungia. Veikimo mechanizmas vadinamas trej vart
(angl. three gates) (2.26pav.). Pirmiausiai per fermento, kuris yra atvirojoje konformacijoje, N
vartus (ATPazs domenus) pakliva vienas DNR fragmentas G segmentas (angl. gate). G DNR
yra stipriai lenkiama, ji prijungiama DNR vartuose, kur vyksta jos sklimas ir vliau sujungimas. Prisijungus ATP prie N vart (ATPazs domen), vyksta domen dimerizacija. N vartai
usiveria, traukdami kit DNR fragment T segment (angl. transfer). G DNR skeliama, o per
susidarius ply traukiama sveikoji T DNR. Skeltoji G DNR sujungiama. T DNR ieina per C vartus, tada ie usiveria. ATP molekuli hidroliz prasideda, kai prasideda T DNR pernaa. vykus
hidrolizei, disocijuoja ADP, ir fermentas grta pradin bsen.
Veikiant topoizomerazms susidaro dar kelios neprastos tretins DNR struktros: mazgai
ir katenanai (2.27pav., ac). DNR mazgai aptikti in vitro veikiant DNR topoizomerazmis. DNR
mazg aptinkama ir lstelse, taiau retai: j yra bakteriofag, virus, bakterij, turini replikacijos baltym mutacij, DNR.
Katenanai (lot. catena grandin) yra biologikai svarbios DNR struktros. Vykstant bakterij, mitochondrij, chloroplast, virus, plazmidi iedini DNR replikacijai, dukterins
iedins DNR molekuls lieka sukibusios sudaro katenanus. Sukibimas (Lk) turi bti visikai
panaikintas, kad molekuls bt atskirtos viena nuo kitos. Sukibim panaikina II tipo DNR topoizomerazs (bakterijose IV topoizomeraz, eukariotuose II topoizomeraz). ie fermentai
gali ir sujungti DNR iedus katenanus. Jeigu ied DNR esti viengrandini trki, iedus atskirti ar sujungti gali I tipo topoizomerazs.
55
MOLEKULIN BIOLOGIJA
2.26pav. II tipo topoizomerazi trej vart veikimo mechanizm iliustruojanti schema. Apibrtas vienas
fermento protomeras
(Nucleic Acids Research,
v.37, p.712, 2009)
Tripanosomatidi mitochondrij DNR, kuri dar vadinama kinetoplasto DNR (kDNR), topologija
yra labai neprasta. DNR organizuota didiul tarpusavyje sujungt DNR ied (katenan) tinkl. Pvz.,
organizmo Crithidia fasciculata kDNR sudaro ~25 dideli (37kb) DNR iedai ir 5000 ma (2,5kb) DNR
ied. Vis ied DNR yra relaksuotos formos, kiekvienas j sujungtas su madaug trimis kitais iedais. ied tinklas primena i daugybs ied nukalt vidurami riteri arv. Panaiai organizuotas
ir Leishmania tarentolae genomas (2.14 pav., c). Dar nra iaikinta, kodl tokia DNR struktrin organizacija atsirado tripanosom mitochondrij DNR, taiau ji neabejotinai pasitarnauja i organeli
genomo talpinimui.
2.27pav. DNR mazgai ir katenanai. DNR mazg (a) ir katenan (b) elektronins mikroskopijos nuotraukos ir schemos; Leishmania tarentolae kinetoplasto DNR (kDNR) elektronins mikroskopijos nuotrauka
(c) (http://dna.kdna.ucla.edu/trypanosome)
56
2.1.7. RNR antrin ir tretin struktra

Kitaip nei DNR spiral, kuri yra linijin struktra, RNR molekuls nra linijins. Joms bdinga
didel dydi ir struktr vairov (2.5lentel), kuri atspindi RNR funkcij vairov. Vis labiau
linkstama manyti, kad RNR funkcijos tiesiogiai priklauso nuo j tretins struktros.
2.5lentel. Kai kurios RNR molekuls ir j ilgiai
RNR
Ilgis nukleotidais
Pernaos RNR (tRNR)
6085
Ribosomins RNR
5S
5,8S (iurk)
16S (E. coli)
18S (iurk)
23S (E. coli)
28S (iurk)
~120
158
1542
1874
2904
4718
Telomerazs RNR (Tetrahymena)
159
Ribonukleazs P M1 RNR
350410
I klass ribozimo intronas (Tetrahymena)
413
Maosios branduolio RNR
2130
RNR gidai
~60
Viroid RNR
240380
RNR erdvins struktros, kurias in vivo ir in vitro gyja RNR molekuls, nedaug kuo primena anksiau aptartas DNR konformacijas. Jos labiau panaios baltym erdvines struktras.
F. Krikas yra pasaks, kad ios molekuls atrodo kaip gamtos bandymas suteikti RNR baltym
funkcijas.
RNR antrins struktros iuo metu gana tiksliai apraomos bioinformatiniais metodais, kurie remiasi lyginamja RNR nukleotid sek analize, vairi RNR konformacij laisvosios energijos termodinaminiais duomenimis, RNR molekuli kristal rentgeno analizs duomenimis.
RNR molekul neturi jai komplementarios grandins, kurios heterociklins bazs sudaryt
poras su kitos RNR molekuls heterociklinmis bazmis, kaip yra dvigrandinje DNR. Taiau
RNR molekulms yra bdinga antrin struktra, kuri susidaro dl vidumolekulins sveikos
tarp tos paios RNR molekuls heterociklini bazi. Antrin RNR struktra yra RNR erdvins
struktros organizacinis pagrindas.
Antrines RNR struktras priimta vaizduoti vienoje ploktumoje, taiau antrin RNR struktra nra tik dvimat struktra: ji turi tretins struktros element, pvz., A formos dvigrandins RNR spirali. A formos RNR spirals yra tipiki RNR molekuli antrins struktros elementai, susidarantys sveikaujant komplementarioms tos paios RNR molekuls heterociklinms
bazms.
RNR spiralje A sudaro komplementari sveik su U, o G su C. Tarp i heterociklini bazi
susidaro Votsono-Kriko sveika. RNR spiralse gausu (skaiiuojama daugiau nei 20) vadinamj
nekanonini (ne Votsono-Kriko) heterociklini bazi por. I j labiausiai paplitusi G-U pora.
57
MOLEKULIN BIOLOGIJA
2.28pav. RNR antrin struktra ir jos element tarpusavio sveikos tretinje struktroje. RNR antrins struktros elementai (a) (T. D. Pollard, W. C. Earnshaw, J. Lippincott-Schwartz, Cell Biology, second
edition, 2007); antrins struktros element tarpusavio sveika (b); RNR pseudomazgo susidarymo
schema ir erdvin struktra (c) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012)
58
2.6lentel. RNR molekuli tipai ir j funkcijos

RNR
Funkcijos
Baltymus koduojanios
iRNR
Matricos baltym biosintezei ribosomose
Baltym nekoduojanios
rRNR
Struktriniai ir funkciniai ribosom komponentai
tRNR
Baltym biosintezs tarpininkai
miRNR
Gen raikos valdymas
snRNR
RNR splaisingo aparato komponentai
siRNR
Gen raikos valdymas
rasiRNR
Gen raikos valdymas
snoRNR
rRNR brendimo aparato komponentai
Didels ncRNR
Gen raikos valdymas
RNR A formos spirals maasis griovys yra platus ir seklus, o didysis griovys labai siauras ir
gilus, j pakankamai sunku pasiekti su nukleorgtimis sveikaujantiems baltymams bei ligandams. Kita vertus, 2 OH grups yra vandenilini ryi akceptoriai, todl sveikos galimyb yra.
Dvigrandiniai fragmentai RNR molekulje gali bti pertraukti nesuporuot linijini fragment vairaus dydio kilp (angl. loop) ir pups (angl. bulge), kuriuos sudaro vienas ar keli
nesuporuoti nukleotidai, istumti i suporuotos srities (2.28pav., a).
Danas RNR molekuli antrins struktros elementas yra plauk segtukas (angl. hairpin), kur
sudaro dvigrandins RNR fragmentas stiebas (angl. stem), turintis nesuporuot kilp. RNR stiebokilpos struktros (angl. stem-loop) yra svarbs pernaos RNR molekuli (tRNR) erdvins struktros
elementai. Dvigrandiniai RNR fragmentai bei kilpos sudaro ir akotsias struktras (2.28pav., a).
Tretinje RNR struktroje antrins struktros elementai sveikauja tarpusavyje. Taip, pvz.,
susidaro RNR pseudomazgai (angl. pseudoknots), besibuiuojantys plauk segtukai (angl.
kissing hairpins), plauk segtukopupso (angl. hairpinbulge) struktros (2.28pav., b).
RNR pseudomazgas susidaro, kai RNR kilpoje esanios heterociklins bazs sveikauja su
kito RNR molekuls fragmento heterociklinmis bazmis (2.28pav., c). RNR pseudomazgai pirm kart buvo nustatyti griei mozaikos viruso RNR. Pseudomazg esti vairaus dydio ir
struktr, nes juos galini sudaryti RNR stieb bei kilp vairov taip pat yra didel. Pseudomazg funkcijos vairios: jie sudaro katalizin ribozim erd, svarbs telomerazs RNR struktrai ir funkcijoms. Retrovirus iRNR susidarantys pseudomazgai lemia skaitymo rmelio poslink
transliacijos metu, toks poslinkis btinas viruso dauginimuisi reikaling baltym sintezei.
Lstelse RNR molekuli funkcijos yra labai vairios (2.6lentel). Lstelse vyrauja trij tip
RNR molekuls:
zz nedidelio ilgio pernaos RNR, tRNR (angl. transfer RNR), kurios dalyvauja baltym
biosintezje;
zz ribosomins RNR, rRNR, kurios ribosomose sudaro struktrin ir funkcin pamat peptidiniams ryiams sintetinamose baltym molekulse susidaryti;
zz informacins RNR, iRNR, kuriose yra nuo DNR transkripcijos metu nurayta informacija;
iRNR molekuls talpina informacij apie baltym aminorgi sekas.
59
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Be pamint RNR molekuli, lstelse gausu ma RNR molekuli, kurios dalyvauja vairiuose biologiniuose procesuose: iRNR splaisingo bei redagavimo, tRNR, rRNR, kit RNR pirmtak brendimo, baltym inaos, DNR replikacijos, gen raikos valdymo (2.6lentel).
Trumpai aptarsime pagrindini RNR molekuli tip antrins ir tretins struktr ypatybes.
2.1.8. Pernaos RNR (tRNR) antrin ir tretin struktra

Pernaos RNR molekuli erdvin struktra lemia i molekuli savitas funkcijas lstelje.
tRNR molekuli struktra turi utikrinti tiksl j prisijungim ribosomoje. Kita vertus, tRNR molekuls turi pasiymti ir pakankama struktr vairove, utikrinania, kad tRNR molekules atpaint savitosios aminoacil-tRNR sintetazs, jungianios aminorgtis prie tRNR.
1965m. Robertas Holis (Robert Holley) nustat mieli fenilanil-tRNR (tRNRPhe) nukleotid
sek. Pernaos RNR yra palyginti maos ir kompaktikos molekuls (7393 nukleotidai). Taiau
jos nra linijins.
Antrin tRNR molekuli struktra yra dobilo lap primenanti struktra, kuriai yra bdingos keturios dvigrandins stiebo formos sritys, susidaranios tarp komplementari heterociklini bazi molekulje (Votsono-Kriko poros), ir trys viengrandins kilpos pavidalo sritys
(2.29pav., a). Antrin tRNR molekuli struktr i dalies stabilizuoja Votsono-Kriko sveika tarp
heterociklini bazi. Dvigrandins tRNR molekuls sritys yra A formos RNR spirals. Visos inomos citozolio tRNR molekuls sudaro dobilo lapo formos antrin struktr.
zz Pernaos RNR molekuls funkcijoms labai svarbs antrins struktros elementai yra antikodono stiebas ir antikodono kilpa. Stieb sudaro 5 komplementari nukleotid
poros. Antikodono kilpoje visos tRNR molekuls turi 7 nukleotidus. Antrasis antikodono
kilpos nukleotidas visuomet yra uridinas, U. U jo kiekviena tRNR molekul turi savit
nukleotid trejet antikodon, kuris komplementarus tam tikram nukleotid trejetui kodonui iRNR molekulje. RNR molekuli kodono-antikodono sveika susidaro
ribosomoje.
zz 5 gale visos tRNR molekuls yra fosforilintos ir beveik visos turi 7 nukleotid por dvigrandin struktr akceptorin stieb. tRNR akceptoriniame stiebe yra netipika bazi
pora G-U. Akceptorinio stiebo 3 gale visos tRNR turi viengrandin keturi nukleotid
5RCCA3OH iky, prie kurios jungiama aminorgtis (R purinas A arba G).
zz Kiti struktriniai tRNR elementai yra T stiebas su T kilpa. Stieb sudaro penkios
nukleotid poros, o kilpoje yra labai konservatyvs 7 nukleotidai, tarp j modifikuotas
nukleotidas pseudouridinas, y (psi), taip pat ir neprastas RNR molekulei nukleotidas su T.
zz Visos tRNR molekuls turi D stieb ir D kilp. D stieb prastai sudaro 4 nukleotid poros, o D kilp 711 nukleotid. Kilpoje danai yra modifikuotas nukleotidas dihidrouridinas, D (i ia kils ir kilpos pavadinimas).
zz Pernaos RNR struktrai bdingas elementas yra kintamoji kilpa, V (angl. variable loop).
Pagal kintamosios kilpos dyd tRNR molekuls yra skirstomos dvi grupes. 1-os grups
tRNR turi nedidel kintamj kilp, kuri sudaro 35 nukleotidai (toki kilp turi ~75%
tRNR molekuli). 2-os grups tRNR molekuli kintamj kilp sudaro 1321 nukleotidas.
60
Palyginus vairi tRNR antrines struktras, paaikjo, kad tam tikrose padtyse yra tie patys nekintamieji (angl. invariant) nukleotidai. Tam tikrose padtyse nustatyti nukleotidai,
turintys tik purino arba tik pirimidino heterociklines bazes i dalies kintamieji (angl. semivariant). Toki nukleotid tRNR molekulje suskaiiuojama ~22.
Kai kuri tRNR molekuli antrin struktra skiriasi nuo daugumos tRNR struktros. Pvz., iniciatorins tRNR pasiymi struktriniais skirtumais dl savo ypating funkcij. ios tRNR prisijungia ribosomoje ne A srityje, bet P srityje (r. skyri Baltym biosintez). Prokariot iniciatorins tRNR akceptorinio stiebo pirmoji nukleotid pora yra ne Votsono-Kriko tai utikrina iniciacijos veiksnio IF-2
prijungim.
Didiule struktrine vairove pasiymi eukariot organeli mitochondrij tRNR. Kai kuriose mitochondrij tRNR vietoje T arba D stiebo yra viengrandins sritys. i molekuli erdvin stuktra dar
nra eksperimentikai nustatyta.
Tretin tRNR struktra. 1968m. Maiklas Levitas (Michael Levitt), palygins keliolikos tRNR
molekuli nukleotid sekas, pasil teorin erdvins tRNR struktros model. is modelis nebuvo tikslus, taiau tai buvo pirmasis bandymas susieti RNR molekuls struktr su jos biologine
funkcija. tRNR molekuls erdvin struktra buvo iaikinta 1974m. atlikus mieli tRNRPhe molekuls kristalo rentgenostruktrin analiz.
Tretin tRNR struktra, kuri susidaro tirpale tarpusavyje sveikaujant anksiau mintiems antrins struktros elementams, yra apverstos L raids pavidalo (2.29pav., b). i struktra, taip pat
kaip ir antrin struktra, yra bdinga visoms tRNR molekulms, nors j nukleotid sekos skiriasi.
2.29pav. Pernaos RNR molekuli antrin ir tretin struktros. tRNR antrin dobilo lapo formos
struktra. Pagrindiniai tRNR molekuls struktriniai elementai kilpos ir stiebai paymti; konservatyvs
nukleotidai, aptinkami visose tRNR molekulse, paymti apskritimais; itisins linijos jungia heterociklines bazes, kurioms yra bdinga tarpusavio sveika susidarant tretinei tRNR struktrai (a); tRNR tretin
struktra (b) (http://drtedwilliams.net/cop/BB492/BB492tRNATertiaryStructure.gif )
61
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Tretinje struktroje tRNR molekuls akceptorinis stiebas ir T kilpa sudaro vien tRNR erd
vins struktros rankos formos element, o D kilpa ir antikodono kilpa panaiai sudaro kit
rank. Abi rankos ioje tRNR struktroje yra ~60 ilgio, jos tarpusavyje sudaro ~90 kamp.
Du labai svarbs tRNR molekuls funkciniai centrai antikodonas ir akceptorinis stiebas yra
prieingose tRNR erdvins struktros pusse, juos skiria 7,58 nm. tRNR molekuls erdvin
struktra susidaro tirpale dl vandenilini ryi tarp vairiose tRNR molekuls srityse esani
heterociklini bazi (ne Votsono-Kriko).
Tretin tRNR molekuli struktr stabilizuoja netipikos sveikos tarp heterociklini
bazi. Dauguma tRNR konservatyvi ir pusiau konservatyvi nukleotid heterociklini bazi, esani molekuls antrins struktros kilpose (D, V ir TyC) bei stiebuose, dalyvauja iose
netipikose sveikose. Pvz., sveika tarp konservatyvi U8 ir A14 bei 9-oje ir 23-ioje padtyse
esani purin heterociklini bazi lemia staig posk nuo akceptorinio stiebo link D stiebo
tRNR molekuls erdvinje struktroje. Tai utikrina tolesn molekuls erdvins struktros formavimsi (2.29pav., ab).
Pernaos RNR molekuli spirali elementuose dana netipika bazi pora yra G-U
(2.29pav.,a), kuri skiriasi nuo Votsono-Kriko bazi por savo savybmis. Dl j G-U bazi pora
yra danas su RNR sveikaujani baltym taikinys. Pvz., G-U pora, esanti tRNRAla molekuls
akceptoriniame stiebe, yra vienas pagrindini atpainimo signal fermentui aminoacil-tRNR
sintetazei jungti prie tRNR aminorgt alanin.
Kitos netipikos bazi poros, aptinkamos tRNR molekulse (taip pat ir kitose RNR molekulse), yra Hugstyno sveikos tarp A-U (2.30pav.) heterociklini bazi.
Pernaos RNR bei kitose RNR molekulse susidaro sveik tarp trij heterociklini bazi.
ios sveikos yra labai svarbios tretinei molekuli struktrai susidaryti ir palaikyti. tRNR A23
heterociklin baz molekuls D stiebe sudaro Votsono-Kriko por su U12 ir dar Hugstyno bazi
por su A9 (2.29pav., a). Tokia sveika stabilizuoja staig ilinkim tarp akceptorinio ir D stieb.
Kita panai sveika tarp C13, G22 ir G46 jungia D stieb su V kilpa ir dalyvauja stekingo sveikose molekuls tretinje struktroje.
2.30pav. Netipika G-U ir Hugstyno A-U sveika tarp RNR heterociklini bazi
62
Stekingo sveika tarp heterociklini bazi tRNR molekuls viduje yra labai svarbi molekuls tretinei struktrai. ioje sveikoje dalyvauja iki 90% tRNR molekuls heterociklini
bazi. Molekulje susidaro vadinamasis stieb stekingas (angl. coaxial stacking). Stieb stekinge dalyvauja keli dvigrandiniai spirals pavidalo RNR fragmentai, isidst vienas iilgai kito.
Pvz., tRNR akceptorinis stiebas, kur sudaro 7 nukleotid poros, dalyvauja stieb stekinge su 5
nukleotid por T stiebu, o D stiebas su antikodono stiebu (2.29pav., b). Dl stekingo sveikos
tRNR molekuls vid beveik nepatenka tirpalo molekuls, taiau jos funkciniai centrai, pvz.,
antikodono kilpa ir akceptorinis stiebas, yra greitai pasiekiami su jais sveikaujani molekuli.
Pernaos RNR molekuls transkripcijos metu susintetinamos kaip pre-tRNR molekuls, kurios yra gerokai ilgesns nei funkcionalios subrendusios tRNR. Brendimo metu yra alinamos ir
terpiamos nukleotid sekos, modifikuojami nukleotidai (r. skyri RNR brendimas).
2.1.9. Ribosomini RNR antrin ir tretin struktra

Baltym biosintez visuose organizmuose vyksta ribosomose. Ribosomos yra labai sudtingi nukleoproteinai nekovalentiniais ryiais sveikaujani baltym ir ribosomini RNR
(rRNR) kompleksai. Du tredalius ribosom mass sudaro rRNR. Prokariot ribosom sudtyje
yra trij tip rRNR: 16S rRNR, 23S rRNR ir 5S rRNR. Eukariot ribosom sudtyje 18S rRNR,
28S rRNR, 5,8S rRNR ir 5SrRNR. rRNR molekuls taip buvo pavadintos pagal j sedimentavimo greiius (matuojamus svedbergais, S), nustatytus centrifuguojant drusk tankio gradiente.
1970-j pabaigoje palyginus keli organizm rRNR nukleotid sekas, buvo pasilytos 5S,
16S ir 23S rRNR molekuli antrins struktros, kurios vliau buvo patvirtintos daugelio laboratorij tyrimais naudojant biocheminius bei kitus eksperimentinius metodus. Vis gyvybs
domen organizm rRNR molekuli antrins bei tretins struktros pasiymi dideliu konservatyvumu, nors pai rRNR molekuli dydiai enkliai skiriasi. Pvz., bakterij 16S rRNR bei j
analog eukariotuose ilgis svyruoja nuo 620 iki daugiau nei 1800 nukleotid, o bakterij 23S
rRNR bei j eukariot analog nuo 1 150 (tripanosom mitochondrijose) iki daugiau nei
5000 nukleotid (mogaus lstelse). rRNR ilgi vairov lemia siterpusios nukleotid sekos
(angl. expansion elements), kurios daniausiai isidsiusios nekonservatyviuose rRNR molekuli struktros elementuose ir gali siekti iki 900 nt.
Ribosomini RNR antrinje struktroje gausu dvigrandini fragment, turini nesuporuot viengrandini srii, kilp. Dl toki struktros ypatum rRNR molekuls gyja labai sudting tretin struktr, kuriai dar papildomai daro tak sveika su baltymais, vandens molekulmis ir metal jonais.
Ribosomini RNR erdvins struktros iuo metu pakankamai tiksliai apraomos kompiuteriniais metodais, remiantis vairi konformacij laisvosios energijos termodinaminiais duomenimis, lyginamja (filogenetine) rRNR sek analize, kristalografins analizs duomenimis.
Pvz., lyginamoji nukleotid sek analiz remiasi principu, kad rRNR, kuri nukleotid sekos yra
panaios, pasiymi panaia antrine bei tretine struktra.
Konservatyvs rRNR molekuli antrins struktros elementai sudaro universali erd,
bding tiek citozolio, tiek ir organeli (mitochondrij, chloroplast) rRNR. Ribosomini RNR
erdvinei struktrai bdingi beveik visi RNR erdvins struktros elementai.
63
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Pvz., E. coli 16S rRNR turi 45 dvigrandines sritis spirales. 16S rRNR antrinje struktroje
yra keturi struktriniai domenai: trys dideli (5 domenas, centrinis domenas, 3 didysis domenas) ir vienas maesnis 3 maasis domenas (2.31pav., a). Manoma, kad kiekvienas domenas
gyja erdvin struktr nepriklausomai. 16S rRNR molekuls labiausiai konservatyvios sritys yra
isidsiusios 24 spirals kilpoje, 44 spirals virutinje dalyje ir 18 spiralje. Visos sritys yra labai svarbios 16S rRNR funkcijai: 24 spiral dalyvauja ribosomos subvienet sveikoje, 44 spiral
yra ribosomos ikodavimo centro dalis (2.31pav., ab), 18 spiral dalyvauja susidarant funkcikai svarbiai pseudomazgo struktrai.
2.31pav. Bakterijos Thermus thermophilus 16S rRNR antrin ir tretin struktros. 16S rRNR antrin struktra. Pagrindiniai molekuls domenai paymti. 44 spiral yra isidsiusi maojo ir didiojo
ribosomini subvienet slyio paviriuje (a); 16S rRNR tretin struktra, nustatyta rentgenostruktrine
analize. Parodyti ribosomos maojo subvieneto struktriniai elementai ir ikodavimo centras (b) (Nature,
v.407, p.327, 2000)
23S rRNR molekuls antrinje struktroje labiausiai konservatyvs yra apie 100 dvigrandini spirals pavidalo fragment, kurie organizuoti eis didelius IVI domenus (2.32pav.,
ab). Molekuls V domene yra daugelis konservatyvi nukleotid, kurie sudaro ribosomos
peptidiltransferazs centr (r. skyri Baltym biosintez). VI domene (95 spiral) yra konservatyvs vadinamosios sarcino-ricino kilpos nukleotidai. ioje srityje ribosomoje prisijungia transliacijos veiksniai EF-G ir EF-Tu.
Maiausios tarp rRNR yra 120 nt 5S rRNR molekuls, kurios yra labai konservatyvios visuose organizmuose. 5S rRNR antrin struktr sudaro 5 dvigrandiniai spiraliniai fragmentai
(2.32pav., c).
Tiksli tretin rRNR molekuli struktra buvo iaikinta pastaraisiais metais, atlikus didels
skyros ribosom bei ribosomos subvienet rentgenostruktrin analiz. rRNR molekuli tretins struktros susidaro dl heterociklini bazi tarpusavio sveikos ir stekingo sveikos. Dalis
64
2.32pav. Archjos Haloarcula marismortui 23S rRNR ir 5S rRNR antrin ir tretin struktros. 23S
rRNR antrin struktra. IVI domenai paymti skirtingomis spalvomis (a); 5S rRNR antrin struktra
(b); 23S rRNR kartu su 5S rRNR tretin struktra, nustatyta 2,4 skyros rentgenostruktrine analize.
23S rRNR domen spalvos atitinka pavaizduotsias a dalyje (c) (http://www.proteopedia.org/wiki/
index.php/Large_Ribosomal_Subunit_of_Haloarculahttp://www.proteopedia.org/wiki/index.php/
Large_Ribosomal_Subunit_of_Haloarcula)
65
MOLEKULIN BIOLOGIJA
rRNR heterociklini bazi sudaro Votsono-Kriko sveikas ir formuoja A tipo RNR spirales. Kita
dalis bazi sveik rRNR tretinje struktroje yra netipikos: tai Hugstyno sveikos, taip pat
G-A, A-A, U-U sveikos.
Sveikaujant netipikoms bazi poroms, RNR molekulse susidaro papildomos sveikos,
pvz., vandeniliniai ryiai tarp ribozs-fosfat karkas, tarp ribozs-fosfat ir heterociklini bazi, sveika tarp trij bazi por. Bdinga, kad tokiose sveikose dalyvauja ne viena bazi pora,
o kelios heterociklini bazi poros, vadinamieji RNR motyvai. ie motyvai, manoma, yra universals dideli RNR molekuli tretins struktros elementai.
2.33pav. A minoriniai motyvai archjos Haloarcula marismortui 23S rRNR molekulje. Sveika tarp
IV domeno 68 spirals (ji dalyvauja formuojant ribosomos aktyvj centr) ir V domeno 75 spirals. Keturios 68 spirals adenino heterociklins bazs sveikauja su 75 spirals mauoju grioviu (a); sveika tarp
rRNR 52 ir 66 kilp (b); sveika tarp 4142 spirali viengrandins srities adenin ir 89 bei 90 spirali (c)
(PNAS,v.98, p.4899, 2001)
Gana paplits dideli RNR molekuli tretins struktros elementas yra vadinamasis A minorinis motyvas (2.33pav., ac). Jis pirm kart nustatytas plaktuko galvos (angl. hammerhead)
ribozime ir I grups intron P4P6 domene (r. skyri RNR brendimas). is erdvins struktros
elementas susidaro sveikaujant nesuporuotai ir istumtai i antrins struktros adenine heterociklinei bazei su Votsono-Kriko bazi pora RNR spiralje i jos maojo griovio puss. Jeigu
yra ne vienas, o daugiau nesuporuot adenin, susidaro keletas tokio tipo sveik. Adeninas
labai tiksliai siterpia RNR maj griov. rRNR molekuli tretinei struktrai susidaryti svarbios ir
vandens molekuls bei metal jonai.
Didieji 16S rRNR domenai ribosomoje isidsto atskirai vienas nuo kito ir formuoja ribosomos 30S subvieneto dalis: galv, kn, platform. Maasis 3 domenas sudaro ilg RNR spiral
(44 spiral), kuri yra ribosomos 30S ir 50S subvienet slyio paviriuje (2.31pav., b).
Kitaip nei tretinje 16S rRNR struktroje, 23S rRNR molekulje ei antrins struktros domenai sudaro labai kompaktik vienalyt struktr. 5S rRNR isidsto 23S rRNR iorje (2.32pav., c).
66
2.1.10. Katalizikai aktyvios RNR (ribozimai)

Ilgai manyta, kad tik baltymai gali pasiymti katalizinmis funkcijomis. Baltym molekuls
gali gyti erdvin struktr, gerai pritaikyt prijungti substrat ir turini aktyvj centr cheminei reakcijai vykti. Taiau pasirod, kad ir tam tikros RNR molekuls gali gyti sudting erdvin
struktr, formuoti aktyvj centr ir pasiymti katalizinmis savybmis. Tokios RNR vadinamos ribozimais. 1982m. Tomas echas (Thomas Cech) su kolegomis tyrinjo pirmuonies Tetrahymena thermophila rRNR pirmtako brendim. Pirmtako genas koduoja didel >400nt intron. Nuo geno in vitro buvo susintetinta pirmtako RNR, mokslininkai ketino isiaikinti, kokie
Tetrahymena baltymai reikalingi pirmtako brendimui. Didelei j nuostabai, netrukus paaikjo,
kad intronas i susintetinto rRNR pirmtako isikirpo savaime, o likusios RNR molekuls dalys
buvo sujungtos reakcijoje be joki baltym. Reakcijai vykti reikjo tik paties pirmtako su intronu, Mg2+ jon ir koveiksnio guanozino. Tetrahymena rRNR pirmtako intronas susilankst erdvin struktr, kurioje veiksmingai vyko introno isikirpimo ir likusi dali (egzon) sujungimo
reakcijos. Plaiau apie ribozim skaitykite skyriuje RNR brendimas.
Panaiu metu (1983 m.) Sidnis Altmanas (Sidney Altman) su kolegomis po ilg tyrinjim
met nustat, kad E. coli ribonukleaz P taip pat yra ribozimas. Bakterij ribonukleaz P sudaro
RNR (M1 RNR) molekul ir baltymo (C5) molekul, o kataliziniu aktyvumu pasiymi btent RNR.
Tolesni tyrimai atskleid, kad ribonukleaz P yra gyvybikai svarbi molekul vis gyvybs domen organizmuose. Su retomis iimtimis, ji dalyvauja bakterij, archj, eukariot tRNR pirmtak
brendimo procese skelia pre-tRNR molekuli 5 gale esani lyderin sek (r. skyri RNR brendimas). Didioji dauRibozimai katalizikai aktyvios
guma gamtini ribozim skelia fosfodiesterinius ryius RNR
RNR molekuls, kuri aktyvj
molekulse. Iimtis yra ribosoma, kur 23S rRNR katalizuoja
centr iimtinai sudaro RNR.
kitoki chemin reakcij peptidinio ryio susidarym.
Gamtini ribozim nra daug (2.7lentel). Erdvinis RNR susilankstymas yra esmin ribozim katalizinio aktyvumo slyga. Metalo jonai svarbs RNR susilankstymui ir kai kuri ribozim
kataliziniam aktyvumui. Vis dlto nors vis ribozim katalizikai aktyvus komponentas yra RNR,
daugumos j, iskyrus maus ribozimus, aktyvumui in vivo pasireikti reikia baltym, tad ribozim molekuls funkcionuoja kaip nukleoproteinai.
domus ribozim pavyzdys yra mai save skeliantys ribozimai. Yra inomi penki skirting
struktr mai ribozimai: plaktuko galvos (angl. hammerhead), plauk segtuko (angl. hairpin), VS
(angl. Varkud satellite), HDV (angl. hepatitis delta virus) ir keli ribozimai, esantys bakterij ir eukariot iRNR sudtyje (2.7lentel). Plaktuko galvos ir plauk segtuko ribozim yra infekcini agent viroid ir virusoid RNR sudtyje. Viroidai yra viengrandins iedins RNR molekuls, funkcionuojanios be baltym kapsids. Viroid RNR nekoduoja baltym ir iRNR. Viroidai infekuoja
augalus ir sukelia j ligas. Jie replikuojasi lsteli branduolyje ir chloroplastuose, j patogenezs
mechanizmas nra iki galo iaikintas. Viroid RNR dauginama besisukanio rato (angl. rolling
circle) principu (2.34pav., c). Kaip matric naudojant viroido RNR (+ (plius) grandin), besisukanio rato mechanizmu, pasitelkiant lstels eimininks baltymus, kopijuojama komplementari
RNR grandin ( (minus) grandin). Susidaro linijin RNR, kurioje yra viroido genomo kopijos.
Kiekvienoje kopijoje susiformuoja nedidelis katalizikai aktyvus plaktuko galvos ribozimas, kuris
67
MOLEKULIN BIOLOGIJA
skelia RNR. Susidaro linijin molekul (5 OH viename molekuls gale ir 2-3 ciklofosfatas kitame),
kuri sujungiama (2.34pav., c). Taip susidaro viengrandins iedins viroido RNR kopija, kuri toliau
taip pat gali bti kopijuojama besisukanio rato mechanizmu. Plaktuko galvos ribozimo molekul susilanksto savit erdvin struktr, kurioje yra trys RNR spirals, o struktra primena T raid.
Katalizikai aktyvi ribozimo erd sudaro ~58 nukleotidai (2.34pav., ab). Ribozimo aktyvumui
itin svarbi sveika tarp pupso I stiebe ir kilpos II stiebe ji stabilizuoja aktyvj centr, kuriame
tiksliai idstoma sklimo vieta (17 nukleotidas, 2.34pav., ab).
2.34pav. Viroid plaktuko galvos ribozimas ir jo vaidmuo viroido RNR replikacijoje. Plaktuko galvos ribozimo antrin struktra (a); plaktuko galvos ribozimo tretin struktra. Punktyrins linijos ymi
svarbias sveikas tretinje struktroje. Raudonai nuspalvinti nukleotidai yra arti sklimo vietos, geltonai nukleotidai, svarbs katalizei (b) (Nature Reviews Genetics, v.8, p.778, 2007); viroido RNR replikacija
besisukanio rato mechanizmu. Plaktuko galvos ribozimo struktra, susidaranti viroido RNR. Ribozimas
ir sklimo vieta (paymta trikampiu) parodytos (c)
Virusoidai (dar vadinami satelitine RNR) yra panaiai funkcionuojanios RNR, taiau jos
yra augal virus (pvz., tabako iedikosios dmtligs viruso) sudtyje, supakuotos viruso
genome, ir j replikacija priklauso nuo viruso replikacijos. Virusoid RNR sudtyje yra plauk
segtuko ribozimas, kurio erdvins struktros pagrind sudaro keturi dvigrandiniai stiebai. Ribozimas funkcionuoja panaiai kaip ir viroid plaktuko galvos ribozimas: skelia virusoido RNR
kopijas, kai vyksta replikacija besisukanio rato mechanizmu.
HDV ribozimas yra vienintelis inomas ribozimas mogaus lsteles infekuojanioje satelitinje RNR. HDV RNR yra mogaus hepatito B viruso satelitin RNR. Jai esant, pasireikia itin sunki
hepatito forma. 1679nt ilgio iedinje viengrandinje RNR ribozimas sudaro 85nt. Ribozimas
susilanksto savit katalizikai aktyvi dvigubo pseudomazgo struktr.
68
2.7lentel. Gamtiniai ribozimai ir j savybs4

Ribozim
klas
Grup
Nariai
Dydis
(nukleotidais)
Pagrindin
funkcija
Paplitimas
Skeliantys ribozimai
Save skeliantys
Satelitin
RNR
Plaktuko
galvos
65
Viroidai, augal virus satelitin RNR, eukariotai
75
Augal virus satelitin RNR
VS
155
Neurospora spp.,
mitochondrij satelitin RNR
HDV
85
mogaus viruso satelitin RNR
Plauk
segtuko
iRNR
Trans skeliantys
Replikacija besisukanio
rato mechanizmu
Gen raikos valdymas
CoTC
Transkripcijos
terminacija
190
Bedions ir mogus
CPEB3
Splaisingo valdymas
70
induoliai
glmS
Gen raikos valdymas
170
Gram teigiamos bakterijos
RNaz P
tRNR brendimas
140500
Prokariotai ir eukariotai
Splaisingo ribozimai
I grup
Introno savaiminis
isikirpimas
200
1500
Organels (augalai, pirmuonys,

grybai), bakterijos, bakteriofagai, gyvn mitochondrijos
II grup
Introno savaiminis
isikirpimas
300
3000
Organels (augalai, pirmuonys,

grybai), bakterijos, archjos
Splaisosoma
(U2 ir U6 snRNR)
Pre-iRNR, turini intron, splaisingas
100; 180
Eukariotai
Ribosoma
(23 S rRNR)
Peptidiltransferazin
reakcija
2600
Prokariotai, eukariotai
Kiti
VS ribozimas yra ~150 nt ilgio ribozimas, esantis RNR molekulje, kuri kopijuojama nuo
Neurospora crassa mitochondrij plazmids.
domus yra gram teigiamose bakterijose aptinkamo glmS ribozimo veikimas. Fenomenas
buvo aptiktas Bacillus genties bakterijose. Ribozimas yra glmS geno iRNR molekuls sudtyje.
glmS genas koduoja ferment glutamino fruktozs 6-fosfato amidotransferaz. Fermentas katalizuoja reakcij, kurios metu i fruktozs 6-fosfato ir glutamino sintetinamas glukozamino 6-fosfatas (Glc6P), reikalingas peptidoglikano bakterij sienels komponento sintezei (2.35pav., a).
Ribozimas yra glmS iRNR netransliuojamoje 5 dalyje. Kai ligando Glc6P yra, jis prisijungia ribozimo aktyviajame centre, ribozimas gyja katalizikai aktyvi struktr (joje susidaro keli dvigubi
pseudomazgai), vyksta glmS iRNR sklimas (2.35pav., bc). Iaktyvinus iRNR, fruktozs 6-fosfato
amidotransferazs biosintez sustabdoma, kartu sustabdoma ir Glc6P sintez. Kai Glc6P trksta,
glmS iRNR esantis ribozimas nra aktyvus, iRNR neskaidoma, vl vyksta glmS iRNR sintez, gaminamas Glc6P. Taigi, Bacillus glmS ribozimas yra valdomas metabolito Glc6P. Ribozimas ypatingas
dar ir tuo, kad jis kartu veikia ir kaip nuo ligando priklausomas ribojungiklis glmS iRNR esanio
ribozimo struktra pakinta ir gali daryti tak glmS iRNR raikai tik prisijungus ligandui.
Pagal: Nature Reviews Genetics, v.8, p.777, 2007.
69
MOLEKULIN BIOLOGIJA
2.35pav. Bacillus athracis glmS ribozimo struktra ir veikimas. glmS iRNR raikos schema. Ribozim koduojanti dalis glmS iRNR 5 dalyje paymta raudonai (a); glmS ribozimo antrin struktra (b); glmS ribozimo
tretin struktra. Raudonuose apskritimuose parodytas ligandas GlcN6P ir glmS iRNR sklimo vieta; punktyrins linijos ymi svarbias sveikas tretinje struktroje (c) (Nature Reviews Genetics, v.8, p.778, 2007)
2.1.11. Ribojungikliai
Didel RNR molekuli struktr vairov lemia j funkcij vairov. Bakterijose kai kuri
iRNR molekuli, koduojani baltymus, 5 netransliuojamose dalyse rasti RNR domenai, sveikaujantys su maomis molekulmis ligandais ir galintys keisti iRNR raik. Tokios RNR vadinamos ribojungikliais. Daugelis inom ribojungikli valdo gen raik transkripcijos ateniuacijos mechanizmu arba slopina transliacijos iniciacij. Tam tikrose bakterijose ribojungikliai
valdo pakankamai didel gen dal. Ribojungikliai, reguliuojantys iRNR splaising ir stabilum,
rasti grybuose ir augaluose.
Vien ribojungiklio glmS, kuris veikia ir kaip riboRibojungikliai tai RNR molekuls,
zimas, pavyzd k tik aptarme. Ribojungikli veikikuri struktra pasikeiia, prie j prisimo mechanizmas paremtas alternatyvi ribojungijungus reguliacinms molekulms.
klio konformacij susidarymu, prie j konservatyvi
srii prisijungus metabolitui.
70
Ribojungiklius sudaro dvi dalys aptameras (angl. aptamer), prie kurio atrankiai jungiasi
reguliacin molekul (2.36pav.), ir raikos platforma (angl. expression platform) u aptamero
esanti RNR dalis, kuria valdoma geno raika (2.36pav.). Aptameras (<100nt) gali gyti alternatyvias erdvines struktras priklausomai nuo to, ar prie jo yra prisijungs ligandas ar ne, kartu
kintant raikos platformos struktrai, kuria valdoma geno raika.
Genai, kuri raika valdoma pasitelkiant ribojungiklius, danai koduoja to paties metabolito,
kuris sveikauja su ribojungikliu, biosintezs ar pernaos baltymus. Prisijungus metabolitui prie
ribojungiklio, transkripcija stabdoma ir tokiu bdu slopinama geno produkto (-), sintetinanio (-i) metabolit, raika. Slopinimas vyksta stabdant transkripcij arba slopinant susintetinto
transkripto iRNR transliacijos iniciacij. Retais atvejais ribojungikliai jungia transkripcij.
2.36pav. Tiamino pirofosfatu valdomo ribojungiklio veikimo schema (Annual Review Microbiology,
v.59, p.487, 2005)
2.36pav. parodyta metabolitu tiamino pirofosfatu (TPP) valdomo bakterij ribojungiklio

struktra ir veikimas. TPP valdom ribojungikli yra bakterijose, archjose, kai kuriuose eukariotuose. Jei nra prisijungusio ligando (TPP), bakterij geno iRNR, kurios 5 gale yra ribojungiklio struktra, yra transliuojama, nes ribosom prisijungimo vieta, RBS (angl. ribosome binding
site), yra prieinama ribosomoms. TPP atrankiai jungiasi prie ribojungiklio aptamero. Prisijungimas keiia aptamero struktr, keiiasi ir raikos platformos struktra. Raikos platformoje
esanti ribosom prisijungimo sritis susilanksto antrin struktr ir tampa neprieinama ribosomoms. Transliacija stabdoma.
I viso inoma apie 10 ribojungikli klasi. Reguliacins molekuls, kurios jungiasi prie ribojungikli aptamer, gali bti metabolitai aminorgtys, heterociklins bazs, kofermentai. Ribojungikli aptamero dalis susilanksto labai savit erdvin struktr, kurioje yra ligando prisijugimo kien (angl. pocket). Yra inoma ribojungikli, prie kuri jungiasi metal jonai, taip pat
ribojungikli, valdom temperatra (RNR termometrai), pH, kit ma RNR, tRNR (2.8lentel).
71
MOLEKULIN BIOLOGIJA
2.8lentel. Gamtiniai ribojungikliai ir j savybs5

Ribojungikli
klas
RNR
termometrai
sRNR
T duts
Metabolitais
valdomi
ribojungikliai
Grup
Dydis
(nukleotidais)
vairus
TPP*
Maos RNR
tRNR
TPP*
>85
190
100
FMN*
Ado-Cbl*
SAM*-I
FMN*
AdoCbl*
SAM*
120
200
105
SAM*
60
SAM*
Lizinas
80
175
Glicinas
110
Bakterijos
Guaninas,
hipoksantinas
Adeninas
70
70
Gram teigiamos
bakterijos
Bakterijos
Pre-Q*
35
Bakterijos
Narys
Pagrindin
funkcija
Temparatra valdomi
Kofermentais
valdomi
SAM*-II
Aminorgtimis
valdomi
Heterociklinmis
bazmis
valdomi
SAM*-III
Lizino
valdomi
Gen
raikos
valdymas
Glicino
valdomi
Guanino
valdomi
Adenino
valdomi
Pre-Q*
valdomi
mgtA
Gamtinis
ligandas
Paplitimas
Bakteriofagai, bakterijos,
eukariotai
Bakterijos
Bakterijos
Bakterijos, archjos, eukariotai (grybai ir augalai)
Bakterijos
Bakterijos
Gram teigiamos
bakterijos
a ir b proteobakterijos
Gram neigiamos bakterijos
g proteobakterijos,
Thermotogales, Firmicutes
70
Gram neigiamos bakterijos
Mg valdomi
Mg2+
ribojungikliai
*Ado-Cbl adenozino kobalaminas; FMN flavino mononukleotidas; pre-Q pre-kuezinas; SAM S-adenozilmetioninas; TPP tiamino pirofosfatas.
Daugelio Bradyrhizobium japonicum ir kit Rhizobia genties bakterij temperatrinio streso

gen raika valdoma pasitelkiant konservatyv RNR element ROSE (angl. repression of heat
shock gene expression). ROSE yra temperatrai jautrus ribojungkilis RNR termometras. Ribojungiklio struktra jautri temperatros pokyiams 3040 intervale. Esant emesnei temperatrai, iRNR transliacijos iniciacija slopinama dl susidariusios antrins struktros transkripte.
Esant auktesnei temperatrai, antrin struktra suyra, ir iRNR tampa prieinama transliacijai.
Panaiu bdu yra valdoma E. coli temperatrinio streso savitojo transkripcijos veiksnio, s32
(RpoH), sintez.
2.1.12. Genomai
1970m. Karlas Vos (Carl Woese) su kolegomis palygino vairi eukariot ir prokariot 16S
rRNR nukleotid sekas. ios molekuls yra vieni esmini ribosomos struktrini ir funkcini
komponent, j nukleotid sekos evoliucionuoja ltai. Todl buvo padaryta prielaida, kad or Pagal: Nature Reviews Genetics, v.8, p. 777, 2007.
72
ganizmai, kuri 16S rRNR nukleotid sekos panaesns, yra evoliucikai artimesni. Remdamiesi 16S rRNR sekomis, mokslininkai sudar organizm filogenetinius medius. Paaikjo, kad
prokariotai sudar dvi pagrindines akas vienoje buvo prastos bakterijos, o kitoje mikroorganizmai, gyvenantys ekstremaliomis slygomis. i grup buvo pavadinta archjomis. Archj
16S rRNR analiz atskleid, kad jos labiau panja eukariotus nei prokariotus. Itobuljus
DNR sekoskaitos metodams, nustatytos tkstani organizm genom sekos. Aikja, kad genom dydiai ir j koduojam gen skaiius organizmuose labai skiriasi (2.37pav., 2.9lentel).
2.37pav. vairi organizm genom dydiai ir baltymus koduojani gen skaiius (L. A. Allison.
Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012)
Genomus pagal j dyd galima suskirstyti dvi grupes:

zz maus virus, archj, bakterij (<10Mb) ir vienalsi eukariot (<20Mb) genomus;
didiaj j dal sudaro baltymus ir RNR koduojantys genai;
zz didelius daugialsi eukariot ir kai kuri vienalsi eukariot (>100Mb) genomus;
didioji dalis genomo nukleotid sek yra gen nekoduojanios sekos.
Taiau ie dsningumai turi nemaai nukrypim. Pvz., miliniko ameb infekuojanio mimiviruso genomo dydis yra 1,2Mb ir prilygsta vidutinio bakterijos genomo dydiui, o simbion
tin bakterija Carsonella rudii turi tik ~200 gen. mogaus genomas nra pats didiausias tarp
eukariot, didesnius genomus turi kai kurie augalai, pirmuonys. Taigi, nra tiesiogins priklausomybs tarp genomo dydio ir organizmo fenotipo sudtingumo. Tai yra vadinamasis Ckiekio paradoksas. C (angl. constant) kiekis yra organizmo haploidinio genomo DNR kiekis, daniausiai ireikiamas pikogramais.
73
MOLEKULIN BIOLOGIJA
2.9lentel. Kai kuri organizm genom dydis ir gen skaiius

Organizmas
Ris
Genomo dydis (nukleotid por skaiius)
Gen skaiius
Carsonella rudii
Bakterija
160000
182
Escherichia coli
Bakterija
4640000
4377
Pyrococcus horikoshii
Archja
1740000
2000
Saccharomyces cerevisiae
Miel
12100000
6034
Caenorhabditis elegans
Kirml
100000000
19820
Arabidopsis thaliana
Vairenis
135000000
27407
Drosophila melanogaster
Vaisin musel
123000000
17000
Gallus gallus
Viiukas
1200000000
~2000030000
Homo sapiens
mogus
3400000000
~30000
Mus musculus
Pel
3454200000
~23000
Pan troglodytes
impanz
3600000000
~2200025000
Pinus resinosa
Puis
68000000000
~30000
Amoeba dubia
Ameba
670000000000
Nenustatyta
Nustaius daugelio organizm genom nukleotid sekas paaikjo, kad didioji dalis eukariot genomo sudaro vairios pasikartojanios sekos, kilusios i judrij element, pvz., transpozon. mogaus genome tik ~40% genomo koduoja genus ir genus panaias sekas, i j
~2% gen koduoja baltymus, lik ~38% maas nekoduojanias RNR, gen fragmentus,
intronus, netransliuojamsias sritis (angl. untranslated regions, UTRs), pseudogenus. Pseudogenai yra DNR sekos, panaios tikrus genus, taiau pakitusios taip, kad j raika nevyksta.
Likusi mogaus genomo dalis (~60%) yra tarp gen esanios DNR sekos tarpgenins sritys.
Sekose yra unikali, taip pat maai pasikartojani sek ir vidutiniu daniu bei danai pasikartojani sek. Kai kuri eukariot genomai yra kompaktikesni, pvz., viiuko genome tik 10%
sek yra pasikartojanios.
74
2.2. Baltym molekulin struktra

Mikroskopu irdami lstel ar tirdami jos biochemin aktyvum, mes i tikrj tiriame
baltymus. Baltymai sudaro didesnij dal sausosios lsteli mass.
Baltymai (angl. protein, kils i gr. proteios pirmas, ypatingos svarbos) yra biologins makromolekuls, pasiyminios daugybe funkcij. Tipin induoli lstel turi ~10000 baltym,
atliekani skirtingas funkcijas. Baltymai dalyvauja visuose biologiniuose procesuose. Savitieji
baltymai fermentai labai greitina metabolines reakcijas; struktriniai baltymai sukuria mechanin lsteli atram j viduje ir paviriuje, ryius tarp lsteli; baltymai hormonai, augimo
veiksniai ir gen veikl valdantys baltymai atlieka valdymo funkcijas. Bdami membran receptoriais ir neikliais, baltymai lemia, k reaguos lstel, kokios mediagos j paklius ir i jos
ieis. Antiknai ir toksinai taip pat yra baltymai.
Kaip vieno tipo makromolekuls gali atlikti tiek skirting funkcij? i savyb lemia tai,
kad baltymai gali bti vairiausi struktr. Cheminiu poiriu baltymai yra sudtingiausios
struktros ir vairiausi funkcij inomos molekuls. Jas baltym molekuls gijo per milijonus
evoliucijos met.
Kiekvienas konkretus baltymas pasiymi savita struktra, kuri lemia baltymo funkcij lstelje. Savitos struktros baltymai labai atrankiai (specifikai) sveikauja su kitomis biologinmis
molekulmis. Atranki sveika su kitomis molekulmis yra esmin baltym savyb. Pvz.,
fermentas restrikcijos endonukleaz NotI atrankiai sveikauja su savita atuoni nukleotid seka DNR moleBaltymai yra linijiniai polimerai, sukulje ir j skelia, taiau ignoruoja kitas 65535 atuodaryti i monomer aminorgi.
ni nukleotid kombinacijas DNR sekoje!
Baltym sudaro vienas ar daugiau linijini polimer polipeptid. Polipeptiduose aminorgtys viena su kita yra sujungtos peptidiniais ryiais. Aminorgtys,
Kiekvienas baltymas turi savit aminorgi sek. Amiesanios polipeptid sudtyje, vadinorgi kiekis, j savybs ir seka lemia baltymo savybes.
namos aminorgi liekanomis.
2.2.1. Aminorgi savybs

Gamtoje aptinkama ~700 skirting aminorgi, taiau vis organizm (virus, bakterij,
augal, gyvn) baltymai sintetinami i 20-ies svarbiausi aminorgi (2.38 pav.). Jos dar
vadinamos standartinmis aminorgtimis. Pastaraisias metais aptiktos dvi naujos aminorgtys selenocisteinas ir L pirolizinas, kurios jungiamos baltym biosintezs metu tam tikr
baltym sudt (r. skyri Baltym biosintez).
Pavadinimas aminorgtis puikiai nusako i molekuli chemin prigimt:
Aminorgtys yra organins karboksirgtys, kuriose bent vienas anglies atom grandins atomas pakeistas aminogrupe.
75
MOLEKULIN BIOLOGIJA
2.38pav. Standartini aminorgi struktra. Pateiktos jonizuot aminorgi molekuli struktros, triraidiai ir vienraidiai simboliai
76
Kiekviena baltym sudt einanti aminorgtis turi tipik struktr: aminogrup (-NH2)
ir karboksigrup (-COOH), kovalentiniu ryiu sujungtas su C atomu, dar vadinamu anglies
atomu (Ca) (graikika raid ties anglies atomu nurodo jo pozicij karboksigrups anglies ato
mo atvilgiu) (2.39 pav., a). Ties Ca atomu yra dar prijungtas vandenilio (H) atomas ir savita
kiekvienai aminorgiai onin grup, R (2.39pav., b). onins grups aminorgtyse skiriasi
savo dydiu, krviu, chemine sudtimi (2.38pav.). Ties anglies atomu prijungtos grups vadinamos grupmis, pvz., karboksigrup, aminogrup ir t. t.
2.39pav. Aminorgi struktra. Abclinis (graikiko raidyno) anglies atom ymjimas organinje
karboksirgtyje. Ties Ca atomu yra prijungta aminogrup (a); aminorgties struktra (R onin grup; aminorgtis pavaizduota su jonizuotomis karboksi- ir aminogrupmis) (b)
Tarp 20-ies baltymus sudarani standartini aminorgi yra kelios, kuri struktra skiriasi nuo tipikos: aminorgties prolino onin grup yra dar papildomu kovalentiniu ryiu
sujungta su aminogrups azoto atomu ir sudaro iminogrup (2.38pav.). Glicino aminorgtis R padtyje prie anglies atomo turi prijungt vandenilio atom. Aminorgtys ymimos
trij raidi arba vienraidiais simboliais pagal Tarptautins teorins ir taikomosios chemijos
sjungos (International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC) rekomendacijas (http://
www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/) (2.38pav.).
Visose aminorgtyse, iskyrus glicin, anglies atomas yra asimetrikas visos ties iuo
atomu prijungtos grups yra skirtingos. Molekuls, turinios asimetrijos centr, arba chiralin
atom, neturi simetrijos aies ir vadinamos chiralinmis molekulmis. Visos baltymus sudaranios aminorgtys, iskyrus glicin, yra chiralins molekuls. Aminorgtys treoninas bei
izoleucinas turi du chiralinius atomus.
Chiralini molekuli erdvins formos vadinamos stereoizomerais. Steroizomerai gali bti
dviej tip: enantiomerai ir diastereomerai. Enantiomer chemins formuls yra vienodos,
taiau prie chiralinio atomo prijungtos grups skiriasi savo isidstymu erdvje, panaiai kaip
daiktas ir jo atspindys veidrodyje (2.40pav., a). Tokios stereoizomerijos pavyzdiai yra dein ir
kair rankos, vartai su deinio ir kairio sukimo sriegiais ir t. t. (2.40 pav., b). Diastereomerai ia
savybe nepasiymi.
Molekuls su vienu chiraliniu atomu turi du enantiomerus. Enantiomer savybs yra vienodos, iskyrus tai, kad j molekuls skirtinga kryptimi suka poliarizuot vies jos yra optikai
aktyvios, todl kartais yra vadinamos optiniais izomerais (2.40pav., a).
Visos aminorgtys, iskyrus glicin, turi 2 enantiomerus L-aminorgt (lot. laevo kair) ir D-aminorgt (lot. dextro dein). Aminorgtys, kurios lstelje jungiamos baltymus biosintezs proceso metu, visuomet yra L aminorgtys. D aminorgtys gamtoje yra
77
MOLEKULIN BIOLOGIJA
gana retos. Toks stereoizomer pasirinkimas nra aikus, svarstoma, ar jis yra evoliucijos rezultatas ar yra atsitiktininis. Pvz., meteorituose aptinkamos aminorgtys yra racematai L- ir
D-aminorgi miiniai.
2.40pav. Aminorgi chiralikumas. Vien chiralin atom turinios aminorgties stereoizomerai

(enantiomerai) (a); stereoizomer pavyzdiai (b); optikai aktyvi molekuli gebjimas sukti poliarizuotos viesos ploktum (c) (http://en.wikipedia.org/wiki/Chirality_(chemistry))
Mikroorganizmai tam tikr ma peptid (lstels sienels peptid, antibiotik gramicidino A,
valinomicino, aktinomicino D) sintezei naudoja ir D-aminorgtis. Pvz., jon kanal sudaranioje bakterijos Bacillus brevis 15 aminorgi gramicidino molekulje L aminorgtys kaitaliojasi su D-aminorgtimis. Tai utikrina, kad vidiniame kanalo paviriuje isidstyt polins aminorgi grups.
78
D-aminorgi rasta peptiduose, esaniuose moliusk, gyvai, vor nuoduose. domu tai, kad
nuod stiprumas susijs su D-aminorgi buvimu peptiduose. Piet Afrikos medvarls odoje sintetinamas D-alanin turintis peptidas pasiymi tkstant kart stipresniu poveikiu nei morfinas. Pakeitus
D-aminorgt L-aminorgtimi, junginio poveikis tampa ymiai silpnesnis. Savitieji fermentai (peptid izomeraz) L-aminorgtis jau susintetintuose peptiduose veria D-aminorgtimis.
D-serinas aptiktas mogaus smegenyse. ia jis dalyvauja signal perdavimo procese ir neurodegeneracijoje. i aminorgtis rasta amiloiduose, kurie susidaro smegenyse sergant Alzheimerio liga.
iuolaikiniais metodais buvo susintetinti baltymai, sudaryti i D-aminorgi. ios molekuls
buvo gamtini molekuli veidrodiniai atspindiai. Pvz., mogaus imunodeficito viruso (IV) peptidaz,
susintetinta i D-aminorgi, hidrolizavo baltymus, sudarytus taip pat i D-aminorgi.
Aminorgtys yra silpnos rgtys / bazs. Vandeniniuose tirpaluose, kur pH 7,5, aminorgi karboksigrup netenka protono (elgiasi kaip rgtis) ir gyja neigiam krv (-COO-),
o aminogrup prijungia proton (elgiasi kaip baz) ir gyja teigiam krv (-NH3+) (2.41pav.).
Tokia aminorgties molekul yra cviterjonas. Stipriai rgtinje terpje a karboksigrup ir
a aminogrup yra protonizuotos, aminorgtis virsta katijonu. Stipriai arminje terpje abi
grups netenka protono, todl aminorgties molekul virsta anijonu (2.41pav.).
Aminorgi rgtines ir bazines savybes aprao ios lygtys:
-
[ ] [A ]
[]
+
Ka =
pKa= -log 10 Ka
pH = -log 10 [H ]
pH = pKa + log 10
[A ]
[] .
2.41pav. Aminorgi jonizacija (http://met.fzu.edu.cn/eduonline/chemistry/english/bjkc/jawd2.html)
79
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Kiekviena rgtis [HA] turi jai bding disociacijos konstant, Ka, kuri aprao protono [H+]
perna nuo rgties molekuls prie vandens molekuls. Tas pats tinka ir aminorgtims. Patogumo dlei naudojamos ne disociacijos konstantos, bet jos deimtainio logaritmo, pKa, skaitins reikms (2). Hendersono-Haselbalcho lygtis (4) sieja tirpalo pH ir disociacijos konstantos
logaritm, pKa. Tarkime, silpna rgtis, kurios pKa=4,0, itirpinama buferyje, kurio pH yra 7,0. Atlik skaiiavimus 4-oje lygtyje, pamatysime, kad tirpale bus 1000 kart daugiau rgties molekuli, netekusi protono [A-], nei molekuli, turini proton [HA]. Kuo didesnis tirpalo pH, tuo
daugiau disocijavusi rgties molekuli yra tirpale. Kai pH artimas 7,0, rgtys, kuri pKa>7,0,
tirpale yra nedisocijavusios [HA]. O rgtys, kuri pKa<7,0, yra disocijuotos formos [A-].
Aminorgi karboksigrups pK1 yra ~2,40,5, aminogrups pK2 yra ~9,60,5. Kintant
tirpalo pH, keiiasi ne tik aminorgi karboksi- ir aminogrupi jonizacija. Jonizuotis gali ir kai
kuri aminorgi onins grups, R.
Aminorgi onini grupi, R, pKR reikms pateiktos 2.10lentelje.
2.10lentel. Aminorgi onini grupi pKR reikms
Aminorgtis
onins grups pavadinimas
pKR
Argininas
Guanidino-
12,5
Asparto aminorgtis
g karboksi-
3,9
Cisteinas
Merkapto-
8,3
Glutamo aminorgtis
d karboksi-
4,2
Histidinas
Imidazolo-
6,0
Lizinas
Amino-
10,0
Serinas
Hidroksi-
13,0
Treoninas
Hidroksi-
13,0
Tirozinas
Hidroksi-
10,1
Disocijuojanios aminorgi liekan onins grups lemia peptid ir baltym molekuls

sumin krv (vis molekulje esani krvi algebrin sum). Keiiantis tirpalo pH, keiiasi ir
molekuls suminis krvis. Tirpalo pH, kai jame esanios baltymo molekuls suminis krvis yra
lygus nuliui, vadinamas izoelektriniu taku, pI. Nuliniu suminiu krviu pasiyminti baltymo
molekul nejuda elektriniame lauke. Aminorgi karboksi- ir aminogrups baltymuose dalyvauja sudarant peptidinius ryius ir nedaro takos suminiam baltym molekuls krviui.
2.2.2. Peptidinis ryys ir jo savybs

Polipeptidinje grandinje aminorgtys tarpusavyje sujungtos peptidiniu ryiu, jungianiu vienos aminorgties karboksigrup su kitos aminorgties aminogrupe. Peptidinis ryys cheminiu poiriu yra amidinis ryys (amidas susidaro reaguojant aminui ir aktyvintai karboksigrupei). Lstelje peptidinis ryys susidaro ribosomoje reaguojant vienos aminorgties
karboksigrupei su kitos aminorgties a aminogrupe.
80
Aminorgi jungimasis yra kondensacijos reakcija. Susidarant ryiui tarp aminorgi

karboksi- ir aminogrupi, eliminuojama vandens molekul (2.42pav., a). Peptidinio ryio susidarymas vandeninje terpje nra termodinamikai palankus. Pusiausvyra greiiau nusistovi io ryio hidrolizs
pusn. Taiau savaiminis hidrolizs greitis yra labai nediPeptidinis ryys yra kovalentinis
delis: peptidinio ryio skilimo pusperiodis, kai pH 7,0, yra
ryys, susidarantis tarp vienos
~7 metai. Lsteli fermentai peptidazs greiiau suskaido
aminorgties karboksigrubaltym peptidinius ryius, nei jie suskyla savaime.
ps ir kitos aminorgties
Gamtoje peptidiniam ryiui susidaryti baltym biosinaminogrups.
tezs metu naudojama energija hidrolizuojant didiaenergius junginius: ATP, GTP (r. skyri Baltym biosintez).
Susidarius peptidiniam ryiui, aminorgtys netenka anksiau turt karboksi- ir aminogrupi, todl polimero sudtyje jos vadinamos ne aminorgtimis, o aminorgi liekanomis.
Daugelis gamtini peptid sudaryti i 502000 aminorgi liekan (Mw > 5000 Da). Jie vadinami polipeptidais, arba baltymais. Ilgiausi inom gamtoje polipeptidin grandin turi
raumen baltymas titinas, sudarytas i ~27000 aminorgi. Peptidai, sudaryti i maesnio
skaiiaus (<50) aminorgi liekan, vadinami oligopeptidais, arba tiesiog peptidais.
Vidutin peptidus sudarani aminorgi liekan santykin molekulin mas yra
~110Da. Baltym molekulinei masei ireikti yra naudojami atomo mass vienetai daltonai,
Da (vieneto pavadinimas kils i mediagos atomins teorijos krjo Dono Daltono (John Dalton) pavards). Vienas daltonas prilygsta vienam atomo mass vienetui. Atomo mass vienetas
beveik lygus vandenilio atomo masei (1,66x10-24g).
2.42pav. Peptidinio ryio susidarymas. Dviej aminorgi

kondensacijos reakcija (a); pentapeptido Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu
(serilgliciltirozilalanilleucino)
struktra (b) (http://www.
biochem.arizona.edu/classes/
bioc462/462a/NOTES/Amino_
Acids/amino_acids.htm)
81
MOLEKULIN BIOLOGIJA
2.11lentel. vairi baltym aminorgi kiekis, molekulin mas, polipeptidini grandini

skaiius
Baltymas
Molekulin mas, Da
Aminorgi
skaiius
Polipeptidini grandini skaiius
Citochromas c (mogus)
13000
104
Ribonukleaz A (jautis)
13700
124
Lizocimas (vitos kiauinis)
13930
129
Mioglobinas (arklys)
16890
153
Chimotripsinas (jautis)
21600
241
Hemoglobinas (mogus)
64500
574
Serumo albuminas (mogus)
68500
609
Heksokinaz (miels)
102000
972
RNR polimeraz (E. coli)
450000
4158
Apolipoproteinas B (mogus)
513000
4536
Glutamino sintetaz (E. coli)
619000
5628
12
Titinas (mogus)
2993000
26926
Peptidin grandin viename gale turi aminorgt su laisva, t. y. nedalyvaujania peptidiniame ryyje, aminogrupe. is polipeptidins grandins galas yra aminogalas, arba N galas.
Kitas polipeptidins grandins galas turi aminorgt su laisva karboksigrupe. is galas yra
karboksigalas, arba C galas (2.42pav., b). Rasta oligopeptid, kuri N ir C galai yra sujungti.
Tokie, pvz., yra (teta) defenzinai vieninteliai cikliniai oligopeptidai gyvn (bedioni) organizmuose. Jie yra gimto imuninio atsako dalis.
Daugelio baltym N galai yra modifikuojami jungiant N formil- ir N acetilgrupes. Kai kurie
baltymai turi ir modifikuot C gal.
Polipeptidins grandins sintez lstelse prasideda nuo N galo, o baigiasi C galu. Baltym
aminorgi seka raoma pradedant N galu ir baigiant C galu, i kairs dein (2.42pav., b).
Peptido pavadinimas sudaromas i aminorgi pavadinim pridedant priesag -il. Pradedama nuo N galo, baigiama paskutinija aminorgtimi, esania C gale. Jos pavadinimas nra
keiiamas (2.42pav., b).
Peptidinio ryio savybs. 1940 m. L. Polingas ir R. Koris, atlik aminorgi rentgeno
struktrin analiz, nustat peptidinio ryio struktrines savybes. Peptidiniame ryyje dalyvaujaniuose CONH atomuose, vadinamojoje peptidinje (amidinje) grupje, nepadalintoji
azoto atomo p elektron pora konjuguoja su karbonilgrups dvigubojo ryio >C=O elektronais. Susidaro konjuguotoji sistema. Dl konjugacijos peptidinje grupje vyksta chemini
ryi ilgi pokyiai. Dvigubasis ryys karbonilgrupje >C=O yra ilgesnis u prast (0,124nm), o
amidinis -C-N ryys trumpesnis u prast (0,145nm) (2.43pav., a).
Peptidins grups konjuguotosios sistemos C, O, N atomai yra vienoje ploktumoje, o
elektron tankis yra pasislinks elektroneigiamo deguonies atomo link. Dl tokio elektron
pasiskirstymo peptidinis ryys yra i dalies dvigubasis. Elektron tankio pasiskirstym peptidinje grupje galima aprayti rezonansinmis struktromis (2.43 pav., ac). Tiesa, labiau
prasta peptidinio ryio formul rayti su viengubuoju -C-N ryiu (2.43pav., a).
82
2.43pav. Peptidinio ryio rezonansins struktros
Dl konjuguotos sistemos susidarymo ir i dalies dl dvigubojo peptidinio ryio sukimasis

apie ry yra negalimas. Peptidin grup isidsto vienoje ploktumoje (2.44pav., a). Taigi,
polipeptidin grandin yra tarsi sudaryta i daugelio peptidini grupi ploktum, tarpusavyje
sujungt per Ca (Ca1, Ca2 ir t. t.) atomus Ca-- ir N-Ca- ryiais. Apie iuos viengubuosius ryius
ploktum sukimasis yra galimas. is sukimasis apibdinamas dihedriniais (torsiniais) (psi)
(apie Ca--) ir (fi) (apie N-Ca-) kampais (2.44pav., bd).
Polipeptidins grandins isidstym erdvje ties kiekviena aminorgties liekana galima apibdinti iais
Sukimasis apie viengubuosius
kampais. Teorikai ie kampai gali bti tarp 180 ir +180.
peptidins grups ryius slySukimsi i dalies riboja onini grupi dydis ir gebjimas
goja vair baltym isidstym
isidstyti erdvje. Nustatyta, kad dl erdvini susidrierdvje.
m tarp atom ne visos padtys yra galimos, t. y. du atomai negali bti toje paioje vietoje tuo paiu metu. Galimas ir negalimas konkreios peptidins grandins erdvines padtis, atsivelgiant atstumus
tarp atom, aprao Ramaandrano diagrama (angl. Ramachandran plot / diagram). ie erdviniai ribojimai galiausiai ir lemia polipeptidins grandins isidstym erdvje.
Plokios erdvins struktros peptidin grup dipeptide gali egzistuoti dviem konfigracijomis: cis ir trans. Cis konfigracijoje Ca1 ir Ca2 atomai yra toje paioje C-N ryio pusje. Trans
konfigracijoje Ca1 ir Ca2 atomai yra isidst prieingose C-N ryio pusse (2.44pav., e). Daugumai peptidini ryi trans konfigracija (dl erdvini susidrim) yra ~1000 kart stabilesn
nei cis konfigracija. Kristalografine analize baltymuose yra nustatoma apie 1% cis konfigracijos peptidini ryi. Peptidinis ryys, kuriame dalyvauja prolinas (X-Pro), labiau links gyti
cis konfigracij, nes iminogrup neturi vandenilio atomo, kuris galt erdvje susidurti su
deguonies atomu (2.44pav., e).
Tai, kad peptidinis ryys yra i dalies dvigubasis, lemia kit labai svarbi jo savyb: peptidinis ryys yra polinis. Ties peptidins grups deguonies atomu yra sutelktas dalinis neigiamas krvis, o ties azoto atomu dalinis teigiamas krvis (2.43pav., bc). Taigi, peptidinis
ryys yra krvi dipolis. i peptidinio ryio ypatyb lemia tai, kad ryio atomai dalyvauja sudarant vandenilinius ryius, kurie yra labai svarbs auktesniems baltym struktros lygmenims
susidaryti.
83
MOLEKULIN BIOLOGIJA
2.44pav. Peptidinio ryio struktra. Atstumai tarp atom peptidiniame ryyje ir peptidins grups
erdvin struktra (a); peptidins grandins erdvin struktra (b) (T. E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecular Principles, second edition, 1993); sukimasis apie y (a-C) ir f (N-a) ryius (taip pat parodytas
ir b) (cd); peptidinio ryio cis ir trans konfigracijos (e) (J. M. Berg, J. L. Tymoczko, L. Stryer, Biochemistry,
seventh edition, 2012)
2.2.3. Aminorgi onins grups

Savitas baltym chemines ir fizikines savybes didija dalimi lemia aminorgi onini
grupi savybs. Pastaruoju metu naudojamos kelios aminorgi klasifikacijos pagal j onini grupi struktr ir savybes, taiau n viena j nra visikai isami. Patogiausioje ir populia-
84
riausioje klasifikacijoje aminorgtys skirstomos atsivelgiant j polines savybes. Remiantis

ia klasifikacija, aminorgi onins grups skirstomos dvi grupes:
zz nepolines (hidrofobines);
zz polines (hidrofilines):
zz krvio neturinias polines;
zz krv turinias polines:
zz teigiam krv turinias polines;
zz neigiam krv turinias polines.
Nepolins (hidrofobins) aminorgtys. iai grupei priskiriamos glicino (Gly), prolino
(Pro), leucino (Leu), alanino (Ala), fenilalanino (Phe), metionino (Met), valino (Val), triptofano
(Trp) ir izoleucino (Ile) aminorgtys (2.38pav.). Aminorgi onins grups yra hidrofobikos, blogai tirpsta vandenyje. Jos nesudaro elektrostatine sveika paremt ryi, nesveikauja
su vandens molekulmis. onins grups skiriasi savo dydiu, baltym erdvinje struktroje
jos isidsto vidinje molekuls pusje, sveikaudamos tarpusavyje Van der Valso ryais ir hidrofobine sveika.
Hidrofobins aminorgtys dar skirstomos alifatines ir aromatines, priklausomai nuo onins grups struktros.
zz Hidrofobini aromatini aminorgi fenilalanino ir triptofano onins grups
struktroje yra benzeno iedas (2.38pav.).
zz Hidrofobini alifatini aminorgi prolino, glicino, leucino, alanino, valino ir izoleucino onins grups sudarytos tik i anglies ir vandenilio atom. Kuo ilgesn angliavandenilin grandin, tuo aminorgtis hidrofobikesn. Metionino onins grups sudtyje yra sieros atomas, taiau onin grup ilieka hidrofobika (2.38pav.).
Krvio neturinios polins aminorgtys. iai grupei priskiriamos serino (Ser), treonino
(Thr), asparagino (Asn), cisteino (Cys), tirozino (Tyr), glutamino (Gln) aminorgtys. Aminorgi onini grupi sudtyje yra deguonies, sieros ir / ar azoto atomai. Taiau onins grups
nepasiymi jonizacinmis savybmis, jos neturi krvio.
Teigiam krv turinios polins aminorgtys. iai grupei priklausanios amino rgtys
lizinas (Lys), argininas (Arg) ir histidinas (His) yra ne tik polins, bet ir fiziologinmis slygomis
turi teigiam krv, kur suteikia j onins grups. Dl krvio onins grups sudaro joninius
ryius su kitomis krautomis molekulmis. Lizino ir arginino onini grupi pKa yra ~10, todl
fiziologinmis slygomis jos turi teigiam krv. Histidino onins grups pKa=6,5. Fiziologinmis slygomis ios grups jonizacija labai priklauso nuo artimiausios aplinkos. i savyb lemia
histidino aminorgties liekanos svarb ferment katalizei, ji neretai yra ferment aktyviajame
centre, dalyvauja kaip H+ donoras ar akceptorius.
Neigiam krv turinios polins aminorgtys. iai grupei priklauso aspartatas (Asp)
ir glutamatas (Glu), kuri onins grups turi karboksigrup. i grup fiziologinmis slygomis yra jonizuota, pasiymi neigiamu krviu (dmesio: nejonizuotos formos ios aminorgtys
85
MOLEKULIN BIOLOGIJA
vadinamos glutamo aminorgtimi ir asparto aminorgtimi). O asparto ir glutamo aminorgi amidai asparaginas ir glutaminas fiziologinmis slygomis krviu nepasiymi. ios
aminorgtys priskiriamos krvio neturinioms polinms aminorgtims.
2.2.4. Baltym erdvins struktros susidarymui svarbs

nekovalentiniai ir kovalentiniai ryiai
Galimyb suktis atomams apie tam tikrus peptidins grandins ryius suteikia grandinei
lankstumo. Dl io lankstumo peptidin grandin turt erdvje isidstyti kaip atsitiktin
grandin (angl. random coil). Ji galt gyti daugyb erdvini struktr, kuri laisvoji energija
yra panai. Taiau gamtoje kiekvienas baltymas gyja vienintel erdvin struktr konformacij, kurios laisvoji energija yra minimali. Konformacij suprantame kaip molekuls atom
trimat isidstym erdvje.
Konkreti maksimaliai stabili baltymo konformacija susidaro dl atskir peptidins grandins atom ir atom grupi tarpusavio sveikos bei j sveikos su tirpalo molekulmis. Didioji
dauguma i sveik yra silpni nekovalentinio tipo ryiai:
zz Hidrofobin sveika tarp nepolini (hidrofobini) aminorgi liekan. Hidrofobin
sveika labiausiai veikia baltymo molekuls stabilum.
Nepolins molekuls neturi nei jon, nei ryi, kuriems bdingas krvi dipolis, todl jos
nra hidratuotos; kitaip tariant, yra netirpios arba beveik netirpios vandenyje. Tokios molekuls
vadinamos hidrofobinmis. O polins molekuls sveikauja su polinmis vandens molekulmis. Jos yra hidrofilins.
Angliavandeniliai tai molekuls, sudarytos i anglies ir vandenilio atom. Jos yra hidrofobins, t. y. beveik netirpios vandenyje. Angliavandeniliai sudaro biologini membran vidin
sluoksn.
Jgos, skatinanios hidrofobines molekules arba nepolines molekuli dalis vandenyje agreguoti, kitaip tariant, kuo labiau sumainti slyt su vandens molekulmis, vadinamos hidrofobine sveika, tiksliau hidrofobiniu efektu. Tai i tikrj ne sveika, o termodinaminis efektas.
Jis atsiranda istmus vandens molekules i hidrofobini molekuli tarpo. Kodl vyksta toks
procesas? Patalpinus hidrofobines molekules vanden, j paviriuje susidaro tvarkingas vandens molekuli sluoksnis (2.45pav.). Taiau toks vandens molekuli isidstymas (klatratai) ant
hidrofobini molekuli paviriaus yra tvarkingesnis (t. y. jam bdinga maesn sistemos entropija) nei vandens molekuli tarpusavyje sudaromas vandenilini ryi tinklas (kuriam bdinga
didesn sistemos entropija). Todl hidrofobins molekuls agreguoja tarpusavyje, istumdamos dal vandens molekuli aplink ir taip maindamos pastarj galimyb sudaryti labiau
tvarking, taigi, ir energetikai imlesn struktr.
Baltym molekulse hidrofobin sveika atsiranda, kai tarpusavyje sveikauja nepolini
aminorgi valino, leucino, izoleucino, alanino, metionino, fenilalanino, triptofano onins
grups. Vandeninje terpje toki aminorgi liekan onins grups isidsto polipeptido
viduje.
86
2.45pav. Ryiai baltym molekulje. vairios sveikos polipeptidinje grandinje (viruje); hidrofobin
efekt iliustruojanti schema (apaioje) (T. D. Pollard, W. C. Earnshaw, J. Lippincott-Schwartz, Cell Biology,
second edition, 2007)
87
MOLEKULIN BIOLOGIJA
zz Vandenilinis ryys. Ry sudaro vandenilio (H) atomas, esantis tarp dviej elektroneigiam atom (2.45pav.).
Vienas i elektroneigiam atom (donoras) sudaro kovalentin ry su vandenilio atomu
(pvz., -NH, -OH) ir pritraukia vandenilio atomo elektron savo pus, todl pastarasis gyja dalin teigiam krv (tampa beveik protonu) ir j ima traukti kitas elektroneigiamas atomas (akceptorius, pvz., O, N). Tokiu bdu, vandenilio atomas yra ryyje su dviem atomais, nors jo elektronas
gali dalyvauti tik viename kovalentiniame ryyje. Biologinse molekulse vandenilinius ryius
sudaro vandenilio atomai, kovalentiniu ryiu sujungti su O (O-H) arba N (N-H) atomais, o akceptoriai daniausiai yra N arba O atomai. Vandenilinio ryio energija yra apie 37kcal/mol. Ryys
stipriausias, kai visi trys ryyje dalyvaujantys atomai yra vienoje linijoje.
zz Elektrostatin (jonin) sveika (drusk tilteliai) susidaro tarp dviej prieing krv
turini atom (jon).
Kovalentiniai ryiai gali bti poliniai ir nepoliniai. Esant poliniam kovalentiniam ryiui, vienas atomas yra daugiau elektroneigiamas nei kitas ir traukia savo pus bendrus ryio elektronus. Ryys tampa dipolinis. Nutrkus kovalentiniam ryiui, bendrieji ryio elektronai daniausiai
lieka ties labiau elektroneigiamu atomu, kuris tampa neigiam krv turiniu jonu anijonu.
Kitas ryio atomas tampa teigiam krv turiniu jonu katijonu:
COOH
COO + H+
Tarp anijono ir katijono susidaro elektrostatin sveika, pvz., tarp jonizuot aminorgi
liekan onini grupi -COO- ir -NH3+ (2.45pav.).
zz Van der Valso sveika yra silpna sveika, atsirandanti dl traukos tarp dviej krvi dipoli, susidarani dl elektron pasiskirstymo polinse ir nepolinse molekulse tam
tikru momentu.
Sveik pirm kart apra olandas Johanesas Diderikas van der Valsas (Johannes Diderik
van der Waals). Ji atsiranda, kai dvi molekuls priartja viena prie kitos tam tikru atstumu, ir
tarp j ima veikti labai silpnos traukos jgos. Kiekvienos molekuls elektron pasiskirstymas
konkreiu momentu sukuria laikin elektronin (krvi) dipol (sudaryt i neigiamai kraut
elektron ir teigiamai kraut branduoli). Dviems molekulms esant pakankamai arti viena
kitos, tarp dviej dipoli atsiranda silpna trauka. Tolstant molekulms vienai nuo kitos, sveika
nyksta. Prieingai, joms per daug priartjus, dl neigiamo vidini sluoksni elektron krvio
pasireikia atostmio jgos. Taigi, Van der Valso sveika optimaliai veikia molekulms glaudiai
suartjus savo elektron debesimis (0,30,6nm).
Silpn (12kcal/mol) Van der Valso sveik tarp molekuli yra tkstaniai. Jos susidaro vis
tip molekulse. Biologinse molekulse Van der Valso sveikos yra labai svarbios susidarant
erdvinms struktroms ir biologinms molekulms sveikaujant tarpusavyje.
Nekovalentiai ryiai yra ~30300 kart silpnesni negu kovalentiniai ryiai. Taiau jeigu tam
tikroje vietoje j susidaro daug, peptidins grandins fragmentai gali tvirtai laikytis.
88
Be i nekovalentinio tipo sveik, kai kuri baltym konformacij stabilizuoja ir kovalentiniai ryiai. Tokie yra disulfidiniai tilteliai, susidarantys peptidinje grandinje tarp dviej
cisteino aminorgi liekan j oksidacijos metu (2.45pav.). Veikiant baltymus redukuojaniomis mediagomis (2-merkaptoetanoliu, ditiotreitoliu), disulfidiniai tilteliai suyra, suardoma
ir baltymo erdvin struktra.
Visos anksiau apraytos sveikos susidaro baltym molekulms gyjant erdvin struktr
ir j stabilizuoja. Skirtinguose baltym struktros lygiuose antrinje, tretinje ir ketvirtinje
struktroje vyrauja skirtingo tipo sveikos.
2.2.5. Baltym pirmin struktra

Baltym molekuls yra didels ir sudtingos, bet j
Baltymo pirmin struktra yra
struktra kiekvienoje konkreioje aplinkoje yra apibrta ir
linijin polipeptidin aminonusakoma. Kiekviena baltymo molekuls aminorgties
rgi grandin.
liekana isidsto savitai, j visuma suteikia baltymui struktr ir funkcines savybes.
Baltym struktr galima apibdinti keliais struktros
Kiekvienas baltymas turi savit
lygiais, kurie skiriasi chemini ryi prigimtimi ir kitomis
aminorgi sek.
ypatybmis: pirmine, antrine, tretine ir ketvirtine struktra. Baltymo pirmin struktra yra aminorgi seka polipeptidinje grandinje.
Baltymo aminorgi sekoje yra visa informacija apie jo antrin, tretin ir ketvirtin
struktr. Baltymus sudaro 20 skirting aminorgi, todl sekos variant gali bti 20n, kur
n yra aminorgi liekan skaiius polipeptidinje grandinje. Daugel baltym sudaro daugiau nei 100 aminorgi, taigi, potenciali kombinacij skaiius yra milinikas. Informacija
apie kiekvieno baltymo savitj aminorgi sek yra organizmo genome.
Pirm kart baltymo (jauio insulino) aminorgi sek nustat Frederikas Sengeris (Frederick Sanger) ir jo bendradarbiai 1950m. Jauio insulinas nedidelis 51 aminorgi liekanos
baltymas, kur sudaro dvi polipeptidins grandins, sujungtos tarpusavyje keliais disulfidiniais
tilteliais. Sengeris sukr baltym aminorgi sekos nustatymo metod, kuris 1958m. buvo
vertintas Nobelio premija chemijos srityje. Itobuljus chemins analizs technologijoms, iais
laikais baltym tapatyb nustatoma masi spektrometrija, taip pat bioinformatiniais metodais analizuojant genom nukleotid sekas.
Masi spektrometrija tapo viena populiariausi baltym ir peptid nustatymo strategij, kuri remiasi j molekuli masi nustatymu. iuo metu taikomi du masi spektrometrijos metodai. Pirmasis
yra vieno baltymo peptid masi pirt atspaud metodas, kuris pagrstas jonizuot peptid praskriejimo laiko nustatymu (angl. Matrix-assisted laser desorption / ionization-time of flight, MALDI-TOF).
I lsteli iskiriami baltymai, jie iskirstomi vienos arba dviej krypi elektroforeze arba chromatografija. Konkretus baltymas, kurio tapatyb norima nustatyti, igryninamas. Baltymas veikiamas peptidazmis (tripsinu) ir suskaidomas peptidus. Tripsinas atrankiai skelia polipeptidin grandin ties
arginino ir lizino aminorgi C galu, jeigu u j nra prolino. Miinio peptid molekulins mass
89
MOLEKULIN BIOLOGIJA
toliau nustatomos MALDI-TOF spektrometrija. Peptidai jonizuojami pasitelkiant lazer ir nukreipiami

masi detektori. Molekuli praskriejimo laikas detektoriuje yra atvirkiai proporcingas j masei
ir tiesiogiai proporcingas krviui. Detektorius registruoja jonizuot peptid mass ir krvio santyk,
m/z. Toliau, taikant kompiuterinius algoritmus, MALDI-TOF spektrai lyginami su peptid, gaut in silico
(kompiuterine simuliacija) peptidazmis suskaidius inom aminorgi sek baltymus, masmis.
Nustatoma tiriamo baltymo tapatyb.
Kitas metodas dviguba masi spektrometrija, MS / MS, remiasi vis lstels baltym proteomos skaidymu peptidazmis (2.46 pav., ab). Gautas peptid miinys iskirstomas skystins
chromatografijos arba dviej krypi elektroforezs metodais. Tada kiekvienas peptidas individualiai
jonizuojamas elektropurkimo bdu. Peptid m/z santyk detektuoja masi spektrometras. Tada peptidai dar skaidomi maesnius fragmentus pasitelkiant duj atomus. Susidaro trumpesni peptid,
besiskiriani viena aminorgtimi, miinys. Nustatomas miinio peptid m/z santykis. Gaunamas vadinamasis tandeminis MS spektras. Pagal nustatyt miinio peptid mas, identifikuojama j tapatyb
ir aminorgi sekos, tada nustatoma viso baltymo aminorgi seka.
2.46pav. Baltym tapatybs nustatymas masi spektrometrija. Dvigubos masi spektometrijos

(MS/ MS) schema (a) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012); dviej pakop
praskriejimo laiko masi spektrometras Vilniaus universiteto Proteomikos centre (b) (http://www.bchi.lt)
90
2.2.6. Baltym antrin struktra

Palyginus vairi baltym erdvines struktras, pasirod, kad, nors jos visikai skirtingos, tam
tikrose j dalyse polipeptidins grandins isidsto sudarydamos dviej tip reguliarias
struktras. ias dvi baltym struktras 19501951m., likus
deimtmeiui iki pirmosios baltymo (mioglobino) erdvins
spiral ir struktra yra regustruktros nustatymo, atrado L. Polingas ir R. Koris. Jie rliars polipeptidins grandins
msi iniomis apie baltymus sudarani aminorgi cheisidstymai erdvje konmin struktr (L. Polingas ia buvo nepralenkiamas tarp to
formacijos, susidaranios tam
meto mokslinink), taip pat aminorgi bei nedideli
tikrose polipeptidins grandipeptid rentgenostruktrins analizs duomenimis.
ns vietose ir stabilizuojamos
Pirmoji pasilyta reguliari struktra baltym molekulvandenilini ryi tarp -N-H ir
se buvo spiral. i struktra buvo labai greitai patvirtinta
>C=O grupi.
baltyme keratine atlikus arklio plauko rentgenostruktrin analiz. Keratino baltymo gausu odoje, plaukuose, naguose, plunksnose. Struktr patvirtino Lorensas Bragas (Lawrence Bragg), anksiau paskelbs
savo baltym struktros model, kuris, deja, buvo neteisingas.
Kita reguliari struktra baltymo molekulse, pasilyta L. Polingo ir jo koleg, buvo struktra. Ji netrukus buvo nustatyta fibroine, pagrindiniame ilko baltyme. Ji pavadinta antrja
graik abcls raide beta, nes buvo antroji nustatyta baltym struktra.
onins grups vandeniliniuose ryiuose, stabilizuojaniuose a spirales ir b struktras, nedalyvauja. Taigi, a spirales ir b struktras gali gyti vairi aminorgi sek polipeptidins
grandins.
a spiral ir b struktra yra daniausios baltym antrins struktros. Detaliau aptarsime kiekvien i j.
2.2.7. spiral
Peptidin grandin spiralje susisuka apie tariam a deiniuoju sukimu (i kairs dein, 2.48pav.). Spirals vidin dal sudaro susisukusi pagrindin polipeptidin grandin. Spirals
iorje yra aminorgi liekan onins grups. a spiral
susidaro savaime, ji yra minimalios laisvosios energijos poa spirals struktr stabilizuoja
lipeptidins grandins konformacija.
vandeniliniai ryiai, susidaiuose vandeniliniuose ryiuose dalyvauja visos peptidins grups, esanios a spiralje (kiekviena peptidin
grup dalyvauja sudarant po du vandenilinius ryius).
Spirals vijos ingsnis sudaro 5,4 , jis talpina ~ 3,6
aminorgties liekanas (3,6x1,5=5,4). Taigi, 36 aminorgi polipeptidas sudaryt 10-ties ski spiral
(2.12lentel).
rantys tarp kiekvienos aminorgties liekanos (i)>C=O

(karbonilgrups) deguonies ir
kas ketvirtos aminorgties liekanos (i+4) -N-H (iminogrups)
vandenilio.
91
MOLEKULIN BIOLOGIJA
2.12lentel. Kai kuri polipeptidins grandins antrins struktros element savybs

Struktra
Aminorgi liekan skaiius skyje
Auktis, kur uima

viena aminorgtis
spirals skyje,
Atom skaiius vandenilini ryi stabilizuojamame iede
f ()
y ()
a spiral
3,6
1,5
13
57
47
310 spiral
3,0
2,0
10
49
26
p spiral
4,4
1,2
16
57
70
Antilygiagreti b juosta
2,0
3,4
-*
139
+135
Lygiagreti b juosta
2,0
3,2
-*
119
+135
* Vandeniliniai ryiai susidaro tarp polipeptidini grandini.
2.47pav. Baltym spirals struktra. Schematinis spirals vaizdas. Linijomis parodyti vandeniliniai
ryiai, stabilizuojantys struktr (deinje); spirals fragmento, besisukanio apie tariam a, atom
isidstymas (viduryje); vandeniliniai ryiai, susidarantys tarp polipeptidins grandins atom (kairje);
spiral sudaranios peptidins grandins fragmentas. Rodyklmis paymtos karbonil- ir iminogrups,
tarp kuri susidaro vandeniliniai ryiai (apaioje) (J.M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer. Biochemistry, seventh edition, 2012)
92
Iilgai spirals vandeniliniai ryiai yra isidst beveik lygiagreiai tariamai spirals aiai, o
juose dalyvaujantys atomai beveik vienoje linijoje. Tokiuose ryiuose dalyvaujantys atomai
yra krvi dipoliai, a spiral yra toki dipoli visuma makrodipolis, turintis teigiam krv N
gale, ir neigiam C gale.
Dar viena svarbi a spirals ypatyb yra ta, kad jos galai yra maiau stabils nei vidin struktros dalis. Spirals galuose keli vandeniliniai ryiai nesusidaro. Juos gali sudaryti spirals galuose esani kai kuri aminorgi onins grups. Pvz., spirals N gale esanios serino arba
asparagino aminorgi liekanos gali sudaryti vandenilinius ryius su -N-H grupe. Aminorgtys lizinas, histidinas ir glutaminas link sudaryti vandenilinius ryius a spirals C gale.
Polipeptidins grandins gebjimui sudaryti a spirales takos turi aminorgi liekan
chemin prigimtis. Pvz., aminorgtys alaninas (Ala), leucinas (Leu), metioninas (Met), histidinas (His) ir glutaminas (Gln) stabilizuoja a spiral. Aminorgtys triptofanas (Trp), fenilalaninas
(Phe), lizinas (Lys), argininas (Arg), asparto (Asp) ir glutamo (Glu) aminorgtys j destabilizuoja. Polipeptidinje grandinje esanios prolino ir hidroksiprolino aminorgi liekanos sukuria staigius spirals ilinkimus (~20), suardydamos trumpesnes a spirales. Taip atsitinka dl
prolino ir hidroksiprolino onini grupi ciklinio ryio su -N-H grupe, kuri negali dalyvauti a
spirals vandeniliniuose ryiuose.
Baltymuose a spirali ilgis gali siekti nuo keli iki keliasdeimties aminorgi. Vidutin
a spiral sudaro ~ 10 aminorgi liekan. a spirali kiekis baltymuose yra vairus. J yra
daug globuliniuose baltymuose hemoglobine, mioglobine, feritine; taip pat fibriliniuose baltymuose miozine, epidermine, fibrinogene, a keratine. Baltymo a keratino struktroje a spirals dominuoja. Tokios spirals dar yra tarpusavyje kairiuoju sukimu (po 2) susivijusios vien
superspiral (angl. coiled coil). a keratino superspirals yra plauko pamatin struktra: po dvi
a keratino superspirales sveikauja tarpusavyje galva-uodega bdu, sudarydamos protofilamentus. Keturi protofilamentai sudaro protofibriles tamprias skaidulas (2.48pav., ab).
Superspirali, daniausiai sudaryt i 25 a spirali, yra ir kituose struktriniuose baltymuose, esaniuose gyvn ir mieli lsteli citoskelete, Goldio komplekse, chromatine, branduolio upildo baltymuose. Jie randami virus baltymuose, lsteli transkripcijos veiksniuose,
sveikaujaniuose su DNR, pvz., baltyme GCN4. Superspirales stabilizuoja hidrofobin sveika
dl spirali aminorgi izoleucino, valino, metionino, onini grupi, kuri tokiuose baltymuose yra gausu (2.48pav., c).
Daugumos superspirales sudarani baltym aminorgi seka pasiymi heptadiniu pasikartojimu. i seka gali bti urayta formule (a-b-c-d-e-f-g)n, kur a ir d aminorgi liekanos, turinios hidrofobines onines grupes. d padtyje danai aptinkamas leucinas (Leu) arba
izoleucinas (Ileu). e ir g pozicijose esanios aminorgi liekan onins grups turi krv, arba
yra polins. Septynios heptadinio pasikartojimo aminorgtys isidsto madaug dviejuose a
spirals skiuose. Heptadiniuose pasikartojimuose esani a ir d aminorgi liekan onins
grups isirikiuoja iilgai vidins spirali puss, tarp dviej spirali grupi atsiranda hidrofobins sveikos. i onini grupi rikiuot iek tiek sukasi, skatindama sveikaujanias spirales
susivyti superspiral (2.48pav., c).
Superspiralje tarp atskir a spirali gali susidaryti ir kovalentiniai ryiai disulfidiniai tilteliai. Tokia baltymo struktra yra ypa stabili. Ja pasiymi jau mintas a keratinas. a keratine
93
MOLEKULIN BIOLOGIJA
gausu cisteino (Cys) aminorgi liekan, kuri onins grups dalyvauja disulfidiniuose ryiuose. Dl disulfidini ryi gausos a keratin sunku hidrolizuoti. Taiau, pvz., kandi lerv
virkinimo sistemoje yra merkaptan, suardani vilnos a keratino disulfidinius ryius. Nedideles a spirales turi membranose esantys baltymai, pvz., transporto baltymai, receptoriai. i baltym dalys, perverianios membran lipid sluoksnius, yra a spirals, kurias sudaro nepolini
aminorgi liekanos.
Kai kuri baltym struktroje a spirali yra labai maai arba visai nra, pvz., chimotripsine,
superoksido dismutazje, citochrome c.
2.48pav. Baltym superspiral. Superspirals, sudarytos i dviej tarpusavyje susivijusi a spirali, schematinis vaizdas (a); plauko, kurio pagrind sudaro keratino a spirals, struktra (D. L. Nelson, M.C.Cox.
Lehninger Principles of Biochemistry, sixth editition, 2012) (b); heptadinis pasikartojimas baltym super
spiralse (c): heptadini pasikartojim hidrofobini aminorgi liekanos a ir d isidsto vidinje a spirali pusje (kairje); a spirals sveikauja tarpusavyje vidinje pusje esaniomis aminorgi liekan
hidrofobinmis oninmis grupmis, susivydamos superspiral (viduryje); transkripcijos veiksnio GCN4
baltymo superspirals, sudarytos i dviej identik polipeptid a spirali, struktra (deinje)
94
Baltymuose esanios spirals daniausiai yra deinio sukimo. Erdvje gali susidaryti ir kairiojo sukimo spiral, taiau tokia konformacija yra nestabili, todl retai aptinkama gamtiniuose
polipeptiduose. Randamos, nors ir retai, kitoki tip a spirals. Vadinamojoje 310 spiralje vandenilinius ryius tarp peptidini grupi atom sudaro kas ketvirta aminorgties liekana, o p
spiralje kas eta. 310 spirali yra gamtini a spirali galuose. p spirals gamtiniuose polipeptiduose yra gana retos ir, manoma, yra evoliucins adaptacijos rezultatas. Daugiausiai p spirali
rasta baltyme metano monooksigenazje.
Erdviniuose baltym struktros modeliuose a spirals vaizduojamos kaip spirals pavidalo
kaspinai (2.48pav., c).
2.2.8. struktra
Kita dana baltym reguliari antrin struktra yra struktra.
Ji dar vadinama b laktu, b klostytu laktu, b klostyta struktra. Tokioje struktroje polipeptidin grandin yra itsusi, ji vadinama juosta (angl. strand). b juostos peptidini
grupi ploktumos per y ir f ryius yra pasisukusios ir isidsto zigzagu, todl struktra atrodo isilanksiusi. Aminorgi onins grups isidsto b grandins viruje arba apaioje
(2.49pav., a).
Pavieniui b juostos nra stabilios, todl jos stengiasi sveikauti su kitomis b juostomis, esaniomis kitose tos paios polipeptidins grandins srityse (tai vadinama vidumolekuline sveika), arba kitose polipeptidinse grandinse (tai vadinama tarpmolekuline sveika). bjuost
tarpusavio sveik stabilizuoja vandeniliniai ryiai, susidarantys tarp b juost >C=O ir -N-H grupi (2.49pav., ab).
Kitaip nei a spiralje, vandeniliniai ryiai tarp b juost yra isidst statmenai polipeptidins grandins aiai ir skersai jungia vien grandin su kita arba du grandins fragmentus.
Tarpusavyje sveikaujanios b juostos sudaro struktr lakt, arba klostyt lakt (angl.
-sheet, platteled sheet).
Polipeptidins grandins ( juostos) struktroje viena kitos atvilgiu gali isidstyti dviem
bdais:
zz lygiagreioje struktroje polipeptidini grandini N galai yra nukreipti vien pus
(2.49pav., b);
zz antilygiagreioje struktroje polipeptidini grandini N galai nukreipti prieingas
puses (2.49pav., c).
Vandenilini ryi isidstymas yra stabilesnis antilygiagreiojoje b struktroje, nes >C=O
ir -N-H grupi dipoliai yra vieno linijoje ir sveikauja maksimaliai. Lygiagreti b struktra yra itsusi ir daniausiai baltym viduje.
Didesn tikimyb sudaryti b struktr polipeptidinei grandinei suteikia valino (Val), izoleucino (Ile), treonino (Thr), fenilalanino (Phe), tirozino (Tyr), triptofano (Trp) aminorgi liekanos. Glutamino (Glu), glutamo rgties (Gln), lizino (Lys), asparagino (Asp), asparto (Asn), cisteino (Cys), prolino (Pro) aminorgi liekanos nra palankios b struktrai susidaryti.
95
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Kitaip nei a spiral, baltym b struktr dl jos itsimo sunku itempti. Pvz., ilkverpi silo
ar voratinklio pagrind sudaro antilygiagreios baltymo fibroino b struktros. Fibroino b struktra yra maksimaliai itsusi. i ypatyb suteikia mediagai ypatingo tvirtumo. Taiau silai kartu yra ir labai lanksts, nes tarpusavyje b struktros sveikauja silpnais nekovalentiniais Van der
Valso ryiais.
Erdviniuose baltym struktros modeliuose b juostos vaizduojamos kaip plaios rodykls.
Rodykli kryptis nurodo polipeptidins grandins krypt (N galas C galas) (2.49pav., bc).
2.49pav. Baltymo struktra. Polipeptidins grandins isidstymas b juostose, kurios sudaro b struktr (a); lygiagreti b struktra (b); antilygiagreti b struktra. Peptidins grups, dalyvaujanios sudarant
vandenilinius ryius, paymtos punktyru. Geltonos rodykls ymi polipeptidins grandins krypt (c)
(http://biochemistrycourse.blogspot.com/2011/05/secondary-structure-of-proteins.html)
96
2.2.9. Kiti baltym antrins struktros elementai

Polipeptidins grandins antrins struktros reguliars elementai erdvje keiia krypt arba
viena reguliari struktra pereina kit. Poski arba perjiLinkis ir kilpa yra nereguliarios
m vietose, pvz., viena greta kitos isidstant b juostoms,
antrins baltym struktros
polipeptidins grandins struktra nra reguliari, taiau
elementai.
jai bdingi gana tipiki antrins struktros elementai, vadinamieji linkiai (angl. turns) ir kilpos (angl. loops).
Poskiai yra trumpi polipeptidins grandins fragmentai. Juose gali bti iki ei aminorgi liekan, daniausiai gausu aminorgi glicino (Gly) ir prolino (Pro).
Linkiuose tarp >C=O ir -N-H grupi taip pat susidaro vandeniliniai ryiai, jie stabilizuoja
struktr. Pagal tai, kiek aminorgi liekan sudaro link, yra skiriami delta linkiai (2 aminorgtys), gama linkiai (3 aminorgtys), beta linkiai (4 aminorgtys), alfa linkiai (5 aminorgtys), pi linkiai (6 aminorgtys).
Beta linkiai baltymuose yra daniausi. Jie jungia, pvz., b juostas antilygiagreioje b struktroje (2.50pav., c). Dl beta linki polipeptidin grandin keiia krypt 180 kampu. Beta linkiuose visuomet yra vandenilinis ryys tarp pirmos aminorgties liekanos karbonilgrups >C=O
ir ketvirtos aminorgties liekanos iminogrups -N-H (2.50 pav., ab). Beta linki struktros
tarpusavyje iek tiek skiriasi, skiriami ei j tipai. I ir II tipo beta linkiai yra labiausiai paplit
baltymuose (2.50pav., ab).
Linkiuose yra isidsiusios iki tredalio globulini baltym aminorgi. ie struktros
elementai daniausiai yra baltymo paviriuje. Jie suteikia baltymams globuls pavidal. Antikn atpainimo, fosforilinimo, glikozilinimo, hidroksilinimo sritys yra linkiuose arba netoli j.
Kitas nereguliarios baltym antrins struktros elementas yra kilpa. Elemento struktra erdvje primena kilp, panai graikikomega raid, i ia kils struktros pavadinimas omega
kilpa (2.50pav., c). Omega kilp sudaro 616 aminorgi liekan. Kilp aminorgi sudtis
2.50pav. Linki ir kilpos struktros. I tipo beta linkis (a); II tipo beta linkis (b); omega kilpa (c) (T. D. Pollard, W. C. Earnshaw, J. Lippincott-Schwartz, Cell Biology, second edition, 2007)
97
MOLEKULIN BIOLOGIJA
vairi. Pasitaiko ir ilgesni omega kilp. Kilpoje tarp aminorgi liekan susidaro vandeniliniai
ryiai, jie yra nereguliars. Kilpos isidsto baltym paviriuje. Jose danai yra antigen-antikn
sveikos sritys, metal jon sryos vietos. Kilp yra ferment aktyviuosiuose centruose.
2.2.10. Baltym struktros motyvai (superantrin struktra)

1973m. S. Narasinga Rao (S. Narasinga Rao) ir Maiklas Rosmanas (Michael Rossmann) nustat, kad baltym erdvinje struktroje yra element, turini kelias a spirales, b juostas arba
j kombinacijas, kurias tarpusavyje jungia nereguliarios
antrins struktros elementai staigs poskiai ir / ar kilpos. ie elementai yra tarsi antrins struktros element
Superantrin baltym struktra
sankaupos, j rasta paias vairiausias funkcijas atliekani
(motyvai) tai tam tikras nuobaltym struktrose. Tokie struktros elementai vadinami
seklus 23 antrins struktros
baltym struktros motyvais, arba superantrine struktelement isidstymas.
ra. Motyvus galima laikyti tarpine struktra tarp antrins ir
tretins baltym struktros lygi.
Kai kurie baltym struktros motyvai pavieniui lemia konkrei baltymo funkcij, taiau kiti
yra tik baltym erdvins struktros dalis.
Danai aptinkami ie baltym struktros motyvai:
zz Motyvai, kuriuose yra a spirals struktra (2.51pav., a):
zz spiral-kilpa-spiral, H-L-H (angl. helix-loop-helix). Motyv sudaro dvi a spirals, kurias
jungia kilpa. Danas ir kitas panaus motyvas: spiral-linkis-spiral, H-T-H (angl. helixturn-helix). Spirals-linkio-spirals motyvas lemia kai kuri baltym funkcijas: atranki
baltym sveik su DNR (pvz., katabolit genus aktyvinanio baltymo, CAP, l bakteriofago slopiklio, lCro), Ca2+ jon suriim.
2.51pav. Baltym struktros motyvai (www.proteinstructures.com)
98
1973m. nustatyta, kad karpio baltymo parvalbumino (Mw=12000Da) struktroje spiralskilpos-spirals motyvas kartojasi tris kartus. Du i i trij motyv dalyvauja suriant kalcio jonus.
Tokio tipo kalc suriantys motyvai yra paplit baltymuose ir dar vadinami EF rankos (angl. EF
hand) motyvais (2.51pav., a). Motyvas nustatytas tarp parvalbumino E ir F spirali, i ia kils jo
pavadinimas. EF rankos motyvo kilp sudaro ~12 aminorgi liekan, tarp j gausu polini ir
hidrofobini, esani konservatyviose padtyse. Ca2+ jonai oktaedriniu bdu koordinuojami aminorgi liekan onini karboksigrupi ir tirpiklio molekuli. EF motyvus turintys eukariot
baltymai, pvz., kalmodulinas, troponinas C, yra svarbs signal perdavimo keli dalyviai.
zz Motyvai, kuriuose yra b struktra (2.51pav., ce):
zz plauk segtuko motyvas (angl. hairpin -motif). Motyv sudaro dvi antilygiagreios
b juostos, kurias jungia kilpa;
zz graik rakto motyvas (angl. greek key motif). Motyv sudaro keturios greta esanios antilygiagreios b juostos, jungiamos kilp. Element isidstymas primena senovs Graikijos ornamentus, i ia kils ir struktros pavadinimas.
zz Motyvai, kuriuose yra b juostos ir a spirals struktros (2.51pav., b):
zz beta-alfa-beta motyvas (angl. beta-alpha-beta motif). Motyv sudaro b juosta, a spiral
ir dar viena b juosta, kurias tarpusavyje jungia kilpos. Palyginti su antilygreiomis juostomis, kurioms tarpusavyje sujungti pakanka nedidels kilpos, lygiagreias struktras
skersai jungia ilgos kilpos, neretai tarp j yra a spiral.
Baltym erdvinje struktroje aptinkamos antrins struktros motyv grups klosts
(angl. fold), kurias galima laikyti dar sudtingesnmis superantrinmis struktromis. Pvz., du
spirals-kilpos-spirals motyvai sudaro sudtingesn struktr keturi spirali ryul (angl.
four helix bundle) (2.52pav., a). i struktr sudaranios spirals yra amfipatins hidrofobins aminorgi liekanos isidsiusios vienoje spirals pusje, o hidrofilins kitoje. Keturi
spirali ryulyje spirals pakrypusios nuo tariamos aies ~20.
2.52pav. Struktros motyv grups mogaus baltymuose. Keturi spirali ryulys interleukino-2
struktroje (a); globino klost neuroglobine. Hemas parodytas centre (b); Rosmano klost dehidrogenazje. Parodyta ketvirtin baltymo struktra, sudaryta i keturi baltymo monomer. Kiekvienas monomeras prijungs NADP (c) (http://www.ebi.ac.uk/pdbe/)
99
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Kitas motyvas, sudarytas i a spirali struktr, yra globino klost (angl. globin fold)
(2.52pav., b). J sudaro atuoni spirali ryulys. Globino klostje greta esanios spirals viena kitos atvilgiu isidsto antilygiagreiai, jos pakrypusios nuo tariamos aies ~50. Globino
klosts struktros motyvas bdingas hemoglobinui, mioglobinui, dumbliuose esaniam fikocianinui. Evoliuciniu poiriu tai yra labai konservatyvi struktra: j ilaiko baltymai, kuri aminorgi sek panaumas yra ne didesnis nei 16%.
Du beta-alfa-beta motyvai sudaro vadinamj Rosmano klost (angl. Rossmann fold)
(2.52pav., c). Motyvas bdingas baltymams, prijungiantiems nukleotidus, ypa nikotinamiddinukleotid (NAD).
2.2.11. Baltym tretin struktra

Tretin baltym struktra apibdina savit erdvin polipeptidins grandins antrins struktros element isidstym susidarant kompaktikai molekuls struktrai. Visos to paties baltymo molekuls gyja vienod erdvin struktr, kuri dar
vadinama gamtine (angl. native) baltymo struktra.
Tretin baltymo struktra tai
Atsivelgiant baltymo molekuls tretins struktros
savitas polipeptidins granpavidal, baltymai skirstomi globulinius ir fibrilinius.
dins antrins struktros eleGlobuliniai baltymai yra sferos, globuls formos, o fibriliment isidstymas erdvje
niai itsusios (silo, lazdels, pluoto) formos. Tiek globukompaktik struktr.
lini, tiek fibrilini baltym tretin struktr sudaro vairs
antrins struktros elementai a spirals, b juostos, nereguliars elementai.
Fibrilini baltym struktrai bdingas antrins struktros motyv pasikartojimas. Fibriliniai
baltymai daniausiai yra struktriniai baltymai (kolagenas, elastinas, miozinas, fibrinogenas).
Globuliniai baltymai pasiymi didiule struktr vairove. Todl ir j funkcijos yra daug
vairesns.
Baltym tretin struktra termodinaminiu poiriu yra stabiliausia baltymo molekuls struktra tirpale. Tretin struktr stabilizuoja ios silpnos vidumolekulins sveikos tarp
aminorgi onini grupi:
99 hidrofobin sveika;
99 vandeniliniai ryiai;
99 elektrostatin sveika;
99 Van der Valso sveika;
99 disulfidiniai tilteliai.
Susidarant baltym tretinei struktrai hidrofobins aminorgi onins grups paslepiamos struktros viduje kuo labiau sumainant kontakt su vandens molekulmis.
Ilgai manyta, kad baltymo tretin struktr lemia jo aminorgi seka, ir baltymas tirpale j
gauna savaime, nedalyvaujant jokiems paaliniams veiksniams. is teiginys inomas kaip
100
Anfinseno1 dogma. i nuostata buvo grindiama kai kuri baltym gebjimu, suardius j
gamtin erdvin struktr, tirpale vl savaime susilankstyti ir gyti prarast biologin aktyvum.
Pvz., veikiant ribonukleaz A ma 124 aminorgi liekan baltym redukuojaniomis mediagomis (2-merkaptoetanoliu), kurios suardo di
sulfidinius tiltelius (redukuojamos merkaptogrups), ir deProcesas, kurio metu suardoma
natruojaniomis mediagomis (karbamidu, guanidino
baltymo erdvin struktra, vachloridu), suardoma baltymo erdvin struktra, jis prarandinamas denatracija.
da aktyvum. Taiau paalinus denatracij suklusius
veiksnius ir oksidavus merkaptogrupes deguonimi, tirpale
ribonukleaz A vl gyja erdvin struktr ir biologin aktyvum. Toks grtamas procesas vadinamas renatracija (2.53pav.). Negrtamj baltym denatracij sukelia temperatra, didels koncentracijos rgtys, armai, alkoholiai.
2.53pav. Ribonukleazs A denatravimo ir renatravimo schema
2.2.12. Baltym erdvins struktros susidarymas

Eksperimentai in vitro su ribonukleaze A ir kitais baltymais parod, kad baltymai fiziologinmis slygomis spontanikai gyja erdvin struktr (angl. self assembling). Procesas mgintuvlyje trunka sekundes, o lstelje dar greiiau. Kaip jis vyksta?
1968m. Sairusas Levintalis (Cyrus Levinthal) suformulavo teigin, inom kaip Levintalio
paradoksas. Jeigu erdvin baltymo struktr lemia polipeptidins grandins aminorgi
seka, kaip grandin gyja vienintel termodinamikai palankiausi erdvin struktr per labai trump laiko tarp?
Baltym erdvin struktra susiLevintalis klausim pagrind skaiiavimais. Tarkime, sadaro ne vis manom struktvaime susidaro 100 aminorgi liekan polipeptido erros variant paiekos bdu.
dvin struktra. Manant, kad kiekviena aminorgties liekana gali egzistuoti vienoje i trij konformacij itsusioje, kilpos bei spirals, yra 3100 bd susidaryti polipeptido
erdvinei struktrai, arba 1048 galim erdvins struktros variant. Ryio sukimasis keiiant padt utrukt ~10-14s. Tai reikia, kad atsitiktin stabiliausios polipeptidins grandins erdvins
struktros paieka utrukt 1034s, arba 1026met. Tai daugiau nei visatos amius. O jau minta
ribonukleaz A, renatruota in vitro, gyja erdvin struktr greiiau nei per minut.
Pavadinimas kils i Kristiano B. Anfinseno (Christian B. Anfinsen) vardo.
101
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Taigi, gamtoje turi egzistuoti bdas baltymams gyti minimalios energijos erdvin struktr
per palyginti trump laik. Daugel met truk eksperimentiniai tyrimai ir teoriniai skaiiavimai
sprend paradoks, taiau ir iuo metu yra bent dvi baltym erdvins struktros susidarymo
(angl. folding) teorijos.
Pirmoji teorija remiasi kinetiniais tyrimais, kuri rezultatai sudar prielaidas manyti, kad baltymai nuosekliai gyja erdvin struktr per tam tikras savitas tarpines struktros bsenas.
Susidarius vienai tarpinei struktrai, susidaro kita, ivengiant nestabilios konformacijos bsen. Toki tarpini bsen egzistavim paliudijo eksperimentai in vitro.
Naujesn piltuvo (angl. funnel) teorija teigia, kad nra vieno kelio, kuriuo baltymas gyja
minimalios laisvosios energijos erdvin struktr, bet egzistuoja daug galim keli j pasiekti.
Molekul pasirenka labai nedidel dal i vis galim erdvini konformacij, ir tarpins erdvins
struktros, majant energijos, virsta galutine erdvine struktra. Kitaip tariant, denatruota molekul energiniu piltuvu greitai pasiekia minimalios energijos erdvin struktr, ir Levintalio paradoksas isprendiamas. Piltuvo teorija iliustruojama nelygaus paviriaus (energinio paviriaus)
piltuvu, kurio dugn (minimalios energijos erdvin struktr) juda molekul (2.54pav.).
Savaiminis baltym susilankstymas (angl. self assembling) lstelse vyksta, taiau tik kai
kuri baltym. 1987m. D. Elis (J. Ellis) ikl hipotez, kad savaiminis susilankstymas nra
vyraujantis baltym erdvins struktros susidarymo bdas gamtoje. Paaikjo, kad daugelio baltym savitai tretinei struktrai susidaryti reikia pagalbini veiksni molekulini
2.54 pav. Energiniai paviriai, iliustruojantys gamtins baltymo erdvins struktros susidarym.
Levintalio paradokso golfo lauko energinis pavirius. N gamtin baltymo konformacija; D denatruota bsena. Polipeptidin grandin ieko maiausios laisvosios energijos erdvins struktros atsitiktinai ir turi nedaug galimybi pakliti nedidel duobut, atitinkani gamtin struktr (a); energinis
pavirius, kai baltymo erdvin struktra susidaro vairiais keliais judant energiniu piltuvu. A baltymas
i karto pasiekia erdvin struktr; gamtin B baltymo struktra susidaro per tarpines bsenas (b)
(D.L.Nelson and M.V. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry, sixth edition, 2012)
102
aperon. Taip yra ne todl, kad baltym aminorgi sekoje trkt informacijos apie j erdvin struktr. Baltym koncentracija lstelse yra labai didel. Susidarant baltymo erdvinei
struktrai, galima daugyb nereikaling sveik, kurios didina netikslios struktros ir agregacijos susidarymo galimyb. Netikslis struktros hidrofobins aminorgi grups danai yra
baltym molekuls iorje, jos linkusios sveikauti su kit molekuli hidrofobinmis grupmis,
ir tokie baltymai sudaro agregatus. ia gelbsti molekuliniai aperonai gausi baltym, utikrinani tikslios kit baltym struktros susidarym lstelje, grup.
2.2.13. Baltym tretins struktros domenai

Baltym tretinje struktroje aptinkamos tam tikros antrins struktros element kombinacijos. Kai kurios i j yra gana danos globuliniuose baltymuose. Toki antrins struktros
kombinacij baltymo erdvinje struktroje gali bti ne viena, o keletas. ie baltym tretins struktros vienetai yra
Domenai yra pamatiniai polivadinami domenais.
peptidins grandins struktDomen vidutinikai sudaro 100150 aminorgi
riniai ir funkciniai vienetai, kuliekan. Vidutinio dydio domenas yra ~ 25 skersmens
riems bdinga tretin struktra.
globul. Ilgesnes polipeptidines grandines turintys baltymai daniausiai sudaryti i dviej ir daugiau domen. Tarpusavyje domenai sujungti trumpa lanksia polipeptidine
grandine, kuriai nebdinga reguliari antrin struktra. Domen gebjimas judti erdvje yra
labai svarbus baltym biologiniam aktyvumui, pvz., ferment aktyvumo reguliacijai, j gebjimui jungtis su substratu. Katabolit genus aktyvinanio baltymo, CAP (angl. catabolite acti-
2.55pav. E. coli katabolit genus aktyvinanio baltymo (CAP) antrins struktros elementai, tretins struktros domenai ir ketvirtin struktra. Rodyklmis paymtos DNR ir ATP prisijungimo sritys,
esanios skirtinguose baltymo domenuose (B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin et al. Essential Cell Biology,
fourth edition, 2014)
103
MOLEKULIN BIOLOGIJA
vator protein), monomerui yra bdingi du domenai: vienas prisijungia ATP, o kitas jungiasi prie
DNR (2.55pav.). Kai kuriuos baltym domenus galima atskirti skaidant juos jungianios polipeptidins grandins fragmento peptidinius ryius fermentais peptidazmis. Tokie atskirti
baltymo domenai ilaiko savo tretin struktr, kuri yra jiems bdinga baltyme.
Manoma, kad polipeptidai, kuri erdvinje struktroje yra ne vienas, o keletas domen,
atsirado evoliucijos keliu susiliejant genams, koduojantiems paprastesns struktros vieno domeno polipeptidus. Pvz., induoli baltymo fosfolipazs C molekuls domenai yra nustatyti
kituose maesniuose baltymuose. Toks evoliucijos metu vykstantis domen dreifas kuria baltymus, pasiyminius naujomis savybi kombinacijomis.
Pagal tai, kokios antrins struktros element (motyv) kombinacijos sudaro baltymo domen, baltym tretins struktros yra skirstomos kelias grupes:
99 baltymai, sudaryti tik i spirals struktr, kurias tarpusavyje jungia kilpos. Toki
baltym hidrofobini aminorgi liekanos yra giliai paslptos viduje. Tokios struktros yra mioglobinas, hemoglobinas, feritinas, bakteriorodopsinas, fosfolipaz C
(2.56pav.);
99 baltymai, sudaryti tik i juost, daniausiai isidsiusi viena kitos atvilgiu antilygiagreiai (antilygiagretus b laktas). Tokia struktra pasiymi, pvz., baltymai imunoglobulinas, superoksido dismutaz;
99 - struktros baltymai. Baltymus sudaro b juostos, daniausiai isidsiusios lygiagret b lakt, apsupt a spirali. Tokios struktros yra baltymai alkoholio dehidrogenaz, subtilizinas, tioredoksinas, heksokinaz;
99 + struktros baltymai. Baltym struktr sudaro a spirali ir b juost motyv
kombinacija.
2.2.14. Baltym ketvirtin struktra

Kai kuriuos baltymus sudaro viena polipeptidin grandin. Tokie baltymai pasiymi tik tretine struktra. Taiau daugel lsteli baltym sudaro ne viena, o dvi ar daugiau tarpusavyje
sveikaujani polipeptidini grandini. Jos yra vadinamos subvienetais. Kiekvienas subvienetas gyja savit treTarpusavyje sveikaujan
tin struktr nepriklausomai. Subvienetai sveikauja tardviej ar daugiau polipeptipusavyje nekovalentinio tipo ryiais, susidaraniais tarp
dini grandini (subvienet),
atskir polipeptidini grandini aminorgi onini
sudarani funkcional baltygrupi. Tai yra vandeniliniai ryiai, joniniai ryiai, Van der
m, erdvinis isidstymas yra
Valso ryiai ir hidrofobin sveika. Visi minti ryiai stabiliketvirtin baltymo struktra.
zuoja ketvirtin baltymo struktr. Ketvirtins struktros susidarymas, iskyrus retas iimtis, yra btinas baltymo
funkcijoms pasireikti.
Daugiasubvienets struktros baltymai yra vadinami oligomerais. Subvienetai, sudarantys baltym, gali bti identiki arba skirtingi. I identik subvienet sudaryti baltymai,
104
2.56pav. Baltym domen struktra (D.L. Nelson and M.V. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry,
sixth edition, 2012)
105
MOLEKULIN BIOLOGIJA
priklausomai nuo juos sudarani subvienet skaiiaus, yra homodimerai (du subvienetai),
homotrimerai (trys subvienetai), homotetramerai (keturi subvienetai) ir t. t. Pvz., E. coli DNR
helikaz sudaro ei identiki subvienetai, baltymas yra homoheksameras. Jeigu baltym sudaro maiausiai du skirtingi subvienetai, priklausomai nuo subvienet skaiiaus, baltymai gali
bti heterodimerai, heterotrimerai, heterotetramerai ir t. t.
Daugiasubvienets baltym struktros pavyzdys yra hemoglobinas O2 suriantis eritrocit baltymas. mogaus hemoglobino molekul sudaro keturi subvienetai du a globino ir
du b globino polipeptidai (2.57pav., ac). Vis polipeptid erdvin struktra yra globuls pavidalo, jie suformuoja globuls pavidalo hemoglobino molekul. Kiekvienas polipeptidas turi
prostetin grup hem, kiekviena grup prijungia vien deguonies molekul. Prostetin
grup nra baltymo polipeptidins grandins sudtyje ji yra prijungiama prie baltymo j susintetinus. 1959m. Maksas Perucas (Max Perutz) nustat erdvin hemoglobino struktr
ir parod, kad kiekvieno hemoglobin sudaranio polipeptido erdvin struktra yra panai
mioglobino struktr. Mioglobinas yra monomerinis raumen baltymas, taip pat turintis hem
ir prijungiantis deguonies molekul. Buvo spta, kad abu hemoglobino sudt einantys polipeptidai yra kil i mioglobino. Perucas taip pat nustat, kad prisijungus deguonies molekulms, b globino subvienet erdvinis isidstymas pakinta: molekuls priartja viena prie kitos.
Taip pirmkart buvo parodyta, kad sudtingoms baltym funkcijoms atlikti yra svarbs net ir
nedideli molekuls struktros pokyiai erdvje.
Baltymo subvienetams jungiantis oligomer, ~2030% sumaja tirpalui prieinamo baltymo pavirius. Oligomerai yra atsparesni proteazi, temperatros, denatracijos poveikiui.
Atskiri baltym sudarantys subvienetai patys daniausiai yra nesimetriki, taiau daugiasub
vienei baltym ketvirtins struktros pasiymi vairi ri simetrija, panaiai kaip kristaluose. Subvienetams jungiantis tokiu bdu yra siekiama sumainti molekuls laisvj energij.
Oligomerin baltym struktra padidina molekuli stabilum, suartina aktyviuosius centrus,
utikrina veikimo kooperatyvum.
2.57pav. Hemoglobino ir mioglobino erdvins struktros. mogaus oksihemoglobino molekuls

ketvirtin struktra. Parodytos hemo prostetins grups ir baltymo b ir a subvienetai (a, b); banginio
spermos oksimioglobino erdvin struktra (c) (D.L. Nelson and M.V. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry, sixth edition, 2012)
106
2.2.15. Daugiabaltyminiai kompleksai

Nors hemoglobino molekul sudaro 4 subvienetai, jis laikomas palyginti paprastos struktros baltymu. Neretai lstelje skirtingi baltymai, pasiymintys savita funkcija, asocijuoja sudarydami didelius daugiabaltyminius kompleksus. Daugiabaltyminiai kompleksai, dar vadinami molekulinmis mainomis (angl. molecular machines), dalyvauja svarbiausiuose lstels
procesuose: replikacijos, transkripcijos, ribonukleorgi brendimo, baltym biosintezs,
pernaos, biomolekuli degradacijos. Daugelio i kompleks struktra ir funkcijos bus nagrinjami kituose skyriuose.
Vienas pirmj nustatyt ir itirt daugiabaltymini kompleks buvo E. coli piruvato dehidrogenazs kompleksas. Kompleks sudaro 3 skirting baltym (ferment piruvato dehidrogenazs, dihidrolipoiltransacetilazs ir dihidrolipoildehidrogenazs) molekuls (2.43pav.,
ab). Kiekvieno baltymo molekuli komplekse yra ne viena, bet daug. I viso j sudaro 60 polipeptidini grandini. Komplekso molekulin mas yra ~4600000Da, jo skersmuo50nm.
Komplekso fermentai katalizuoja dviej metabolini keli glikolizs ir Krebso ciklo reakcijas.
Daugiabaltymin piruvato dehidrogenazs struktra utikrina, kad vienos fermentins reakcijos produktas bt i karto nukreipiamas link kito komplekso fermento ir t. t. Komplekso viduje
palaikoma didel substrat koncentracija, koordinuotai vyksta fermentini reakcij reguliavimas. Kitas veiksmingai funkcionuojanio daugiabaltyminio komplekso pavyzdys lsteli RNR
ardymo molekulin maina egzosoma. Prokariotuose, archjose, eukariotuose egzosom
sudaro iki devyni baltym, 3-5 egzonukleazi bei kit baltym (2.58pav., cd).
Lstels daugiabaltyminiai kompleksai yra skirtingo stabilumo. Daugelio kompleks baltymai jungiasi kompleks ir disocijuoja i jo priklausomai nuo tam tikru momentu lstelje
esani slyg.
2.58pav. Daugiabaltymini kompleks pavyzdiai. E. coli piruvato

dehidrogenazs komplekso struktra,
nustatyta krioelektronins mikroskopijos metodu (a) (The EMBO Journal,
v. 21, p. 5587, 2002); komplekso struktros schema (b); mogaus egzosomos komplekso struktra, nustatyta
rentgenostruktrins analizs metodu(c); egzosomos struktros schema(d) (Journal of Cell Science, v.122,
p. 1488, 2009)
107
MOLEKULIN BIOLOGIJA
ANALITINIAI KLAUSIMAI IR UDAVINIAI

1. Kodl dvigrandin DNR gyja dvigubos spirals antrin struktr?
2. Bakteriofago X174 DNR heterociklini bazi sudtis yra tokia: 25% A, 33% T, 24% G ir
18% C. K ie duomenyssako apie bakteriofago DNR?
3. Kodl daugelyje organizm DNR yra superspiralizuota neigiamai?
4. Plazmid pDJ02 yra udara dvigrandin iedin DNR molekul, sudaryta i 1650 bazi
por. Koks yra ios molekuls Lk, kai ji yra relaksuota B formos DNR? Patogumo dlei
laikykime, kad B formos DNR viename skyje telpa 10 bazi por, A formos DNR telpa
11 bazi por, o Z formos DNR 12 bazi por.
5. Ta pati plazmids DNR yra perkeliama i vandenilinio tirpalo 70% etanolio tirpal. Koks
DNR molekuls Lk bus iuo atveju? Kuri molekul bus kompaktikesn pirmuoju ar
antruoju atveju?
6. Turime neigiamai superspiralizuot dvigrandin DNR. Ar keisis itos molekuls Lk, Tw ir
Wr, jeigu:
a) padidinsime etanolio koncentracij iki 70%?
b) pripilsime baltymo, kuris prisijungia prie DNR G ir C sek ir slygoja Z formos susidarym?
7. DNR sekos gyja Z form tam tikromis slygomis. Viena toki slyg yra pasikartojani
deoksinukleotid seka d(5GC3). sivaizduokime, kad udara iedin DNR yra sudaryta
i deinio sukimo B formos relaksuotos DNR, kuri sudaro 1000 bazi por ir 18 d(GC)
dinukleotid, kurie sudaro kairiojo sukimo Z formos DNR. Koks yra tokios molekuls Lk?
8. Viroid RNR ir virusoid (satelitins) RNR sudtyje yra save kerpani ribozim. Paaikinkite, kam jie reikalingi?
9. Uraykite RNR molekuls, kuri galt sudaryti 9bp stieb ir 7 nukleotid kilp, sek.
10. Kokios sekos dar reikia, kad RNR molekul, aprayta 9 klausime, gyt pseudomazgo
struktr?
108
III. CHROMATINO MOLEKULIN STRUKTRA

DNR yra biologin makromolekul, sudaryta i daugelio atom ir pasiyminti savita molekuline struktra. Taiau DNR kartu yra ir biologins informacijos (gen) saugykla. Kaip ji organizuota vairi organizm lstelse?
Pirmiausia aptarsime eukariot DNR organizacij, nes ji yra sudtingesn nei prokariot ir
struktriniu, ir funkciniu poiriu (daugiau gen, sudtingesnis j veiklos valdymas).
Beveik visa eukariot DNR yra sutelkta branduolyje. Kartu su baltymais ji sudaro savit dinamik struktr chromatin (gr. chromos spalvotas; pavadinimas kilo dl chromatino
sveikos su daais). Chromatinas tam tikru lstels ciklo tarpsniu mitozs metu gyja dar
kompaktikesn form, i jo susidaro individualios struktros chromosomos.
Kiekvienos mogaus somatins lstels branduolyje yra 2x3,2x109 nukleotid por DNR,
pasiskirsiusi 46 chromosomose (diploidinis chromosom skaiius). Chromosomas sudaro labai ilgos DNR molekuls. I viso susidaryt ~2m ilgio 20 DNR silas. Nepamirkime, kad DNR
lstelje yra hidratuota: vienai bazi porai tenka ~ 6 vandens molekuls. Taigi, branduolyje
DNR uimamas tris dar labiau padidja. Nepaisant to, DNR telpa branduolyje, kurio skersmuo ~610mm. Kad galtume suvokti, kaip kompaktikai ji supakuota, sivaizduokime plonyt
40km ilgio sil, sutalpint teniso kamuoliuk!
Didioji dalis DNR chromatine yra struktrikai neprieinama ir funkcikai neaktyvi. Toks
chromatinas yra vadinamas heterochromatinu. Pvz., chromosom sritys, kurios yra neaktyvios (jose nevyksta gen raika transkripcija), matomos per lstels ciklo interfaz (pvz., Baro
kneliai). Tik nedidel dalis chromatino DNR sek yra aktyvios, t. y. transkribuojamos. Toks
chromatinas vadinamas euchromatinu.
Vis eukariot chromatino organizacija branduolyje yra stebtinai panai. DNR kartu su
baltymais ir kitomis molekulmis jame supakuota pagal tam tikr hierarchin sistem.
Eukariot chromatinas yra sudtingas nukleoproteinas, kur sudaro:
zz DNR,
zz baltymai histonai,
zz nehistoniniai baltymai (~1000 baltym branduolyje),
zz RNR (<10% DNR mass).
Histonai yra mai, bazinmis savybmis pasiymintys baltymai. J struktra gerai apibdinta. O nehistoniniai baltymai yra labai vari struktr ir funkcij molekuls. Dauguma nehistonini baltym, esani chromatino sudtyje, dar gana menkai ityrinti.
109
MOLEKULIN BIOLOGIJA
3.1. Nukleosoma chromatino struktrinis ir

reguliacinis vienetas
1974m. Roderis Kornbergas (Rodger D. Kornberg) pasil chromatino struktros model. Jis suformulavo nukleosom hipotez, anot kurios, chromatino pamat sudaro pasikartojantys elementai nukleosomos. Nukleosomose DNR
apsisuka apie baltym histon erd, o chromatine yra isiNukleosoma yra pagrindinis
dsiusi grandinles chromatino silus (3.1 pav. ir
chromatino struktrinis ir regu3.2pav.). Remiantis iuo modeliu buvo atliekami eukariot
liacinis elementas.
chromatino tyrimai. Jau 1975m. elektronins mikroskopijos metodu buvo gauti pirmieji kokybiki nukleosom
vaizdai. 1997m., atlikus nukleosomos kristalo didels skyros (2,8) rentgenostruktrin analiz, nustatyta nukleosomos erdvin struktra. Buvo nustatytos visos pagrindins nukleosomos molekulins struktros savybs. iuo metu nukleosom
kristalai analizuojami maesne nei 2 skyra.
Nukleosomos evoliucikai yra labai konservatyvios struktros ir aptinkamos vis
eukariot chromatine. Manoma, kad >99,5% genomins DNR galt bti nukleosomins
struktros.
3.1pav. Chromatino struktrins organizacijos lygmenys

(http://en.wikipedia.org/wiki/
File:DNA_to_Chromatin_Formation.jpg)
110
Pagrindiniai nukleosomos organizacijos principai yra ie:

zz nukleosomos baltym histon erd histon oktamer sudaro po dvi keturi ri
histon molekules: H2A, H2B, H3 ir H4;
zz nukleosomos baltym histon mas yra apytikriai lygi DNR masei, histon oktameras
susijungia su madaug 200 nukleotid por DNR;
zz histon oktameras yra kompaktika struktra, apie
Nukleosoma yra pirmasis chrokuri apsivynioja DNR;
matino organizacijos lygmuo.
zz su viena nukleosoma chromatine yra susijungusi
madaug viena jungties histono (pvz., H1) molekul.
Chromatine nukleosomos ilieka ir mitozs, ir interfazs metu. J yra euchromatine ir
heterochromatine.
Nukleosoma yra pirmasis chromatino organizacijos lygmuo. Tam, kad pasiekt didiausi DNR kondensacij, kuri mitozs metu gali siekti 10100000 kart, DNR, organizuota nukleosomas, kondensuojasi dar kelet tarpini struktr (3.1lentel, 3.1pav.). In vitro geriau
ityrintos yra dvi tokios struktros 10nm chromatino silas (fibril) ir 30nm chromatino
silas (fibril) (3.2pav.).
3.1lentel. Chromatino struktros lygmenys
Nr.
Chromatino struktra
Kompaktizacijos laipsnis*
1.
nuoga (be baltym) DNR
2.
10nm chromatino silas
67
3.
30nm chromatino silas
3040
4.
chromatino kilpa
1000
5.
mitozin chromosoma
10000100000
* Kompaktizacijos laipsnis nurodo, kiek mm DNR sutelpa vien atitinkamos chromatino struktros ilgio mm.
Auktesn DNR kompaktizacijos lygmen atitinkani chromatino struktr, pvz., chromatino kilp bei mitozini chromosom, organizacija dar nra gerai iaikinta.
Yra pasilytas ir kitas chromatino organizacijos modelis:
zz pirmj chromatino lygmen sudaro nukleosom grandinl (10nm chromatino silas);
zz antrj chromatino lygmen sudaro tarpusavyje sveikaujanios nukleosomos (30 nm
chromatino silas);
zz treij chromatino lygmen sudaro tarpusavyje sveikaujanios antrojo lygmens struktros kartu su chromatino architektroje dalyvaujaniais baltymais.
111
MOLEKULIN BIOLOGIJA
3.1.1. Molekulin nukleosomos organizacija

Nukleosomos iskiriamos tokiu bdu: suardomi lsteli branduoliai, vliau i j iskirtas
chromatinas inkubuojamas nedidels jonins jgos tirpal. Chromatinas ibrinksta, kai kur
isivynioja silo pavidalo struktr; joje elektronins mikroskopijos bdu galima irti pavienes nukleosomines daleles, kurias viena su kita jungia DNR.
Prajusio amiaus 7-to deimtmeio pradioje buvo nustatyta, kad tok i dalies ipakuot
chromatin paveikus fermentu mikrokok nukleaze endonukleaze, skaidania baltymais
neapsaugot DNR galima gauti pavieni daleli. Daleli sudtyje aptikta baltym ir ~200
nukleotid por DNR. Prieingai, veikiant mikrokok nukleaze nuog (be baltym) DNR,
buvo gauti skirting ilgi DNR fragmentai. Tai leido daryti prielaid, kad chromosomin DNR
yra apsaugota nuo nukleazi poveikio, iskyrus tam tikru periodikumu pasikartojanias jos
vietas. DNR, greiiausiai, apsaugojo baltymai. Tai leido R. Kornbergui suformuluoti jau mint
chromatino struktros nukleosom hipotez.
Paviens dalels, gautos suskaidius chromatin nukleaze, yra paviens nukleosomos. Jas
sudaro penki ri histonai H2A, H2B, H3, H4, vadinamasis jungties histonas (H1) ir
DNR molekul, kurios ilgis yra ~200 nukleotid por (3.3pav.). Po dvi H2A, H2B, H3 ir H4 histon molekules sudaro vadinamj histon erd, apie kuri apsivynioja DNR.
Ilgiau inkubuojant nukleosomas mikrokok nukleaze, vairiu laipsniu suardomi ir apie histonin erd apsivijusios DNR galai. Gaunamos nukleosomins dalels, turinios tik 165 nukleotid por DNR, chromatosomos (3.3pav.). Ilgiau veikiant mikrokok nukleaze, nuo j atsiskiria H1 histonas. Nukleaz suskaido dar ~20 nukleotid por DNR, kuri, manoma, apsaugo
jungties histono molekul.
Tokiu bdu gaunamos dalels, kuriose apie histon erd apsivyniojusi tik 146 nukleotid
por DNR. Tokios dalels yra vadinamos erdinmis nukleosominmis dalelmis (angl. nucleosome core particle). 2,8 skyros rentgenostruktrine analize pirm kart nustatyta erdins
nukleosomins dalels erdvin struktra (3.4pav.). 2003m. atlikta 1,9 skyros rentgenostruk-
3.2pav. 10nm ir
30nm chromatino silai (fibrils).
Schema (a); chromatino sil nuotraukos,
gautos elektronins
mikroskopijos metodu (b) (http://sgi.bls.
umkc.edu/waterborg/
chromat/chroma09.
html)
112
3.3pav. Laipsnikas chromatino skaidymas

mikrokok nukleaze
trin analiz (analizs duomenis galima rasti peptid duomen bazje (kodas 1AOI) interneto
adresu http://www.rcsb.org/pdb/). ia analize nustatytos visos baltym ir DNR sveikos erdinje nukleosominje dalelje bei ~3000 vandens molekuli buvimas.
3.1.2. erdin nukleosomin dalel

Rentgenostruktrine nukleosom kristal analize patvirtinta, kad nukleosomoje DNR apsiveja apie histon erd 1,65 karto kairiuoju sukimu. Nukleosoma primena cilindr, kurio
auktis yra ~6nm, o skersmuo ~11nm (3.4pav.). einanioji DNR (angl. entering DNA) ir ieinanioji DNR (angl. leaving DNA) nukleosomoje isidsiuosios netoli viena kitos.
113
MOLEKULIN BIOLOGIJA
3.4pav. erdins nukleosomins dalels struktra, nustatyta 2,8 skyros rentgenostruktrine

analize. Vaizdas i viraus (a); vaizdas i priekio (b). Rodyklmis paymti DNR ir erdiniai histonai (Nature, v.389, p. 251, 2005)
Kaip organizuotos histon molekuls nukleosomoje?

zz Histon tetrameras (H3-H4)2, sudarytas i dviej H3-H4 heterodimer, isidsto histon
erdies centre;
zz du H2A-H2B heterodimerai isidsto ties DNR spirals jimu ir ijimu erdinje
nukleosomoje.
Histon tarpusavio sveik daugiausiai lemia hidrofobin sveika. Nukleosomoje baltymams ir DNR bdinga tarpusavio elektrostatin sveika (sveikauja histon aminorgtys ir
DNR fosforo rgties liekanos), taip pat nepolin sveika (tarp aminorgi ir deoksiribozi).
Kiekvienoje nukleosomoje susidaro 142 vandeniliniai ryiai tarp histon aminorgi ir DNR,
i j madaug pus tarp aminorgi ir DNR fosforo rgties liekan. Sveika tarp histon ir
DNR heterociklini bazi nenustatyta.
Taigi, histon ir DNR sveikai nereikia savitj DNR sek: histon oktameras gali apsivyti
apie bet kuri DNR. Vis dlto DNR sveika su histon erdies baltymais pasiymi tam tikrais
struktriniais ypatumais. DNR spiralei yra sunku beveik 2 kartus apsivynioti apie histon oktamer, nes reikia suspausti DNR maj griov. A ir T poras, esanias maajame griovyje, yra
114
lengviau suspausti negu G ir C poras, todl kiekvienas histon oktameras stengiasi isidstyti
taip, kad sveikaut su A ir T poromis, esaniomis DNR spirals mauosiuose grioviuose. DNR
fragmentas, turintis daugiau A ir T por, lengviau apsivynioja apie histonus nei tas, kuriame
daugiau G ir C por (3.5pav., a). Pastarj met mogaus lsteli chromatino visuminiai tyrimai
parod, kad bent jau pirminse kraujo lstelse tik nedidels dalies nukleosom padtis yra
susijusi su tam tikromis DNR sekomis (angl. nucleosome positioning).
DNR spiralje, apsivejanioje erdinius histonus, vidutinis DNR skis yra maesnis negu
prastos B formos DNR spiralje ir talpina ~10,2 (o ne 10,5) nukleotid por. Toks pakits nukleosomos DNR spirals periodas nra toks pat visoje nukleosomos DNR, bet priklausomas nuo
DNR lenkimo (angl. bending), susidaranio jai apsivejant apie histon erd.
Chromatino veiklos valdymui labai svarbi nukleosomos
savyb yra ta, kad histon, sudarani nukleosomos
Ilindusiais ior erdini
erd, N galai yra ilind nukleosomos ior (3.4pav.,
histon N galais nukleosomos
a, b). H3 ir H2B histon molekuli galai ilenda per plyius,
sveikauja tarpusavyje. Histon
susidaranius tarp gretim DNR vij spirali maj grioN galai lemia sudtingiausi
vi (tai manoma todl, kad DNR kai kuriose vietose, kaip
chromatino struktr (30nm
jau minta, yra lenkiama), o H4 ir H2A histon N galai ilensilo) susidarym.
da per nukleosomos onus.
Nors nukleosomines daleles stabilizuoja daugelis sveik tarp histon ir DNR, nukleosomos yra dinamikos struktros. Veikiama baltym (r. 3.5.2. poskyr Chromatin pertvarkantys baltym kompleksai ir transkripcijos valdymas), histon erdis gali bti istumta i nukleosomos ir perkelta pakankamai toli DNR atvilgiu.
3.1.3. nukleosomos sudt einani histon savybs

Histon molekuli kiekvienoje eukariot lstelje yra nepaprastai daug: ~60 milijon. Histon gen kopij eukariot genomuose yra nuo 1020 pels lstelse iki keli imt jr eio
lastelse.
H3 ir H4 histonai sudaro du H3-H4 dimerus, kurie jungiasi (H3-H4)2 tetramer. Centrinio histon erdies (H3Nukleosomos histon erd
H4)2 heterotetramero pagrindas dviej H3 histon mosudaro keturi ri histon
lekuli keturi a spirali ryulys (angl. four helix bundle).
molekuls, kiekvieno tipo po
Kitas keturi spirali ryulys, kur sudaro H4 ir H2B histon
dvi, i viso atuonios.
a spirals, ria H2A-H2B dimer su H3-H4 dimeru. H2A ir
H2B histonai gali sudaryti vairius kompleksus, taiau daniausiai sudaro H2A-H2B heterodimerus.
In vitro tetrameras ir du dimerai jungiasi histon erd tam tikra tvarka: pirmiausiai jungiasi
(H3-H4)2 tetrameras, vliau prie jo prisijungia du H2A-H2B dimerai. Histon oktamero, kuris susiformuoja sveikaujant erdiniams histonams tirpale, erdvin struktra yra panai oktamero
struktr erdinje dalelje. Tai reikia, kad histon oktamero struktr lemia sveika tarp
pai histon molekuli.
115
MOLEKULIN BIOLOGIJA
3.5pav. Histon klost ir DNR sveika su histon erdimi. Nukleosomos DNR sveika su histon erdimi (a); H3 ir H4 histon erdvin struktra. a spirals ir kilpos paymtos atitinkamai a ir L (b); nukleosomos erdies histon molekuli struktrins schemos. Punktyru paymtos nestruktrizuotos baltym
dalys (c) (Encyclopedia of Life Sciences, 2001)
Histonai yra nedideli, 1015kDa baziniai baltymai, kuri sudtyje yra daug teigiamai kraut aminorgi lizino ir arginino liekan (3.2lentel). Atsivelgiant bazini aminorgi
kiek histonuose, histonai skirstomi turinius daug lizino (pvz., H1) ir turinius daug arginino
(pvz., H3).
Vis erd sudarani histon erdvin struktra yra panai. Kiekvienas erdinis histonas turi
kompaktik 70100 aminorgi domen, vadinamj histon klost (angl. histone fold)
(3.5pav., b, c). Histon klost sudaro trys a spirals: centrin didel spiral ir dvi maesns,
kurias tarpusavyje jungia L1 ir L2 kilpos. Sveika tarp erdini histon centrini spirali stabilizuoja histon heterodimerus.
Likusios erdini histon 1540 N galini aminorgi yra nestruktrizuotos. N galai
yra maiau konservatyvs nei centrins molekuli dalys. N galai ilenda nukleosomos ior
per centrin ply ir onuose per DNR mauosius griovius (3.4pav., a, b). N galai labai svarbs
chromatinio struktrai ir funkcijoms, taiau j vaidmuo skirtingas.
116
H2A histonas turi ir kintamo ilgio nestruktrizuot C gal (3.5 pav., b). Histon galuose
esanios aminorgtys yra vairiai modifikuojamos. Modifikacijos yra labai svarbios chromatino funkcijoms.
3.2lentel. Histon savybs
Histon
tipas
Molekulin mas
daltonais
Aminorgi
skaiius
Lizino ir arginino kiekis

procentais
Bendras molekuls
krvis
H2A
13960
129
11% lizino, 9% arginino
+15
H2B
13774
125
+19
H3
15342
135
+20
H4
11282
102
+16
H1
1700028000
200265
+58
Nukleosomos erdies H3 ir H4 histonai yra vieni konservatyviausi eukariot baltym vienai aminorgiai i histon molekulje pakisti reikjo ~1milijardo met (palyginkime: hemoglobino baltymo molekulei taip pat pasikeisti reikjo ~6 milijard met). H4 ypa
konservatyvus. induoli ir augal organizmai skiriasi 2 aminorgtimis. Tai, kad kiekviena
aminorgtis histon molekulse nepaprastai svarbi, patvirtino mieli histon aminorgi
mutacijos: tik pavieni aminorgi mutacijos buvo neletalios, taiau ir jos lm svarbius
gen raikos pokyius ir vairias mieli anomalijas.
Kodl histonai yra tokie konservatyvs baltymai? Viena prieasi, nulmusi i savyb,
galt bti ta, kad histonai lstelje sveikauja su DNR, kurios molekulin struktra visuose
organizmuose yra tokia pati. Kita galima prieastis: beveik visos i nedideli baltym aminorgtys dalyvauja ryiuose arba su DNR, arba su kitais baltymais.
Nors erdiniai histonai yra labai konservatyvios molekuls, daugelyje eukariot, be prast histon,
yra aptikti ir histon baltym variantai, kuriuos koduoja nealeliniai genai, o aminorgi sekos skiriasi
nuo prast histon. Histon variant vairov skiriasi tarp organizm. Erdvin nukleosom, turini
histon variantus, struktra, ypa nukleosom pavirius, skiriasi nuo prastos nukleosomos.
Geriausiai yra itirti H2A histon (H2A.Z, H2A.X, MakroH2A ir H2A.Bbd ir kt.) bei H3 histon (H3.3,
CenH3 bei kt.) variantai. Nustatyta ir H2B histono variant (3.3lentel).
Specializuoti histonai egzistuoja kartu su prastais (kanoniniais) histonais ir sudaro nukleosomas.
Tiesa, jie sintetinami ne per S faz j sijungimas nukleosomas nepriklauso nuo DNR sintezs kaip
prast histon.
H2A.Z histonas yra gyvybikai svarbus daugeliui organizm (Drosophilla, Tetrahymena, pels), taiau jo funkcija nra iki galo iaikinta. Histonas aptinkamas ir ties aktyviai transkribuojamais genais, ir
ten, kur gen raika slopinama.
Esant DNR paaidoms (dvigrandiniams trkiams), H2A.X histono C gale fosforilinama serino aminorgties liekana. Histon fosforilina ATM bei kitos kinazs, kurios telkiamos trki vietose. is histonas atsitiktiniu bdu pasiskirsts chromatine, kur nukleosomose pakeiia H2A histon. Histon fosforilinimas iplinta nuo DNR paaidos vietos nuo tkstani iki milijon nukleotid por. Tada prie fosforilint histon telkiami reparacijos kompleksai. Taigi, H2A.X yra vienas ankstyvj DNR paaid jutikli.
117
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Neaktyvios induoli X chromosomos taip pat turi vien i histon variant macroH2A, kuris yra
bent tris kartus didesnis u H2A histon.
H2A.Bbd (angl. bar body deficient) histonas, prieingai, neaptinkamas neaktyviojoje X chromosomoje. H2A.Bbd aminorgi seka labai skiriasi nuo H2A histono. H2A.Bbd yra tose chromatino
srityse, kuriuose vyksta transkripcija.
Vienas histon variantas CenH3 iskirtinai bdingas heterochromatinui, kuris yra chromosom
centromer srityse. mogaus CenH3 histonas CENP-A. CENP-A yra btinas histonas centromeroms
susidaryti. Jo aminorgi seka tik ~46% identika H3. Susidarius centromer nukleosomoms, prie
j prisijungia savitieji centromer baltymai (CENP-B ir CENP-C), o toliau formuojasi kinetochorai
struktros, prie kuri tvirtinasi mitozins verpsts mikrovamzdeliai.
induoli organizmuose nustatyti H3 variantai H3.1 ir H3.2, besiskiriantys tik viena aminorgtimi.
Jie atlieka H3 histon vaidmen nukleosomose.
H3.3 histonas skiriasi nuo H3 trimispenkiomis aminorgtimis. Pakeitus H3 histon H3.3 histonu, aktyvinama gen raika, kuri iki tol buvo slopinama dl H3 histono lizino, esanio 9-oje padtyje,
metilinimo.
Nra daug inoma, kaip specializuoti histonai pakliva savo viet chromatine. Tai, kad vairs erdini histon variantai aptinkami tam tikrose chromatino vietose, liudija apie evoliucin chromatino
adaptacij.
3.3lentel. induoli histon variantai, lokalizacija ir funkcijos1
Histonas
H2A
H2A.X
Lstels ciklo faz, kurios

metu vyksta histono sintez
S
ne S
Lokalizacija
Funkcija
Visame genome
Visame genome ties DNR
paaidomis
Visame genomea
erdinis histonas
DNR reparacija, genomo
integralumas
Gen raikos aktyvinimas, slopiniH2A.Z
ne S
mas, chromosom padalijimas
H2A.Bbd
Nenustatyta
Nra Xi (neaktyviojoje X
Gen raikos aktyvinimas (?)
chromosomoje)
Replikacija
MacroH2A1.1
Nenustatyta
Xi
Xi chromosomos iaktyvinimas,
gen raikos slopinimas (?)
MacroH2A1.2
Nenustatyta
Xi
MacroH2.A2
Nenustatyta
Xi
H2B
S
Visame genome
erdinis histonas
Nenustatyta
Telomerose
Nenustatyta
spH2Bb
H2BFWT
Nenustatyta
Telomerose (?)
Nenustatyta
Nenustatyta
Nenustatyta
Nenustatyta
hTSH2Bb
S
Nenustatyta
Nenustatyta
H3.1c
S
Nenustatyta
Nenustatyta
H3.2c
H3.3
ne S
Euchromatine
Gen raikos aktyvinimas
S (?)
Nenustatyta
Nenustatyta
H3.1tb
CenH3
ne S
Centromerose
Chromosom padalijimas
H4
S
Visame genome
erdinis histonas
a S. cerevisiae H2A.Z telkiasi ties euchromatinoirheterchromatino riba ir, manoma, tokiu bdu apsaugo nuo heterochromatino plitimo euchromatino sritis;
b sintetinamas sklidse;
c H3.1 ir H3.2 induoli organizmuose skiriasi tik viena aminorgtimi, jie yra kanoniniai histonai, todl danai vadinami tiesiog H3.
Pagal: E. Bernstein and S. B. Hake. Biochem Cell Biol, 2006; A. Loyola and G. Almouzni. Trends Biochem Sci, 2007.
118
Kitaip nei daugelio baltym, kurie sintetinami per lstels ciklo interfaz, pagrindini histon sintez vyksta per S faz, kai vyksta ir DNR replikacija. S fazs metu histon iRNR kiekis
iauga apie 5 kartus (tai lemia bent du veiksniai: padidjusi transkripcija ir padidjs iRNR stabilumas). Baigiantis S fazei, kai baigiasi ir DNR replikacija (arba esant DNR sintezs slopikli),
pagrindini histon iRNR stabilumas staigiai krinta, iRNR suskaidomos per kelias minutes. Histon variantai daniausiai sintetinami ne per S faz (3.3lentel).
Histon molekuls yra labai stabilios ir gali tokios ilikti vis lstels ami. Ryys tarp histon ir DNR sintezs yra labai glaudus. Jis utikrinamas grtamosios kontrols (angl. feedback)
principu: lstelje nustatomas laisv histon kiekis ir i to sprendiama, kiek reiks sintetinti
nauj histon, kad j utekt susidaryti nukleosomoms i naujai replikuotos DNR.
3.1.4. Histon aminorgi modifikacijos ir j biologin

reikm
H2A, H2B, H3, H4 histon, jungties histon, histon variant molekuls po transliacijos yra
modifikuojamos prie aminorgi kovalentiniais ryiais prijungiant vairi chemini struktr
grupes ar baltymus (angl. post-translational modifications, PTMs). Histonuose modifikuojamos
savitos aminorgtys savitose padtyse. Modifikuojama >160 aminorgi liekan (modifikacijos nustatytos su savitaisiais antiknais ir masi spektrometrija). Daugiausiai modifikuot
histon yra molekuli N galuose, kurie ilenda nukleosom paviri. Taiau rasta modifikacij
ir nukleosomos viduje. Parodyta, kad erdies histonai gali bti modifikuojami ir nesimetrikai
viena to paties histono molekul modifikuojama, kita ne.
Taigi, modifikacij kombinacij skaiius gali bti didiulis.
Histon modifikacijos yra labai
Histon aminorgi modifikavimas valdomas disvarbios chromatino struktnamikas procesas, vykstantis per vairius lstels gyveniros sudarymui ir gen veiklos
mo tarpsnius: chromatino susidarym, tam tikr chromativaldymui.
no srii gen transkripcij, mitoz, vystymsi.
Nustatyta daugiau nei deimt skirting histon aminorgi modifikacij:
zz acetilinimas;
zz metilinimas;
zz fosforilinimas;
zz ADP-ribozilinimas;
zz deimininimas;
zz baltymo ubikvitino prijungimas;
zz baltymo SUMO prijungimas;
zz krotonilinimas;
zz tirozino hidroksilinimas;
zz prolino izomerizacija;
zz biotinilinimas.
119
MOLEKULIN BIOLOGIJA
vairiausiai histonuose modifikuojamos lizino aminorgi liekanos (3.4lentel). Histonai

sintetinami citozolyje, vliau i j branduolyje sudaromos nukleosomos. Kai kurios modifikacijos vyksta citozolyje tuoj po baltym biosintezs, taiau dauguma branduolyje, histonams
jau esant nukleosom sudtyje. Branduolyje sutelkta dauguma histon aminorgi modifikacijas vykdani bei jas paalinani ferment.
3.4lentel. Kai kurios histon aminorgi kovalentins modifikacijos
Ubikvitino prijungimas
SUMO
prijungimas
ADP-ribozilinimas
Ser
Thr
Lys
Lys
Glu
Asp
Arg
Pro-cis
Pro-trans
H4
H1
Funkcija
Transkripcija,
reparacija,
replikacija,
kondensacija
Transkripcija,
reparacija
Transkripcija,
reparacija,
kondensacija
Transkripcija,
reparacija
Transkripcija
Transkripcija
Transkripcija
Transkripcija
Histon
tipas
Acetilinimas
Metilinimas
Fosforilinimas
Modifikuojamos
aminorgtys
Lys
Lys
Arg
H2A
H2B
H3
Deimininimas
Prolino
izomerizacija
N nenustatyta.
Histon acetilinimas. Pagrindinis acetilinimo taikinys histonuose yra aminogrups

lizino aminorgtyse, esaniose histon molekuli N galuose (3.6pav., a). Acetilgrups prijungimu panaikinamas neigiamas lizino onins aminogrups krvis. Acetilinimas nustatytas
visuose erdiniuose histonuose, taiau nenustatytas H1 histone. Dar 1964m. VincentasAlfris
(Vincent G. Alfrey) ir kt. ityr, kad in vitro acetilinti histonai slopina nuo DNR matricos vykstani RNR sintez maesniu laipsniu negu neacetilinti. Vliau atlikti tyrimai patvirtino, kad
chromatino vietose, kuriose vyksta gen transkripcija, yra daug acetilint histon. Pvz.,
aktyviai transkribuojamame chromatine buvo acetilinamos tos aminorgtys, kurios nebuvo
acetilinamos nuolat neaktyviame (konstitutyviajame) heterochromatine histonuose (hipoacetilintame chromatine). Pakeitus mieli H4 histono acetilinamas lizino aminorgi liekanas
arginino aminorgi liekanomis, vyko mieli tam tikr gen transkripcijos slopinimas. m
aikti akivaizdi ssaja tarp histon acetilinimo ir gen transkripcijos valdymo.
Tik 1996m. pirm kart buvo aptiktas eukariotini organizm fermentas, acetilinantis histon molekules, histon acetiltransferaz, HAT (angl. histone acetylransferase). Vliau rasta
daug baltym, pasiymini histon acetiltransferaziniu aktyvumu. Nustatyti ir modifikacij
panaikinantys fermentai histon deacetilazs, HDAC (angl. histone deacetylase). Remiantis
ankstesniais tyrimais, visiems iems baltymams buvo priskiriamos transkripcijos aktyvikli ar
represori funkcijos.
120
HAT veikia ne pavieniui, o bdama dideli lstels baltymini kompleks sudtyje

(pvz., RNR Pol II transkripcijos komplekse). Pirmiausia nustatyta, kad histon acetiltransferaziniu aktyvumu pasiymi mieli gen transkripcijos aktyviklis GCN5 baltymas. Parodyta, kad
jis jungiamas 1,8MDa kompleks (SAGA), kurio komponentai sveikauja su DNR ir dalyvauja
transkripcijoje. Histon acetiltransferaziniu aktyvumu taip pat pasiymi pagrindinio eukariot
RNR II polimerazs transkripcijos veiksnio TFIID subvienetas TAFII250, mogaus gen transkripcijos aktyviklis p300/CBP, mieli gen transkripcijos aktyviklis Nut1 baltymas. Pastarasis
yra mediatoriaus komplekso, dalyvaujanio eukariot gen transkripcijoje, sudtyje (r. skyri
RNR biosintez). Neretai transkripcijos kompleksuose yra ne viena, bet kelios skirtingo atrankumo histon acetiltransferazs.
iuo metu yra inoma apie 20 eukariot baltym, pasiymini histon acetiltransferaziniu
aktyvumu. Jie yra skirstomi kelias histon acetiltransferazi eimas (GNAT, MYST, p300/CBP,
GCN5/PCAF, kt.). Chromatino imunoprecipitacijos ir chromatino sekoskaitos (angl. chip
seq) ekperimentai, kuriuose buvo naudojami acetilintoms histon formoms savitieji antiknai,
parod, kad HAT fermentai daniausiai modifikuoja histonus ties gen promotori sritimis.
Histon acetilinimo pasekms yra tokios:
zz nukleosomoje susilpninami ryiai tarp DNR bei histon, ir tokiu bdu palengvinamas
tolesnis transkripcijos aktyvikli jungimasis (3.6pav., b);
zz sukuriamos savitos atpainimo vietos baltymams, dalyvaujantiems transkripcijoje
(3.14pav., b).
3.6pav. Lizino acetilinimas histonuose ir jo poveikis chromatinui. Lizino e aminogrups acetilinimas.

Acetilgrup apibrta raudonai (a); acetilinimo poveikis suminiam erdies histon teigiamam krviui ir
transkripcijai. HAT histon acetiltransferaz, TF transkripcijos veiksnys, pol II holo RNR II polimerazs holofermentas (b)
121
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Histon acetilinimas gali vykti ne tik ties pavieni gen promotori sritimis, bet ir didelse
chromatino srityse.
H3 ir H4 histon molekuli N galai yra acetilinami konservatyviose padtyse (3.7pav.). H3
lizinas 14 ir H4 lizinai 8 ir 16 acetilinami branduolyje A grups HAT ferment. is histon acetilinimas susijs su gen transkripcijos aktyvinimu.
Prieingai, H4 histono lizinai 5 ir 12 acetilinami citozolyje, kai sintetinamos naujos histon
molekuls, dar iki joms susiformuojant nukleosomas. ias modifikacijas vykdo B grups histon acetiltransferazs. Citozolyje modifikuoti histonai surenkami nukleosomas, o acetilgrups
histonuose greitai paalinamos histon deacetilazi. is acetilinimo citozolyje pavyzdys liudija,
kad acetilinimas susijs ne tik su transkripcija branduolyje, bet ir su nauj nukleosom susidarymu replikacijos metu.
Nustaius funkcin ry tarp histon acetilinimo ir gen transkripcijos, buvo parodyta,
kad histon deacetilinimas sukelia gen transkripcijos slopinim, o daugelis baltym,
anksiau laikyt tik transkripcijos represoriais, pasiymi deacetilaziniu aktyvumu. Beveik visuose organizmuose transkripcikai neaktyvus chromatinas yra hipoacetilintas. Ryys tarp
chromatino funkcinio aktyvumo ir histon acetilinimo / deacetilinimo akivaizdus mielse: sir
gen produktai, baltymai Sir2, Sir3, Sir4, dalyvauja susidarant chromatino tyliosioms sritims
bei telomerinms sritims. Sir3 ir Sir4 baltymai prisijungia prie deacetilint histon in vitro. Sir2
baltymas yra nuo NAD+ priklausoma histon deacetilaz. Taiau ne viskas taip paprasta: nustatytas ir prieingas histon acetilinimo poveikis transkripcijai. Mielse bei drozofiloje H4 histono
lizino aminorgties liekanos (12 padtyje) acetilinimas sukelia gen transkripcijos slopinim.
3.7pav. Kai kurios erdini histon aminorgi modifikacijos. Modifikacij trumpiniai: ph fosforilinimas, ac acetilinimas, me metilinimas, ub1 baltymas ubikvitinas (Nature Structual Molecular
Biology. v.14, p.1008, 2007)
122
Neacetilinti histonai bdingi heterochromatinui. ia savybe pasiymi tiek konstitutyvusis

heterochromatinas (centromerose ir telomerose), tiek fakultatyvusis heterochromatinas
(neaktyvus vienose lstelse, taiau aktyvus kitose).
HAT koduojani gen ikritos ir mutacijos lemia vairius embriogenezs sutrikimus (nustatytus eksperimentais su pelmis), taip pat yra susijusios su mogaus tam tikrais piktybiniais navikais
(pvz., mutacij sukeltas sutriks histon acetilinimas yra susijs su daugeliu leukemijos ri).
Pagrindiniai neatsakyti klausimai apie histon acetilinim ir jame dalyvaujanius fermentus
yra tokie: kaip atrankiai atpastama viena ar kita aminorgtis histonuose, kuri reikia acetilinti? Kodl vienas aminorgtis acetilina vienos grups HAT, o kitas kitos? Ar lizin krvio panaikinimas juos acetilinant lygiai taip pat susilpnina histon ir DNR bei nukleosom tarpusavio
ryius lstelje, kaip tai nustatyta in vitro?
Histon fosforilinimas. Histonuose fosforilinamos serino ir treonino aminorgi liekanos (3.7pav.). Fosforilinimo reakcijas vykdo fermentai kinazs. Manoma, kad histon, ypa H1
ir H3, fosforilinimas yra susijs su chromosom kondensacija mitozs metu. Pvz., H1 histonas
fosforilinamas sukultrintose lstelse prasidjus mitozei ir greitai defosforilinamas po anafazs. is histonas yra Cdc2 kinazs, kuri dalyvauja lstels dalijimosi valdyme, substratas. Taigi,
histon fosforilinimas-defosforilinimas yra ciklikas. Histonus defosforilina fosfatazi 1 bei
2 eim fosfatazs (PP1, PP2).
Neblogai ityrintas yra H3 histono serino aminorgties liekanos 10-oje pozicijoje fosforilinimas. Panaudojus savitus antiknus prie ioje pozicijoje fosforilint serin, buvo nustatyta,
kad modifikacija stipriai koreliuoja su chromosom kondensacija mejozs ir mitozs metu.
Ssaj tarp H3 histono fosforilinimo ir chromatino supakavimo patvirtina eksperimentai su
pirmuonimi Tetrahymena. Tetrahymena mutante, kurio H3 10-oje pozicijoje esanti serino liekana negaljo bti fosforilinama, nenormaliai vyko chromosom kondensacija bei padalijimas.
Iveiklinus (angl. knockout) Jil-1 kinazs, kuri fosforilina Ser 10 H3 histone, gen, pasekms D.
melanogaster buvo letalios: prie vant musi lervoms, j politenins chromosomos buvo
ypa kondensuotos. Taigi, H3 fosforilinimas slygoja normalios kondensacijos chromatino
susidarym.
Eksperimentiniai duomenys liudija, kad i histon modifikacija yra susijusi ir su gen transkripcijos aktyvinimu. Pvz., H3 histono fosforilinimas koreliuoja su c-jun, c-fos, c-myc onkogen transkripcijos aktyvinimu. Tiriant fosforilint histon pasiskirstym mielse chromatino
imunoprecipitacijos metodu, rasta, kad fosforilinti histonai pasiskirst ne tolygiai, bet ties tam
tikrais genais.
Jau minta, kad H2A.X histono fosforilinimas yra svarbus DNR dvigrandini trki reparacijai.
Histon metilinimas. Histonuose metilinami lizinai ir argininai, daniausiai histon H3
bei H4 molekuli N galuose (3.7pav.). Metilinimas nesumaina bendro lizino teigiamo krvio,
kaip acetilinimo atveju. In vivo lizin aminorgi liekanos gali bti mono-, di- arba trimetilintos (3.8 pav.), o arginin mono- arba dimetilintos (3.9 pav.). Tokia metilinimo derini
vairov utikrina vairias su chromatino veikla susijusias funkcijas.
Histonus metilina savita ferment grup histon metiltransferazs, HMT (angl. histone
methyltransferase). Histon metiltransferazs yra vieni atrankiausi inom ferment. Lizinus
metilina lizin metiltransfereazs, o argininus arginin metiltransferazs. Mono-, di-, trimeti-
123
MOLEKULIN BIOLOGIJA
3.8pav. Lizino aminogrups mono-, di-, trimetilinimo reakcijos. SAM S-adenozilmetioninas,

SAH S-adenozilhomocisteinas (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 8, p.307, 2007)
linimo funkcijas atlieka skirtingi fermentai. Vis iki iol atrast histon metiltransferazi substratas S-adenozilmetioninas. Pirmosios histon metiltransferazs atrastos palyginti neseniai (2000m.). iuo metu jau inomos bent kelios arginino metiltransferazs ir daugelis lizino
metiltransferazi.
Skirting histon metilinimas yra susijs su skirtingomis chromatino funkcijomis. Pirmiausiai nustatyta, kad H3 Lys9 metilinimas yra susijs su gen veiklos slopinimu ir yra kondensuot chromatino srii, tarp j ir heterochromatino, savyb. Pvz., E ciklino promotoriaus
aktyvumas slopinamas lstels ciklo G1 fazje dl lizino, esanio 9-oje padtyje, metilinimo.
Pereinant i G1 S faz i modifikacija turi bti panaikinta, kad vykt E ciklino geno raika. Mielse Lys4 pozicijoje metilinti H3 histonai yra tyliosiose chromatino srityse. Taiau kai kuriuose
eukariotuose (mielse) Lys4 metilinimas H3 histone yra susijs su gen transkripcijos aktyvinimu. Manoma, kad ne tiek metilinimo padtis histon molekulse, kiek metilinimo laipsnis turi
didesns takos funkcinms modifikacij pasekmms.
3.9pav. Arginino mono-, dimetilinimas. SAM S-adenozilmetioninas, SAH S-adenozilhomocisteinas

(Genes and Development, v. 15, p.243, 2001)
124
Iki iol manyta, kad histon metilinimas, kitaip nei acetilinimas ir fosforilinimas, yra ilgalaik
ir negrtama histon molekuli modifikacija. Taiau 2010m. pirm kart rastas fermentas, demetilinantis H4 Lys20. In vitro galima atrankiai demetilinti mono- bei dimetilint lizino liekan
reakcij katalizuoja mogaus fermentas poliamino oksidaz (LSD1).
Deimininimas. Deimininimo reakcijos metu argininas veriamas citrulinu. H3 ir H4 histon arginino liekanos veriamos citrulinu dalyvaujant fermentui peptidilarginino deiminazei 14
(PAD14). PAD14 gali deimininti ir monometilint arginin (3.10pav.).
Ubikvitino ir SUMO baltym prijungimas. i baltym prijungimas yra didiausios histon aminorgi liekan modifikacijos. Ubikvitino (lot. ubque bet kur, visur) yra gausu
eukariot lstelse; tai nedidelis 76 aminorgi baltymas, kuris gali bti kovalentiniu ryiu
jungiamas prie vairi substrat keli fermentini reakcij (fermentins kaskados) keliu. Kai
prijungiamos kelios io baltymo molekuls (t. y. vyksta poliubikvitilinimas), daniausiai tokia modifikacija signalizuoja apie baltymo suardym. Taiau ubikvitino prijungimas taip pat
gali bti signalas plazmins membranos baltym endocitozei arba baltymo konformacijos
pasikeitimui.
Histon molekulse ubikvitino baltymas jungiamas daniausiai j C gale prie lizino aminorgi liekanos izopeptidiniu ryiu (3.11 pav., b, c). Fermentas, kuris jungia ubikvitin
prie H2B histono Lys123 Rad6, pirm kart rastas mielse. induoli lstelse ~10% H2A
ir ~1,5% H2B histon turi prijungt po vien ubikvitino baltymo molekul, t. y. histonai yra
monoubikvitilinti.
Nustatyti modifikacij panaikinantys fermentai deubikvitilazs. H2A ir H2B histon monoubikvitilinimo pasekms chromatino funkcijoms yra skirtingos. H2A ubikvitilinimas labiau
susijs su gen raikos slopinimu, o H2B ir su aktyvinimu, ir su slopinimu. Fermentai, ubikvitilinantys ir deubikvitilinantys histonus, yra dideliuose baltym kompleksuose.
Prie histon lizino jungiamas ir kitas, ubikvitin panaus 101 aminorgties baltymas
SUMO (angl. small ubiquitin-related modifier). Tarp SUMO ir ubikvitino baltym 18% aminorgi yra vienodos, baltym erdvins struktros taip pat panaios (3.11pav., a). SUMO prie
baltym yra jungiamas taip pat fermentins kaskados keliu. SUMO prijungimas prie H4 histono aminorgi liekan in vivo ir in vitro transkripcij slopino sukl nuo proteosomos
priklausom transkripcijos veiksni suardym. Parodyta, kad SUMO geno iveiklinimas (geno
ikrita) mielse panaikino heterochromatino slopinim sukl Lys4 metilinim ir aktyvino
transkripcij.
3.10pav. Arginino deimininimas (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 8, p.307, 2007)
125
MOLEKULIN BIOLOGIJA
3.11pav. Ubikvitino ir SUMO baltymai bei j jungimas prie histon. Ubikvitino ir SUMO baltym erdvins struktros (a) (Cell Molecular Life Sciences, v.69, p.3269, 2012); nukleosomos, kurioje ubikvitilinti du
H2B histonai, erdvin struktra (b); izopeptidinis ryys tarp histono lizino e aminogrups ir ubikvitino (c)
Histon ADP ribozilinimas. i modifikacija konservatyvi stuburiniuose, taiau neaptikta

mielse. Ji gali bti mono- arba poli- formos. Gali bti modifikuojami visi erdiniai histonai
ir jungties histonas. Modifikacijas vykdo MART baltymai monoADP riboziltransferazs ir
PARP baltymai poli (ADP) polimerazs. Pirmieji fermentai prijungia monoADP ribozs liekan, o antrieji akotas poli (ADP) ribozs grandines prie glutamato (Glu) ir aspartato (Asp)
histon aminorgi liekan karboksigrupi (3.12pav., b). Modifikacija yra grtama: akotas poli (ADP) grandines lstelje hidrolizuoja poli (ADP) ribozs glikohidrolaz (PARG)
arba ribozilbaltymo liaz. Nustatyta, kad poli (ADP) ribozilintas chromatinas yra maiau kondensuotas. Tai pasitarnauja transkripcijai (3.12pav., a), nukleosom dinamikai, DNR reparacijai,
replikacijai.
126
3.12pav. Histon ADP ribozilinimas. Histon ADP ribozilinimo pasekms transkripcijai (a); poli (ADP)
ribozs jungimas dalyvaujant poli (ADP) polimerazei PARP-1. aliomis rodyklmis paymtos hidrolizs
dalyvaujant glikohidrolazei (PARG) vietos (b) (Journal of Cell Science, v.117, p.6815, 2004)
Prolino izomerizacija. Prolino aminorgties liekanos pasiymi cis arba trans konformacija. ie
konformaciniai pokyiai gana stipriai veikia polipeptid grandin. Mielse rastas fermentas FPR4, kuris vykdo prolino izomerizacij H3 histone. Prolino izomerizacija gali bti reikalinga atpainti ir metilinti H3 lizino aminorgties liekan 36-oje padtyje.
Lizin krotonilinimas. 2011m. didelio naumo chromatino analizs metodais rastos dar 67 naujos histon modifikacijos, dalis j krotonilinti lizinai (Kcr). i konservatyvi modifikacija aptikta gen
promotori ir stiprikli srityse. Vykstant spermatogenezei, po mejozs, Kcr ymi laikinas transkripcikai
aktyvi gen sritis lytinse chromosomose.
Histon biotinilinimas yra kovalentinis vitamino biotino prijungimas prie histon lizino aminorgi liekan. i histon modifikacija atrasta pastaraisiais metais. Reakcij nepriklausomai vykdo
bent du fermentai biotinidaz ir holokarboksilazs sintetaz. Spjama, kad biotinilinami vis tip
histonai, nors kol kas nustatytos tikslios modifikuot lizino aminorgi liekan padtys tik H3, H4,
H2A histonuose. Biotinilinimas siejamas su lsteli proliferacija, gen slopinimu, atsaku DNR paaidas bei apoptoze. Nustatyta, kad esant dvigrandins DNR trki, kuriuos sukelia prievinis vaistas
etopozidas, H4 histonuose maja Lys12 biotinilinimo laipsnis. Biotinilinimas gali bti atsakas DNR
paaidas.
127
MOLEKULIN BIOLOGIJA
3.1.5. Histon kovalentini modifikacij kodo hipotez

Nukleosomins dalels, kuriose histonai yra modifikuoti, erdvin struktra nedaug skiriasi
nuo nukleosomins dalels, sumontuotos in vitro i DNR bei rekombinantini histon baltym
(susintetint E. coli bakterijoje ir neturini modifikacij) erdvins struktros. Tai liudija, kad
histon aminorgi modifikacijos svarbios ne tiek nukleosomos struktrai susidaryti ir/ar
palaikyti, kiek kitiems biologiniams vyksmams.
2000m. Brajanas tralis (Brian D.Strahl) ir Devidas Alis (David C.Allis), remdamiesi iniomis
apie histon molekuli modifikacij vairov ir j savitum,
suformulavo modifikacij kodo hipotez. Hipoteze teigiaHiston kodo hipotez teigia,
ma, kad chromatine egzistuoja histon modifikacij kokad egzistuoja histon modidas, kur skaito baltymai ir kitos molekuls, sveikaujanfikacij kodas molekuliniai
ios su chromatinu, ir tokiu bdu valdo chromatino veikl.
ymenys, kuriuos atpasta
ios hipotezs esm yra ta, kad histon modifikacijos ir/ar
baltymai ir kitos molekuls,
j deriniai yra molekuliniai ymenys, kuriuos atpasta kiti
sveikaujanios su chromatinu,
lstels komponentai ir kurie lemia konkreius biologinius
ir lemia vyksmus, kurie valdo
vyksmus, pvz., transkripcijos aktyvinim arba slopinim,
chromatino veikl.
mitoz, nauj histon susijungim su replikuota DNR ir t.t.
Histon kodo signalai gali bti:
zz trumpalaikiai, reikalingi aktyvinti arba slopinti individuali gen transkripcij;
zz stabils chromatino ymenys, slygojantys chromatino bsen, kuri paveldima epigenetiniu (ne DNR mutacij) keliu.
3.13pav. Histon modifikacij kodo pavyzdys. Deinje pateikta H3 ir H4 histon kai kuri modifikacij galima biologin reikm
128
Dalies konkrei modifikacij biologin reikm yra iaikinta: pvz., dvigubai acetilintas H4
histonas 9-oje padtyje N gale atpastamas baltymo, kurio reikia gen raikai vykti; metilinta lizino liekana H3 histone lemia chromatino susipakavim, kuris slopina gen raik, ir t.t. (3.13pav.).
Histon kodo hipotez paremia ie faktai:
Pirma, tam tikri baltymai atrankiai jungiasi prie modifikuot histon. Pvz., grup baltym,
kurie turi ~100 aminorgi savit konservatyv domen bromodomen, domenu atrankiai jungiasi su acetilintomis histon aminorgtimis. Bromodomeno struktrai bdingas keturi a spirali ryulys (3.14pav., a). Bromodomen turi transkripcijos aktyvikliai, kuri sudtyje
yra HAT (jau minti p300, GCN5, PCAF ir kiti baltymai). Kai kurie baltymai turi vadinamj dvigub bromodomen juo jungiasi prie dviej acetilint lizin. Pirm kart i savyb nustatyta eukariot transkripcijos veiksnio TFIID baltyme TAF1. Kita grup baltym, sveikaujani su chromatinu, turi savit ~60 aminorgi domen chromodomen, kuriuo sveikauja su metilintu lizinu (3.14pav., b). Pvz., chromodomen turi histon metiltransferazs, kiti chromatino
slopinime, pertvarkoje dalyvaujantys baltymai. Su metilintais lizinais ir argininais atrankiai s-
3.14pav. Baltym domenai, kuriais jie sveikauja su modifikuotomis histon aminorgtimis.

Bromodomeno ir acetilinto lizino komplekso erdvin struktra (a) (PDB: 1e6i); chromodomeno ir metilinto lizino komplekso erdvin struktra (b) (PDB: 1KNA); baltym, turini bromodomen (TAFII, PCAF,
GCN5) arba chromodomen (HP1), sveikos su chromatinu schema ir poveikis transkripcijai (c)
129
MOLEKULIN BIOLOGIJA
3.15pav. Histon modifikacij tarpusavio ryi pavyzdiai. H3 histono Ser10 fosforilinimas skatina to
paties histono Lys14 acetilinim, kur vykdo acetiltransferazin aktyvum turintis transkripcijos veiksnys
GCN5 (a); H2B histono Lys120 monoubikvitilinimas skatina Lys4 trimetilinim H3 histone, kur atlieka baltym kompleksas Set1-COMPASS. Metilinimas slopinamas, jeigu yra vyks netoli esanio arginino metilinimas (b) (Cell, v. 142, p. 683, 2010)
veikaujani baltym domen rasta ir daugiau PHD, Tudor, kt. inomi saviti domenai, kuriais
baltymai jungiasi prie fosforilint, ubikvitilint aminorgi histonuose. Baltyminiuose kompleksuose, sveikaujaniuose su chromatinu, gali bti ne vienas, o daugiau baltym, turini
vairi savit domen, kuriais sveikauja su histon modifikacij kombinacijomis moduliais.
Antra, iaikinti sudtingi tarpusavio ryiai (angl. histone crosstalk) tarp histon modifikacij: viena modifikacija gali priklausyti nuo kitos modifikacijos tame paiame histone (cis padtyje) ar/ir nuo modifikacijos kitame histone (trans padtyje) (3.15pav., ab).
3.2. 10nm ir 30nm chromatino silai

Atskiros nukleosom dalels gaunamos ipakuot chromatin veikiant mikrokok nukleaze. Taiau paviens nukleosomos lstelje paprastai neegzistuoja. Inkubuojant chromatin
nedidels jonins jgos tirpale, elektronins mikroskopijos bdu matomos sil pavidalo
~ 10 nm skersmens struktros, kuriose nukleosomas jungia DNR (3.2 pav., b). Tokioje struktroje nukleosomos isidsiusios reguliariai. Struktrai susidaryti nereikia jungties histono
molekuli, taiau j reikia kompaktikesnei struktrai 30nm silui susidaryti. Taigi, 10nm
silas susidaro tik dl pai nukleosom savybi. Nra aiku, ar tokia struktra egzistuoja
in vivo ar tra chromatino dekondensacijos in vitro pasekm. 10nm chromatino sile esanios
DNR kondensacijos laipsnis yra ~67, t.y. kiekvienas tokios struktros ilgio mikrometras talpina 67 mikrometrus DNR.
DNR, nukleosominje grandinje skirianti vien nukleosomin dalel nuo kitos, yra vadinama jungties DNR, arba DNR jungtuku. Jungtuko, skirianio nukleosomines daleles, ilgis vairi
organizm chromatine ir net to paties organizmo vairi tip lstelse skiriasi, taiau tai neturi
didels reikms nukleosomoms ir chromatinui susidaryti. Pvz., mieli chromatine jungtuk
130
3.16pav. 30nm chromatino silo

solenoido ir zigzago modeliai. Kairje 30nm chromatino struktros in vitro
elektronins mikroskopijos nuotrauka (L.
A. Allison. Fundamental Molecular Biology,
sudaro ~ 20 nukleotid por DNR, o jros eio ~ 100 nukleotid por DNR. induoli neuronuose nukleosomos yra labai glaudiai supakuotos, be jungtuk, o greta esaniose glijos
lstelse jas skiria 34 nukleotid por DNR.
DNR, apsivijusi apie histon oktamer (erdinje nukleosominje dalelje), ir DNR jungtukas nukleosom kartotje i viso sudaro apie 200260 nukleotid por. Jungties histonus galima paalinti i chromatino veikiant j 0,30,45M NaCl tirpalu, H2A ir H2B histonus veikiant
chromatin ~0,8M NaCl tirpalu, o histon (H3-H4)2 tetramer veikiant chromatin 1,2M NaCl
tirpalu.
Nedidels jonins jgos tirpale chromatinas isivynioja 10nm sil, kuriame elektroniniu
mikroskopu aikiai galima pamatyti atskiras nukleosomas. Padidinus tirpalo jonin jg, galima stebti dar vien chromatinui in vitro bding struktr 30nm sil (3.2pav., b). 30nm
chromatino sile DNR kondensacijos laipsnis siekia ~40.
Yra pasilyti solenoido ir zigzago, taip pat kiti 30nm chromatino silo modeliai (3.16pav.).
Solenoido modelyje nukleosomos grandinl sukasi apie tariam a, o nukleosomos isidsto
nuosekliai viena greta kitos. is modelis dar vadinamas vieno starto modeliu.
Zigzago modelyje nukleosomos isidsto zigzagu: viens nukleosom grandinls nukleosomos sveikauja su kaimyninmis kitos grandinls nukleosomomis ir tokiu bdu 30nm sil
formuoja dvi nukleosom grandinls. Kitaip is modelis dar vadinamas dviej start modeliu.
2014m. 11 skyros krioelektronins mikroskopijos metodu atlikta in vitro suformuotos struktros, kuri sudar 12 nukleosom (kartu su jungties histonu H1) grandinl, analiz. I gaut mikroskopijos duomen (3.17pav., a) padaryta ivada, kad struktra yra zigzago formos, atitinkanti
dviej start model (3.17pav., b). Remiantis ia ivada, pasilyta 30nm chromatino silo struktra, kurioje dvi nukleosom grandinls sukasi viena apie kit kairiuoju sukimu (3.17pav., c).
30nm chromatino sile tarp nukleosom, manoma, yra vidutinikai po vien H1 histono
molekul (3.16pav.). Apie H1 histono isidstym chromatine i pradi sprsta i biochemini eksperiment su mikrokok nukleaze. Suskaldius chromatin, gautos chromatosomos,
kuriose yra histon erdis, 165 nukleotid por DNR ir histono H1 molekul. Toliau veikiant mikrokok nukleaze paalintas jungties histonas H1 ir suskaidytos dar 20 nukleotid por DNR.
131
MOLEKULIN BIOLOGIJA
3.17pav. Chromatino 30nm

silo struktra. In vitro suformuotos 12 nukleosom grandinls (su jungties histonu H1)
elektronins mikroskopijos nuotraukos (a); mikroskopijos duomenimis paremtas 12 nukleosom erdvins struktros modelis
(nukleosomos sunumeruotos)
(b); dviej start chromatino
30nm silo modelis (c) (Science,
v. 344 p. 376, 2014)
Paalinus H1 histon, DNR suskaidyta 146 np fragmentus. Gautos erdins nukleosomins

dalels, turinios 146np DNR. Taigi, jungties histonas H1 apsaugojo ~20 nukleotid por DNR,
kuri jungia vien nukleosom su kita.
Jungties histonas H1 yra 18 00028 000 Da molekul, daug maiau konservatyvus
baltymas nei nukleosomins erdies histonai. 80% nukleosom turi H1 histon. H1 histono dydis smarkiai varijuoja tarp organizm ri ir tos paios ries organizmuose. Yra tam tikriems audiniams savit H1 histon. Pvz., mogaus ir pels lstelse yra 11 H1 histono variant
(potipi): H1a-e, H1, H1t. H1 histon potipi aminorgi sekos skiriasi 1520%.
H1 histono erdvinje struktroje yra konservatyvi centrin globul ir maiau konservatyvs
nestruktrizuoti N bei C galai (3.18pav., a). Kai kuri organizm H1 histono molekul turi dvi
globules, o, pvz., pirmuonies Tetrahymena H1 globuls neturi. Atlikus pauki eritrocit H5
histono (H5 yra H1 eimos baltymas) globuls erdvins struktros analiz, nustatyta, kad ji panai su DNR sveikaujani baltym, kurie turi vadinamj wHTH (angl. winged helix-turn-helix)
motyv (3.18pav., b), struktr.
Nestruktrizuoti H1 histono galai galt neutralizuoti neigiam jungties DNR krv ir taip
skatinti chromatino kompaktizavim. Fotoblukimo eksperiment duomenys parod, kad gyv
lsteli chromatine H1 histonas pasiskirsts tolygiai. Pasiskirstymas dinamikas: H1 greitai prisijungia prie chromatino viet ir greitai nuo j atsijungia. Nustatyta, kad H1 pasiskirstymas
pakinta, kai sukeliami dvigrandins DNR trkiai. Yra pasilytas H1 histono isidstymo 30nm
chromatino silo solenoido ir zigzago struktrose modelis. Jungties histonas prisijungia nukleosomoje ties DNR jimo ir ijimo vietomis, taiau jo padtis nra simetrika nukleosomos
aies atvilgiu (3.18pav., c). Modelins 12 nukleosom grandinls krioelektronins mikrosko-
132
3.18pav. Jungties histono struktra ir vieta nukleosomoje. Jungties H1 histono struktros ir prisijungimo nukleosomoje schema (a); pauki eritrocit jungties histono H5 globuls erdvin struktra (b);
H1 histono padtis nukleosomoje remiantis 12 nukleosom dalels 11 krioelektronins mikroskopijos
duomenimis. Simetrijos ais parodyta raudonu punktyru (c) (Science, v.344 p.376, 2014)
pijos tyrimai parod, kad greta esani nukleosom H1 histonai sveikauja tarpusavyje ir tokiu
bdu galt suartinti chromosomas.
Duomenys apie H1 histono reikm chromatino struktrai ir funkcijoms gana prietaringi. Nra
aiku, kiek H1 svarbus auktesni chromatino struktr susidarymui. Ilgai vyravo poiris, kad H1
histonas yra neatskiriamas chromatino komponentas, skatinantis chromatino kondensacij ir tokiu
bdu slopinantis gen transkripcij. Taiau eksperimentais su Xenopus laevis parodyta, kad mitozini
chromosom (tokios chromosomos savo fizinmis savybmis nedaug skiriasi nuo mitozini chromosom lstelje) susidarymui in vitro H1 histonas nra svarbus. Pvz., pirmuonies Tetrahymena ir grybo
Aspergillus nidulans mutantai neturi H1 koduojanio geno. Nors Tetrahymena mutant branduoliai yra
dvigubai didesni nei laukinio tipo lsteli, organizmo gyvybingumui ir chromosom bei branduolio
struktrai tai neturi reikmingos takos. Kita vertus, peli embrionai, turintys maesn H1 kiek lstelse, va. Tai liudija apie H1 svarb normaliam i induoli vystymuisi.
3.3. Chromatino auktesnio lygio struktros

Tolesn chromatino kompaktizacija branduolyje nra gerai iaikinta. Daugiausiai ini
apie struktrin chromatino organizacij buvo gauta tiriant mitozines chromosomas. iuolaikiniai tyrim metodai (pvz., in situ hibridizacija, fluorescentin gyv lsteli mikroskopija) jau
leidia tirti ir interfazinio chromatino struktrin organizacij.
133
MOLEKULIN BIOLOGIJA
3.18pav. Chromatino struktra per interfaz ir mitoz. Struktros modelis (kairje); mitozins chromosomos vaizdai, gauti variais vizualizavimo metodais (deinje) (T. D. Pollard, W. C. Earnshaw, J. Lippincott-Schwartz, Cell Biology, second edition, 2007)
Mitozini chromosom organizacija. Remiantis mitozini chromosom ir specializuot

chromosom (pvz., politenini chromosom, lemp epei chromosom) tyrimais, pasilytas toks tolesnio chromatino susipakavimo branduolyje modelis: 30 nm chromatino silas
sudaro chromatino kilpas, kuriose DNR superspiralizuota, o jos kondensacijos laipsnis siekia
~1000 (3.19pav.). Kiekviena mitozin chromosoma tai atskira dvigrandin DNR molekul
kartu su baltymais. Vidutinis chromosomos DNR dydis ~100Mb. Ubaigtos kondensacijos mitozin chromosom sudaro dvi dukterins chromatids, kurias jungia centromera.
Kai kuriais atvejais chromosom kilpas patogu stebti. Afrikos naguotosios varls Xenopus laevis ovocit chromosomos pasiymi tuo, kad turi didiules kilpas, kurios puikiai matomos mikrosokopu. Tokios
chromosomos vadinamos lemp epeiais (angl. lampbrush). ios chromosomos susidaro dl labai usitsusios mejozs, kuri gali trukti mnesius. Kiekviena konkreti lemp epei chromosomos kilpa atitinka konkrei DNR sek ir lieka tokio kilpos pavidalo vis laik, kol ovocitas auga. domu, kad injekavus
ovocit kito organizmo (pvz., uvies) DNR, kuriai nebdinga sudaryti lemp epei struktr, ovocite
svetima DNR suformuoja tokias struktras. Parodyta, kad lemp epei DNR kilpose intensyviai vyksta
daugelio gen raika. Deja, didioji dalis lemp epei DNR yra ne kilpose, bet, smarkiai kondensuota,
talpinama chromomerose struktrinse chromatino ayse, nuo kuri kilpos isiakoja.
134
Mitozinse chromosomose chromatino kilpos prisitvirtinusios prie pagrindo branduolio

baltym, dar vadinam pastoliais (angl. scaffold) (3.16pav.). Branduolio pastoli baltymai
yra ne histon tipo ir sudaro ~1/3 mitozini chromosom mass. ie baltymai dar menkai
itirti. Paalinus nukleazmis didiaj dal DNR ir histon, pastoliai ilaiko savo struktr ir pri-
3.20pav. SMC baltym ir kompleks struktra. SMC baltymo dimero struktros schema. Parodytos
struktros dalys ir aminorgi motyvai, sudarantys ATPazs aktyvj centr (a) (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 7, p. 311, 2006); vidumolekulinio ir tarpmolekulinio SMC baltym dimero susidarymo
schemos (b) (Nature Reviews Molecular Cell Biolology, v.7, p.311, 2006); kohezin ir kondensin kompleks schemos (c) (Nature Reviews Genetics, v.11, p.391, 2010)
135
MOLEKULIN BIOLOGIJA
3.21pav. Mitozins chromosomos ir j sritys per interfaz. Vaizdai gauti fluorescentins hibridizacijos
metodu, naudojant individualioms chromosomoms savitas fluorescentines ymes. Diploidinis mitozini
viiuko chromosom rinkinys (a); chromatinas per interfaz (b) (Nature Reviews Genetics, v.2, p.292,
2001)
mena dvi chromatides (3.19pav.). Sritys, kuriomis chromatino DNR prisitvirtina prie pastoli
baltym, pasiymi savitumu, nes turi charaktering restrikcijos endonukleazi skeliam srii.
Vienoje kilpoje yra apie 15000100000 nukleotid por DNR. I mitozini chromosom preparato paalinus didij dal baltym (histon), kilpas galima stebti elektronins mikroskopijos bdu (3.19pav.). Tkios didisios dalies baltym netekusios chromosomos turi centrin
rezgin, nuo kurio visas puses isiakoja didiulis DNR kilp tinklas. Panai chromatino struktra stebima ir panaiu bdu veikiant lsteli branduolius interfazs metu, tik ji dar sudtingesn, nes joje lieka daug ribonukleoprotein.
Chromatino kilpos gerai matomos metafazs metu, kai susidaro dukterins chromatids,
kurias jungia centromera (3.19pav.). Susiklosiusi kilpas DNR, pvz., mogaus DNR, sudaro tik
~100 mikron, bet kad tilpt branduolyje, ji turi dar labiau kompaktizuotis. Toki kompaktizacij
pasiekia metafazins chromosomos, kuri kondensacijos laipsnis yra 10000100000. Tok kompaktikumo laipsn gijusias chromosomas yra patogiausia paskirstyti tarp dukterini lsteli.
Vienas baltym, kuri kiekis mitozini chromosom pastoliuose yra didiausias, tai
DNRIItopoizomeraz (Topo IIa). Imunofluorescentine analize nustatyta, kad II topoizomerazs
gausu ties centromeromis ir iilgai dvigub mitozini chromosom ai ties DNR kilp pamatu.
Mielse, turiniose II topoizomerazs iveiklint gen, nevyksta galutin mitozini chromosom
kompaktizacija. Gali bti, kad II topoizomeraz reguliuoja DNR superspiralizacijos proces.
Kita branduolio pastoli baltym grup, svarbi mitozinio chromatino kompaktizacijai, yra
SMC (angl. structural maintainence of chromosomes) eimos baltymai. Pirmieji SMC baltymai
atrasti mielse, kur jie reikalingi minichromosomoms palaikyti. SMC baltymai rasti visuose
eukariot genomuose, kuri nukleotid seka yra nustatyta. domu, kad j turi ir beveik visi
prokariotai. Pastarj met tyrimai liudija, kad SMC baltymai yra viena svarbiausi baltym
grupi, valdani chromatino struktrin ir funkcin organizacij organizmuose nuo bakterij iki mogaus. Mieli chromatino imunoprecipitacijos tyrimai parod kondensin telkimsi
centromerinse, pericentromerinse srityse, telomerose ir pasikartojaniose genomo srityse.
136
SMC baltymai yra dideli, 10001300 aminorgi polipeptidai. Baltym N ir C galuose yra
isidst ATPazms bdingi vadinamieji aminorgi Volkerio motyvai, kurie prijungia ir hidrolizuoja ATP. Ikelta hipotez, kad ATP jungimas ir hidroliz slygoja chromatino struktrinius
pokyius. Hipotez paremia eksperimentai in vitro, kuriuose SMC baltymai sukl iedins DNR
superspiralizacij nuo ATP priklausomu bdu.
Tarp SMC baltym ATPazs motyv yra ilgi, superspirales sudarantys domenai, perskirti
lankstaus domeno, svaros (angl. hinge) (3.20pav., a). In vitro tyrimais nustatyta, kad du SMC
baltymai sudaro dimerus vieno monomero N galui sveikaujant su kito monomero C galu arba
dviems monomerams stipriai sveikaujant per lankstj domen (pastarasis atvejis danesnis)
(3.19pav., b). Baltym dimeras gyja vairi erdvini struktr. Daniausia nustatyta struktra
primena V raid.
SMC baltymai sudaro didels molekulins mass baltym kompleks, svarbi eukariot
chromatino struktrai per mitoz, mejoz ir kitus su DNR susijusius vyksmus utikrinti, erd
(3.19pav., c). Homologik kompleks turi netgi bakterijos. Eukariotuose inomi ie kompleksai:
zz du kohezin kompleksai (mitozs kohezin kompleksas ir mejozs kohezin
kompleksas);
zz trys kondensin kompleksai (I kondensinas, II kondensinas ir gen dozs kompensavimo kompleksas IDC kondensinas);
zz DNR reparacijos kompleksas.
Kompleks sudtyje yra du SMC eimos baltymai ir 23 ne SMC baltymai (3.20pav., c).
Kohezinai laiko replikuotas DNR (seserines chromatides), t.y. utikrina kohezij nuo S fazs
pradios iki mitozs, kol nesuardomas j komponentas baltymas a kleizinas.
Kondensinai per mitoz utikrina savalaik chromosom kompaktizacij ir naikina chromosom sukibim, susidarius, manoma, dl kompaktizacijos. Taip pat tiriamas kohezin bei
kondensin vaidmuo ir per interfaz.
Chromatino organizacija per interfaz. Anksiau buvo manyta, kad chromatinas per interfaz yra difuzikai pasiskirsts branduolyje. Pastarj met chromatino tyrimai in vivo atskleid, kad atskir chromatino fragment dydis interfazs metu branduolyje keiiasi neymiai.
Tai liudija, kad jis yra supakuotas pakankamai stabilias struktras. Interfazinio chromatino
sritys, kurios atitinka daugiau gen turinias chromosomas, yra maiau kondensuotos; jos isidsiusios branduolio centre. Smarkiai patobuljus chromatino analizs metodams, daugja
informacijos, kad interfazs metu chromosomos ilaiko savo struktr ir uima fiksuotas branduolio sritis (3.21pav., a, b).
Kai kuriais atvejais savitas interfazinio chromatino struktras galima nesunkiai stebti. Pvz.,
Drosophila, taip pat uodo trklio lerv seili liauk lstels uauga labai didels, kai j DNR
dauginamas daugyb kart nevykstant lsteli dalijimuisi. Tokiose lstelse DNR molekuli
kopijos organizuotos politeninse chromosomose, kuriose chromatids isidsto viena alia
kitos.
137
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Chromatinas per interfaz tvirtinasi prie branduolio skeleto branduolio upildo baltym ir sveikauja su tankija ploktele lamina, kuri ikloja branduolio apvalkall i vidaus.
Branduolio upildo baltym skaiiuojama iki keli imt. Lamin sudaro branduolio upildo
baltymai laminai, kai kurie branduolio vidins membranos baltymai, periferiniai baltymai. DNR
prisitvirtina prie branduolio upildo baltym per savitas branduolio upildo prisijungimo sekas MAR-SAR (angl. matrix attachment region / scaffold atachment region) sekas. Sekose yra
gausu A ir T nukleotid (70%), taiau didesniu konservatyvumu jos nepasiymi. Bdinga MAR
DNR sek savyb ta, kad jose yra srii, veikiani kaip transkripcijos cis reguliacins sekos, taip
pat II topoizomerazs atpainimo srii. MAR-SAR srii padtis susijusi su chromatino veikla.
Neaiku, ar MAR-SAR nukleotid sekos yra tos paios sekos, kuriomis DNR prisitvirtina prie
pastoli baltym mitozinse chromosomose. Yra inoma, kad dalis baltym, dalyvaujani palaikant mitozini chromosom ir interfazinio chromatino struktras, skiriasi, taiau kai kurie
j yra tie patys, pvz., II topoizomeraz. Tai liudija, kad DNR topologijos valdymas yra svarbus
interfazinio ir mitozinio chromatino struktrai.
3.4. Chromatinas ir replikacija

Naujai susintetintos DNR molekuls greitai supakuojamos chromatin. Naujajame chromatine turi bti atgaminta visa epigenetin informacija, kuri turi bti perduota lstelms
(DNR metilinimo pobdis, posttransliacins histon modifikacijos, histon variantai ir j pasiskirstymas). Turi egzistuoti mechanizmas, utikrinantis greit nukleosom susidarym ant
replikuotos DNR.
Vykstant DNR replikacijai, nukleosomos laikinai suardomos, kad replikacijos akuts
galt judti pirmyn. erdies histonai disocijuoja (H3-H4)2 ir H2A-H2B kompleksus. Nukleosomos labai greitai vl susidaro ant dukterini DNR grandini. Elektronine mikroskopija nustatyta, kad nenukleosomins struktros DNR yra tik ties replikacijos akute, o jau u ~ 600
nukleotid poros DNR yra nukleosomins struktros (3.22pav.).
Kaip vyksta nauj nukleosom susidarymas ant dukterini DNR grandini? Galimi du keliai:
zz prie DNR pirmiausiai prisijungia (H3-H4)2 histon tetrameras, vliau prisijungia du H2AH2B histon heterodimerai ir ubaigia histon erdies, apie kuri apsiveja 146 nukleotid por DNR, formavimsi;
zz apie jau susiformavus erdini histon oktamer apsivynioja DNR ir susidaro
nukleosomos.
Nauj nukleosom susidarymas ties replikuota DNR vyksta pirmuoju keliu. Antruoju keliu
nukleosoma formuojasi vykstant chromatino pertvarkai.
Nukleosomos ties naujai replikuota DNR susidaro i sen ir naujai susintetint histon molekuli. Didiosios dalies nauj histon sintez citozolyje koreliuoja su DNR replikacija. Reikinys vadinamas nuo DNR replikacijos priklausoma histon sinteze.
138
Nauj histon jungim nukleosomas valdo baltymai histon aperonai, kurie prijungia
histonus citozolyje ir branduolyje juos nukreipia link DNR. ia histon aperonai atpalaiduoja
pavienius histonus arba j kompleksus, ir pastarieji kartu su DNR sudaro nukleosomas. Nauj
histon pristatymas naujai replikuotos DNR viet yra kritikai svarbus: jeigu S. cerevisiae S fazje nevyksta histon sintez, miels yra negyvybingos, net jeigu histon sintez indukuojama
po DNR sintezs lstels ciklo G2 fazje.
Histon aperonai neleidia netaisyklingai susisukti (angl. missfolding) naujai susintetintiems histonams. Prisijung prie histon molekuli, aperonai neutralizuoja teigiam j krv,
tokiu bdu apsaugodami histonus nuo tarpusavio agregacijos, kit tarpini sveik. Histon
aperonai taip pat veikia ir kaip histon saugyklos.
3.22pav. Nukleosom susidarymo ties naujai replikuota DNR schema. Apaioje deinje replikuojamos DNR vaizdas, gautas elektronine mikroskopija. Aikiai matyti nukleosomos u replikacins akuts
ir prie j (Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2013)
139
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Tyrim, kuriais siekta iaikinti, koki tak mogaus lsteli baltymai daro DNR replikacijai ir replikuotos DNR susipakavimui, metu buvo pastebta, kad nukleosomos susidaro tik ant
replikuojamos arba k tik replikuotos DNR (3.22pav.). Naujai susintetintus H3-H4 dimerus ties
naujai replikuojama DNR pristato ASF1 aperonas. ASF1 ia pristato ir tvinius H3-H4 dimerus,
imontuotus i senj nukleosom H3-H4 tetramer (3.22pav.). ia H3-H4 dimerus prijungia
kitas aperonas CAF1 (angl. chromatin assembly factor), kuris pasiymi funkcija prijungti dimer ties replikuojama DNR. CAF1 (trys jo subvienetai) nustatytas mogaus organizme, homologikus kompleksus turi Sacharomyces ir Drosophila organizmai. CAF1 prisijungia prie histon
H3-H4 dimero ir nukreipia j replikuotos DNR link (3.22pav.). CAF1 prijungia H3-H4 histon dimer, kuriame histonai turi citozolio modifikacij metilint Lys 5 ir acetilint Lys 12. Pirmiausiai
ties naujai replikuota DNR sumontuojamas (H3-H4)2 tetrameras, o vliau, dalyvaujant kitiems
baltymams, H2A-H2B histon heterodimerai. Per S faz CAF1 telkiamas ties euchromatinu, o
vliau nukreipiamas replikuojamas heterochromatino sritis. ia CAF1 sveikauja su PCNA baltymu. PCNA baltymo gausu ties replikuojama ir reparuojama DNR (r. skyri DNR biosintez).
Nustatyta, kad PCNA baltymas yra molekulinis ymuo, kur CAF1 atpasta replikuojamoje arba
k tik replikuotoje DNR. PCNA baltymas pritraukia CAF1 prie DNR, ia jis atpalaiduoja H3-H4.
H2A-H2B dimerams prijungti ties naujai replikuota DNR reikalingas kitas specializuotas aperonas Nap1 baltymas, kuris, kaip ir CAF1 bei ASF1 histon aperonai, eukariotuose yra konservatyvus. Nap1 lokalizacija lstelje keiiasi priklausomai nuo lstels ciklo fazs. Taigi, Nap1
baltymas, greiiausiai, taip pat pasitelkiamas H2A-H2B histon naai i citozolio branduol.
Prisijungus visiems erdiniams histonams, vyksta chromatino brendimas: susidaro reguliarios nukleosomos, kurias skiria vienodo dydio DNR jungtukai. DNR tampa nepasiekiama I
DNazei, deacetilinamas H4 histonas, prie nukleosom prisijungia H1 histonas.
Taiau vien tik histon aperon nepakanka, kad susidaryt reguliarios chromatinui bdingos nukleosomos. Nustatyta, kad reguliari nukleosom susidarymui in vivo reikia papildom
veiksni, pvz., chromatin pertvarkani kompleks, kuri veikimui reikia ATP.
3.5. Chromatinas ir gen transkripcija bei jos valdymas

Chromatine DNR yra nebeprieinama baltymams ir baltyminiams kompleksams, dalyvaujantiems gen transkripcijoje. Eukariotinse lstelse egzistuoja keletas bd veikti chromatino struktrinius barjerus:
zz histon modifikacijos (pvz., acetilinimas, ubikvitilinimas);
zz chromatino struktr pertvarkantys baltyminiai kompleksai, kuri veikimui reikia ATP;
zz erdini histon variantai (aptarti anksiau), kurie tam tikrose chromatino vietose pakeiia prastus histonus ir tokiu bdu veikia chromatino struktr.
140
3.5.1. Histon acetilinimas ir gen transkripcijos valdymas

Daugiau nei prie 30 met buvo pasilyta hipotez, kad histon lizino aminorgi liekan acetilinimas gali turti tiesiogins takos gen transkripcijai eukariotinse lstelse. Kaip jau
aptarme, i aminorgi liekan acetilinimas sumaina teigiam krv histon molekuli
galuose ir tokiu bdu susilpnina j sveik su DNR. Nukleosom konformacija ir stabilumas
keiiasi, DNR tampa labiau prieinama transkripcijoje dalyvaujantiems baltymams.
Acetiltransferaziniu ir deacetilaziniu aktyvumu pasiymi gen transkripcijos aktyvikliai, represoriai bei RNR Pol II baltyminio komplekso komponentai.
3.5.2. Chromatin pertvarkantys baltym kompleksai ir

transkripcijos valdymas
Nors histon molekuli gal acetilinimas gali susilpninti tarpnukleosominius ryius, maai
tiktina, kad is procesas galt visikai suardyti nukleosomas taip, kad histonai bt paalinti
nuo DNR, o pastaroji tapt prieinama transkripcijai. Kaip minta, acetilinami daugiausia histon molekuli galai, o jie nesudaro pagrindini tarpmolekulini ryi formuojantis erdinei
nukleosominei dalelei.
Danu atveju transkribuojam gen promotori bei stiprikli (angl. enhancer) sritys
yra nenukleosomins struktros: tai liudija i srii DNR jautrumas deoksiribonukleazi poveikiui. Taip pat eksperimentikai nustatyta, kad nukleosomos trukdo prisijungti prie DNR RNR
polimerazei bei kitiems transkripcijos baltymams.
Kokiu bdu nukleosomos suardomos, kai reikia transkribuoti genus? Ryiai nukleosomoje
tarp baltym, taip pat tarp baltym ir DNR, yra suardomi vykstant chromatino pertvarkai
(angl. chromatine remodeling). Histonai disocijuoja nuo DNR, DNR tampa prieinama kitiems
baltymams. iems procesams vykti reikia energijos.
Kokiais bdais gali bti pertvarkomas chromatinas? In vitro tyrimais buvo nustatyti ie galimi chromatino pertvarkymo bdai:
zz histon oktameras gali slysti iilgai DNR; taip pasikeiia tam tikr sek padtis nukleosomos atvilgiu (3.23pav.);
zz gali kisti atstumas tarp histon oktamer; taip pat pasikeiia tam tikr sek padtis nukleosomos atvilgiu;
zz histon oktameras gali bti istumtas i nukleosomos; taip susidaro nenukleosomins
struktros tarpas chromatine.
Chromatino pertvark lstelje vykdo chromatin pertvarkantys baltym kompleksai
(angl. chromatin remodeling protein complexes) nuo ATP priklausomos DNR translokazs,
prisijungianios prie tam tikros vietos histon oktamere ir keiianios DNR padt jo atvilgiu
141
MOLEKULIN BIOLOGIJA
(3.23pav.). Vykstant iems pokyiams, turi bti suardomi ir vl sudaromi molekuliniai ryiai tarp
histon molekuli ir DNR. Chromatin pertvarkantys kompleksai reikalingi iems vyksmams:
zz visikai supakuoti genom;
zz sukurti specializuotas chromatino sritis (pvz., su histon variantais);
zz utikrinti valdom prijim prie genomins DNR.
Chromatin pertvarkani baltym kompleks eukariotuose yra rasta gana daug ir randama
vis daugiau. Kompleks sudtyje yra subvienetas, pasiymintis ATPaziniu aktyvumu, kuris yra komplekso motoChromatin pertvarkantys
ras. Pagal ATPazi panaum skiriamos keturios kompleks
kompleksai, panaudodami ATP
eimos. ATPazi subvienetai panas tik savo ATPazi dohidrolizs metu gaut energij,
menais, kiti domenai skirtingi. Skirtinguose kompleksuose
keiia nukleosom struktr,
yra skirtinga ir kit baltymini subvienet sudtis (3.24pav.).
t.y. nukleosomos histon padKiti kompleks baltymai valdo ATPazs aktyvum, sveikaut DNR atvilgiu.
ja su chromatino baltymais ar transkripcijos veiksniais. Gausiausios yra SWI-SNF ir ISWI baltym eimos.
Chromatin pertvarkantys baltym kompleksai chromatino link yra nukreipiami dvejopai:
zz juos pritraukia gen transkripcijoje dalyvaujantys baltymai aktyvikliai arba represoriai;
zz baltymini kompleks sudtyje esantys subvienetai atpasta ir savo domenais atrankiai sveikauja su modifikuotais histonais (histon epitopais). Pvz., komplekso SWI-SNF
sudtyje esantis Snf2 subvienetas savo bromodomenu jungiasi prie acetilint histon
chromatine tiek in vitro, tiek in vivo.
Chromatino struktr keiiantys kompleksai, greiiausiai, veikia ne vis chromatin, o pavieni gen promotorius. Pvz., nustatyta, kad SWI-SNF kompleksai mielse daro tak ~6%
gen veiklai.
3.23pav. Chromatin pertvarkani baltym kompleks veikimas

(J.E.Krebs, E. S. Goldstein, S. T. Kilpatrick.
Lewins Genes XI, 2014)
142
3.24pav. Nuo ATP priklausomi chromatin pertvarkantys kompleksai eukariotuose. Chromatin

pertvarkani baltym kompleks eim ATPazs subvienet struktr schemos. Parodyti baltym domenai ir sekos, siterpusios ATPazs domen (a); SWI-SNF ir ISWI eimos kompleks struktros schema.
Apaioje parodyti kompleks sudtyje esantys baltymai (b) (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v.7,
p.437, 2006)
Kompleks veikimas chromatino atvilgiu skiriasi. SWI-SNF eimos kompleksai destabilizuoja nukleosomas, suardydami DNR ir histon ryius: t liudija chromatino jautrumo deoksiribonukleazms pokyiai. Nustatyta, kad vienas i SWI-SNF eimai priskiriam kompleks, RSC,
in vitro gali visikai suardyti nukleosom ir perkelti jos histon erd ant kitos DNR molekuls.
ISWI baltyminiai kompleksai toki ymi chromatino persitvarkym nesukelia.
Apibendrinant galima pasakyti, kad gen promotori bei kitos transkripcijos valdymo sritys, vykstant gen transkripcijos iniciacijai, yra nenukleosomins struktros; reguliacini baltym bei RNR polimerazs komplekso sveika su DNR yra palengvinama chromatino struktr
keiiant j pertvarkantiems baltym kompleksams. Transkripcijos metu, veikiant chromatin
pertvarkantiems kompleksams, nukleosomos veikia kaip dinamikos struktros, kuriose histon oktameras gali bti istumiamas i nukleosomos ir vl grinamas atgal.
Ar DNR supakuota nukleosomas, kai RNR polimeraz, transkribuodama gen, juda priek?
Chromatino, kuriame transkribuojami genai, elektronins mikroskopijos nuotraukose matyti,
143
MOLEKULIN BIOLOGIJA
kad RNR polimeraz gali transkribuoti DNR iai esant nukleosomins struktros: nukleosomos
matyti prie RNR polimeraz ir u jos. Atliktais tyrimais remiantis siloma, kad silpnai transkribuojam gen atveju RNR polimeraz veikia nukleosomos barjer nesuardydama histon
oktamero (3.25pav., a). RNR polimeraz, juddama iilgai DNR, suardo molekulinius ryius tarp
DNR bei histon pirmiausiai tose vietose, kur jie yra silpniausi ties DNR jimo nukleosom
vieta. Dalies erdyje esani histon ryiai su DNR susilpnja. Laikinai susidaro udara kilpa,
kurios viename krate yra RNR polimeraz, o kitame histon oktameras. Juddama toliau
RNR polimeraz iskiria DNR grandines kilp sudaraniame DNR fragmente atsiranda teigiama superspiralizacija, ir tolesnis judjimas tampa vis sudtingesnis. Pasiekusi DNR vidur RNR
polimeraz ima judti greitai. iuo momentu histon oktameras, greiiausiai, yra istumiamas
ir apsivynioja DNR u RNR polimerazs, t.y. keiia savo padt DNR atvilgiu, nuo jos nedisocijuodamas. Fotossiuv eksperimentai liudija, kad judant RNR polimerazei, histon oktameras
nedisocijuoja atskirus histonus. Aktyviai transkribuojam gen srityse histon oktameras yra
suardomas. iame procese dalyvauja chromatin pertvarkantys baltym kompleksai ir histon
aperonai (3.25pav., b).
HeLa lstelse buvo nustatytas transkripcijos elongacijai reikalingas kompleksas FACT
(angl. facilitates chromatin transcription). In vitro, kai nra FACT komplekso, RNR Pol II po transkripcijos iniciacijos etapo ustringa ties DNR, suformuota nukleosomas, ir transkripcijos
elongacija yra stabdoma. Pridjus FACT baltyminio komplekso, transkripcijos elongacija vyksta. FACT kompleksas destabilizuoja nukleosomos struktr, paalindamas H2A-H2B dimer, o
vliau gali prijungti histonus prie DNR, t. y. veikia kaip histon aperonas. Drozofilos politeninse chromosomose FACT kompleks yra ten, kur vyksta aktyvi gen transkripcija ir joje dalyvauja RNR Pol II, bet ne RNR Pol III kompleksas.
3.25pav. Transkripcijos nukleosomose proces iliustruojantys modeliai. Silpnai

transkribuojami genai (a); aktyviai transkribuojami genai (b)
(Biochimica et biophysica acta,
v.1890, p.332, 2013)
144
Apibendrinant chromatino molekulin struktr ir jo vaidmen gen veiklos valdyme, galima suformuluoti iuos principus:
zz Nukleosoma pagrindinis chromatino struktrinis ir reguliacinis elementas yra sudaryta i histon oktamero, kur eina po dvi keturi tip histon molekules: H2A, H2B, H3,
H4, ir DNR, kuri yra apsivijusi apie histon oktamer.
zz Kiekvienas histonas yra organizuotas du domenus: centrins histon globuls, kurios
yra isidsiusios nukleosomos viduje, sudaro nukleosomos erd, apie kuri apsiveja
DNR spiral, o nestruktrizuoti histon molekuli N galai ilenda nukleosomos ior ir
dalyvauja chromatino struktrinje organizacijoje bei chromatino veiklos reguliacijoje.
zz Nukleosom grandin, sveikaujant erdini histon molekuli N galams su gretimomis nukleosomomis, sudaro auktesnius chromatino struktros lygmenis (IIII lygmens
struktras). iame procese dalyvauja jungties histonai, kiti baltymai. i sveika gali keistis, kovalentikai modifikuojant histon N galus.
zz Chromatin pertvarkantys baltym kompleksai keiia nukleosom struktr gen promotori, stiprikli ir kitose transkripcijos valdymo srityse, palengvindami transkripcijoje
dalyvaujani baltym bei daugiabaltymini kompleks sveik su DNR.
zz Gen transkripcijos aktyvinimas bei slopinimas gali bti slygojami histon acetiltransferazi bei histon deacetilazi, kurios kovalentikai modifikuoja histon molekuli galus nukleosomose. Nuolatinio transkripcijos slopinimo heterochromatine pamatas taip
pat yra nukleosomos, kuriose histon molekuli galai sveikauja su savitaisiais baltymais
slopikliais (angl. silencing proteins); ios nukleosomos sudaro chromatino struktras, kurios gali bti perduodamos i kartos kart.
3.6. DNR organizacija prokariotuose

Ilg laik bakterij DNR struktrin organizacija lstelje nebuvo aiki. Itobuljus vaizdinimo technikai bei kitiems metodams, nustatyta, kad bakterij vidulstelins struktros yra
organizuotos ir pertvarkomos tam tikru bdu, atsivelgiant lstels augimo, dalijimosi poreikius. Bakterij DNR daugiausiai yra iedins dvigrandins DNR molekuls. Kai kurios i j yra
pakankamai didels: kad sutilpt lstelje, jos turi sudaryti pakankamai kodensuot struktr.
Pvz., E. coli iedin 4,6x106 nukleotid por DNR chromosoma yra i viso ~1,5mm ilgio, ir turi
tilpti ~12mm ilgio ir 0,51mm ploio lstelje.
Bakterij DNR kartu su DNR sveikaujaniais baltymais lstelje sudaro savit struktr
nukleoid (3.26pav., a). Nukleoidas yra funkcinis eukariot branduolio ekvivalentas. Bakterij
nukleoidas yra pakankamai kondensuota struktra, uimanti tam tikr lstels erdvs srit, kurioje yra maai ribosom.
Nukleoide DNR yra superspiralizuota neigiamai, prie jos prisijung savitieji nukleoido baltymai. Bakterijose nustatyta ~1020 skirting nukleoido baltym. Jie daniausiai gausiai sintetinami. Geriausiai apibdinti yra H-NS, HU, IHF, Lrp, CbpA, CbpB baltymai. Dalis i baltym (pvz., H-NS, HU, CbpA, CbpB) nepasiymi savitumu DNR sekoms, kiti atrankiai jungiasi prie
DNR (pvz., IHF, Lrp). Nukleoido HNS, HU, IHF baltymai pasiymi savybe superspiralizuoti ir lenkti
145
MOLEKULIN BIOLOGIJA
DNR. Bakterijose aptikti baltymai, panas eukariot SMC baltymus ir gebantys kompaktizuoti DNR; toks, pvz., yra MukB baltymas.
Prisijung prie DNR, baltymai daro tak DNR struktrai ir funkcijoms replikacijai, rekombinacijai, reparacijai ir transkripcijai. Be nukleoido baltym, prie bakterij DNR bna prisijung
dar ~100 transkripcijos veiksni aktyvikli bei represori, sveikaujani su savitosiomis DNR
sekomis gen promotoriuose.
Bakterij DNR lstelje nesudaro struktrini element, panai eukariot nukleosomas,
taiau j genomas yra organizuotas tam tikras struktras, kurios gerai matomos elektronine
mikroskopija. Pvz., lizavus E.coli lsteles, aplink jas visas puses pasklinda vairaus dydio DNR
kilpos (3.26pav., b, c). Bakterij DNR kilpose DNR yra superspiralizuota plektoneminiu bdu.
Manoma, kad btent DNR kilpos sudaro struktrinius nukleoido domenus bakterijos lstelje.
Topologikai domenai nra susij, j dydis ir superspiralizacija skiriasi. Atskir domen kratuose yra savitj DNR sek. Domenai yra tam tikru bdu fiksuoti. Bakterijos DNR turt bti
susiklosiusi ~20100 toki domen, o kiekvien kilp turt sudaryti ~10000 nukleotid
por. Tokia struktrin nukleoido organizacija bdinga daugeliui tirt bakterij.
Archj DNR organizacija skiriasi nuo bakterij. 1990m. tyrinjant archj Methanothermus
fervidus, buvo atrasta, kad joje yra du skirtingi histonai HmfA ir HmfB. ie baltymai yra eukariot histon ortologai, todl tapo domu ar iedin archj DNR taip pat yra organizuota
nukleosomas? Daugelio archj histonai turi tik histon klost, nestruktrizuot N ir C gal
nra. vairiose archjose gali bti 26 histonus koduojantys genai, kai kurios j i viso neturi
(pvz., Thermoplasma). Archj histonai labiausiai panja eukarot H3 ir H4 histonus. Nustatyta, kad prie archj DNR prisijungia histon tetrameras arba du dimerai, jie apvynioja ~60
nukleotid por DNR. Methanopyrus kandleri ries ir Halobacterium genties archjose rastas
dvigubas histonas HMk, turintis dvi histon klostes. Manoma, kad histon koduojantis genas evoliucijos metu isiskaid atskirus genus, skirtus koduoti eukariot histonus.
3.26pav. DNR organizacija bakterijose. E. coli bakterijos elektronins mikroskopijos nuotrauka. Lstels viduje gerai matyti kompaktika struktra nukleoidas (a); lizuotos E. coli lstels elektronins
mikroskopijos nuotrauka. DNR kilpos pasklidusios aplink bakterijos apvalkall (b); bakterijos DNR kilp
schema (c) (http://genes.atspace.org/18.3.html)
146

1. Eksperimentiniais chromatino tyrimo metodais nustatyta, kad ~95% mogaus kamienini lsteli chromatino yra nukleosomins struktros. Pasitelk turimas inias apie
mogaus nukleosomas, chromosomas ir DNR, atsakykite:
a) K
iek nukleosom galt bti kiekvienos tokios lstels branduolyje?
b) Kiek histon molekuli i viso reikt de novo susintetinti lstelei S fazs
metu, kad bt pasiektas Js apskaiiuotas nukleosom skaiius kiekvienoje i dukterini lsteli?
2. Kas yra nesimetrinis histon modifikavimas?
3. Kokiais ryiais nukleosomoje sveikauja DNR ir baltymai histonai?
4. Trumpai veikiant eukariot chromatin mikrokok nukleaze, gaunamos dalels, kuriose
yra 200 bp DNR. Pakartojus eksperiment, bet ilgiau inkubavus fermentu, gaunamos
dalels, kuriose yra 146bp DNR. Kodl pakinta bazi por skaiius?
5. Iki 10% chromatino mass gali sudaryti RNR. Kokios tai RNR ir kokios j funkcijos?
147
MOLEKULIN BIOLOGIJA
IV. DNR BIOSINTEZ (REPLIKACIJA)

Kiekvienai gyvai lstelei, nepriklausomai nuo to, ar jos DNR organizuota daugelyje chromosom, ar tik vienoje, svarbu isaugoti ir perduoti palikuonims savo genetin mediag DNR.
Tai utikrina lstels vystymsi, egzistavim sudtingoje aplinkoje, savalaik dalijimsi ir t.
is tikslas yra pasiekiamas DNR replikacijos procesu, kai prie pasidalijant lstelei vyksta genetins mediagos dvigubjimas.
1953m. D.Votsonas ir F.Krikas pasil ne tik DNR struktros model, bet ir galim DNR molekuls kopijavimo bd. Jis buvo paremtas komplementarumo tarp heterociklini bazi
principu. Pagal Votsono ir Kriko pasilyt DNR replikacijos model, naujos DNR molekuls sintetinamos pagal matricas. Matricos yra laikinai atskirtos motinins DNR duplekso grandins.
DNR grandins yra komplementarios, todl vienoje grandinje yra visa informacija apie kit
grandin. Netrukus is modelis buvo patvirtintas eksperimentais.
4.1. DNR replikacijos mechanizmo iaikinimas

1958m. Metju Mezelsonas (Matthew Meselson) ir Frankas talis (Frank Stahl) eksperimentais rod, kad lstelse DNR replikacija vyksta pusiau konservatyviuoju bdu, t.y. po replikacijos susidaro dvi DNR molekuls, identikos senajai
DNR molekulei, kuriose viena nukleotidin grandin yra
DNR replikacija vyksta pusiau
sena (motinin), o kita naujai susintetinta (dukterin).
konservatyviuoju bdu. Po
M. Mezelsono ir F. talio eksperimentu buvo atmesti kiti
replikacijos yra susidariusios
tuo metu svarstyti galimi alternatyvs DNR replikacijos bdvi DNR molekuls, identikos
dai: konservatyvusis bei dispersinis. Pagal konservatyvsenajai DNR molekulei, kuriose
j DNR replikacijos bd, po replikacijos lieka motinin
viena nukleotidin grandin yra
DNR molekul, kurioje abi DNR grandins yra senos, ir susena (motinin), o kita naujai
sintetinta dukterin DNR molekul, kurioje abi grandins
susintetinta (dukterin).
yra naujos. Pagal dispersin DNR replikacijos model, po replikacijos susidariusi DNR molekuli abi grandins yra
sens ir naujs DNR fragment miinys (4.1pav.).
Mezelsonas ir talis, atlikdami eksperiment, rmsi prielaida, kad molekules, kuri tankis skiriasi
neymiai, galima atskirti vien nuo kitos centrifuguojant drusk tankio gradiente. Koncentracijos
tankio gradientas sukuriamas naudojant koncentruot sunkiojo metalo druskos, pvz., CsCl, tirpal.
Nukleorgi molekuls, esanios tokio tirpalo paviriuje, centrifuguojant (veikiant icentrine jga)
migruoja emyn iki tos vietos, kur j tankis sutampa su tirpalo tankiu.
148
Mezelsonas ir talis augino E.coli bakterijas augimo terpje, kur vienintelis azoto (N) altinis buvo
amonio chloridas (N15H4Cl). Amonio chloridas vietoje stabiliojo N14 azoto atomo (lengvojo) turjo
radioaktyv N15 azoto atom (sunkj). Buvo siekiama, kad augani bakterij DNR heterociklini
bazi sudt bt jungtas sunkusis N15 izotopas. Kelet kart pasidalijus bakterijoms, augimo terp
buvo centrifuguota. I dalies bakterij buvo iskirta DNR (1mginys), likusios bakterijos buvo resuspenduotos vieioje augimo terpje su N14H4C, kuris jau turjo stabilj N14 azoto atom. Bakterijos
ioje terpje buvo augintos tiek, kad pasidalyt vien kart (2mginys) ir du kartus (3mginys). I 2
ir 3 mgini taip pat buvo iskirta DNR. Dar vienas DNR mginys (4) buvo iskirtas i E.coli, augint tik
N14 azot turinioje terpje.
4.1pav. Pusiau konservatyviosios DNR replikacijos rodymas M.Mezelsono ir F.talio eksperimentu. Hipotetiniai DNR replikacijos bdai (a); DNR sintez E.coli bakterijose, auganiose terpje su
radioaktyviuoju izotopu (b); DNR centrifugavimas CsCl tankio gradiente (c) (http://biology200.gsu.edu/
houghton/2107%2014/lecture24.html)
149
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Tada DNR 14 mginiai buvo centrifuguoti CsCl tankio gradiente ir nustatyta, kad stabilj N14 azoto atom turinios DNR tankis skiriasi nuo DNR, turinios radioaktyv N15 azoto atom, tankio ~1%.
Todl DNR isidsto tankio gradiente skirtingose zonose. N15 izotop turinioje terpje augusi E.coli
DNR (1mginys) yra vienodo tankio (~1,724g/ml) ir isidsto vienoje gradiento zonoje. Taip pat vienoje zonoje isidsto ir N14 azoto atom turinioje terpje ilgai augusi bakterij DNR (4mginys). i
DNR yra lengvesn, jos tankis siekia 1,710g/ml. Bakterij, perkelt terp su stabiliuoju N14 azoto
atomu ir pasidalijusi vien kart (2mginys), visos DNR molekuls taip pat buvo vienodo tankio, taiau tankio reikm buvo tarpin tarp sunkiosios (N14) ir lengvosios (N15) DNR tanki ~1,717g/ml.
Tokia DNR, kurioje pus molekulje esani heterociklini bazi turjo sunkj N15 azoto atom,
o pus lengvj N14, vien kart pasidalijus bakterijoms, perkeltoms N14 turini terp, galjo
bti susintetinta tuo atveju, jei naujai pasidalijusiose lstelse viena DNR polinukleotidin grandin
buvo sena, t.y. sunki, o kita naujai susintetinta, t.y. lengva. Du kartus pasidalijusi E.coli bakterij
(3mginys) DNR pasiskirst tokiu bdu: dalies DNR tankis buvo tarpinis tarp sunkiosios ir lengvosios DNR, kitos DNR dalies tankis atitiko lengvosios DNR tank. Tai paliudijo, kad DNR sintez vyksta
kaip matric naudojant atskiras motinines grandines, o dukterines lsteles pakliva DNR, turinti vien
senj motinin ir vien nauj dukterin grandin. Taip buvo patvirtinta, kad DNR replikacija vyksta
pusiau konservatyviuoju bdu, o ne, pvz., dispersiniu ar konservatyviuoju, nes pastaraisiais atvejais
DNR pasiskirstymas bt kitoks.
4.2pav. Bakterij DNR replikacija. Besireplikuojanios E.coli iedins DNR autoradiografijos vaizdas
(kairje); schema, paaikinanti autoradiografijos rezultatus. X ir Y replikacins akuts, AC kilpos,
susidaranios replikuojamoje DNR; dvigubomis linijomis paymta senoji DNR grandin; punktyrine
linija naujoji DNR grandin (apaioje); E.coli iedins DNR replikacijos schema (deinje) (L. A. Allison.
Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012)
150
Netrukus pavyko vizualizuoti replikuot DNR. Donas Kairnsas (John Cairns) 1963m., panaudojs autoradiografijos metod, patvirtino, kad iedin E.coli DNR replikuojama pusiau
konservatyviuoju bdu. Autoradiografijos metodas pagrstas tuo, kad mginyje esanti radioaktyvi mediaga apvieia rentgeno juost. Kairnsas panaudojo E.coli augimo terp, kurioje buvo
DNR biosintezs pirmtako timidino, turinio radioaktyv vandenilio izotop trit (H3). Buvo
nustatyta, kad E.coli DNR replikuojama per ~40minui. Bakterijos buvo augintos terpje su
izotopu dvi generacijas. Kairnsas intaktin bakterij DNR patalpino ant mikroskopinio stiklelio,
padeng fotografine emulsija ir po dviej mnesi j irykino. Eksperimento rezultatai patvirtino, kad bakterijos iedin DNR replikuojama pusiau konservatyviuoju bdu. Buvo padarytas
dar vienas svarbus atradimas: bakterijos DNR replikacija vyksta dviem kryptimis t paliudijo
stebtos nuo replikacijos iniciacijos tako prieingas puses judanios dvi replikacins akuts (angl. replication forks) (4.2pav.).
Vliau, ityrus daugelio organizm bei virus DNR replikacij, buvo iaikinta, kad pusiau
konservatyvioji DNR replikacija gali bti:
zz vienkrypt prasidedanti replikacijos pradios vietoje ir nuo jos vykstanti viena kryptimi (suformuojant vien replikacin akut) (4.3pav.);
zz dvikrypt prasidedanti replikacijos pradios vietoje ir nuo jos vykstanti dviem prieingomis kryptimis
(suformuojant dvi replikacines akutes) (4.3pav.).
Prokariot ir eukariot chromosom DNR replikacija, vykstanti nuo replikacijos iniciacijos

srii, yra dvikrypt ir pusiau
konservatyvi.
Prokariotuose ir eukariotuose chromosom DNR repliReplisoma yra laikinas baltym

kacija yra pusiau konservatyvi ir dvikrypt.
kompleksas, veikiantis ties DNR
Remiantis palyginti paprastu DNR struktros modeliu,
replikacinmis akutmis.
buvo linkstama manyti, kad ir DNR replikacija yra paprasta. Taiau kelet deimtmei vykdyti replikacijos tyrimai
parod, kad is procesas nepaprastai sudtingas. Pagrindiniuose DNR replikacijos etapuose iniciacijos, elongacijos ir terminacijos veikia daug
lstels baltym ir baltymini kompleks. J veikimas tiksliai koordinuotas.
4.3pav. Dvikrypts ir vienkrypts replikacijos

schema
151
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Replikacijos iniciacijos metu DNR replikacijos iniciacijos srit atpasta baltym kompleksas.
Komplekso baltymai utikrina, kad prie prasidedant DNR replikacijai abi DNR duplekso grandins bt laikinai atskiriamos ir stabilizuojamos tokios bsenos. Tada replikacinje akutje
prasideda nauj komplementarij DNR grandini sintez.
Kitas DNR replikacijos etapas elongacija (kitaip ilginimas) vyksta dalyvaujant baltym
kompleksui replisomai. Replisoma yra laikinas baltym kompleksas, veikiantis ties DNR
replikacinmis akutmis. Replikacines akutes sudaro replisomos ir replikuojama DNR.
Replisoma utikrina pagrindinius bet kurio genomo replikacijos tikslus tiksliai ir veiksmingai nukopijuoti DNR. DNR sintetinantys fermentai DNR polimerazs i tiksl visikai
realizuoti negali, todl pasitelkiami pagalbiniai baltymai. Replisomos sudtiniai komponentai yra konservatyvs visuose organizmuose nuo paprasiausi iki mogaus. Replisomai
judant iilgai DNR, abi DNR grandins iskiriamos, vyksta komplementarij DNR grandini
sintez.
Taiau DNR biosintezs metu replisoma susiduria su esmine problema, kuri dert ia pat
aptarti. Dvigrandins DNR duplekso grandins yra antilygiagreios, t. y. viena grandin isidsiusi 35 kryptimi, o kita prieinga, 53, kryptimi. I pradi manyta, kad replikacijos
metu atskyrus DNR grandines, viena komplementari grandin sintezuojama 53 kryptimi, o
kita 35 kryptimi. Taiau paaikjo, kad DNR sintez gamtoje vyksta tik 53 kryptimi.
Kaip replikacijos metu kopijuojamos ilgosios DNR? Atsakymas buvo gautas 1960 m. pabaigoje japon mokslinink Reidi ir Cuneko Okazaki (Reiji & Tsuneko Okazaki). Eksperimento
metu greitai besidalijani E.coli bakterij kultr buvo pilta timidino, turinio radioaktyv
H izotop trit (H3). pylus timidino, bakterijos buvo auginamos tik kelet sekundi tol, kol
radioaktyvusis timidinas buvo jungtas k tik susintetint DNR. Iskyrus toki DNR i lsteli, ji
centrifuguota cezio chlorido gradiente.
Nustaius, kur susitelks radioaktyvusis timidinas, paaikjo, kad labai trumpai (kelet sekundi) inkubuojant lsteles su radioaktyviuoju timidinu, jis susitelk 10002000 nukleotid
ilgio DNR fragmentuose. Ilgiau inkubuojant lsteles su radioaktyviuoju timidinu, radioaktyvioji
ym jau telksi ilgose DNR molekulse (4.4pav.). Eksperimento rezultatai paliudijo, kad viena
i DNR grandini sintetinama fragmentais (nutrkstamai), kurie vliau sujungiami itis DNR
grandin. ie fragmentai pavadinti Okazaki fragmentais. Okazaki fragmentai sintetinami tik
53 kryptimi ir vliau sujungiami itis DNR grandin. DNR grandin, kuri sintetinama tokiu
bdu, vadinama vluojanija DNR grandine (angl. lagging DNA strand) (4.4pav.).
Kita DNR grandin yra sintetinama 53 kryptimi nenutrkstamai. Ji vadinama pirmaujanija DNR grandine (angl. leading strand) (4.4pav.). Okazaki fragmentai DNR replikacijos
metu sintetinami daugumos organizm DNR biosintezs metu.
Kaip matyti i schemos, pateiktos 4.4pav., vluojaniosios DNR grandins sintezs kryptis
yra prieinga pirmaujaniosios grandins sintezs krypiai, taip pat ir replikacins akuts judjimo krypiai. Vluojaniosios grandins sintez iek tiek atsilieka, nes pirmiausiai turi bti
susintetintas pirmaujaniosios grandins fragmentas, kad viena i matric tapt prieinama
Okazaki fragmento sintezei.
Pasibaigus DNR replikacijai, replisom sudarantys komponentai disocijuoja. DNR replikacijos procesas baigiasi terminacija (dar vadinama baigtimi). iame replikacijos etape dalyvauja
152
savitieji terminacijos baltymai. vykus terminacijai, sudvigubjusios chromosomos atskiriamos

viena nuo kitos ir paskirstomos tarp dukterini lsteli.
DNR biosintez lstelse vyksta ne tik replikacijos metu, bet ir reparacijos metu, kai, paalinus paeist DNR grandins nukleotid ar fragment, yra sintetinama nauja DNR grandin.
Reparacijoje dalyvaujanios DNR polimerazs yra paprastesns struktros baltymai nei ilgas
DNR molekules replikuojanios DNR polimerazs. Jos veikia daniausiai konkreiose reparuojamos DNR vietose.
4.4pav. Pirmaujaniosios ir vluojaniosios DNR grandins sintez. R. ir C.Okazaki eksperimento

rezultatai (kairje); DNR pirmaujanij ir vluojanij grandini sintezs schema (deinje ) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012)
153
MOLEKULIN BIOLOGIJA
4.2. DNR polimerazs pagrindiniai DNR replikacijos

fermentai
Fermentai, sintetinantys naujas DNR molekules pagal matric, vadinami DNR polimerazmis (nuo matricos priklausomomis DNR polimerazmis). Prokariot ir eukariot lstelse yra
vairi DNR polimerazi. Tik tam tikros DNR polimerazs dalyvauja DNR replikacijoje. Tokios
DNR polimerazs dar vadinamos replikazmis. Replikazs sudtingi baltymai, sudaryti i
daugelio subvienet. Kitos DNR polimerazs atlieka tam tikras specializuotas funkcijas replikacijos metu arba dalyvauja reparacijoje ir rekombinacijoje.
4.2.1. DNR polimerazi bendrosios savybs

DNR polimerazs pasiymi didele dydi, fermentini savybi vairove, dalyvauja skirtinguose biologiniuose vyksmuose. Taiau eukariot, prokariot, taip pat bakteriofag bei virus
DNR polimerazms, sintetinanioms DNR, yra bdingos kelios bendros savybs.
Viena i bendr savybi yra ta, kad visos nuo matricos1 priklausomos DNR polimerazs (DNR
nukleotidiltransferazs) katalizuoja toki pai chemin DNR sintezs reakcij, kurios metu
jungia monomerus deoksinukleozido 5trifosfatus (dNTP) prie sintetinamos DNR grandins
ribozs laisvos 3OHgrups (t.y. pernea nukleotidilgrup). Tarp dNTP padtyje esanio fosfato ir 3OHgrups susidaro fosfoesterinis ryys. Reakcijos metu atsipalaiduoja pirofosfatas.
DNR polimerazi katalizuojamos reakcijos schema pateikta 4.5pav. Reakcij galima urayti
ir tokia lygtimi: matrica-pradmuo-(dNMP)n+dNTPmatrica-pradmuo-(dNMP)n+1+PPi
(kur n nukleotid skaiius sintetintoje grandinje; i neorganinis pirofosfatas, fosforo rgties anijonas).
ios reakcijos laisvoji energija yra palyginti nedidel. Papildoma laisvoji energija gaunama
fermentui pirofosfatazei greitai hidrolizuojant pirofosfat dvi fosfato grupes: matrica-pradmuo-(dNMP)n+dNTPmatrica-pradmuo-(dNMP)n+1+2Pi.
grandin jungto nukleotido laisva ribozs 3OHgrup tampa akceptoriumi kitam deoksinukleozido trifosfatui. Koks nukleotidas toliau bus jungiamas sintetinam grandin, priklauso
nuo jo komplementarumo matricoje esaniam nukleotidui.
1998m. Tomas Steicas (Tom Steitz) pasil universal DNR ir RNR polimerazi katalizuojamos reakcijos chemin model. iame modelyje svarbus vaidmuo skiriamas metalo jonams,
dalyvaujantiems reakcijoje (4.6pav.). Metalo jonai (daniausiai Mg2+ arba Zn2+) yra DNR polimerazi kofaktoriai (angl. cofactors). Anot Steico, metalo jonai koordinuojami DNR (taip
pat RNR) polimerazi aktyviajame centre dviej (kartais trij) konservatyvi fermento asparto
(Asp) aminorgi karboksigrupi deguonies atom. ios aminorgi liekanos yra visikai
konservatyvios DNR ir RNR polimerazse. Nustaius vis DNR polimerazi eim atstov molekuli ir j substrat kompleks erdvines struktras, paaikjo, kad DNR polimerazi aktyviuosiuose centruose panaiai isidst metalo jonai, panai j sveika su reakcijoje dalyvaujaniomis grupmis, nepaisant dideli skirtum tarp baltym aminorgi sek. Vienas metalo
Matrica naudoja DNR arba kai kuriais atvejais RNR molekul.
154
4.5pav. DNR polimerazi katalizuojamos

reakcijos schema (L.
A. Allison. Fundamental Molecular Biology,
155
MOLEKULIN BIOLOGIJA
4.5pav. DNR polimerazs

katalizuojamos reakcijos
mechanizmas, pasilytas T.Steico (D.L.Nelson,
M.M.Cox. Lehninger Principles of Biochemistry, sixth
edition, 2012)
jonas (A) yra isidsts tiksliai ties pradmens galinio nukleotido ribozs 3OHgrupe ir laisvo
dNTP fosfato grupe. Teigiamas metalo jonas poliarizuoja 3OHgrup (t.y. pritraukia deguonies elektronus), jos vandenilio jonas disocijuoja. Toliau vyksta SN2 tipo nukleofilinio pakeitimo
reakcija: 3OHgrups deguonis atakuoja deoksiribonukleozido 5trifosfato (dNTP) padtyje
esant fosfat.
Abu metalo jonai (A ir B) stabilizuoja tarpin pentakovalentin fosfato bsen. ioje bsenoje fosforo atomas yra koordinuotas su penkiais deguonies atomais. Kitas metalo jonas
(B) stabilizuoja neigiam krv ties nueinaniosios grups deguonimi ir suria bei fosfatus.
Katalizs mechanizmas ir aktyviojo centro geometrija yra konservatyvs net ir evoliucikai
labai nutolusiose DNR polimerazse, pvz., T7bakteriofago ir mitochondrij DNR polimerazje. Tai liudija apie io mechanizmo veiksmingum.
Kita eukariot, prokariot, taip pat bakteriofag bei virus DNR polimerazms, sintetinanioms DNR, bendra savyb yra ta, kad DNR polimerazs negali vykdyti DNR sintezs de novo,
4.7pav. DNR matricos, netinkamos DNR sintezei
156
t.y. sintetinti kaip matric naudodamos tik itisin DNR dupleks (4.7pav., a, b) arba tik viengrandin DNR (4.7pav., c).
Sintezs reakcijai vykti reikalinga matrica ir jai komplementarus pradmuo. I tikrj visa
ilga matrica nra btina DNR polimerazei svarbi matricos-pradmens jungties vieta (angl. primer/template junction) (4.4pav. ir 5.5pav.).
Pradmuo suteikia laisv ribozs 3OHgrup, kuri panaudojama cheminje reakcijoje.
Pradmeniu gali bti matricai komplementari RNR, DNR, taip pat prie baltymo prijungtas nukleotidas, komplementarus matricos nukleotidui.
4.2.2. DNR polimerazi katalizuojama reakcija

DNR polimerazi katalizuojamai reakcijai vykti reikia:
zz 1 substrato vis keturi deoksiribonukleozido 5trifosfat: dATP, dGTP, dCTP, dTTP;
zz 2 substrato matricos-pradmens;
zz metalo (Mg2+ ) jon.
Sintezs reakcijos vyksmui ir dideliam jos greiiui bei tikslumui utikrinti DNR polimerazs
turi pasiymti iomis savybmis:
zz atpainti ir prisijungti prie matricos-pradmens;
zz atpainti ir prijungti visus keturis deoksinukleozido 5 trifosfatus (dNTP) bei utikrinti, kad grandin jungiamas nukleotidas bt komplementarus matricoje esaniam
nukleotidui;
zz katalizuoti nukleotidilgrups perna ir sudaryti kovalentin fosfoesterin ry tarp ilginamos DNR grandins laisvos 3OHgrups ir nukleotidilgrups;
zz pakeisti vienu nukleotidu pailginto DNR polimero padt aktyviojo centro atvilgiu tam,
kad bt prijungtas kitas nukleotidas.
Kokios turi bti DNR matricos, kad DNR polimeraz galt sintetinti joms komplementari
grandin? Matrica turi turti jai komplementar pradmen pvz., viengrandin DNR ar RNR,
kurios 3galin sritis komplementari matricai. Pradmens nukleotidas turi turti laisv 3OHgrup. Tok pradmen ilgina DNR polimeraz. 4.8pav. pateikti keli matric pavyzdiai: viengrandins linijins DNR arba RNR ir pradmens kompleksas (a); viengrandins iedins DNR arba RNR
ir pradmens kompleksas (b); segtuko struktra, susidaranti DNR ar RNR tarp komplementari
viengrandini srii usilenkiant 3galui (c) ir vienos grandins trkis dvigrandinje DNR (d).
Pastaruoju atveju, vykus vienos grandins trkiui dvigrandinje DNR, atsiranda laisva 3OHgrup, DNR polimeraz
DNR polimerazs katalizuojama
j ilgina. Kai kurios DNR polimerazs pasiymi savybe iDNR sintezs reakcija vyksta tik
stumti priekyje esani DNR ar RNR grandin (angl. strand
53 kryptimi.
displacement) i duplekso. Istumta grandin suardoma iki
157
MOLEKULIN BIOLOGIJA
nukleotid ar oligonukleotid DNR polimerazi, kurios pasiymi 53 egzonukleaziniu aktyvumu (pvz., E.coli DNR I polimerazs), arba nukleazi.
Laisv 3OHgrup DNR sintezei gali suteikti ir prie DNR matricos prisijungs baltymas, turintis kovalentikai prijungt nukleotid, kuris sudaro komplementari por su vienu i matricos nukleotid (4.8pav., e). Toks DNR replikacijos mechanizmas bdingas kai kuriems bakteriofagams ir virusams.
Cheminiu poiriu nukleotidin grandin gali bti ilginama ir 35 kryptimi. iai reakcijai
taip pat bt tinkami 5deoksinukleozid trifosfatai (5dNTP). Reakcijai vykti reikt aktyvinti
5dNTP 3OHgrup, ji reaguot su 5trifosfatu sintetinamos grandins gale (4.9pav.), susidaryt fosfodiesterinis ryys. Taigi, sintez 35 kryptimi yra manoma. Kodl gamtoje aptinkamos
DNR polimerazs nepasiymi tokiu aktyvumu? Tai, kad DNR polimerazs gali ilginti grandin
tik viena kryptimi, yra susij su kita labai svarbia replikacijos proceso ypatybe replikacijos
tikslumu (angl. fidelity). Replikacijos tikslumas apibriamas pagal matricai komplementari
nukleotid jungim naujai sintetinam DNR polinukleotidin grandin. Aptarsime i DNR
polimerazi savyb isamiau.
DNR polimerazs yra ypa atranks (specifiki) fermentai, bent keliais bdais utikrinantys
replikacijos tikslum (4.1lentel). Tiksliomis DNR polimerazmis laikomi fermentai, kuri klaid
danis yra ~1 klaida 1mln. jungt nukleotid (106).
Pirmasis DNR polimerazi tikslumo lygmuo. DNR polimeraz pirmiausiai prijungia DNR
matric-pradmen. Vandens molekuls istumiamos i fermento aktyviojo centro. Pateks aktyvj centr, dNTP sudaro por su matricos nukleotidu. Nekomplementarus nukleotidas greiiau disocijuoja i DNR polimerazs (disociacijos konstanta Kd=48mM), nes nekomplementaris pors geometrija neatitinka fermento aktyviojo centro ji nesudaro pakankamai ryi
su fermentu, palyginti su nukleotidu, komplementariu matricos nukleotidui (kurio disociacijos
konstanta Kd = 20 M). DNR polimerazs komplementari nukleotid jungimo aktyviajame
centre tikslumas siekia 103.
4.8pav. vairs matricos-pradmens

kompleksai, tinkami DNR polimerazs
katalizuojamai sintezei
158
DNR polimerazs taip pat pasiymi savybe veiksmingai skirti dNTP nuo rNTP, nepaisant to, kad
pastarj vidulstelin koncentracija yra bent 10 kart didesn. Tam, kad atskirt dNTP nuo rNTP,
DNR polimerazs pasitelkia vairius bdus: pvz., T7bakteriofago DNR polimerazje tik dNTP ribozs
C-2atomas lenda siaur fermento kien, kuri netelpa rNTP C-2OHgrup.
Kitose DNR polimerazse rNTP prisijungti aktyviajame centre pasitelkiamas trukdymo bdas: aminorgi funkcins grups, pvz., DNRPolI Glu liekana, trukdo prisijungti rNTP.
Antrasis DNR polimerazi tikslumo lygmuo. DNR polimeraz pasiymi savybe atrinkti
komplementarias heterociklines bazi poras nuo nekomplementari. Fermentas sveikauja su
aktyvj centr pakliuvusiu dNTP. Tik tuo atveju, jeigu aktyviajame centre yra matricai komplementarus nukleotidas, DNR polimerazs konformacija keiiasi i atvirosios (angl. open)
udarj (angl. closed). ia svarbus vaidmuo tenka fermento struktriniam pirt domenui
(4.11pav., a). Kelios domeno aminorgtys sudaro ryius su aktyviajame centre esaniu dNTP.
Susidarius komplementariai sveikai tarp dNTP ir matricos nukleotido, pirt domeno spi-
4.9pav. Schema, iliustruojanti DNR polimerazs jungt nekomplementari nukleotid taisymo

kelius, jeigu DNR sintez vykt 35 ir 53 kryptimis (Pagal B. Alberts, D. Bray, Johnson et al. Essential Cell Biology, fourth edition, 2014)
159
MOLEKULIN BIOLOGIJA
ral (Ospiral) pasisuka ~40 kampu (4.10pav.). Ji labai priartja prie dNTP ir sudaro su juo
ryius. Atvirojoje fermento konformacijoje i spiral yra nutolusi nuo dNTP. Toks DNR polimerazs struktrinis virsmas patvirtintas matricos-dNTP-DNR polimerazs komplekso rentgeno
struktrine analize. Priartjus Ospiralei prie dNTP, susidaro ryiai tarp dNTP ir kai kuri Ospirals aminorgi. Tarp tirozino ir dNTP heterociklins bazs ima veikti stekingo sveika, o
dvi krv turinios aminorgi liekanos sveikauja su trifosfatu. Udarojoje DNR polimerazs
konformacijoje dNTP priartja prie metalo jon aktyviajame centre ie pokyiai labai greitina
chemin reakcij.
K tik aptarta DNR polimerazi savyb skirti komplementari bazi sveik nuo nekomplementarios yra vadinama indukuoto atitikimo (angl. induced fit) valdymo mechanizmu. Esant
komplementariajai sveikai tarp laisvo dNTP ir matricos nukleotido, susidaro trinaris kompleksas matrica-dNTP-DNR polimeraz. Tik tuomet vyksta katalizin reakcija. Kovalentiniu
ryiu prijungus nukleotid, DNR polimeraz grta pirmin atvirj konformacij. Dl anksiau aprayto indukuoto atitikimo mechanizmo nukleotid jungimo tikslumas pasiekia 105.
Vis dlto anksiau aptart DNR sintezs tikslum utikrinani mechanizm nepakanka pasiekti labai didelio tikslumo, btino lstelei sintetinant ilgas genomines DNR. Todl yra jungiami nekomplementars nukleotidai. Daniausiai tai vyksta dl atsitiktinio dNTP heterociklini
bazi virsmo tautomerines (imino arba enolin) formas. Nekomplementars nukleotidai,
4.10pav. DNR polimerazs indukuoto atitikimo mechanizmas (J.D.Watson, T.A.Baker, S.P.Bell,

A.Gann, M.Levine, R.Losick. Molecular Biology of the Gene, seventh edition, 2013)
160
kuri heterociklins bazs yra tam tikros tautomerins formos, gali bti tiksliai idstomi katalizinei reakcijai fermento aktyviajame centre ir jungiami sintetinam grandin (jungimo danis yra ~1 jungimas i 105). Reakcija vyksta ltai, DNR polimerazei nebdingas konformacijos
virsmas i atvirosios udarj.
Treiasis DNR polimerazi tikslumo lygmuo. Nekomplementarus nukleotidas turi bti
paalintas, o vietoje jo jungtas komplementarus. i klaid taisymo (angl. proofreading) katalizin funkcij turi tam tikros DNR polimerazs. Ji vadinama 35 egzonukleaziniu aktyvumu. Aktyvumas grandins atvilgiu veikia prieinga kryptimi, nei vyksta DNR sintez. Tokiu
bdu nuo sintetinamos grandins 3galo paalinamas jungtas nekomplementarus nukleotidas (4.9 pav.). Dl 35 egzonukleazinio aktyvumo DNR polimerazi tikslumas iauga dar
~100 kart ir gali siekti 107 (4.11pav.).
DNR polimerazi 35 egzonukleazs aktyvusis cenReplikatyvins DNR polimetras paprastai bna nutols nuo polimerazs aktyviojo
razs pasiymi klaidas taisancentro ~3040. Jis gali bti tame paiame polipeptide,
iu 35 egzonukleaziniu
kaip ir polimerazs aktyvusis centras (pvz., DNRPolI), arba
aktyvumu.
kitame baltyminiame subvienete (pvz., DNRPolIII). Svarbi
35 egzonukleazs aktyviojo centro savyb viengrandins DNR jungimo sritis.
Egzonukleazs aktyviajame centre, panaiai kaip ir polimerazs aktyviajame centre, rgtinmis
savybmis pasiyminios aminorgi liekanos prijungia du metalo jonus, kurie veikia panaiai kaip
metalo jonai, esantys polimerazs aktyviajame centre. Vienas metalo jonas deprotonizuoja vandens
molekul. Toliau vyksta susidariusio hidroksido jono nukleofilin ataka fosfat. Abu metalo jonai koordinuoja fosfodiesterinio ryio deguonies atomus, stabilizuodami tarpin bsen ir palengvindami
produkto nukleotido oksianijono pasialinim.
4.11pav. Kai kuri eukariotini ir prokariotini DNR polimerazi sintezs tikslumas (Nature Reviews Genetics, v.9, p. 594, 2008)
161
MOLEKULIN BIOLOGIJA
DNR sintezs metu jungtas nekomplementarus nukleotidas sultina DNR polimerazs

greit, fermentas lieka atvirojoje konformacijoje. Pvz., jungus nekomplementar nukleotid,
T7bakteriofago DNR polimerazs greitis sumaja nuo 300nt/s iki 0,01nt/s. ios pauzs metu
DNR atpalaiduojama i DNR polimerazs aktyviojo centro
ir nukreipiama egzonukleazs aktyvj centr (4.11pav.,
Klaid taisymas vyksta nepaleid). Nustatyta, kad nekomplementari bazi pora DNR polidiant matricos i DNR polimemerazs aktyviajame centre stimuliuoja egzonukleazs
razs fermento.
aktyvum. Tai patvirtina in vitro eksperimentai su substrat
analogais, kurie tiko aktyviajame centre, bet nesudar vandenilini ryi su matricos heterociklinmis bazmis.
Tarkime, kad nukleotidins grandins sintez vyksta ne 53, bet 35 kryptimi. vykus
klaidai ir jungus nekomplementar nukleotid, jis turi bti paalintas. 5gale jungt nukleotid gali paalinti 53 egzonukleaz. Po hidrolizs grandins 5gale lieka fosfoesteris (4.9pav.).
i grup, papildomai neaktyvinta, negali sudaryti fosfodiesterinio ryio su nauju dNTP. Be aktyvinimo grandins sintez nutrksta. Taigi, 35 kryptimi vykstanios DNR sintezs klaid
taisymas yra energetikai nenaudingas.
Galiausiai, egzistuoja dar vienas etapas, kurio metu taisomos DNR polimerazs replikacijos
metu paliktos klaidos, nekomplementari nukleotid reparacija (angl. missmatch repair).
Dl io proceso DNR replikacijos metu padarom klaid skaiius sumaja dar ~1000 kart
(4.11pav.).
4.2.3. DNR polimerazi struktra

Visos replikatyvins DNR polimerazs, iskyrus eukariot DNR polimeraz-praimaz,
turi polimerazs aktyvj centr ir 35 egzonukleazs aktyvj centr, esant arba tame paiame subvienete, arba kitame baltyme. 1985m. pirm kart buvo nustatyta DNR polimerazs E.coli DNR Ipolimerazs erdvin struktra. iuo metu yra nustatytos daugiau nei 30 DNR
polimerazi erdvins struktros.
Bendra vis inom polimerazi ne tik dalyvaujani DNR replikacijoje, bet ir reparacijoje,
taip pat atvirktins transkriptazs ir net RNR polimerazs struktrin ypatyb yra ta, kad ie
baltymai savo struktroje turi ply (angl. cleft), kuriame isidsto B formos DNR (4.12pav., a, c).
Erdvin DNR polimerazi struktra primena pusiau atgniaut dein deln, todl jos domenai
yra vadinami platakos dalimis. Fermento apatinje dalyje esaniame delne (angl. palm) yra
DNR polimerazs aktyvusis centras, kuriame isidsiusios konservatyvios asparto aminorgtys, prijungianios metalo jonus, taip pat aminorgtys, sveikaujanios su pradmens 3galu ir
laisvo dNTP fosfatu.
Delno domene yra konservatyvs aminorgi A ir C motyvai, bdingi visoms nukleorgi polimerazms, taip pat B motyvas, bdingas tik DNR polimerazms. Delno domeno
aminorgtys sudaro vandenilinius ryius su DNR mauoju grioviu. Jeigu yra jungiamas nekomplementarus nukleotidas, ryi susidaro maiau, reakcijos greitis sumaja, o matrica yra
nukreipiama DNR polimerazs egzonukleazs aktyvj centr.
162
Kiti du polimerazi domenai tai pirtai (angl. fingers) ir nyktys (angl. thumb) (4.12pav.,
ac). ie domenai yra maiau konservatyvs polimerazse nei delno domenas, taiau daugelyje ferment lemia panaias svarbias funkcijas. Pirt domenas svarbus katalizei. Jo O spiral
sveikauja su aktyviajame centre esaniu laisvu dNTP (4.7pav., a). Pirtai sveikauja su DNR
matrica. Tuoj u aktyviojo centro matricos grandin smarkiai ilinksta. Dl ilinkimo tik vienas
matricos nukleotidas yra idstomas aktyviajame centre (4.12pav., a).
Nykio domenas sveikauja su DNR dupleksu. Tokiu bdu utikrinama fermento sveika
su substratu DNR.
4.12pav. DNR polimerazi struktra. E.coli DNR Ipolimerazs Klenovo fragmento su DNR polimerazs
ir 53 egzonukleazs aktyviaisiais centrais schema (a, b) (J.D.Watson, T.A.Baker, S.P.Bell, A.Gann,
M.Levine, R.Losick. Molecular Biology of the Gene, seventh edition, 2013); T.aquaticus DNR Ipolimerazs
kartu su matricos-pradmens DNR erdvin struktra (c)
163
MOLEKULIN BIOLOGIJA
4.2.4. DNR polimerazi vairov

vairi organizm DNR polimerazs pagal aminorgi sek homologij yra skirstomos
7 eimas, eimos dar skirstomos poeimius. Pagal DNR polimerazes koduojani gen polA,
polB ir polC nukleotid sek panaum E.coli DNRPolI, DNRPolII ir DNRPolIII priskiriamos
A, B ir C eimoms (4.2lentel).
DNR III polimeraz yra vienetelis C eimos atstovas bakterijose. C eimos polimerazi rasta
ir virusuose.
Eukariot DNR Pol ir j panaios DNR polimerazs neturi homolog E. coli ir sudaro
atskir Xeim.
Palyginti neseniai atrastos E.coli DNRPolIV ir DNRPolV, kuri katalizinius subvienetus
koduoja genai umuC ir dinB, sudaro dar vien, pastaruoju metu spariai gausjani Yeim.
Dar vien D eim sudaro archj (Archaea) pogrupio Euryarchaeota atstovuose atrastas
fermentas DNR PolDI. D eimos atstov iki iol nerasta jokioje kitoje organizm grupje.
Dar inoma RT polimerazi eima, kuri sudaro nuo RNR priklausomos DNR polimerazs
bei telomerazi atvirktins transkriptazs.
4.2lentel. DNR polimerazs archjose, bakterijose, eukariotuose ir virusuose
Gyvybs
domenas/
virusai
DNR polimerazi eima

A
RT
Archjos
PolBI
PolBII*
(PolBIII)**
PolDI***
Dpo4
Dbh
Bakterijos
PolI
PolII
PolIII
PolIV /
DinBPolV /
UmuC
Eukariotai
Pol (teta)
Pol (gama)
Pol (alfa)
Pol (delta)
Pol (epsilon)
PolV****
Pol (zeta)
Pol (beta)
Pol (lambda)
Pol (miu)
Pol (sigma)
Pol (eta)
Pol (kapa)
Pol (jota)
REV1
Telomerazs
atvirktin
transkriptaz
Virusai
(+)
IV viruso DNR
polimeraz
DNR polimerazs yra pateikiamos lentelje su j pavadinimais; jeigu pavadinimo neturi, ymima +.
* Tik Crenarchaeota.
** Polimerazs, kurios tik atsitiktinai aptiktos kurios nors karalysts atstovuose, paymtos skliaustuose.
*** Tik Euryarchaeota.
**** Tik mielse.
DNR polimerazms bdinga ir dydi vairov: maiausia DNR polimeraz, priklausanti

X eimai, yra ~ 20 kDa fermentas; mogaus DNR (zeta) polimerazs katalizinio subvieneto
molekulin mas yra 344kDa, o E.coli DNRPolIII holofermento net ~800kDa. Taiau, nepaisant labai skirting dydi ir savybi, DNR polimerazi katalizuojamos sintezs reakcijos
mechanizmas yra universalus.
164
4.3. DNR replikacija prokariotuose

4.3.1. Bakterij (E.coli) DNR polimerazs
DNR Ipolimeraz. 1957m. ArturasKornbergas (Arthur Kornberg) ir jo kolegos atrado pirmj DNR polimeraz Escherichia coli DNR Ipolimeraz, DNRPolI (E.coli DNR polimerazs
numeruojamos pagal j atradimo eilikum). E.coli DNR Ipolimeraz yra 109kDa baltymas, j
sudaro viena 928 aminorgi polipeptidin grandin. Trys polimerazs kataliziniai aktyvumai (4.2lentel ir 4.13pav.) yra isidst skirtinguose domenuose. Panaia domenine organizacija pasiymi daugelio bakterij DNRPolI.
Atliekant E. coli DNR Ipolimerazs dalin proteoliz fermentais tripsinu ir subtilizinu buvo
nustatyta, kad baltymas skaidomas du fragmentus: maesnj 323 aminorgi ir didesnj
605 aminorgi fragment.
Maasis DNRPolI fragmentas pasiymi 53 egzonukleaziniu aktyvumu. Didysis fragmentas pasiymi 53 DNR polimeraziniu ir 35 egzonukleaziniu aktyvumu.
Proteolizs bdu gautas didysis fragmentas yra dar vadinamas Klenovo fragmentu ir danai naudojamas DNR sintezs reakcijose in vitro. Klenovo fragmentas pasiymi ir nedideliu atvirktins polimerazs aktyvumu. Klenovo fragmente kataliziniai DNR polimerazs ir egzonukleazs centrai yra nutol vienas nuo kito ~30. Abu centrai isidst DNR polimerazs delne
(4.12pav., ac). Esant tokiai centr konfigracijai, sintetinamos DNR grandins 3galas turt
pasisukti i vieno aktyviojo centro kit tuo atveju, jeigu reikt paalinti jungt nekomplementar nukleotid. vykus sintezs klaidai, DNR duplekso 3gale vandeniliniai ryiai tarp heterociklini bazi suyra (angl. melting). Toks dupleksas netinkamas substratas DNR polimerazei.
Jos sintezs greitis maja. Pasisukusi viengrandin DNR (turinti 45 nukleotidus 3gale) yra
giminingesn egzonukleazei, DNRPolI egzonukleaz aktyvinama. Vyksta nekomplementariojo nukleotido paalinimas nedisocijuojant DNR i fermento.
Proteolizs bdu gautas maasis DNR Ipolimerazs fragmentas pasiymi 53 egzonukleaziniu aktyvumu. Dl io katalizinio aktyvumo DNR Ipolimeraz gali paalinti nedidelius
viengrandinius oligonukleotidus (iki 10) arba mononukleotidus nuo DNR 5galo (4.8pav., d).
Gali bti paalinami tiek deoksinukleotidai (dvigrandinje DNR), tiek ribonukleotidai (DNRRNR hibride).
E.coli DNR I polimeraz in vitro gali pradti DNR sintez nuo DNR grandinje esanio viengrandinio trkio (4.8 pav., d). Trkio vietoje DNR I polimeraz ilgina laisvj 3 gal. Priekyje
esanti komplementari grandin yra istumiama (angl. strand displacement) ir suardoma DNR
Ipolimerazs 53 egzonukleazinio aktyvumo. N viena
kita DNR polimeraz nepasiymi savybe istumti priekyje
DNR Ipolimeraz upildo DNR
esani grandini. is procesas yra dar vadinamas karpos
grandinje atsiradusius plyius
transliacija (angl. nick translation).
replikacijos metu arba po DNR
DNR I polimerazs molekuli E.coli lstelje yra ymiai
reparacijos.
daugiau negu DNR II polimerazs ir DNR III polimerazs
(4.13pav.). Dl didelio DNR Ipolimerazs kiekio E.coli sun-
165
MOLEKULIN BIOLOGIJA
4.13pav. E.coli DNR polimerazi savybs. TLS DNR sintez ties paaidomis (FEMS Microbiology Reviews, v. 36, p. 11056, 2012)
ku aptikti kitas DNR polimerazes. Taiau nepaisant to, kad DNRPolI bakterinje lstelje yra
daug, ne ji sintetina ilgas E.coli DNR.
DNR IIpolimeraz. Nors DNR IIpolimeraz (Mw=~90kDa) buvo atrasta seniai (1970m.),
ilg laik jos funkcija lstelje buvo neinoma. Pastaruoju metu aikja, kad fermentas yra
svarbus lstels SOS atsako ultravioletins spinduliuots (UV) sukeltas DNR paaidas dalyvis.
E.coli lstelje DNRPolII koduoja dinA genas, kurio transkripcija aktyvinama kelet kart atsiradus UV sukeltoms DNR paaidoms (4.13pav.).
Be DNR polimerazinio aktyvumo, DNR Pol II taip pat pasiymi ir 35 egzonukleaziniu
aktyvumu. Taigi, DNRPolII yra tiksli polimeraz (klaid danis: ~1klaida/1mln. nukleotid).
DNRPolII priskiriama polimerazi Beimai. Beimai dar priklauso archj ir eukariot DNR
polimerazs. Genetiniais ir biocheminiais tyrimais nustatyta, kad DNRPolII dalyvauja iuose
procesuose:
zz DNR, turinios UV sukelt spinduli paaid, reparacijoje (SOS mutagenezje); tarpgrandinini sry reparacijoje; DNR, kurioje nukleotidai yra netek heterociklini bazi,
reparacijoje;
zz atnaujinant DNR replikacij (angl. replication restart). is procesas vyksta tada, kai dl
UV spinduli, oksidacinio streso sukelt DNR paaid DNR IIIpolimeraz ustringa ties
166
DNR matrica ir nebegali tsti sintezs. Replikacijos atnaujinimas ymiai vluoja lstelse,
kurios yra DNRPolII mutantai. Nemutantinse lstelse ji vyksta po 10 min, o mutantinse po 50min. DNRPolII veikimo mechanizmas iame procese dar nra iki galo iaikintas. Manoma, kad ji pradeda sintez u paaidos dalyvaujant atnaujintos replikacijos
praimosomai. Vliau DNRPolII pakeiia DNRPolV ir DNRPolIII (4.14pav.);
zz episom (plazmidi) replikacijoje in vivo;
zz procesyviosios DNR sintezs metu in vitro sveikaudama su iedu ir -iedo uklimo kompleksu.
DNR IVpolimeraz ir Vpolimeraz. E.coli DNR IVpolimeraz (kuri koduoja dinB genas)
ir V polimeraz (kuri koduoja umuC ir umuD genai) buvo atrastos tik pastaraisias metais. i
polimerazi sintez aktyvinama lstels SOS atsako DNR paaidas metu, kaip ir DNRPolII
(4.13 pav.). Abi ios DNR polimerazs neturi 35 egzonukleazinio aktyvumo, jos priklauso
DNR polimerazi Y eimai. IV ir V polimerazs dalyvauja UV spinduli sukelt DNR paaid
reparacijos procesuose, j gebjimas sintetinti DNR ties paaidomis matricinje grandinje
vadinamas DNR paaid perjimu, TLS (angl. translession synthesis). Sintetindamos DNR ties
4.14pav. E.coli DNR IIpolimerazs

veikimas dl UV spinduli sukelt
DNR paaid nustojus veikti DNR
IIIpolimerazei
167
MOLEKULIN BIOLOGIJA
paaidomis polimerazs palieka klaid, t.y. terpia nekomplementari nukleotid. Tokia DNR
sintez vadinama klaidas paliekanija (angl. error prone). DNR polimerazs, kurios dalyvauja
iuose procesuose, yra vadinamos klaidas paliekaniosiomis, arba DNR EP polimerazmis.
Replikatyvins DNR polimerazs, prijusios DNR matricinje grandinje paaid, sustoja,
nes j aktyvusis centras jautriai reaguoja pasikeitusi DNR geometrij. Kas tuomet vyksta?
Nustatyta, kad tiek prokariotinse, tiek eukariotinse lstelse gausu DNR polimerazi, kurios
pasiymi daug maesniu tikslumu nei replikatyvins polimerazs. Esant DNR paaid, jos pakeiia ties paaida ustrigusi replikatyvin DNR polimeraz, kuri nebegali tsti sintezs.
DNR EPpolimerazms yra bdingos kelios bendros savybs:
zz DNR EP polimerazs veiksmingai sintetina DNR ties paaida vienos arba kartu su pagalbiniais baltymais;
zz DNR EP polimerazs palieka klaid (klaid danis: 101104);
zz DNR EP polimerazs yra linkusios tarp matricos ir sintetinamos DNR sudaryti ne VotsonoKriko tipo nukleotid poras.
DNRPolV yra heterotrimerinis baltymas UmuD2C (4.13pav.). DNRPolV DNR paaidos link
nukreipia kitas SOS atsako komponentas RecA baltymas. Polimerazs veikimui utikrinti
dar reikia prie viengrandins DNR prisijungiani bakterijos SSB baltym, taip pat DNRPolIII
holofermento komponent iedo ir UK komplekso. Ties paaida DNRPolV daniausiai terpia Anukleotid (4.15pav.). Itaisius paaid, DNR IIIpolimeraz gali toliau tsti sintez. DNR
Vpolimeraz gali veikti ir kitaip: esant tam tikroms paaid rims, ji jungia komplementar
4.15pav. Bakterij DNR Vpolimerazs veikimo schema (PNAS, v.98, p.8350, 2001)
168
nukleotid, t.y. sintetina be klaid (angl. error free). DNRPolV gali sintetinti DNR ir pagal nepaeist DNR matric, taiau, kaip minjome, sintezs klaid danis yra gana didelis.
DNRPolIV pasiymi tuo, kad danai terpia klaid sintetinam DNR grandin. Taigi, ios
polimerazs veikimas yra mutageninis. Padidinus DNRPolIV sintez, lstelje esanioje plazmidje mutacij padaugja ~1000 kart. DNRPolIV yra labai neprocesyvi (distributyvi) polimeraz: prijungusi vien nukleotid ji disocijuoja nuo matricos.
Taigi, atsiradus DNR paaidoms, organizmas veriau renkasi ties jomis replikuoti DNR polimerazes, kurios terpia daug nekomplementari nukleotid, negu stabdyti replikacij.
Sintezs bdas, taip pat ir DNR polimeraz, pakeiianti replikatyvin DNRPolIII, greiiausiai,
pasirenkami priklausomai nuo paaid tipo, DNR nukleotid sek. Pvz., cis-sin pirimidino dimerai replikuojami nepaliekant klaid, o heterociklini bazi netek nukleotidai su klaidomis.
E.coli DNR IIIpolimeraz. DNR polimeraz, dalyvaujanti E.coli chromosomos replikacijoje, arba replikaz, yra DNR IIIpolimeraz. Ji buvo aptikta E.coli polA mutante, kuris neturjo
DNR Pol I aktyvumo. i DNR polimeraz ypatinga tuo, kad lstelje funkcionuoja kaip i 10
skirting tip subvienet sudarytas baltym kompleksas holofermentas.
Keli holofermento sudt einani subvienet tip esti po kelet kopij. Vis DNR IIIpolimerazs holoferment sudaro 17 polipeptid. Holofermentas, esantis replisomos sudtyje,
yra labai stabilus, taiau gryninamas i lsteli disocijuoja atskirus subvienetus arba holofermento dalis (4.16pav., a). Toliau 4.3 lentelje yra pateikiama DNR IIIpolimerazs holofermento
sudtis ir trumpai apibdintos j sudarani subvienet funkcijos.
4.3lentel. E.coli DNR IIIpolimerazs holofermento komponentai ir j funkcijos

Komponentas
(subvienet kiekis holofermente)
Genas
Molekulin
mas* (kDa)
Funkcija
(2)
dnaE
129,9
53 polimerazinis aktyvumas
(2)
dnaQ
27,5
35 egzonukleazinis aktyvumas
(2)
holE
8,6
Stimuliuoja egzonukleaz; stimuliuoja erdins dalels

susimontavim
- (1/2)**
dnaX
47,5/71,1
ATPaz, organizuoja DNRPolIII holoferment (jungia dvi erdines DNRPolIII, DnaB)
(1)
holA
38,7
Jungia ied
(1)
holB
36,9
Stimuliuoja ATP 1srityje
(1)
holC
16,6
Jungiasi prie SSB
(1)
holD
15,2
Jungia prie iedo uklimo komplekso -komplekso
(2 dimerai)
dnaN
40,6
iedas utikrina DNR polimerazs procesyvum***
-kompleksas
Nuo ATP priklausomas iedo uklimo kompleksas
* Viso E.coli DNRPolIII holofermento molekulin mas sudaro ~791,5kDa.

** Priklausomai nuo to, ar kompleksas yra laisvas tirpale ar holofermento sudtyje, -subvienet stechiometrin sudtis skiriasi. Lentelje pateikta holofermento sudtyje esanio - sudtis.
*** Procesyvumas polimerazi savyb jungti nukleotidus nedisocijuojant nuo matricos.
169
MOLEKULIN BIOLOGIJA
DNR IIIpolimerazs katalizuojamai reakcijai in vitro utenka trij baltym: , ir . Kompleksas, kurio sudtyje yra po vien , ir polipetid (Mw=166kDa), dar vadinamas erdine (angl.
core) DNR IIIpolimeraze. erdin DNR polimeraz pasiymi iais aktyvumais:
zz polipeptidas pasiymi 53 DNR polimeraziniu aktyvumu;
zz polipeptidas pasiymi 35 egzonukleaziniu aktyvumu;
zz polipeptidas stimuliuoja egzonukleaz.
erdins polimerazs sintezs greitis ir procesyvumas yra nedideli: sintezs greitis siekia
~20nt/s, o procesyvumas 110 nukleotid. Dar maesni yra subvieneto sintezs greitis
(8nt/s) ir procesyvumas.
Ilg genomins DNR molekuli replikacijai lstelje utikrinti DNR polimeraz susijungia
su papildomais baltymais ir sudaro DNR III polimerazs holoferment. Tokia polimeraz yra
itin greita (iki 5001000nt/s) ir procesyvi (>50kb). Holofermento sudtyje esantys baltymai
atlieka vairias funkcijas, kurios btinos utikrinti veiksming genomo DNR replikacij. E.coli
DNR IIIpolimerazs holofermentas organizuotas tris funkcinius vienetus (4.4lentel). Tokia
replikatyvini DNR polimerazi replikazi funkcin organizacija yra konservatyvi visuose
organizmuose nuo bakterij iki mogaus:
zz erdini (, , ) DNR IIIpolimerazi holofermente i viso yra dvi po vien pirmaujaniosios ir vluojaniosios DNR grandini sintezei (4.16pav., a);
zz -iedo uklimo (angl. clamp loader) kompleksas;
zz du iedai (angl. sliding clamp), kuri kiekvienas sudarytas i dviej baltymo
monomer.
4.16pav. E.coli DNR IIIpolimerazs holofermento struktra. Holofermento struktros schema (a);
holofermento baltym savybs ir juos koduojantys genai (b) (http://genemol.org/biomolespa/Enzimas/
replication.html)
170
4.17pav. E.coli DNR polimerazs

holofermento ir subvienet
stuktrin organizacija
iedo uklimo kompleks (UK) sudaro 7 baltymai, j stechiometrin sudtis 3-, , ,

(chi) ir (psi). ir subvienetai pasiymi ATPaziniu aktyvumu, yra koduojami to paties E.coli
dnaXgeno (4.15pav. b). baltymas turi 24kDa ilgesn Cgal negu polipeptidas (4.17pav.).
Pastarasis yra sintetinamas vykus skaitymo rmelio poslinkiui dnaXribosomoje iRNR transliacijos metu. ir subvienet IIII domenai yra identiki, subvienetas turi papildomus IV ir V
domenus, kuri reikia DnaB helikazs ir erdini DNRPolIII jungimui (4.17pav.).
iedo uklimo komplekse DnaXbaltym yra i viso 3, taiau j stechiometrin sudtis gali
bti vairi: 3, 21, 12, 3, priklausomai nuo to, ar is kompleksas yra laisvas ar jis yra DNRPolIII
holofermento sudtyje. baltymai Cgalinmis sritimis jungiasi su erdinmis polimerazmis (,
, ). Maiausiai dvi erdins polimerazs turi bti jungtos holoferment, kad bt utikrinta
vluojaniosios ir pirmaujaniosios DNR grandini sintez. Tam reikalingi maiausiai du subvienetai. Dviej subvienet ir dviej erdini polimerazi subkompleksas dar vadinamas DNRPol.
Be anksiau mintos funkcijos, subvienetai dar sujungia holoferment su DnaBhelikaze
(4.16pav., a). Kai heksamerin DnaBhelikaz baltym sujungiama su DNRPolIII holofermentu, DNR grandini iskyrimo greitis labai padidja ir tampa panaus DNRPolIII holofermento,
sintetinanio DNR, greit. Taigi, subvienetai yra replisomos, kurias sudaro DNRPolIII holofermentas, DnaBhelikaz, DnaGpraimaz, SSBbaltymai bei organizacinis centras (4.16pav., a).
erdini polimerazi ir -iedo uklimo komplekso komponentai sudaro DNRPolIII* kompleks vadinamj DNRPolIII vaigd (angl. DNA Pol III star). DNRPolIII* jungiasi su iedais.
I anksiau pateikto komponent apraymo matyti, kad DNR IIIpolimerazs holofermentas
yra asimetrins struktros, nes turi tik vien -kompleks. Holofermentas yra asimetrikas ir
funkcine prasme, nes -kompleksas funkcionuoja ties ta replisomos vieta, kur yra sintetinama
vluojanioji DNR grandin.
Daugelio eubakterij genomuose yra DNR Pol III holofermento komponentus koduojani gen,
tarp kuri labiausiai konservatyvs genai, koduojantys , , , , subvienetus, o kitus subvienetus koduojantys genai smarkiai pakit arba j i viso nra. Pamatin struktrin DNRPolIII organizacija ir
pagrindins biochemins funkcijos yra tos paios. Tiesa, kai kurios gram teigiamos bakterijos, pvz., B.subtilis, S.aureus, S. pyogenes, turi dvi skirtingas DNR polimerazes, dalyvaujanias genomo replikacijoje.
Kaip susimontuoja didiulis DNR IIIpolimerazs holofermentas, dydiu (kuris yra ~800000Da)
beveik prilygstantis maajam E.coli ribosomos subvienetui, ir kokios jo komponent funkcijos
replikacijos procese? erdins DNR Pol III (, , ) sintezs
greitis ir procesyvumas yra mai. Tapti veiksmingomis repliSlystantieji iedai yra DNR polikazmis joms btini slystantieji iedai (angl. sliding
merazi procesyvumo veiksniai.
clamp) polimerazi procesyvumo veiksniai.
171
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Prie prisijungiant erdinms DNR IIIpolimerazms prie DNR grandini ir prie prasidedant
DNR sintezei, prie DNR pirmiausiai jungiami iedai. Prie j prisijungia ar yra prijungiamos DNR
polimerazs, taip pat daugelis pagalbini replikacijoje, reparacijoje bei kituose procesuose dalyvaujani baltym. Slystantiesiems iedams sveikaujant su daugeliu baltym, valdomas ir
pai DNR polimerazi darbas.
Slystantieji iedai yra paplit daugelyje organizm nuo bakteriofag iki mogaus ir atlieka
t pai funkcij replikacijoje. i DNR polimerazi procesyvumo veiksni aminorgi sekos skiriasi, taiau j erdvin struktra yra itin panai: baltym monomerai sudaro ied (homodimer arba homotrimer), turint ~35 ertm, kurioje yra DNR dupleksas (4.18pav., a).
iedo vidiniame paviriuje yra spirali, jis neigiamo krvio. iedo viduje taip pat isitenka
pora sluoksni vandens molekuli. Isidsiusios tarp vidinio baltymo paviriaus ir DNR jos gali
palengvinti DNR slydim. ied sudarantys monomerai tarpusavyje sveikauja vandeniliniais,
4.18pav. Slystantieji iedai ir j su DNR kompleksas. E.coli iedo komplekso su DNR erdvin struktra. IIII baltymo domenai (a); vairi organizm slystanij ied struktros (b) (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 7, p. 751, 2006)
172
hidrofobiniais, joniniais (drusk tilteli) ryiais. Vieno monomero N galas sveikauja su kito
monomero Cgalu (galvos-uodegos principu). Sveika yra labai glaudi. iedo puss skiriasi:
vienoje jo pusje yra protomer Cgalai. I ios puss su iedu sveikauja iedo uklimo kompleksas, DNR polimerazs, kiti baltymai.
iedo vid patalpinamas DNR dupleksas. Atrankia sveika su DNR iedas nepasiymi. Atsiradus dvigrandiniam DNR trkiui, iedas nuo DNR nukrinta, nes sumaja baltymo ir DNR
sveik skaiius.
Slystantieji iedai bakterijose paprastai sudaryti i dviej monomer, o bakteriofaguose,
archjose ir eukariotuose i trij (4.18pav., b).
Kiekvien E. coli DNR III polimerazs slystantj ied sudaro du vienodi subvienetai.
(4.18pav., a). subvienet dimeras yra labai stabilus. Jo gyvavimo ant DNR pusamis sudaro
~100min 37C. dimero jungimui prie DNR reikia ATP ir -komplekso iedo uklimo
komplekso, UK (4.3lentel). ied uklimo kompleksai paplit bakterijose, virusuose, archjose ir eukariotuose. Pvz., T4 bakteriofago ir eukariot iedo uklimo kompleksai sudaryti
i penki subvienet, o archj i dviej subvienet, didiojo ir maojo, kuri stechiometrin
sudtis yra 1:4.
Bakterijose ant sintetinamos pirmaujaniosios DNR grandins iedas ukeliamas vien
kart, o ant vluojaniosios DNR grandins kas 12s, pradedant sintetinti kiekvien nauj
Okazaki fragment ties praimazs susintetintu RNR pradmeniu.
iedui ukelti UK naudoja ATP jungim ir hidroliz. Maiausiai vienos ATP molekuls reikia
ukelti vien ied ant T4 bakteriofago DNR polimerazs, 23 ATP molekuli ukelti vien
ied ant E.coli DNRPolIII.
E.coli iedui ukelti utenka -komplekso sudt einani subvienet, kuri stechiometrin sudtis yra 32, , (vadinamasis minimalus iedo uklimo kompleksas). -komplekso
sudt einantys , , subvienetai yra AAA+ (angl. ATPases associated with a variety of cellular
activities) ATPazi eimos atstovai. eimai priklauso labai daug vairias funkcijas atliekani lstels baltym, kurie skirstomi 7 klases. AAA+ baltym funkcijos priklauso nuo ATP prijungimo
ir hidrolizs. -komplekso baltymai priklauso I klasei, jie sudaro atviro iedo pavidalo struktr. Kit klasi AAA+ eimos atstovai, iskyrus II klass, sudaro udaro iedo struktras.
Kiekvien UK subvienet sudaro trys domenai (4.19pav., a). UK iede tarp ir subvienet yra ~20 plyys (4.19pav., b). Per ply talpinama DNR. UK subvienet Cgaliniai domenai (III domenai) iedo uklimo komplekso struktros viruje sudaro udar apykakl.
Apykaklje plyio nra, todl ties apykakle viengrandin DNR ilinksta (4.20 pav.). Rentgenostruktriniai tyrimai patvirtino, kad UK struktra i ties nra visikai iedin: Ngaliniai
AAA+ domenai (I ir II) isidsto sudarydami struktr, panai deiniojo sukimo spiral. E.coli
UK is struktrinis ypatumas nra toks rykus kaip, pvz., eukariot UK.
UK ATPazin motor sudaro trys subvienetai. Btent j sudtyje yra konservatyvs AAA+
eimos baltymams bdingi aminorgi motyvai (Volkerio A ir B motyvai, SRC motyvas su
arginino pirtu), kur prijungiamos ir hidrolizuojamos ATP molekuls (4.19pav., b). ATP prijungimas ir hidroliz valdo UK aktyvum. subvienetas komplekse sveikauja su , neleisdamas
jam anksiau laiko jungti iedo. subvienetas tiesiogiai sveikauja su iedu. Sveika su
Lstels replisomoje funkcionuoja 2kompleksas.
173
MOLEKULIN BIOLOGIJA
iedu tampa manoma, kai UK prijungia ATP. ATP prijungimas sukelia konformacini pokyi UK. ir subvienetai, kitaip nei , ATPaziniu aktyvumu nepasiymi.
Jei nra ATP, -kompleksas silpnai sveikauja su iedu. O vienas subvienetas pasiymi stipria sveika su iedu, ir iai sveikai ATP nereikia. Tai liudija, kad UK komponentas,
tiesiogiai sveikaujantis su iedu, yra paslptas. ATP molekuli prijungimas prie komplekso
subvienet keiia UK erdvin struktr. Tada vienas jo subvienet () gali prijungti ied
(4.20pav.).
Bakterij UK turi tris ATP prijungimo sritis, o eukariot net keturias. Parodyta, kad iedo
jungimo metu maiausiai viena ATP molekul turi prisijungti prie -komplekse esani vieno
i subvienet, kad komplekse prasidt konformaciniai pokyiai, ilaisvinantys subvienet.
subvienetas prisijungia prie iedo. Kompleksas pirmiausiai prijungia ied, o tada j praveria
ties iedo monomer sveikos riba (4.20pav.). Neseniai patvirtinta, kad iedo pravrimo metu
UK dalyvauja tiesiogiai.
Koks galt bti iedo pravrimo mechanizmas? Tiriant komplekso erdvin struktr, nustatyta,
kad subvieneto sritis, esanti subvieneto N galiniame domene, kaip pleitas siterpia hidrofobin
kien, kuri yra iedo vieno i subvienet Cgale. iedas praveriamas. Pro susidarius ply terpiamas
~20 DNR dupleksas (DNR matrica-pradmuo).
4.19pav. E.coli iedo uklimo komplekso stuktra. Komplekso baltym erdvins struktros. IIII
domenai parodyti (a); ATPazs aktyvusis centras, formuojamas dviej greta esani subvienet (kairje);
iedo uklimo komplekso struktros schema (deinje) (b) (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 7,
p.751, 2000)
174
iedo uklimo kompleksas su prijungtu prie jo ir pravertu iedu ukelia ied ant DNR.
iedas turi bti ukeltas ant DNR taip, kad ta jo pus, prie kurios vliau jungsis DNR polimeraz,
bt tiksliai idstyta DNR atvilgiu (4.20pav.). DNR polimeraz jungiasi ties tuo paiu iedo
paviriumi (iedo Cgaline dalimi), kaip ir UK.
DNR prijungimui ATP hidrolizs nereikia: iame etape ATP gali bti pakeistas nehidrolizuojamu analogu ATPS. UK vienodai veiksmingai prijungia tiek DNR matricos-pradmens kompleks, turint viengrandins matricos 5galo iky, (4.20pav.), tiek dvigrandin DNR, nepriklausomai nuo to, yra iedas ar ne. Taiau tik pirmuoju atveju prijungtas substratas matricapradmuo ~100 kart aktyvina -komplekso ATPazes. Tada vyksta ATP hidroliz.
Pasibaigus ATP hidrolizei, -komplekse vyksta struktros pokyiai. UK disocijuoja, paleisdamas ied. iedas usiveria aplink DNR matricos-pradmens dupleks. Su ta paia iedo
puse sveikauja erdin DNRPolIII, btent tuo metu ji jungiasi prie iedo. Reikia pastebti, kad
-kompleksas gali ir ukelti ied ant DNR, ir j nukelti. Spjama, kad pastarj funkcij gali
atlikti pats subvienetas. Tie kompleksai, prie kuri yra prisijungusi DNR IIIpolimeraz, apsaugoti nuo disociacijos, o tie, kurie yra laisvi, gali bti nukeliami nuo DNR ir naudojami kitose
vietose, kur reikia prijungti DNR polimeraz. Neseniai tyrimais patvirtinta, kad ties bakterij
vluojanija grandine yra daug nenukelt ied.
Dvi erdins DNR III polimerazs pasiymi skirtingomis disociacijos nuo DNR savybmis.
Toji erdin DNR polimeraz, kuri sintetina pirmaujanij grandin, lieka nuolat susijungusi su
iedu, o ta, kuri sintetina vluojanij grandin, kartas nuo karto perjungiama nuo baigto
sintetinti Okazaki fragmento prie iedo ties naujo fragmento pradmeniu. Todl -kompleksas
replisomoje yra susijungs su ta erdine DNR polimeraze, kuri sintetina vluojanij grandin.
ied lstelje yra 2030 kart daugiau nei DNR IIIpolimerazs holoferment kompleks.
-komplekso disociacija nuo iedo ir DNR duplekso yra btina, kad prie jos galt prisijungti
lik DNR polimerazs subvienetai ir prasidti DNR replikacija.
4.20pav. Baltym iedo jungimas prie DNR matricos-pradmens komplekso dalyvaujant iedo uklimo kompleksui (UK) (BMC Biology, v.10, 2012)
175
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Neseniai buvo nustatyta, kad erdins polimerazs disociacijai, kai ji baigia Okazaki fragmento vluojaniojoje grandinje sintez, reikia subvieneto. Kai DNR polimeraz pasiekia prie tai sintetinto
Okazaki fragmento pradmens 5gal ir jungia paskutin prie ankstesnj pradmen, lieka atviras plyys. I DNR polimerazs holofermento yra isukamas subvienetas. Jis sukelia DNR polimerazs erdins dalels disociacij nuo iedo. iam procesui reikalingas subvieneto Cgalinis domenas, kuris
yra komplekso iorje ir sveikauja su DNR polimeraze. domu, kad isukimas priklauso nuo to, ar Okazaki fragmento sintez baigta ar ne jis vyksta tik polimerazei jungus paskutin nukleotid. Manoma,
kad tokiu bdu apsisaugoma nuo pernelyg didelio procesyvumo. Kaip nustatoma Okazaki fragmento
sintezs pabaiga ir kada DNR polimerazs erdin dalel reikia perjungti ties kitu iedu? subvieneto
C galinis domenas pasiymi savybe atrankiai sveikauti su DNR. ios savybs, pvz., neturi to paties
geno koduojamas, tik trumpesn Cgal turintis baltymas. Siloma hipotez, kad baltymo Cgalinis
domenas holofermente yra isidsts arti erdins dalels subvieneto, kuris sveikauja su DNR ir
gali identifikuoti, kada Okazaki fragmento sintez baigta. Disocijavusi nuo iedo DNR polimerazs
erdin dalel greitai prijungiama prie kito iedo, UK prijungto ties naujai susintetintu pradmeniu.
Kaip susimontuoja E.coli DNRPolIII holofermentas? Turi susidaryti dimerin holofermento

struktra, turinti vien UK. ia svarbiausias vaidmuo tenka dviems DNRPolIII subvienetams.
subvienet dimeras DNR IIIpolimerazs holofermente laiko -kompleks ir dvi erdines DNR
polimerazes, sintetinanias pirmaujanij ir vluojanij DNR grandines.
4.3.2. E.coli replikacins akuts modelis

Asimetrins E.coli DNR IIIpolimerazs holofermento struktros nustatymas dav pagrind
ir replikacins akuts struktrinio modelio sukrimui. Modelis vadinamas trombono modeliu. Jame viena erdin DNR IIIpolimeraz sintetina pirmaujanij grandin, o kita vluojanij grandin. Visas DNR IIIpolimerazs holofermentas juda iilgai DNR (arba DNR juda per j)
ta kryptimi, kuria sintetinama pirmaujanioji DNR grandin.
Motinin grandin, kuri yra matrica vluojaniosios grandins sintezei, praskiriama tiek,
kad galt prasidti RNR pradmens sintez (4.21pav., a). Ji sudaro kilp usilenkiant grandinei
replikacins akuts judjimo kryptimi. Kuo toliau priek juda DNR IIIpolimerazs holofermentas, tuo didesn kilpa susidaro vluojaniosios grandins sintezei. Kai praimaz susintetina pirmj RNR pradmen Okazaki fragmentui, prie matricos-pradmens UK prijungia ied. Tada prie
jo prisijungia erdin DNRPolIII. Siloma hipotez, kad susidarant DNR kilpai, abi erdins DNR
III polimerazs dalels juda viena kryptimi kartu su visu holofermentu (4.21 pav.). erdin
DNRPolIII dalel, sintetinanti vluojanij grandin, nedisocijuoja i DNRPolIII holofermento,
taiau persijungia nuo vieno susintetinto Okazaki fragmento prie naujo pradmens, susintetinto kitam Okazaki fragmentui. Abi DNR IIIpolimerazs erdines daleles holofermente, kaip jau
minta, laiko subvienetai. Replikacin akut E.coli juda 5001000nt/s greiiu. Vluojaniojoje grandinje yra sintetinami 10002000 nukleotid ilgio Okazaki fragmentai. Kiekvienas
naujas Okazaki fragmentas pradedamas sintetinti kas 12s. Tai vyksta ciklais (4.21pav., ad),
kuri metu:
zz praimaz, sveikaudama su DNR helikaze, sintetina RNR pradmen;
176
zz UK kompleksas paalina praimaz, jai susintetinus pradmen; kiekvienam naujam pradmeniui sintetinti praimaz pritraukiama i aplinkins terps;
zz prie matricos-pradmens UK kompleksas prijungia ied;
zz erdin DNR IIIpolimeraz, disocijavusi nuo baigto sintetinti Okazaki fragmento, prijungiama prie iedo.
4.21pav. Bakterij DNR IIIpolimerazs holofermento vykdomos DNR replikacijos trombono modelis. Pirmaujaniosios ir vluojaniosios grandini sintez vyksta koordinuotai. Rodykl ymi replikacins akuts judjimo krypt. Okazaki fragmento sintezs pabaiga vluojaniojoje grandinje (a); naujo
pradmens sintez (b); iedo jungimas ties nauju matricos-pradmens kompleksu (c); DNRPolIII erdins
dalels jungimas prie iedo, naujo Okazaki fragmento sintez (d) (J.D.Watson, T.A.Baker, S.P.Bell,
A.Gann, M.Levine, R.Losick. Molecular Biology of the Gene, seventh edition, 2013)
177
MOLEKULIN BIOLOGIJA
4.3.3. Kiti E.coli replikacins akuts komponentai

Be DNR IIIpolimerazs holofermento, E.coli replikacinje akutje svarb vaidmen replikacijos metu atlieka ir kiti replisomos komponentai: praimaz, helikaz ir SSB baltymai. Aptarsime kiekvieno j funkcijas. 4.4lentelje pateikti prokariot ir eukariot baltymai, esantys
replikacins akuts sudtyje ir dalyvaujantys DNR replikacijoje.
4.4lentel. Baltymai ir j funkcijos prokariot ir eukariot replikacinse akutse
Funkcija
E.coli/fagas
T4 fagas
SV40virusas/mogus
Miels
Helikaz
DnaB
gp41
Tantigenas (SV40 specifinis) / MCM baltymai
MCM baltymai
Praimaz
DnaG
gp61
Praimazs subvienetai
DNRPolpraimazje
Praimazs subvienetai
DNRPolpraimazje
Polimeraz
DNRPolIII
holofermento
subvienetas
gp43
DNRPol
DNRPol ir DNRPol
35 egzonukleaz
DNRPolIII
holofermento
subvienetas
Dalis gp43
polimerazs
subvieneto
Dalis DNRPol
subvieneto
Dalis DNRPol ir
subvienet
Slystantysis iedas
subvienetas
gp45
PCNA
PCNA
iedo uklimo
kompleksas
-kompleksas
gp44/62
RFC
RFC
Prie viengrandins
DNR prisijungiantis
baltymas
SSB
gp32
RPA
RPA
4.3.4. E.coli praimaz (DnaG)

DNR polimerazs negali sintetinti nukleotidins grandins de novo. Jos tik ilgina pradmen.
Kaip tada pradedama DNR grandins sintez? Dar 1971m. A.Kornbergas ir jo kolegos ikl hipotez, kad DNR replikacijai reikia RNR sintezs. Vienus pirmj eksperiment, kuriais buvo nustatyta, kad DNR sintezs metu sintetinami RNR pradmenys, atliko R. ir C.Okazaki. E.coli buvo auginamos su radioaktyv fosforo izotop turiniu -[32P]dNTP ir neradioaktyviais rNTP. I bakterij iskirta DNR buvo veikiama silpnu armu, kad vykt RNR hidroliz (DNR yra atsparesn tokiai hidrolizei). R. ir C.Okazaki spjo, kad jeigu DNR sintez prasideda nuo RNR pradmens 3galo, tai kiekviename Okazaki fragmente turt bti po vien DNR-RNR jungt radioaktyvaus dNTP su rNTP. Po
armins hidrolizs radioaktyvus fosfatas turt likti prisijungs prie rNTP 2 arba 3hidroksigrups. Tokie radioaktyvs
Praimazs yra specialios klass
ribonukleozido monofosfatai ir buvo nustatyti (4.22 pav.).
RNR polimerazs, kurios vien
Vliau buvo atrasti fermentai, kurie per replikacij sintetino
kart sintetina RNR pradmen
nedidelius RNR fragmentus pradmenis, komplementarius
pirmaujaniojoje grandinje ir
DNR matricai. Tokius pradmenis ilgino RNR polimerazs. ie
daugel kart vluojaniojoje
baltymai, pavadinti praimazmis, buvo aptikti vairiausiuograndinje.
se organizmuose nuo virus iki daugialsi eukariot.
178
Organizmuose praimazs gali bti pavieni baltym arba keliais fermentiniais aktyvumais
pasiymini baltymini kompleks subvienet pavidalu. Replikacijos metu praimazs sveikauja su kitais replisomos komponentais.
Praimazs, kitaip nei DNR polimerazs, gali pradti
Praimazs sintetina RNR praRNR pradmens de novo sintez ties daugeliu DNR matridmen de novo.
cins grandins viet, vadinam starto sritimis.
E.coli RNR pradmenis chromosomos DNR replikacijos metu replisomoje sintetina jau minta praimaz DnaG. Ji yra ir atnaujintos replikacijos (angl. replication restart) replisomos sudtyje. Be praimazs, atnaujintos replikacijos komplekse dalyvauja pagalbiniai baltymai (PriA, PriB, PriC, DnaT, DnaB,
DnaC), kartu jie sudaro praimosom. Atnaujintos replikacijos mechanizmas jungiamas, kai replisoma
prieina DNR paaidas. Reparacijos metu paaidos itaisomos ir DNR sintez tsiama.
Praimazms bdingas cinko pirt (angl. zink fingers) motyvas ZBD domene, kuris sveikauja
su DNR. ZBD domenas (15kDa) yra baltymo Ngale (4.23pav., a). 36kDa centriniame domene
yra RNR polimerazinis aktyvumas, o 15kDa domenas Cgale reikalingas sveikai su DnaB helikaze. domu, kad T7 bakteriofago praimazs Cgalinis domenas yra kovalentiniu ryiu sujungtas su
helikazs subvieneto Ngaliniu domenu. Taigi, T7 heksamerin helikaz turi net 6 praimazes (6:6)!
Daugelio praimazi sintezs substratai yra tiek dNTP, tiek rNTP, taiau pirmenyb teikiama
ribonukleotidams, nes j kiekiai lstelje yra didesni (nra inoma, ar mirs pradmenys sin-
4.22pav. Schema, iliustruojanti R.

ir C. Okazaki eksperiment, kuriuo
nustatyta, kad DNR sintez E.coli
pradedama RNR pradmeniu
179
MOLEKULIN BIOLOGIJA
tetinami in vivo). Praimazi procesyvumas yra labai maas, in vivo jos gali sintetinti ne ilgesnius
nei 111 nukleotid RNR.
E.coli praimazs funkciniam aktyvumui pasireikti reikalinga jos sveika su DnaB helikaze
(4.23pav., b, c) ir SSB baltymais. DNR replikacijai prasidti DNR grandins turi bti atskirtos.
DNR grandines atskiria DNR DnaB helikaz. Atskyrus ~65bp DNR, praimaz gali prisijungti prie
atskirt grandini ir pradti pradmens sintez.
Praimazs sveika su DNR helikaze padidina praimazs aktyvum >1000 kart. DNR helikaz, savo ruotu, aktyvina praimaz, valdo, kur ir kiek pradmen ji sintetina. Pradmen sintezs
vietoms bdingas nedidelis (daniausiai 23 nukleotid) matricins grandins sek savitumas.
Pvz., E.coli pradmen sintezs vietos yra 5-CTG-3, o RNR pradmens seka pppAG(N)810 (kur
N bet kuris nukleotidas).
E.coli praimazs sveika su kitais replisomos komponentais SSB baltymais yra labai stipri: fotossiuv bdu SSB baltymus galima kovalentiniais ryiais prisiti prie modifikuoto ATP,
esanio praimazs aktyviajame centre.
Nustatyta, kad praimaz, susintetinusi ~ 111 nukleotid pradmen, nedisocijuoja nuo
DNR-RNR duplekso, o lieka tvirtai prisijungusi. Tokios sveikos prieastys nra aikios: gali bti,
kad taip RNR pradmuo apsaugomas nuo ribonukleazi; arba gali bti, kad i sveika utikrina, kad pradmuo nebt ilginamas kit DNR polimerazi, o tik DNR IIIpolimerazs. Manoma,
kad praimaz nuo RNR pradmens paalina -kompleksas. Vienas i io komplekso subvienet,
, taip pat sveikauja su SSB baltymais. Prisijungus prie SSB subvienetui, susilpninama SSB
sveika su praimaze, ir i disocijuoja. Kai kompleksas paalina praimaz nuo pradmens, jis
4.23pav. E.coli praimazs (DnaG) erdvin struktra ir sveika su helikaze DnaB. DnaG domenai (a);
su helikaze sveikaujanio domeno ir helikazs DnaB erdvin struktra (b); DnaG ir DnaB domenin organizacija. Rodykls ymi sveikas (c) (Nucleic Acids Research, v. 34, p. 4082, 2006)
180
prijungia ied, prie kurio jau gali prisijungti DNR IIIpolimerazes erdin dalel. Tuomet gali
prasidti DNR replikacija.
Eukariotinse lstelse RNR pradmenis DNR replikacijos metu sintetina DNR polimeraz-
praimaz (4.4lentel), kuri, kitaip nei kitos inomos prokariot ir eukariot DNR polimerazs,
pasiymi ir praimazs aktyvumu.
4.3.5. E.coli replikatyvin helikaz (DnaB). Kitos DNR helikazs

DNR helikazs yra molekuliniai motorai, hidrolizuojantys NTP judti iilgai nukleorgi.
Helikazs dalyvauja visuose svarbiausiuose nukleorgi metabolizmo procesuose: replikacijoje, reparacijoje, transkripcijoje. Visoms helikazms yra bdingos tokios biochemins savybs:
zz nukleorgi jungimas;
zz NTP / dNTP jungimas;
zz nuo NTP / dNTP priklausomas nukleorgi duplekso iskyrimas 35 arba 53
kryptimi.
Lstelje yra daug helikazi bei baltym, veikiani panaiai kaip helikazs: 14 helikazi
aptikta E.coli, 15 mielse, >24 moguje. Pagal baltym aminorgi sek panaum ir
helikazi domen konservatyvum, helikazs skirstomos helikazi supereimas. Tam tikros
supereimos helikazs pasiymi heksamerine iedo pavidalo struktra. iedo viduje isidsto
viena nukleorgties grandin, o iorje kita. Tokios helikazs geba procesyviai judti iilgai
nukleorgi, iskirdamos dupleks (DNR, dvigrandin RNR arba DNR-RNR heterodupleks).
Heksamerine struktra pasiymi ir replikatyvins helikazs (4.24 pav., a), kurios per replikacij prijungiamos prie DNR replikacijos iniciacijos srities (ori). Atskyrusios DNR duplekso
grandines, helikazs sukuria replikacines akutes (4.24pav., b). Visos replikacijos metu helikazs lokalizuojasi replikacini akui priekyje ir vykdo DNR grandini iskyrim. Replikatyvins
helikazs rastos organizmuose nuo virus iki mogaus. Heksamerines helikazes daniausiai
sudaro vienodi subvienetai, bet, pvz., mogaus lsteli replikatyvins helikazs MCM 27 yra
heteroheksamerins struktros.
Helikazs veikia ne pavieniui, bet kartu su kitais baltymais. Joms bdingas didelis procesyvumas ir sveika su savosiomis (angl. cognate) DNR polimerazmis. Pvz., jei nra DNR polimerazs, E.coli DnaB helikaz iskiria tik ~35 nukleotid por DNR per sekund. DNR IIIpolimerazs holofermento subvieneto utikrinama helikazs sveika su DNR polimeraze E.coli
replikacinje akutje, padidina grandini iskyrimo greit ~10 kart.
Helikazs prijungiamos aplink vien i DNR grandini ir juda arba 35 arba 53 kryptimi, atskirdamos kit DNR grandin. Manoma, kad E.coli replikacijos iniciacijos metu ties replikacijos iniciacijos sritimi (oriC) prisijungia dvi helikazs ir juda prieingas puses, iskirdamos
DNR dupleksus (4.24pav., b).
Kaip veikia replikatyvin helikaz? Siloma hipotez, kad priklausomai nuo ATP prijungimo
ir hidrolizs, keiiasi helikazs subvienet erdvin struktra. Dl erdvins struktros kitimo, fermentas juda sukdamasis iilgai DNR. Manoma, kad vienu metu du ATPazs subvienetai galt
181
MOLEKULIN BIOLOGIJA
bti prijung ATP, kiti du ADP (po ATP hidrolizs), dar kiti du tuti (4.24pav., b). In vitro vienai heterociklini bazi porai DNR iskirti reikia 12 molekuli ATP. Manoma, kad NTP hidroliz
ir DNR judjimas helikazje yra valdomi.
Sveika tarp helikazs, praimazs ir DNR polimerazs utikrina replikacins akuts
veikl. Sveika tarp helikazs ir DNR polimerazs, savo ruotu, padidina erdins DNR polimerazs, sintetinanios pirmaujanij DNR grandin, procesyvum.
4.24pav. Replikatyvini helikazi struktra ir veikimas. T7bakteriofago helikazs, kuri sudaro ei

vienodi subvienetai, erdvin struktra. Subvienetuose prisijungs ATP, ADP arba aktyvusis centras yra
tuias (a); schema, iliustruojanti, kaip dvi E.coli DnaBhelikazs isidsiusios replikacijos iniciacijos ori
srityje (b) (Cell, v. 101, p. 589, 2000); ATP jungimas ir hidroliz sukelia helikazs judjim iilgai nukleorgi (c) (B. Alberts, D. Bray , K. Hopkin et al. Essential Cell Biology, fourth edition, 2014)
182
Helikazs sulauk daugelio tyrj dmesio, kai buvo nustatyta, kad dvi paveldimos ligos Vernerio
sindromas (angl. Werner syndrome) ir Blumo sindromas (angl. Bloom syndrome) yra susijusios su helikazi defektais. mons, sergantys iomis ligomis, yra labiau link sirgti piktybiniais navikais. Vernerio
sindromu sergantys ligoniai labai greitai sensta, prayla 20-ties met, apanka nuo kataraktos ir mirta
nesulauk 50-ties met. Vernerio sindromu ir Blumo sindromu sergani moni genome nustatytos
mutacijos genuose, kurie koduoja baltymus, pasiyminius homologija E.coli recQgeno produktui. ie
genai 8-oje chromosomoje koduoja helikaz, kuri dalyvauja homologinje DNR rekombinacijoje ir gali
bti reikalinga tose vietose, kur po UV spinduli sukelt DNR paaid reparacijos vyksta replikacija.
inomos ir kit helikazi mutacijos, susijusios su vinmis ligomis ir senjimu.
4.3.6. Topoizomerazs
E.coli chromosoma lstelje yra replikuojama nuo replikacijos iniciacijos oriC srities abi
puses. Replikacijos greitis yra ~ 100 000 nukleotid per minut. Jeigu nebt mechanizmo,
panaikinanio vidin tempt, susidarani DNR spiralje dl intensyvaus grandini iskyrimo,
priekyje DNR superspiralizuotsi (vykt teigiamoji superspiralizacija), o replikacini akui
judjimas anksiau ar vliau labai sultt. DNR topologijos problemas, kurios ikyla replikacijos metu, sprendia topoizomerazs. Apie j molekulines savybes plaiau kalbta II
skyriuje Nukleorgi ir baltym molekulin struktra.
Topoizomerazi svarb DNR biologijoje iliustruoja tai, kad jos yra antimikrobini ir prievini
vaist taikiniai. Madaug puss vio chemoterapijai naudojam vaist (pvz., doksorubicino, etopozido, kt.) taikinys yra eukariot IItopoizomeraz. Itopoizomeraz yra prievinio vaisto kamptotechino taikinys, o bakterij IItipo topoizomerazs yra chinolon klass antibiotik taikiniai. Antibiotikai
ir prieviniai vaistai veikia slopindami kur nors topoizomerazi katalizinio ciklo etap arba sukelia
DNR paaidas DNR-topoizomerazs komplekse.
4.3.7. E.coli SSB baltymai

E.coli replikacinje akutje helikazms atskyrus dvi DNR grandines, prie j prisijungia SSB
baltymai (angl. single strand binding protein), kurie pasiymi dideliu giminingumu viengrandinei DNR. Prisijung prie atskirt DNR grandini, SSB baltymai neleidia joms vl sudaryti duplekso bei kitoki antrini struktr (4.25pav., a). SSB baltymai taip pat apsaugo viengrandin
DNR nuo nukleazi poveikio. SSB baltymai DNR atrankumu sekoms nepasiymi.
SSB baltymai yra gyvybikai svarbs nukleorgi metabolizmo komponentai visuose organizmuose. Jie dalyvauja DNR reparacijoje, rekombinacijoje, replikacijoje. SSB baltymai rasti organizmuose nuo virus iki mogaus. SSB baltymams bdinga sveika ne tik su
DNR, bet ir su daugeliu kit lstels baltym.
DNR replikacijos metu E.coli SSB baltymams yra priskiriamos kelios svarbios funkcijos:
zz SSB baltymai dalyvauja utikrinant pirmaujaniosios ir vluojaniosios grandini sintezs koordinacij;
183
MOLEKULIN BIOLOGIJA
zz SSB baltymai nukreipia praimaz link tos DNR vietos, kur bus sintetinamas pradmuo; neleidia praimazei per anksti sintetinti pradmens vluojaniojoje grandinje;
zz DNR IIIpolimerazs holofermento UK komplekso subvienetas konkuruoja su praimaze dl sryos su SSB baltymais, ir tokiu bdu j paalina nuo RNR pradmens, kai reikia
prijungti ied;
zz SSB baltymai stimuliuoja DNR Pol III polimerazin aktyvum ir 35 egzonukleazin
aktyvum;
zz SSB baltymai stimuliuoja DNR helikaz.
4.25pav. E.coli SSB baltymai ir j sveika su viengrandine DNR. SSB jungimasis prie viengrandins
DNR replikacijos metu (a) (B. Alberts, D. Bray , K. Hopkin et al. Essential Cell Biology, 2013); E.coli SSB baltymo tetramero ir viengrandins DNR komplekso struktra (b); SSB baltymo OB domeno erdvin struktra (c); schema, iliustruojanti galim viengrandins DNR prisijungim prie SSB tetrametro (d) (Molecular
Biology, v. 22, p. 369, 2007)
184
E.coli SSB baltymai yra 19kDa monomerai, sudarantys homotetramer. Tetrameras turi 4
DNR jungimo sritis (4.25pav., b). SSB prijungia viengrandin DNR OB domenais (angl. oligosacharide/oligonucleotide binding) (4.25pav., c). OB domenus sudaro 70150 aminorgi. SSB
baltymai jungiasi prie DNR vairiais bdais. Kai drusk koncentracija nedidel (<10mM NaCl),
sveika su DNR pasiymi kooperatyvumu, t.y. savybe, kai vienos ar keli baltymo molekuli
prisijungimas prie DNR skatina kit molekuli jungimsi. Jeigu vienoje vietoje prasideda SSB
molekuli jungimasis prie DNR, visa likusi nuoga DNR grandin greitai yra padengiama SSB
baltymais. Kai drusk koncentracija didel (>0,2M NaCl), SSB baltym jungimasis kooperatyvumu nepasiymi. Kiekvienas SSB baltym tetrameras prisijungia prie ~35nt viengrandins
DNR. Tetrameras gali prijungti ir ~ 65 nt (4.25 pav., d). Manoma, kad skirtingais bdais prie
viengrandins DNR SSB baltymai jungiasi priklausomai nuo to, kuriame procese DNR rekombinacijos, reparacijos ar replikacijos jie dalyvauja. Nustatyta, kad SSB-DNR kompleks struktra yra dinamika.
4.3.8. Replikacijos iniciacija E.coli bakterijose

Replikacins akuts susidaro ne atsitiktinje DNR grandins vietoje, o tam tikrose chromosomos srityse replikacijos iniciacijos ori srityse. Replikacijos ori (angl. origin) sritys prokariotuose veikia kaip cis elementai replikatoriai, kurie yra btini ir pakankami replikacijos
iniciacijai vykti. Replikacijos inciacijai taip pat reikia trans veiksni baltym iniciatori, kurie
atrankiai jungiasi prie ori srities ir lemia kit replikacijos iniciacijos dalyvi susimontavim. Bakterij ori sritis atlieka ias funkcijas:
zz ties ori sritimi vyksta DNR replikacijos iniciacija;
zz ori sritis valdo replikacijos iniciacijos dan;
zz ori sritis utikrina chromosom padalijim (segregacij) dukterines lsteles.
Bakterij ori srii organizacija skiriasi, taiau j sekas DnaA iniciacijos baltymas atpasta
panaiu principu kaip ir E.coli. E.coli iedinje chromosomoje (4,6x106bp) esanti 486bp DNR
sritis utikrina visas anksiau ivardytas ori srities funkcijas. Minimalus E.coli ori srityje esantis
245bp DNR fragmentas oriC utikrina bakterijos DNR replikacijos iniciacij ir valdo replikacijos iniciacijos dan. E.coli oriC sriiai bdingos ios struktrins savybs:
zz penki devyni nukleotid pasikartojimai R1R5. Tipika pasikartojim seka yra 5TTATCCACA3. R1R5 nukleotid sekos iek tiek skiriasi. Pasikartojimai vadinami DnaA dutmis (angl. DnaA box) (4.26pav., a). Duts daniausiai prijungia ATP-DnaA ir ADPDnaA kompleksus;
zz kitos sekos, kurios yra panaios DnaA dutes ir isidsiusios tarp j. Isritys prijungia
ATP-DnaA kompleksus;
zz trys daug A ir T nukleotid turinios sritys. Tipik sek sudaro 13 nukleotid: 5GATCTNTTNTTTT3. Visos trys sekos vadinamos DUE elementu (angl. DNA unwinding element). DUE yra iskiriamos DNR grandins. DUE yra sek, prie kuri jungiasi tik ATP ir
DnaA kompleksai. Sritys vadinamos ATP-DnaA dutmis (4.26pav., a).
185
MOLEKULIN BIOLOGIJA
E.coli replikacijos iniciacijos vyksm seka apibendrinta 4.26pav., b. Pirmiausiai bakterijos

iniciacijos baltymas DnaA komplekse su ATP arba ADP prisijungia prie DnaA dui R1R5.
DnaA baltymai priklauso AAA+ ATPazi eimai. DnaA struktroje yra keturi funkciniai domenai; III domenas atsakinDnaA bakterij replikacijos
gas u silpn ATPazin aktyvum (4.27pav., a, b).
iniciacijos baltymas.
Prie ori srities R dui DNR DnaA baltymas jungiasi
IVdomenu. DnaA gali prisijungti prie viengrandins ir dvigrandins DNR. DnaA pasiymi savybe oligomerizuotis;
i savyb utikrina IIIbaltymo domenas. Oligomerizacij taip pat skatina bakterijos nukleotido
architektrinis IHF baltymas. Siloma hipotez, kad DnaA molekuls sudaro tvarkingos struktros filament, kur apie keliasdeimties DnaA baltym oligomer apvejama DNR (4.27pav.,
c). Baltym oligomero ir DNR kompleksas ties ori sritimi matomas elektroniniu mikroskopu.
Gebjimu oligomerizuotis pasiymi ir virus, archj, eukariot iniciacijos baltymai.
Toliau vyksta kitas replikacijos iniciacijos ties oriC sritimi vykis. oriC DUE srityje DnaA baltymai atskiria DNR grandines (4.27pav., c). iam procesui vykti reikalingi ATP-DnaA kompleksai, kurie jungiasi prie ATP-DnaA dui DUE srityje. DNR grandini isiskyrimo mechanizmas
nra gerai iaikintas. DnaA gali prijungti ir viengrandin, ir dvigrandin DNR. Kai DNR grandins iskiriamos, ATP-DnaA kompleksai iaktyvinami hidrolizavus ATP iki ADP. Viengrandines
DNR padengia SSB baltymai.
4.26pav. Replikacijos iniciacija E.coli oriC srityje. oriC struktros schema. R1, R2, R4 didelio gimingumo DnaA duts, R3, R5 maesnio giminingumo DnaA duts. Isrii, IHF ir Fis baltym prisijungimo sritys parodytos. vaigdutmis parodytos GATC sek padtys (a); replikacijos iniciacija ties oriC
dalyvaujant DnaA iniciacijos baltymui, DnaB helikazei ir helikazs DnaC jungikliui (b)
186
Kitas iniciacijos etapas yra replikatyvini helikazi prijungimo etapas (4.26pav., b). E.coli
replikatyvin helikaz, veikdamas kartu su DnaA baltymais, prijungia helikazs jungiklis
DnaC baltymas. Jungimo mechanizmas nra iki galo iaikintas. ei DnaC baltymai sudaro
kompleks su ATP ir prijungia DnaB helikazs heksamer. DnaC baltymas yra AAA+ baltym eimos narys. DnaB, DnaC ir ATP komplekse helikazs aktyvumas slopinamas. Kompleksas atpasta oriC srities su DnaA baltymais struktr (4.27pav., c). DnaC sveikauja su DnaA baltymais.
Prijungus DnaB, DnaC baltymai disocijuoja. DnaG praimaz prisijungia ties viengrandine
DNR tik tada, kai helikazs pradeda DNR grandini atskyrim (atskiria ~65bp).
Praimazei susintetinus pradmen ir disocijavus nuo jo, UK pradeda jungti ied. Veiksmingam DNR grandini atskyrimui (~1000bp/s) reikia DNR IIIpolimerazs subvieneto. Helikaz
iniciacijos oriC srityje i pradi juda ltai, o vliau, prisijungus DNR polimerazei, ima judti
ymiai greiiau (5001000bp/s). Ltas helikazs judjimas oriC srityje didina tikimyb, kad oriC
srityje prisijungs praimaz.
Utikrinti veiksming DNR grandini iskyrim E.coli replikacinje akutje reikalingi dar
keli baltymai: dl II tipo topoizomerazs DNR girazs veikimo panaikinama torsin temptis
replikacins akuts priekyje; architektrinis bakterijos nukleoido baltymas HU, nors ir nra
btinas, in vitro stimuliuoja replikacijos iniciacijos reakcij.
4.27pav. DnaA baltymo struktra ir veikimo mechanizmas. Dna baltymo domenin organizacija
(a); DnaA baltymo erdvin struktra (b); hipotetinis DnaA sveikos su oriC sritimi ir sveikos su helikaze
DnaB modelis (Annual Review of Biochemistry, v. 82, p. 25, 2013)
187
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Replikacijos iniciacijos valdymas bakterijose utikrinamas vairiais bdais. Valdymo taikiniai

yra DnaA baltymas ir oriC sritis. Tarpsnis, per kur nevyksta nauja replikacijos iniciacija, vadinamas eklipse (angl. eclipse).
Sritis oriC turi 11 kopij GATC sek. Sekos isidsiusios DUE ir DnaA dutse (4.26pav.,
a). Jose adenino heterociklins bazs N6 azoto atomas yra metilintas. Adenin DNR sudtyje
metilina Dam metilaz. Prie replikacij iose srityse adenino heterociklins bazs abiejose
DNR grandinse yra metilintos. Tuoj pat po replikacijos senoji motinin grandin bna metilinta, o nauja nemetilinta; taigi, DNR yra hemimetilinta. Kol oriC srityje DNR yra hemimetilinta,
replikacijos iniciacija nevyksta. domu tai, kad oriC srityje adenino bazs lieka nemetilintos pakankamai ilg laik (hemimetilintos bsenos pusperiodis sudaro 810min), nors kitur chromosomoje analogikos GATC sekos po replikacijos metilinamos daug greiiau (hemimetilintos
bsenos pusperiodis sudaro 12 s). Panaiai, t. y. vluojant, metilinamos E. coli GATC sekos,
esanios ir dnaA geno promotoriuje. Kol i seka promotoriaus DNR yra hemimetilinta, dnaA
geno transkripcija ties iuo promotoriumi slopinama. Tai savo ruotu lemia DnaA baltymo kiekio sumajim lstelje.
Kaip utikrinamas vlesnis tam tikr DNR srii metilinimas? Nustatyta, kad E. coli chromosomoje esant seqAgeno mutacijai, oriC ir dnaA promotoriaus srii metilinimas nevluoja. Prieingai iniciacija vyksta itin danai. SeqA baltym dimeras jungiasi prie GATC sek;
jo sveika su hemimetilinta DNR yra stipresn negu su visikai metilinta DNR. SeqA pasiymi
didesniu giminingumu hemimetilintai DNR nei Dam metilaz. Manoma, kad SeqA oligomeras paslepia hemimetilint replikacijos iniciacijos srities DNR ir neleidia Dam metilazei per
anksti metilinti i srii. Bakterijos membrana taip pat dalyvauja valdant oriC ir dnaA srii
metilinim. Tik hemimetilintos GATC sritys gali prisijungti prie bakterijos membranos in vitro;
visikai metilintos negali.
Replikacijos iniciacija gali bti valdoma keiiant DnaA baltymo aktyvum ir kiek lstelje.
Tik ATP ir DnaA kompleksas, prisijungs ties oriC sekomis, sukelia DUE srities iskyrim; ADP
ir DnaA kompleksas oriC atvilgiu yra neaktyvus. Esant DnaA mutacij, kurios daro tak ATP
jungimui ir hidrolizei, DnaA baltymas lstelse tampa nuolat aktyvus (angl. constitutively active). Tokiose lstelse padidja iniciacijos ties oriC sritimi danis. Taigi, ATP ir DnaA komplekso
iaktyvinimas in vivo yra btinas replikacijos iniciacijos valdymui. Susimontavus replisomoms,
slystantysis iedas sudaro laikin RIDA (angl. regulatory inactivation of DnaA) kompleks su
ATP ir DnaA bei Hda baltymu (angl. homologous to DnaA). RIDA stimuliuoja ATP hidroliz.
ADP disocijuoti i komplekso skatina rgtiniai fosfolipidai (kardiolipinas), kuri yra bakterijos
membranoje.
Lstelje yra valdomas ir laisv DnaA baltym kiekis. E.coli chromosomoje yra~300 srii,
turini tipik sek DnaA dui, prie kuri gali jungtis DnaA baltymas. DnaA nevienodai
giminingas ioms sritims. Vyksta konkurencija dl DnaA tarp oriC ir u jos rib esani dui.
domu, kad didiausiu giminingumu DnaA pasiymi net ne oriC esanios duts, bet netoli
esanti datA sritis. ia prisijungia ymiai daugiau DnaA baltym (~380 molekuli) negu prie oriC.
Manoma, kad vykstant datA srities replikacijai (greitai po replikacijos iniciacijos) ia prisijungia
DnaA baltymai. Tokiu bdu didioji dalis DnaA baltym prijungiama prie datA srities dar replikacijos pradioje ir j nepakanka reiniciacijai ties oriC sritimi. Paalinus datA srit, ties oriC reiniciacija padanja. Prieingu atveju, esant daugiau nei vienai datA kopijai, iniciacija slopinama.
188
4.3.9. DNR grandins elongacija

Vykstant replikacijai, pirmaujanioji DNR grandin sintetinama itisai, o vluojanioji Okazaki fragmentais. Okazaki fragment sujungimui reikia papildom baltym. Ikiriami trys Okazaki fragment brendimo etapai:
zz RNR pradmens paalinimas;
zz plyio tarp Okazaki fragment upildymas deoksiribonukleotidais;
zz Okazaki fragment sujungimas.
4.3.10. DNR ligazs

E.coli 12 etapus vykdo DNR Ipolimeraz, kuri, kaip jau aptarme, pasiymi 53 egzonukleaziniu aktyvumu. Dl io aktyvumo paalinamas priekyje eantis RNR pradmuo, o vietoje
jo sintetinama DNR. Bakterijose, turiniose iveiklint DNR Ipolimerazs gen (polA), Okazaki
fragment brendimas vyksta komplikuotai, bet bakterijos yra gyvybingos. H ribonukleaz
taip pat gali paalinti didij dal RNR pradmens, taiau ji palieka ribonukleotid ties DNRpradmens riba. Ties sakant, iuo metu nelabai sutariama, kuris i ferment dalyvauja Okazaki
fragment brendime in vivo.
Paalinus RNR pradmenis Okazaki fragmentuose, lieka plyys, kuriame vietoje paalinto
RNR pradmens yra naujai sintetinto DNR fragmento 3OHgrup ir DNRPolIII sintetintos DNR
5fosfatingrup (4.28pav.). Plyius sujungia fermentai DNR ligazs. Okazaki fragment
brendime prokariotuose ir eukariotuose DNR ligazs atlieka tokias funkcijas:
zz katalizuoja fosfoesterinio ryio susidarym tarp oligo- arba polinukleotido fosfato 5gale
ir kito oligo- arba polinukleotido 3OHgrups (4.28pav.);
zz sujungia viengrandins DNR plyius dvigrandinje DNR, taip pat DNR-RNR hibride;
zz E.coli ir T4 bakteriofago DNR ligazs sujungia ir du DNR dupleksus, ir dvi RNR molekules.
ios reakcijos yra danai naudojamos in vitro eksperimentuose.
E.coli lstelje yra ~300 DNR ligazs molekuli. DNR ligazs katalizuojam reakcij galima
suskirstyti tris etapus:
zz DNR ligazs lizino aminogrup prijungia AMP i savo kofaktoriaus NAD+ molekuls (4.28 pav.). Atsipalaiduoja nikotinamido mononukleotidas (NMN) ir susidaro tarpinis
DNR ligazs ir AMP kompleksas adenililligazs kompleksas (E.coli DNR ligaz prijungia AMP i NAD+, o eukariot ir bakteriofag DNR ligazs AMP prijungia i ATP);
zz adenililgrup nuo fermento yra perneama ant DNR 5fosfato (jis yra aktyvinamas) ties
DNR plyio vieta;
zz aktyvint fosfat atakuoja plyio vietoje esanti 3OHgrup, susidaro fosfoesterinis ryys,
tada disocijuoja fermentas ir AMP.
189
MOLEKULIN BIOLOGIJA
4.28pav. DNR ligazs katalizuojamos reakcijos schema
4.3.11. Replikacijos terminacija bakterijose

E.coli DNR replikacija prasideda vienoje chromosomos srityje oriC ir tsiasi abiem kryptimis nuo ios srities. Dvi replisomos juda prieingomis kryptimis, kol susitinka terminacijos srityje, esanioje beveik prieingoje chromosomos pusje (4.29pav., b). ioje srityje DNR replikacija
stabdoma. Stabdymo procese dalyvauja du pagrindiniai lstels komponentai:
zz 10 terminacijos srii (Ter AJ) bakterijos chromosomoje. Ter AJ turi ~23 nukleotid
gana konservatyvi sek (4.29 pav., a, c). Sritys gana plaiai pasklidusios E. coli genome. Pvz., B.subtilis bakterijose terminacijos sritys isidsiusios daug kompaktikiau, o j
konservatyvioji seka skiriasi nuo E.coli;
zz Tus baltymas (36kDa), kuris atrankiai jungiasi prie konservatyvij sek Ter srityse. Prie
DNR jungiasi baltymo monomeras (4.29 pav., b). Baltymo sveika su Ter sritimis labai
stipri.
Kokiu bdu Tus baltymas, prisijungs prie DNR i vienos puss, stabdo replisomos judjim? Sutariama, kad yra stabdoma replisomos priekyje esanti replikatyvin helikaz, taiau
kaip? Silomi du veikimo modeliai. Pagal pirmj model, Ter srities iskyrimas nra btinas
stabdyti replikatyvin helikaz i nepralaidiosios puss. Tus-Ter komplekso struktra i ios
puss tiesiog fizikai stabdo helikaz (2.30pav.).
190
Antrasis modelis remiasi Ter srities ir Tus baltymo komplekso su replikacine akute (imituota
situacija, kuri sukuria helikaz, priartjusi prie Ter srities) erdvins struktros tyrimais. Tokiame
komplekse konservatyvios G ir C nukleotid poros 6-oje padtyje Cheterociklin baz isukta
ir sveikauja su Tus baltymu jo vadinamojoje citozino kienje (2.30pav.). Toks kompleksas su
isukta DNR heterocikline baze galt veikti kaip uraktas, stabdantis replikatyvins helikazs
judjim i vienos Tus-Ter komplekso puss. I kitos komplekso puss panai struktra nesusidaro ir helikazs judjimas nestabdomas.
4.3.12. Bakterij DNR replikacija ir lsteli augimas bei

dalijimasis
Bakterijose replikacijos iniciacijos danis valdomas atsivelgiant lstels augimo greit.
DNR replikacijos ciklo pabaigoje vyksta lstels dalijimasis: dvi dukterins chromosomos segreguoja pasidalijusias lsteles (4.31pav., b).
4.29pav. Replikacijos terminacija (baigtis) E.coli. Ter AJ sritys E.coli chromosomoje (a); Tus ir DNR Ter
srities komplekso erdvin struktra (b) (PDB, kodas 1ECR); Ter AJ srii konservatyviosios sekos. Vienodi
nukleotidai paymti brkneliais (c) (Cell, v. 125, p. 1309, 2006)
191
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Bakterins lstels augimo greitis ireikiamas dalijimosi laiku. Kuo trumpesnis dalijimosi
laikas, tuo greiiau lstels auga. Bakterijos gali pasidalyti ir per 20 minui, jeigu augimo slygos yra palankios, ir gali utrukti iki keliadeimties valand (pvz., mogaus skrandyje). Jeigu
substratai DNR sintezei nra riboti, E.coli replikacijos greitis lstelje daugiau ar maiau pastovus. Genomo replikacija trunka ~40min (kai replikacijos greitis yra 50000nukleotid/min). Replikacijos iniciacijos danis valdomas pasitelkiant vien ori srit. Po chromosomos replikacijos
4.30pav. Hipotetiniai E.coli DnaB

helikazs stabdymo modeliai dalyvaujant Tus-Ter DNR kompleksui. Rodykl ymi replisomos judjimo krypt (PNAS, v. 105, p.12831,
2008)
4.31pav. Bakterij replikacija ir dalijimasis. Replikacijos ir dalijimosi ciklo trukm (a); replikacijos iniciacijos, nepasibaigus ankstesniam replikacijos ciklui, schema (b) (J.E.Krebs, E.S.Goldstein, S.T.Kilpatrick.
Lewins Genes XI, 2014)
192
pabaigos turi praeiti dar 20 minui, kol lstel pasidalija (reikia laiko, kad susidaryt dalijimosi
aparatas) (4.25pav., a). Jeigu lstels dalijimosi laikas trumpesnis nei 60min (40min replikacija
+ 20min dalijimosi aparato susiformavimas), tai reikia, kad naujas replikacijos ciklas lstelje
turi prasidti dar nepasibaigus ankstesniajam replikacijos ciklui. Tokiu atveju pasidalijusias
lsteles pakliva chromosomos, kuriose jau yra susiformavusios naujos replikacins akuts
(4.25pav., b).
4.3.13. Replikonai
Bakteriofagai ir virusai reprodukcinio ciklo metu sintetina daug DNR kopij, o lstelse, kurios dalijasi dvi dukterines lsteles, DNR sintez ir genetins mediagos paskirstymas turi bti
tiksliai valdomi, nepriklausomai nuo to, ar lstel turi tik vien chromosom (bakterijose) ar
DNR organizuota daug chromosom (eukariotuose). Pagrindiniai io valdymo principai yra
tokie:
zz genomin DNR turi bti kopijuojama vien kart per lstels cikl;
zz DNR replikacija turi bti koordinuojama atsivelgiant lsteli dalijimsi;
zz lsteli dalijimasis turi bti koordinuojamas atsivelgiant lsteli augim;
zz DNR kopijos turi bti tiksliai paskirstomos palikuonims.
DNR replikacij valdo replikonai (angl. replicon). Replikonas yra DNR vienetas, kuris turi replikacij utikrinanius valdymo elementus ir gali save replikuoti. Replikono model 1963m.
pasil Fransua akobas (Francois Jakob), Sidnis Breneris
(Sydney Brenner) ir akas Kjuzinas (Jacques Cuzin). Pagal
Replikonas yra DNR (arba RNR)
model, replikacijos iniciacij valdo du komponentai: replimolekul, kuri turi replikacij
katorius ir iniciatorius. Replikatori sudaro DNR cis sekos,
utikrinanius valdymo elekuri pakanka replikacijos iniciacijai utikrinti. Ori sekos,
mentus ir gali save replikuoti.
kuriose prasideda replikacija, taip pat yra replikatoriaus
dalis.
Kitas komponentas iniciatorius yra trans veikiantis iniciacijos baltymas. Baltymas atpasta DNR savitas sekas replikatoriuje ir aktyvina replikacijos iniciacij. Iniciacijos baltym turi
virusai, prokariotai ir eukariotai. Jie nra homologiki, taiau j funkcijos panaios.
Kiekvienas replikonas pradedamas ir baigiamas replikuoti tik vien kart per lstels cikl.
Bakterijos replikacijos iniciacija vyksta, kaip jau aptarme, vienintelje bakterijos chromosomos vietoje, tuomet dvi replikacins akuts juda prieingomis kryptimis, kol prieina terminacijos srit. Tada bakterins lstels pasidalija susidarius ssmaukai (angl. septum).
Bakterij chromosomos turi vien replikon. Tai daniausiai iedins DNR, bet pasitaiko ir
linijini bakterij chromosom (pvz., Borrelia ir Streptomyces gentyse). Bakterijos danai turi
plazmidi autonomik vairaus dydio iedini ar linijini DNR. Plazmids taip pat turi atskirus replikonus. Plazmidi replikacijos valdymas gali priklausyti nuo bakterijos chromosomos
replikacijos. Tuomet sintetinama viena plazmids kopija, kaip ir bakterijos chromosomos. Tokios plazmids yra maakopijins (angl. low copy).
193
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Tam tikr plazmidi lstelje gali bti sintetinamas vairus kopij skaiius. Tokios plazmids yra vadinamos daugiakopijinmis (angl. multicopy).
Virus ir bakteriofag DNR taip pat turi vien replikon, kuriame per infekcin cikl daug
kart vyksta replikacija.
Eukariot lstelse chromosom linijini DNR replikacija vyksta per lstels ciklo Sfaz. Yra
daug genomo srii, replikon, kur prasideda replikacija (4.32pav., a; 4.5lentel). Replikacija
vyksta telkiniuose replikacijos fabrikuose (angl. replication factories) (4.32pav., b).
Evoliucijoje tai, kad eukariotai dideli genom replikacijai panaudojo daugiau replikon,
galjo utikrinti j genom didjim neilginant DNR sintezs (S fazs) trukms. Pvz., nors daugelio archj DNR, kaip ir bakterij, turi po vien replikon, kai kurios archjos turi po kelet
replikon (pvz., Sulfolobus acidocaldarius 3). ~330 replikon yra mieli genome ir daugiau nei
10000 daugialsi organizm genomuose.
Valdyti vis replikon replikacij per lstels ciklo Sfaz yra sudtingas udavinys. Replikacijos iniciacija visuose replikonuose vyksta skirtingu metu, taiau visas genomas yra baigiamas
replikuoti per Sfaz.
4.5lentel. DNR replikacija prokariotuose ir eukariotuose
Organizmai
Replikon
skaiius
Replikon ilgis
(kb)
Replikacins
akuts judjimo
greitis (bp/min)
E.coli
4200
50000
S.cerevisiae
500
40
3600
D.melanogaster
3500
40
2600
X.laevis
15000
200
500
M.musculus
25000
150
2200
Vidutinis eukariotinis organizmas
~10000
~100
2000
4.32pav. Eukariot replikonai. Eukarot replikacijos nuo ori srii schema (a); aliai fluorescuoja
replikacijos fabrikai lstels branduolyje, vaizdinti
bromodeoksiuridinu (BrdU), kuris jungiamas
DNR replikacijos metu. Kita DNR vaizdinta DAPI
(b) (L. A. Allison. Fundamental Molecular Biology,
194
Eukariot replikacijos iniciacija (angl. origin fire) ori srityse vyksta tikslia tvarka: pirmiausiai
replikuojamos vienos genomo sritys, vliau kitos, ir t.t. velgta tam tikr dsningum tarp replikon aktyvinimo ir chromatino struktros. Pvz., heterochromatinas replikuojamas per Sfaz
labai vlai, o aktyviai transkribuojam gen sritys euchromatine anksti. Tiriant induoli
pateli Xchromosomas pastebta, kad nors chromosomos vienodos, transkripcikai neaktyvi chromosoma yra kondensuota heterochromatine ir replikuojama Sfazs pabaigoje, o kita
chromosoma yra maiau kondensuota ir replikuojama per vis Sfaz.
Eukariot lstelse taip pat yra iedini nechromosomini DNR (mitochondrij, chloroplast DNR, kit DNR). Jos taip pat turi replikon.
4.4. DNR replikacija eukariotuose

Eukariotinje lstelje genetins mediagos dvigubjimas vyksta per kiekvieno lstels ciklo Sfaz vienintel kart. Replikacija koordinuojama su kitais lstels ciklo etapais mitoze ir
citokineze, taip pat su replikacija kitose j supaniose lstelse. Palyginti su prokariotais, eukariot DNR replikacijos greitis yra nedidelis (~75nt/s). Nedidel greit nulemia tai, kad eukariot
DNR yra supakuota chromatin.
Pirmieji svarbs eksperimentiniai duomenys apie eukariot replikacij buvo gauti naudojant modelin replikacijos sistem in vitro. Sistem sudar plazmids DNR, turinti induoli
(bedioni) papovaviruso SV40 (Simian virus 40) replikacijos pradios srit (SV40 ori) ir induoli lsteli ekstrakto, kuriame buvo visi plazmids DNR replikacijai reikalingi komponentai.
SV40viruso iedins DNR replikacijai pasitelkiamas lstels eimininks replikacijos aparatas ir
vienintelis viruso DNR koduojamas baltymas Tantigenas, Tag (angl. Tantigen) (4.33pav.,a).
Tantigenas atlieka replikacijos iniciacijos veiksnio (iniciatoriaus) ir DNR helikazs funkcijas.
4.33pav. SV40viruso ir lstels eimininks replisomos (PLOS Pathogens, v.8, 2012)
195
MOLEKULIN BIOLOGIJA
SV40viruso Tantigenas yra dvigubas heksameras, kuris, esant ATP, prisijungia ties viruso DNR replikacijos pradios ori sritimi. T antigeno prisijungimas sukelia struktrini pokyi ori srityje. Toliau prie
T antigeno jungiasi viengrandinei DNR savitas lstels baltymas RPA. SV40viruso Tantigenas pasiymi
35 helikaziniu aktyvumu ir iskiria viruso ori srities DNR grandines. Tantigeno helikazin aktyvum
stimuliuoja prie DNR prisijungs RPAbaltymas. Prie RPAbaltymo prisijungia lstels DNR polimeraz-praimaz, kuri sintetina pradmen. RFCbaltymas prijungia DNR polimerazs procesyvumo PCNA
veiksn. Prasideda viruso DNR replikacija. ie procesai ir juose dalyvaujantys lstels komponentai toliau aptariami isamiau.
4.4.1. Eukariot replikacins akuts komponentai ir j

funkcijos
SV40 viruso DNR replikacijos tyrimais, taip pat mieli genetiniais tyrimais nustatyta daugelis eukariot replikacijoje dalyvaujani baltym (4.6lentel).
4.6lentel. Eukariot DNR replikacins akuts komponentai ir j funkcijos
Baltymas
Funkcijos
polimeraz-praimaz
Pradeda pirmaujaniosios ir vluojaniosios grandini sintez; sintetina DNR-RNR

pradmen (~714 ribonukleotid 5gale ir ~20 deoksiribonukleotid 3gale)
RPA
Prisijungia prie viengrandins DNR (E.coli SSBbaltymo analogas); stimuliuoja DNR

, polimerazes; skatina DNR helikazs prisijungim
RFC
Nuo DNR priklausoma ATPaz (E.coli , -iedo uklimo komplekso analogas);

prisijungia prie matricos-pradmens komplekso; stimuliuoja DNR polimeraz; prijungia PCNA; reikalinga polimerazi perjungimui: suardo kontaktus tarp RPA ir
DNRPol-praimazs
PCNA
DNR polimerazi procesyvumo veiksnys; stimuliuoja DNR polimerazes ir RFC ATPaz (slystantysis iedas)
/ polimeraz
DNR polimeraz; 35 egzonukleaz; sintetina pirmaujanij ir vluojanij

grandines
FEN1
53endonukleaz; paalina istumt DNR-RNR pradmen (12nt)
Dna2
Nukleaz / helikaz; paalina istumt DNR-RNR pradmen
DNR Iligaz
Sujungia Okazaki fragmentus
Itopoizomeraz
Panaikina torsin tempt replikacins akuts priekyje
IItopoizomeraz arba
IItopoizomeraz
Iskiria DNR iedus (katenanus)
Tantigenas
Replikatyvin DNR helikaz (35); dalyvauja susimontuojant praimosomai; dalyvauja atpastant SV40 ori srit
MCM baltym kompleksas
Replikatyvin DNR helikaz
4.4.2. DNR polimeraz-praimaz

Eukariot ir archj praimazs yra heterodimerins struktros baltymai, sudaryti i didiojo
subvieneto (PriL) ir maojo subvieneto (PriS). Eukariot praimaz yra komplekse su DNR po-
196
4.34pav. Eukariot DNR polimerazs-praimazs

struktra ir veikimas. Komplekso struktra, iaikinta
remiantis krioelektronins mikroskopijos duomenimis (a);
komplekso struktrin schema. Subvienetai paymti (b);
komplekso judjimo modelis (c) (Nucleic Acids Research,
v.39, p. 8187, 2011)
limeraze ir B subvienetu. Krioelektronine mikroskopija nustatyta, kad baltym kompleksas

nesimetrinis, primena svarmen (4.34pav., a, b). Komplekso praimaz sintetina RNR pradmen
(~714nt), tada DNR polimeraz sintetina nedidel ~20 nukleotid DNR fragment iniciatorin DNR. Praimazei bdingas labai maas procesyvumas ir maas tikslumas. DNR-RNR
pradmenys sintetinami vien kart pirmaujaniojoje grandinje ir daug kart vluojaniojoje
grandinje. Pradmen sintez vluojaniojoje grandinje labai dana, jie sintetinami madaug
kas 50 nukleotid. Tyrimais nustatyta, kad DNR polimerazs praimazs dalys, kuriose yra aktyvieji centrai, yra judrios (4.34 pav., c). Manoma, kad tai padidina pradmens perjungimo i
praimazs DNR polimerazs aktyvj centr veiksmingum.
vykus DNR polimerazi perjungimui, mirus DNR-RNR pradmuo toliau ilginamas replikatyvini DNR polimerazi DNRPol ir Pol, sintetinani pirmaujanij ir vluojanij DNR
grandines (4.33pav., b). DNR polimerazes perjungia eukariot iedo uklimo kompleksas RFC.
Nuo A ciklino priklausomos kinazs (CDK) fosforilina abu DNRPol-praimazs subvienetus
lstels ciklo Sfazs metu. Vliau polimeraz yra defosforilinama, o G1fazs metu vl fosforilinama. DNR polimeraz yra svarbus replikacijos proceso dalyvis, todl yra daugelio DNR
replikacijos ir lstels ciklo kontrols tak (angl. cell cycle checkpoints) reguliatori taikinys.
4.4.3. A replikacijos baltymas (RPA)

A replikacijos baltymas (RPA, angl. replication protein A) yra prie viengrandins DNR prisijungiantis heterotrimerins struktros baltymas (4.35 pav., a, b). Replikacijos procese jis
veikia analogikai bakterij SSBbaltymams. RPAbaltymai stabilizuoja viengrandin DNR neleisdami susidaryti antrinms struktroms, kurios stabdyt replikacini akui judjim, taip
197
MOLEKULIN BIOLOGIJA
4.35pav. Eukariot (S.cerevisiae) PCNA slystaniojo iedo ir RFC iedo uklimo komplekso struktra. PCNA homotrimero erdvin struktra. IIII baltymo domenai (a); PCNA ir RFC komplekso erdvin
struktra. RFC1RFC5 komplekso subvienetai (b); PCNA-RFC-DNR komplekso erdvin struktra (c);
PCNA-RFC-DNR komplekso struktros schema (d) (Trends in Microbiology, v. 15, p. 156, 2007)
pat apsaugo nuo nukleazi poveikio. Didiausias RPAsubvienetas, RPA70, prisijungia prie viengrandins DNR, taiau funkcionaliam baltymui reikia vis trij subvienet. RPA taip pat reikalingas DNR grandini iskyrimui SV40 DNR ori srityje, kur atlieka viruso baltymas Tantigenas.
RPAbaltymas eukariotuose sveikauja su DNR polimeraze-praimaze ir stimuliuoja DNR
polimerazin aktyvum; taip pat sveikauja su kitais baltymais. RPA yra fosforilinamas prasidedant Sfazei ir atsiradus DNR paaidoms.
4.4.4. PCNA slystantysis iedas

PCNA baltymas (angl. proliferating cell nuclear antigen) yra vienas svarbiausi eukariot
DNR metabolizmo baltym. Baltymo gausu piktybini navik lstelse, todl jis naudojamas
kaip vienas lstelini ymen nustatant vines lsteles. PCNA aminorgi seka labai konservatyvi visuose organizmuose nuo vienalsi eukariot iki mogaus. Baltymo homologai
198
atrasti eukariot virusuose bei archjose. PCNA dalyvauja ne tik DNR replikacijos, bet ir rekombinacijos, reparacijos, kituose lstels procesuose.
PCNA yra homotrimeras, sudarytas i trij vienod (mogaus lstelse 36kDa) monomer, susijungusi ied su ertme viduryje (4.35pav., a). Eukariot DNR replikacijos metu PCNA
funkcionuoja kaip DNR polimerazi procesyvumo veiksnys. PCNAied ant DNR duplekso
ukelia RFCbaltym kompleksas (4.35pav., bd). Toliau prie PCNA ir matricos-pradmens komplekso prisijungia DNR polimeraz. Nustatyta, kad PCNA panaiai stimuliuoja ir DNR polimeraz, taiau tik tam tikromis aplinkybmis. Panaiai kaip ir bakterijose, dl jungimosi srities
su PCNA konkuruoja RFC iedo uklimo kompleksas ir DNR polimerazs.
Daugelis lstels baltym, dalyvaujani DNR reparacijos ir lstels ciklo valdymo procesuose, sveikauja su PCNA.
Manoma, kad archj replikacijos aparatas yra panaus eukariot. Archjos turi PCNAied, iedo uklimo kompleks, Beimos DNR polimeraz.
4.4.5. C replikacijos veiksnys (RFC) iedo uklimo

kompleksas
RFC (angl. replication factor C) baltymas yra vienas
RFC yra nuo DNR priklausoma
svarbiausi veiksni prijungiant eukariot DNR polimeraATPaz, kuri ukelia trimerin
zes ties matrica-pradmeniu. RFC buvo nustatytas tiriant
PCNA baltymo ied ant matriSV40viruso DNR replikacijos mechanizm (4.33pav., a, b).
cos-pradmens duplekso ir taip
mogaus RFC baltymas sudarytas i penki subvieneutikrina replikatyvini DNR pot RFC15 (4.35pav., b). RFC komplekso struktra panai
limerazi ( ir ) procesyvum.
E.coli -komplekso struktr. RFC subvienetai homologiki E.coli ir baltymams. RFC ukelia PCNA ied ant
matricos-pradmens komplekso (4.35pav., c, d); jungia ied ir DNR viengrandini trki vietose; gali nukelti ied nuo DNR, kaip ir jo analogai prokariotuose. Eukariuotuose yra vairios sudties RFC kompleks, kuriuose tam tikri RFC subvienetai
pakeisti kitais juos panaiais subvienetais. Manoma, kad tokie alternatyvios struktros UK
atlieka tam tikras specializuotas funkcijas, pvz., lstels ciklo DNR paaid kontrols take, sveikaujant seserinms chromatidms ir t.t.
4.4.6. DNR ir polimerazs

Eukariotuose replikacijos metu pagrindiniai DNR grandines sintetinantys fermentai yra DNR
polimeraz ir polimeraz (4.33 pav., b). Abi polimerazs gyvybikai svarbios lstelms.
Nors DNR polimeraz buvo atrasta dar 1976m., prajo
nemaai laiko, kol buvo nustatyta, kad btent ji dalyvauEukariot replikatyvins DNR
ja DNR replikacijoje. DNR polimeraz (Pol ) sintetina
polimerazs yra DNR polimevluojanij grandin, o DNR polimeraz (Pol) pirraz ir polimeraz.
maujanij (4.33pav., b).
199
MOLEKULIN BIOLOGIJA
DNR polimerazs sudtis eukariotuose yra gana heterogenika: mogaus Pol sudaryta
i keturi subvienet, S.pombe mieli DNR polimeraz i penki, S.serevisiae mieli i trij.
Didiausiame polimerazs subvienete (Asubvienete) yra DNR polimerazinis ir 35 egzonukleazinis aktyvumai. Subvieneto Ngalas sveikauja su PCNA baltymu. Su PCNA sveikauja ir kiti
DNRPol subvienetai. Kartu su PCNA iedu ir RFC iedo uklimo kompleksu DNRPol sudaro
DNR polimerazs holoferment. DNR ir polimerazs dalyvauja ir reparacijoje.
4.4.7. Kitos eukariot DNR polimerazs

Eukariotuose atrasta ~ 15 DNR polimerazi (4.7 lentel), taiau ne vis j funkcijos
nustatytos.
DNR polimeraz (Pol). Pol yra nedidelis, daniausiai vieno polipeptido fermentas, patogus tirti. Tai pirmoji DNR polimeraz, kuri buvo itirta rentgenostruktrins analizs metodu
ir isamiai aprayta. Pol sudaro du domenai, kuri kiekvienas pasiymi biocheminiu aktyvumu. Ngalinis domenas (8kDa) pasiymi deoksiribozs fosfato liazs (dRPliazs) aktyvumu.
is aktyvumas slygoja deoksiribozs fosfato paalinim nuo DNR eliminacijos mechanizmu,
kai prie ribozs nra prijungtos heterociklins bazs (vadinamieji bazi netek nukleotidai). Tas
pats Ngalinis domenas taip pat labai atrankiai prisijungia ties 5 nukleotid viengrandins DNR
plyiais dvigrandinje DNR, jeigu plyio gale yra 5fosfatin grup.
Cgalinis domenas (31kDa) pasiymi DNR polimeraziniu aktyvumu. Pol vykdoma sintez ties matricos-pradmens kompleksu yra distributyvi, fermentas prijungia vien nukleotid ir
disocijuoja. Pol neturi klaidas taisanio aktyvumo, taiau ties viengrandins DNR plyiais sintetina procesyviai ir tiksliai. Todl Pol savybs tinkamos upildyti viengrandins DNR plyius
bazi ipjovimo reparacijos, BER (angl. base excision repair), proceso metu. Taip pat yra eksperimentini rodym, kad i polimeraz dalyvauja nukleotid ipjovimo reparacijoje, NER (angl.
nucleotide excision repair), ir rekombinacijoje mejozs metu.
DNR polimeraz (Pol). Pol dalyvauja mitochondrij DNR replikacijoje. induoli Pol
sudaro du subvienetai didysis (125140kDa) ir maasis (3555kDa), koduojami branduolio
gen. Didysis subvienetas pasiymi polimeraziniu, 35 egzonukleaziniu, 5 deoksiribozs
fosfato liaziniu aktyvumais. Pol procesyvumui reikia RPA baltymo. Pol yra tiksli polimeraz,
kurios klaid danis, nustatytas in vitro, yra 2410-6. Eksperimentai su transgeninmis pelmis
liudija, kad 35 egzonukleazinis aktyvumas lemia ios polimerazs tikslum ir in vivo: egzonukleazs mutacija slygoja takines mitochondrij mutacijas ir sukelia gyvn kardiomiopatij. Pol yra vienintel mitochondrijose esanti DNR polimeraz, todl jidalyvauja ir mitochondrij genomo paaid bazi ipjovimo reparacijoje.
TLS polimerazs. Be DNR , , , , polimerazi, kurias galima laikyti klasikinmis polimerazmis, eukariot lstelse yra daug kit DNR polimerazi. J aktyvumui pasireikti reikia tam tikr slyg, todl
TLS DNR polimerazs pasiymi
ilg laik jos nebuvo aptiktos lstelse tradiciniais biochegebjimu sintetinti DNR ties
miniais metodais. Replikatyvins DNR polimerazs sustoja,
paaidomis matricinje DNR
jeigu prieina paaid DNR matricoje. Jos yra jautrios dl
grandinje.
paaidos pasikeitusiai DNR geometrijai ir disocijuoja, pa-
200
likdamos laisv ilginamos grandins 3OHgal. Kaip ir bakterijose, eukariotuose yra TLS DNR
polimerazi, kurios ties DNR paaidomis pakeiia replikatyvines DNR polimerazes. Polimerazi
sintez taip pat indukuojama DNR paaid, t.y. SOS atsako metu. TLS fenomenas eukariotuose
itin paplits.
Eukariot TLS DNR polimerazs (kuri pirmosios atrastos 1999m.) pasiymi skirtingu atrankumu substratui ir kitomis savybmis. Pasitelkiant vairias polimerazes, DNR replikacija vyksta
net ir esant vairi tip paaid matricinje grandinje. iuo metu inomos ir apibdintos ios
Yeimos TLS DNR polimerazs (4.7lentel):
zz DNR (eta)polimeraz (Pol);
zz DNR(kapa)polimeraz (Pol);
zz DNR(jota)polimeraz (Pol);
zz DNRRev1polimeraz (PolRev1).
DNR hpolimeraz unikali tarp eukariotini DNR polimerazi, nes sintetina DNR ties savitomis matricos paaidomis cis-sin timino (T-T) dimerais. Sintez veiksminga ir tiksli (moguje
ir mielse terpia A-A), lyg matricos DNR bt visikai nepaeista, t.y. Polh veikia kaip tiksli
polimeraz (angl. error free). Polh gali veiksmingai sintetinti ir ties kitos ries paaidomis
7,8dihidro-8-oksiguaninu. Polh yra homologika E.coli UmuC (Dna PolIV) ir DinB (DNR PolV)
baltymams.
DNR hpolimeraz svarbi apsisaugant nuo UV spinduli sukeliamo odos vio. mons, kurie serga odos liga pigmentine kseroderma (bdingi ligos poymiai yra pigmentuota, sausa oda), tiksliau,
viena i ios ligos atmain vadinamja XP-V forma, priklauso itin didels rizikos susirgti odos viu
grupei. XP-V forma sergani ligoni chromosomoje yra mutavusi Polh. Serganij lstels yra labai
jautrios UV spinduliams, jos negali replikuoti paeistos DNR. Pigmentins kserodermos molekulinis
mechanizmas siejamas su UV spinduli sukelt T-T fotodimer susidarymu, ties kuriais replikatyvins
DNR polimerazs negali vykdyti sintezs. Jei nra DNR hpolimerazs, kuri gali tiksliai vykdyti sintez
ties tokios ries paaidomis, replikacija sutrinka. DNR hpolimerazs savyb netiksliai sintetinti DNR
panaudojama somatins hipermutacijos procese genuose, koduojaniuose antiknus. Manoma, kad
btent DNR hpolimeraz vykdo toki gen DNR replikacij. iuose genuose mutacij danis 106 didesnis nei vidutinis kit gen mutacijos danis. Tokiu bdu generuojami didelio savitumo antiknai.
Taiau nra aiku, kaip DNR hpolimeraz nukreipiama antiknus koduojani gen sritis.
DNR ipolimeraz ties timino dimerais terpia ne A, bet Gnukleotidus. DNR polimeraz
vykdo sintez pereidama heterociklini bazi netekusias vietas (angl. abasic sites), taip pat DNR
aduktus. Dl polimerazs veikimo susidaro rmelio poslinkio mutacijos. DNR x(zeta)polimeraz, kitaip nei DNRPolh, sintetina DNR ties T-T dimerais, darydama daug klaid.
Atlikus Y eimos DNR polimerazi struktrinius tyrimus, paaikjo svarbs polimerazi
struktriniai ypatumai, lemiantys ypatingas j biologines funkcijas. Yeimos DNR polimerazi
katalizin subvienet sudaro delno, pirt ir nykio domenai, bdingi ir kit eim DNR polimerazms. Taiau delno ir pirt domenai yra neprastai mai, palyginti su replikatyvinmis
DNR polimerazmis, o aktyvusis centras toleruoja smarkius nukrypimus nuo Votsono-Kriko
201
MOLEKULIN BIOLOGIJA
4.7lentel. Eukariotini DNR polimerazi sudtis, fermentiniai aktyvumai ir funkcijos

Polimeraz
eima
Subvienetaia
(M x 103)
Fermentinis aktyvumas
Funkcijos
(alfa)
165 (167)
DNR polimeraz
Replikacija: iniciacija, Okazaki fragment

sintez;
Reparacija: viengrandini trki reparacija;
Telomer ilgio reguliacija;
Lstels ciklo reguliacija
67 (79 / 86)
58 (58)
48 (48)
Praimaz
(beta)
39 (68)
DNRPol, 5deoksiribozs
fosfato liaz*
Reparacija: bazi ipjovimo reparacija; viengrandini trki reparacija;

Mejoz
(gama)
125 (143)
DNRPol,
35egzonukleaz
Mitochondrij DNR replikacija
DNRPol,
35egzonukleaz
Replikacija: vluojanioji grandin, replikacija

esant DNR paaidoms;
Reparacija: nesuporuot nukleotid paalinimas, bazi ipjovimo reparacija, dvigrandini
trki reparacija;
DNRPol,
35egzonukleaz
Replikacija: pirmaujanti grandin;

Reparacija: dvigrandini trki reparacija,
bazi ipjovimo reparacija, nukleotid ipjovimo reparacija;
DNRPol
Klaidas paliekanioji (angl. error prone) DNR

polimeraz;
Somatin hipermutacija**
35
(delta)
125 (125)
66 (55)
50 (40)
(22)
(epsilon)
261 (256)
59 (79)
(34)
(29)
x(zeta)
353 (173)
(29)
(eta)
78 (70)
DNRPol(Rad30)
Klaid nepaliekanioji (angl. error free) DNR

polimeraz;
Somatin hipermutacija;
Seserini chromatidi sukibimas
(teta)
198 (?)
DNRPol, helikaz (?)
Tarpgrandinini ssiuv taisymas
(jota)
80 (?)
DNRPol(Rad30B), 5deoksiribozs fosfato liaz
Klaidas paliekanioji DNR polimeraz
(liambda)
66
DNRPol, 5deoksiribozs
fosfato liaz
Mejozin reparacija (?)
(kapa)
99
DNRPol
Klaid nepaliekanioji ir klaidas paliekanioji

(angl. error free ir error prone) DNR polimeraz
(miu)
55
DNRPol, galin transferaz
Somatin hipermutacija
(sigma)
42 / 55
DNRPol
Seserini chromatidi sukibimas
Rev1
DNRPol
Pateikiami duomenys apie induoli ir skliausteliuose mieli DNR polimerazes.

* Deoksiribozs fosfato liazs aktyvumas paalina deoksiribozs fosfat i DNR eliminacijos mechanizmu; jeigu prie
ribozs nra prijungtos heterociklins bazs, DNR yra skeliama ties 5padtimi. i reakcija yra tarpin bazi ipjovimo
reparacijos (BER) procese.
** Somatin hipermutacija vyksta savituose imunoglobulino gen segmentuose limfini audini lstelse.
a
202
bazi por geometrijos. Yeimos polimerazs turi papildom Cgalin domen, kuriame yra
struktrinis elementas maasis pirtelis. Jis i dalies kompensuoja fermento ir DNR matricos
sveik stygi.
TLS savybmis pasiymi ir DNR xpolimeraz, kuri yra priskiriama Beimai (4.7lentel). Neseniai atrastos, bet dar neapibdintos DNR q(teta), (liambda), (miu) polimerazs. Manoma,
kad jos taip pat pasiymi TLS savybmis.
TLS DNR polimerazs pritraukiamos prie DNR paaid matricinje grandinje dalyvaujant
PCNA iedui. Esant paaid ir sustojus replikatyvinms DNR polimerazms, PCNA ubikvitilinamas. Prie ubikvitilinto PCNA veiksmingiau jungiasi TLS DNR h, , , Rev1polimerazs. Prisijungusios jos gali pakeisti replikatyvines DNR polimerazes. Savitieji ties DNR paaidomis replikuojani DNR polimerazi veikimo mechanizmai, nors nra iki galo iaikinti, siejami su DNR
replikacijos ir reparacijos proces koordinavimu lstelje. Galima manyti, kad DNR replikacijai
ties savitomis paaidomis yra pasitelkiamos savitos DNR polimerazs, kurios sintetinamos lstelje kaip atsakas DNR paaidas ir kurios tam procesui yra tinkamiausios.
4.4.8. Okazaki fragment brendimas eukariotuose

Eukariotuose vluojaniosios grandins sintez vyksta sintetinant trumpus 100200 nukleotid Okazaki fragmentus, kurie prasideda miriais pradmenimis. Prie sujungiant Okazaki
fragmentus itis DNR grandin, nukleazs paalina pradmenis. Pradmens 5gal pirmiausiai
istumia Pol (kartu su PCNAiedu), sintetinanti prie tai esant Okazaki fragment (4.36pav.).
DNR polimeraz, manoma, siterpia tarp pradmens ir matricos, tuomet yra istumiama ilgesn
ar trumpesn viengrandin uodega (angl. flap). Istumtj DNR atpasta ir skelia nukleazs.
Mieli ir kit eukariot tyrimais nustatyta, kad Okazaki fragment brendime dalyvauja bent dvi
nukleazs FEN1 (angl. flap endonuclease 1) ir Dna2. FEN1 gali paalinti pradmens RNR dal, kai
RNR pradmuo yra istumtas i DNR-RNR duplekso. FEN1 usineria ant istumtos uodegos. Kai
FEN1 paalina pradmen, DNR polimerazs (pvz., Pol) ima sintetinti DNR, kad upildyt ply.
DNR ligazs sujungia DNR (4.36pav.).
FEN1 atpasta ir skelia tik trump (12nt) i duplekso istumt uodeg. Ilgesni istumti fragmentai slopina FEN1 aktyvum (tokie greiiausiai susidaro in vivo). Ilgesnius fragmentus skelia Dna2. Dna2 yra daugiafunkcinis fermentas, pasiymintis nuo DNR priklausomu ATPaziniu,
35 helikaziniu ir viengrandinei DNR savitu endonukleaziniu aktyvumais. Dna2 sveikauja su
keletu baltym, dalyvaujani DNR replikacijoje, pvz., RPAbaltymais. Pasilytas RNR pradmens
paalinimo, dalyvaujant Dna2 ir FEN1, mechanizmas (4.36pav.). Okazaki fragmento RNR pradmen istumia Pol. Jeigu istumiamas didesnis fragmentas, nei yra tinkamas substratas FEN1
endonukleazei, RPA baltymai greitai padengia istumtj uodeg. Prisijungia Dna2 nukleaz ir
slopina tolesn uodegos susidarym. Dna2, greiiausiai, nuskelia vis RNR-DNR pradmen, netiksliai susintetint DNR polimerazs-praimazs. Nusklus pradmen, RPA ir Dna2 disocijuoja.
Ply sujungia DNR ligaz.
203
MOLEKULIN BIOLOGIJA
4.36pav. Okazaki fragment brendimas eukaruotuose dalyvaujant FEN1 ir Dna2baltymams (Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, v. 40, p. 115, 2005)
4.4.9. Replikatyvins helikazs eukariotuose

Eukariot organizmuose replikatyvini helikazi funkcijos priskiriamos MCM (angl. minichromosome maintainance) baltymams. Baltymai nustatyti genetine analize mielse, kurioms
buvo bdingas plazmidi, turini klonuotas centromeros ir replikacijos pradios ori sritis,
netekimas. I viso nustatyti ei skirtingi MCM baltymai (MCM27), kurie atrasti ne tik mielse,
bet ir visuose iki iol tirtuose eukariotuose. MCM baltymus koduojani gen turi ir archjos.
Tai liudija apie labai sen MCM baltym kilm. Kiekvienas MCM27 baltymus koduojantis genas yra gyvybikai svarbus. MCM27 baltymai sudaro atskir AAA+ eimos baltym pogrup.
Kiekvienas MCM baltymas Cgale turi ATPazs domen (4.37pav., a). In vitro MCM27 sudaro
vairius kompleksus, daniausiai heksamer i ei skirting baltym. Funkcionalus MCM27
yra iedo pavidalo, taiau jei nra ATP, iedas gali turti ply (4.37pav., b). Prisijungus ATP ir
aktyvinantiems baltymams, MCM27 plyys usidaro. Manoma, kad replikacijos metu ties ori
sritimi funkcionuoja du MCM27 heksamerai (4.37pav., bd). MCM juda iilgai tos DNR grandins, kuri naudojama kaip matrica pirmaujaniosios grandins sintezje, t.y. 35 kryptimi.
204
4.37pav. MCM27 baltym erdvin struktra. Sulfolobus sulfolactarius MCM27 komplekso erdvin
struktra. AAA+ ir Ngalinis domenai paymti (a); Drosophila melanogaster MCM27 komplekso erdvin
struktra (b); MCM27 komplekso, prijungto ori srityje, schema (c); dviej MCM27 heksamer erdvin
struktra (d) (Annual Reviews of Biochemistry, v. 82, p. 25, 2013)
4.4.10. Replikacijos iniciacija eukariotuose

Eukariot genom replikacija Sfazs metu vyksta pakankamai greitai. Pvz., kai kuri organizm ankstyvuose embrionuose replikacija vyksta per kelet minui. Greit replikacij utikrina ori srii gausa ir iniciacij ties ori sritimis danio valdymas. Pvz., mogaus genome yra
~60000 srii, kur gali prasidti replikacija. Tam, kad replikacijos iniciacija vykt prie ori srii,
turi prisijungti iniciacijos baltymai.
Eukariot organizmuose replikacijos iniciacijos baltym funkcij atlieka ORC baltym
kompleksas (angl. origin recognition complex). Kompleks (~400kDa) sudaro ei baltymai,
kuriuos koduoja cdc (angl. cell division cycle) genai. Komplekso baltymai konservatyvs visuose
organizmuose nuo mieli iki mogaus (4.38pav., ac).
Skirting eukariot ori sritys skirtingos (4.39pav., a). S.cerevisiae mieli ori sritis sudaro ARS
elementai (angl. autonomously replicating sequences), nutol vienas nuo kito ~40kb atstumu.
Sritys yra palyginti nedidels ~100200bp. Mieli genome yra >400 toki srii. ARS elementui bdinga konservatyvi 11 nukleotid, daug A ir T turinti seka A elementas (5ATTTATPUTTTA 3, kur Pu purinas). Mutacijos ioje konservatyvioje srityje daro tak ori srities
funkcijoms.
S.pombe mieli ori sritys ilgesns 5001500bp. Jose nra konservatyvi sek, bet yra du
ar daugiau daug A ir T nukleotid turini element (4.39pav., a).
Daugialsi eukariot replikacijos pradios sritys itirtos menkai. DNR sekos, kurios nustatytos kaip galinios atlikti replikacijos pradios srii funkcij (pvz., galinios bti terptos
plazmides), neturi konservatyvi element (4.39pav., a). Paios ori sritys yra keli tkstani bp
ilgio. Bendras toki srii bruoas tas, kad jos turi daug A ir T turini sek. Manoma, kad ne ori
nukleotid sekos, bet chromatino struktra ir transkripcijos cis bei trans veiksniai yra svarbs
j kaip ori srii funkcijai.
205
MOLEKULIN BIOLOGIJA
4.38pav. ORC baltym struktra. ORC ir Cdc6 baltym domenin organizacija. WHD sparnuotos spirals domenas (angl. winged helix domain), BAH bromo kaimynysts (angl. bromo-adjanced homology)
domenas (a); Drosophila melanogaster ORC komplekso struktra, paremta elektronins mikroskopijos
duomenimis. Punktyru parodyta, kur telkiasi AAA+ domenai (b); mieli ORC su Cdc6 baltym komplekso
struktra, paremta elektronins mikroskopijos duomenimis. Orc6 pakeistas archj Orc1 (c) (Annual Reviews of Biochemistry, v. 82, p. 25, 2013)
4.39pav. ori sritys eukariotuose (a) ir pre-RC komplekso susimontavimas (b)
206
Mielse ORC kompleksas yra prisijungs prie DNR per vis lstels cikl. induoliuose komplekso stabilumas priklauso nuo lstels ciklo fazs: kompleksas i dalies isimontuoja per mitoz ir vl susimontuoja per ankstyvj G1faz. Isimontavimas ir susimontavimas susijs su
ORC baltym fosforilinimu. Taigi, ORC kompleksas nustato, kur vyks replikacijos iniciacija. Taiau replikacijos iniciacijai vykti turi bti patenkintos tam
tikros slygos gautas replikacijos leidimas (angl. replicaReplikacijos leidimas tai
tion licencing). Ties eukariot replikacijos pradios ori sritivyksmai, utikrinantys preremis turi susidaryti pre-RC kompleksas (angl. pre-replicatiplikacijos komplekso (pre-RC)
on complex). Tai yra btina slyga replikacijos iniciacijai
susimontavim ties replikacijos
vykti. Pagrindiniai pre-RC komplekso baltymai yra ORC,
pradios ori sritimi.
Cdc6, Cdt1 ir MCM2-7 (4.39pav., b).
Prereplikacijos komplekso susimontavimo proces valdo nuo ciklin priklausomos kinazs.
Pre-RC kompleksas pradeda montuotis dar vlyvojoje Mfazje / ankstyvoje Gfazje (tuoj po
Mfazs), kai Sfazs nuo ciklin priklausom kinazi aktyvumas yra maas (4.40pav.).
4.40pav. Eukariot pre-RC kompleksas ir jo aktyvinimas. Ribos tak ymi rodykl (L.A.Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012)
207
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Prie ORC prisijungia Cdc6 baltymas. Tada pre-RC kompleks ORC-Cdc6 kompleksas jungia
Cdt1 ir MCM27 baltymus. jungimas yra aktyvus procesas, jam reikia ATP hidrolizs. ORC-Cdc6
Ngaliniai AAA+ domenai sveikauja su galiniais MCM2
7 AAA+ domenais. ORC-Cdc6 komplekse vyksta erdviniai
Eukariot pre-RC kompleks
pokyiai, jis gyja deinio sukimo spirals pavidal, panasudaro ORC, MCM 27, Cdc6 ir
iai kaip RFC iedo uklimo kompleksas (4.35pav.). Pre-RC
Ctd1 baltymai.
komplekse yra net 14 baltym.
Pre-RC komplekso susidarymas vyksta tiksliai nustatytu lstels ciklo tarpsniu per G1faz
iki ribos tako (angl. restriction point). Perjus ribos tak, Sfazs kinazi kiekis lstelje vl
iauga (pirmiausiai Cdk-Eciklino, vliau Cdk-Aciklino). Kol nepasibaigia mitoz, nauji pre-RC
kompleksai susidaryti nebegali, nes dl Sfazs kinazi veikimo iaktyvinami komplekso komponentai Cdc6 ir Cdt1 baltymai. Iaktyvinimo bdai gali bti vairs. Pvz., S.cerevisiaeCdc6
sintetinamas tik G1fazje, o Cdt1 ir MCM sintetinami vis laik, bet branduolyje bna tik per G2
faz. Daugialsiuose organizmuose pre-RC komplekso susidarym valdo ir baltymas gemininas, sintetinamas per S ir G2 fazes. Jis ir suria Cdt1.
Pre-RC komplekse MCM27 baltymai yra neaktyvs. Jie aktyvinami pereinant nuo G1
Sfaz. MCM kompleks, prisijungusi prie ori srii, aktyvinimas vyksta individualiai ir yra valdomas. MCM baltymams aktyvinti reikalingi Cdc45 baltymas bei GINS baltym kompleksas.
ie baltymai tiesiogiai sveikauja su MCM baltymais. Aktyvinim valdo CDK (S-CDK) kinaz ir
DDK (Cdc-Dfb4) kinaz. Kinazs fosforilina pre-RC komplekso komponentus, taip pat ir kitus
replikacijoje dalyvaujanius baltymus, tuomet aktyvinama MCM helikaz. Aktyvintas MCM27
kompleksas iskiria DNR grandines. Toliau ties ori sritimi prisijungia DNR polimeraz-praimaz, kiti replisomos komponentai.
4.5. Kiti DNR replikacijos bdai

Pagal klasikin eukariot ir prokariot DNR replikacijos model, replikacijos metu dvi replikacins akuts juda prieingomis kryptimis nuo ori srities, sintetinama vluojanioji ir pirmaujanioji grandin. Gamtoje yra vairi io mechanizmo modifikacij. Aptarsime kai kurias i j.
4.5.1. Besisukanio rato DNR replikacijos mechanizmas

Besisukanio rato (angl. rolling circle) mechanizmu replikuojami nedideli genomai, pvz.,
viengrandins DNR genom turini bakteriofag, taip pat bakterij kai kuri plazmidi (pvz.,
F plazmids) DNR. Nors replikacijos principas yra tas pats, tam tikri replikacijos etapai gana
smarkiai skiriasi. Skirtumai atsirado dl skirting biologini tiksl: bakteriofagams reikia sintetinti kuo daugiau DNR kopij, o plazmidms tik tam tikr tiksliai apibrt kopij skaii
bakterinje lstelje.
Replikuojant DNR besisukanio rato mechanizmu vluojanioji ir pirmaujanioji DNR grandins replikuojamos atskirai. Dvigrandinje DNR savitasis iniciacijos baltymas, IP (angl. ini-
208
tiation protein) skelia vien DNR grandin. Trkio vietoje laisva motinins grandins 3OHgrup tampa pradmeniu pirmaujaniosios grandins sintezei. Replisomai judant priek, motinins DNR grandins 5galas istumiamas. Nauja DNR grandin lieka kovalentiniu ryiu sujungta
su senja motinine grandine. Visikai susintetinus pirmaujanij grandin, motinin grandin
nuskeliama. Likusi senoji DNR sujungiama, o vliau paveriama dvigrandine DNR, susintetinus RNR pradmen (pRNR), kuris naudojamas komplementarios grandins sintezei. Aptarsime
dviej genom, kuri DNR replikuojama besisukanio rato principu, replikacijos mechanizmus.
Bakteriofago X174 DNR nedidel viengrandin iedin DNR vadinama plius (+) grandine. iai grandinei sintetinama komplementari minus () DNR grandin. Taip susintetinama
dvigrandin fago DNR. Tokia DNR forma, RF (angl. replicative form), naudojama fago genomo
replikacijai. RF DNR yra superspiralizuota. Replikacija vyksta besisukanio rato mechanizmu.
Sintetinama daug viengrandins fago DNR kopij, kurios supakuojamos naujas fag daleles.
Replikacijos iniciacijai reikia fago genomo koduojamo A iniciacijos baltymo (4.41pav., bendroje schemoje IP iniciacijos baltymas).
Visi gamtiniai replikonai, DNR sintezei naudojantys besisukanio rato mechanizm, koduoja
savitus iniciacijos baltymus. Baltymai priskiriami grandini transferazi baltym supereimai.
Baltymai, prie tai iskyr srities DNR, prisijungia prie ori srities pirmaujaniojoje grandinje.
Iniciacijos baltymai atrankiai skelia viengrandin DNR netoli prisijungimo srities. Baltymo
aktyviajame centre esanti tirozino aminorgties liekana vaidina svarbiausi vaidmen susidarant trkiui (4.41pav.). Daugeliu atvej (taiau ne visais) iniciacijos baltymas lieka kovalentiniu
ryiu prisijungs prie skeltosios DNR 5galo. Susidarius trkiui, ties matricos-pradmens vieta
susimontuoja replisoma. Replisom sudaro eimininko SSB baltymai, DNRPolIII holofermentas, helikaz (Rep), bakteriofago iniciacijos baltymas.
Pirmaujaniosios grandins sintez vyksta istumiant senj DNR grandin. Kovalentikai
prisijungs iniciacijos baltymas lieka replikacinje akutje. akutei nutolus nuo ori srities,
pirmaujaniojoje grandinje susintetinama nauja ori sritis. Joje yra nukleotid seka, kuri vl gali skelti iniciacijos
DNR replikacija besisukanio
baltymas. Taiau sklus naujj DNR grandin, tolesn rerato mechanizmu vyksta istuplikacija sustot. Kadangi dvigrandin DNR, kuri sudaro
miant senj DNR grandin,
senoji minus grandin ir naujoji plius grandin, nra suprie tai iniciacijos baltymui
perspiralizuota, o iniciacijos baltymas skelia savitj srit
persklus vien i dviej motik superspiralizuotoje DNR, tokiu bdu naujai susintetinta
tinins DNR grandini ir praori sritis apsaugoma nuo pakartotinio sklimo.
dmeniu sintezei panaudojus
Pirmaujaniosios DNR grandins sintezs terminacija
skeltosios DNR 3OHgal.
vyksta tuomet, kai replisoma, sintetindama nauj grandin, pasiekia ori srit dvigrandinje DNR. ia pirmaujanioji
DNR grandin susintetinama iek tiek toliau u srities, kurioje viengrandin DNR gali skelti iniciacijos baltymas. iuo momentu replisoma stabteli, i jos
disocijuoja DNR helikaz. Pirmaujaniosios DNR grandins 5galas siterpia tarp dviej senj
DNR grandini. Senosios plius grandins sklimo sritis tampa prieinama iniciacijos baltymui,
grandin skeliama. Sklimo procese dalyvauja kita IP baltymo tirozino aminorgties liekana.
Toliau vyksta transesterinimo reakcija: skeltos senosios plius grandins 3OHgalas sujungiamas
209
MOLEKULIN BIOLOGIJA
su tos paios grandins 5galu, ir senoji plius grandin ciklizuojama (4.41pav.). Kai sujungiama
ir paleidiama motinin DNR grandin, ta pati bakteriofago iniciacijos baltymo molekul, prisijungusi prie susintetintos pirmaujaniosios grandins, pradeda nauj DNR sintezs cikl. Tai
leidia sintetinti pirmaujanij plius grandin nenutrkstamai, perjungiant senj ir naujj
DNR grandines nuo vienos iniciacijos baltymo Tyraminorgties liekanos prie kitos.
Kaip jau minta, vluojanioji DNR grandin yra sintetinama nepriklausomai nuo pirmaujaniosios DNR grandins sintezs. Vluojaniosios grandins DNR sintezei naudojama kita replikacijos pradios ori sritis. Fago replikacijos iniciacijos baltymas iame procese nedalyvauja.
RNR pradmen sintetina eimininko RNR polimeraz, replikacijoje dalyvauja SSB, DNR Pol III
holofermentas, kiti baltymai.
Daugiausiai ini apie plazmidi replikacij besisukanio rato mechanizmu gauta tiriant
stafilokok ir streptokok plazmides. Mechanizmas panaus k tik aptartj. Replikacija prasideda, kai Rep iniciacijos baltymas, koduojamas plazmids, prisijungia prie dvigrandins plazmids DNR savitos dso srities (angl. double stranded origin) (4.42pav.). Srityje yra seka, kuri
atrankiai atpasta ir skelia iniciacijos baltymas. Tam tikrose plazmidse baltymo prisijungimo
ir sklimo sritys yra viena alia kitos, kitose gali bti nutolusios iki 85bp. Dl Rep baltymo ir
dso srities sveikos DNR stipriai ilenkiama. dso srityje susidaro dviej kilp pavidalo struktra
(4.42pav.). Tokios struktros viengrandinje DNR esani sklimo srit pasiekia iniciacijos Rep
baltymas. Repbaltymas skelia vien DNR grandin dso srityje. Kaip ir fag replikacijos inicia-
4.41pav. X174bakteriofago replikacijos besisukanio rato mechanizmu schema. Y1, Y2 iniciacijos baltymo tirozino aminorgtys, dalyvaujanios reakcijoje, IP iniciacijos baltymas, H DNR helikaz,
Pol eimininko DNRPolIII
210
cijos baltym, taip ir besisukanio rato mechanizmu besireplikuojani plazmidi iniciacijos

baltym sudtyje yra dvi sklimui svarbios tirozino aminorgi liekanos.
Galimas ir kitoks variantas: pvz., pT181 plazmids RepC baltymas veikia kaip dimeras (RepCRepC), sudarytas i baltymo monomer, turini po vien tirozino aminorgties liekan
(4.42pav.). RepC baltymui sklus viengrandin plazmids DNR, prie DNR prisijungia bakterijos
helikaz. Bakteriofag ir plazmidi DNR replikacijoje dalyvauja vairios lstels helikazs (pvz.,
Rephelikaz, UvrDhelikaz ir kt.). Replikacijai dar reikalingi SSB baltymai ir DNR IIIpolimerazs
holofermentas. Pirmaujaniosios grandins sintez vyksta taip pat, kaip ir bakteriofag istumiant motinin grandin ir j vliau skeliant (4.42pav., b). Naujai susintetinta ir istumtoji DNR
grandins ciklizuojamos, o RepC-RepC baltym dimeras disocijuoja (4.42pav.). Prie kiekvienos
i RepC baltym dimero Tyr aminorgties liekanos lieka prijungtas nedidelis oligonukleotidas.
Esminis skirtumas tarp plazmidi ir fag DNR replikacijos pabaigos yra tas, kad plazmids
RepC baltym dimeras po vieno replikacijos ciklo lieka neaktyvus. Tai reikia, kad plazmids
DNR replikacija gali prasidti tik tada, kai susiformuoja naujas aktyvus RepC baltym dimeras.
Vluojanioji DNR grandin, kaip ir X174bakteriofago DNR, replikacijos metu sintetinama
panaudojant RNR pradmen, eimininko DNR IIIpolimerazs holoferment bei kitus baltymus.
Vluojaniosios grandins sintezs iniciacijai yra naudojama kita plazmids DNR sritis sso.
sso sritys plazmidje turi promotorius, kuriuos atpasta lstels RNR polimeraz. RNR polimeraz sintetina trump pradmen (daniausiai 1718 nukleotid, bet bna ir ilgesni), kur ilgina
DNRPolI, o vliau j pakeiia procesyvesn DNRPolIII. Galiausiai DNR molekules iedus sujungia DNR ligaz, o superspiralizuoja DNR giraz.
4.42pav. Plazmidi replikacija besisukanio rato mechanizmu (Molecular Microbiology, v. 37, p. 447,
2000)
211
MOLEKULIN BIOLOGIJA
4.43pav. Xenopus laevis rDNR replikacijos mechanizmas (L.A.Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition,
2012)
domus replikacijos atvejis nustatytas Afrikos naguotosios varls Xenopus laevis ovocituose.
ia, kaip ir kit eukariot lstelse, yra nechromosomini DNR iedini dvigrandins DNR
molekuli, kuriose yra pasikartojani sek. Toki nechromosomini DNR Xenopus yra itin gausu. Nechromosomini DNR ieduose koduojamos rRNR. Tokia DNR vadinama rDNR. ied replikacija labai intensyvi ovogenezs metu, kada reikia utikrinti veiksming ribosom sintez.
Replikacija prasideda skeliant vien grandin (4.43pav.) ir vyksta besisukanio rato mechanizmu. Pirmaujanioji grandin sintetinama nenutrkstamai. Ji naudojama kaip matrica vluojaniosios grandins sintezje sintetinant Okazaki fragmentus. Tokioje dvigrandinj DNR yra
daug rDNR kopij. DNR atskiras kopijas suskaldo nukleaz, o sujungia DNR ligaz.
4.5.2. DNR replikacija mechanizmu

(teta) mechanizmu daniausiai replikuojamos plazmidi DNR. Vykstant replikacijos
procesui, motinins DNR grandins yra iskiriamos, vliau sintetinamas RNR pradmuo (pRNR).
DNR pirmaujaniosios grandins sintez pradedama, kai DNR polimeraz ilgina pRNR pradmen. Pirmaujanioji DNR grandin sintetinama nenutrkstamai, o vluojanioji DNR grandin
fragmentais. replikacija gali prasidti vienoje arba keliose ori srityse. Replikacins akuts gali
judti viena arba abiem kryptimis. Elektronins mikroskopijos bdu gautose nuotraukose io
tipo mechanizmu besireplikuojanios DNR molekuls yra panaios graikik teta () raid
(4.44pav.).
212
4.44pav. Plazmidi
replikacija (teta)
mechanizmu
Beveik vis plazmidi DNR, kurios yra replikuojamos mechanizmu, replikacijos iniciacijai
reikia plazmidi koduojam Rep iniciacijos baltym. Plazmidi ori srityse yra i baltym
prisijungimo vietos. ori sritys pasiymi dar keletu bding savybi:
zz turi iteron pasikartojani nukleotid sek;
zz turi A ir T nukleotid gausi srii, kuriose iskiriamos DNR grandins ir prisijungia eimininko replikacijos baltymai;
zz turi eimininko DnaAbaltymo prisijungimo viet.
Iteronai yra ~20bp DNR pasikartojimai (4.45pav.). J nukleotid sekos pasiymi gana dideliu konservatyvumu. Pasikartojimai yra saviti kiekvienai plazmidei, prie j atrankiai prisijungia
tik tos plazmids DNR koduojamas Rep iniciacijos baltymas. Repbaltym koduojantis genas yra
isidsts netoliese. DnaAbaltymo prisijungimo srityse yra Dam metilazs metilinimo viet (nors
metilinimas nra svarbus i plazmidi DNR replikacijai). Taigi, mechanizmu besireplikuojani plazmidi DNR ori sritys primena bakterij, pvz., E.coli, DNR replikacijos ori sritis. Replikuojant
DNR mechanizmu, replikacijos iniciacijos metu susimontuoja replisoma, kuri sudaro eimininko DNRPolIII holofermentas, DnaBhelikaz ir praimaz. Daugelio plazmidi DNR replikacijos
iniciacijai reikia plazmids koduojamo Repbaltymo ir eimininko DnaAbaltymo.
DnaAbaltymas reikalingas replikacijos iniciacijai, bet ATP nra btinas. Repbaltym prisijungimas prie iteron srii utikrina replikacijos ori srities grandini iskyrim. Repbaltymai
nepasiymi ATPaziniu aktyvumu. J prisijungimo slygot DNR ori srities pokyi, greiiausiai,
pakanka, grandinms iskirti. Tai, kad Rep baltymas dalyvauja iskiriant DNR grandines, neleidia plazmidi DNR replikacijai visikai priklausyti tik nuo eimininko baltym. Rep-DNR
kompleksas kartu su eimininko DnaA baltymu lemia DnaB-DnaC komplekso prisijungim prie
plazmids DNR ori srities ir abiej grandini isiskyrim daug A ir T nukleotid turinioje srityje.
iame procese taip pat gali dalyvauti eimininko HU, IHF, FIS baltymai.
4.45pav. Plazmidi, besireplikuojani mechanizmu, ori

srii struktra
213
MOLEKULIN BIOLOGIJA
4.5.3. DNR replikacija Dkilpos mechanizmu

D kilpos mechanizmu vyksta mitochondrij iedins dvigrandins DNR replikacija. Kaip
matrica sintezje i pradi naudojama viena i dviej DNR grandini Lgrandin (angl. light).
Ties Hgrandins ori sritimi, OH, susintetinamas pradmuo (4.46pav., a). Pradmen susintetina
mitochondrij RNR polimeraz. Pradmen dar sutrumpina tam tikros endonukleazs (pvz., MRP
ribonukleaz), kuri substratas yra DNR-RNR heterodupleksas.
Sutrumpint pradmen ilgina DNR polimeraz, sintetindama pirmaujanij grandin, o
Lgrandin yra istumiama. Susidaro struktra, primenanti D raid. Struktra vadinama Dkilpa. Judanioje Dkilpoje DNR grandins yra iskiriamos ~500600 nukleotid srityje. Sintetinama madaug du tredaliai naujosios Lgrandins. Tuomet istumtoje senojoje DNR Lgrandinje replikacijai tampa prieinama kita DNR ori sritis OL. Prasideda naujos H (angl. heavy)
grandins, komplementarios Lgrandinei, sintez (4.46pav., b, c).
4.46pav. induoli mitochondrij DNR (mtDNR) replikacija Dkilpos mechanizmu. Replikacijos

schema (a, b) (L.A.Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012); mitochondrij DNR
replikacijoje dalyvaujantys baltymai (c) (http://www.niehs.nih.gov/research/atniehs/labs/lmg/mdnar/)
214
Vykstant tam tikr organizm mitochondrij DNR replikacijai, susidaro ne viena, o kelios
D kilpos. Tai liudija, kad ios DNR turi ne vien, o kelias replikacijos pradios ori sritis. Panaus
mechanizmas pasitelkiamas ir chloroplast DNR replikacijai.
4.5.4. Linijini DNR replikacija

Iki iol aptarme linijini DNR replikacij, neusimindami apie tai, kaip replikuojami chromosom galai. Lstel, replikuodama linijines DNR molekules, susiduria su problema, kaip tiksliai nukopijuoti abiej DNR grandini galus. Paalinus RNR pradmen pirmaujaniojoje grandinje ir paskutin pradmen vluojaniojoje grandinje, lieka j 5 galai. Gamtoje egzistuoja
vairs linijini DNR gal replikacijos problemos sprendimo bdai. Aptarsime kai kuriuos i j.
T4 ir T7 bakteriofagai, kuri DNR yra dvigrandin, turi pasikartojani komplementari
sek. Kai DNR replikuojama ir paalinami galuose esantys pradmenys, dukterins grandins
lieka trumpesns. Fag DNR molekuls sveikauja komplementariomis sekomis ir susijungia.
Tokiu bdu vien ilg molekul konkatemer sujungiama daug linijini fago DNR (~20).
Vliau sujungtos fago DNR molekuls tiksliai suskaldomos vienodo ilgio DNR molekules bsim nauj fag genomus.
4.8lentel. Adenoviruso DNR replikacijoje dalyvaujantys viruso ir lstels baltymai
Viruso / lstels
baltymas
Molekulin mas
(kDa)
Funkcijos replikacijos iniciacijos metu
Funkcijos replikacijos
elongacijos metu
Viruso baltymai
DNR galinio baltymo pirmtakas, pTP
80
Prisijungs prie polimerazs veikia kaip

pradmuo
Prie DNR kovalentikai prijungtas

galinis TP baltymas
55
Apsaugo 5galus; padidina matricos aktyvum;

aktyvina pTP Ad Pol prisijungim; pakeiia replikacijos ori srities struktr;
DNR polimeraz
(AdPol)
140
Prisijungia ties erdine sritimi (kartu su pTP

baltymu); prijungia dCMP prie pTP
Sintetina nauj DNR grandin, istumdama senj

grandin
Prie DNR (viengrandins) prisijungiantis DBP

baltymas
59
Sumaina dCMP Km; aktyvina NFI prisijungim
Apsaugo viengrandin DNR;

iskiria DNR dupleks replikacinje akutje; padidina
DNR replikacijos procesyvum ir sintezs greit
Peptidaz
Po replikacijos skaldo
pTPbaltym iki 55kDa
TPbaltymo
Branduolio I veiksnys, NFI
55
Prisijungia ties pagalbine sritimi; prisijungia prie

pTPAd Pol; nukreipia pTPAd Pol ori srities link;
stabilizuoja preiniciacijos kompleks
Branduolio III
veiksnys , NFIII
90
Prisijungia prie pagalbins srities; lenkia DNR;

silpnai prisijungia prie pTP AdPol
Lstels baltymai
215
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Bakteriofagas 29 ir adenovirusas sintetina linijines DNR dar kitokiu savitu bdu. Pradmens
vaidmen DNR sintezje atlieka DNR gale kovalentiniu ryiu prijungtas baltymas.
Adenoviruso genom sudaro 3036 kb dvigrandin DNR, kurios kiekviename gale prie
grandins 5galo kovalentiniu ryiu prijungtas adenoviruso TPbaltymas (4.47pav.). Kiekviena
adenoviruso DNR grandin replikuojama atskirai, istumiant vien motinin DNR grandin, iki
tol buvusi duplekse su kita DNR grandine. Replikacija gali vykti nepriklausomai kiekviename
viruso dvigrandins DNR gale. Kai replikacin akut pasiekia kit DNR gal, istumtoji DNR
grandin atsipalaiduoja kaip viengrandin DNR.
Adenoviruso linijins DNR replikacijoje dalyvauja 4 viruso koduojami baltymai ir 3 lstels
eimininks baltymai (4.8lentel).
Adenoviruso DNR turi 51bp atvirkius nukleotid pasikartojimus abiejuose DNR galuose. Pasikartojimuose yra cis reguliacins sritys, dalyvaujanios nustatant replikacijos iniciacijos
pradios ori sritis. ori srityse iskiriami keli funkciniai domenai. A domen sudaro 18bp. A domenas yra minimali replikacijos ori sritis. Jis reikalingas replikacijai, bet utikrina tik savo paties
minimali replikacij. Sritis tarp 918bp yra konservatyvi daugelio adenovirus serotip genomuose. ioje srityje prisijungia pTP baltymas kartu su adenoviruso DNR polimeraze. B domen
sudaro 1939bp, o C domen 4051bp. B ir C domenai nra btini adenoviruso DNR replikacijai, bet jie labai pagerina replikacijos iniciacijos veiksmingum. Ties B ir C domenais jungiasi
lstels baltymai branduolio I veiksnys (NFI) ties B, o branduolio III veiksnys (NFIII) ties C do-
4.47pav. Adenoviruso DNR replikacijos schema. Adenoviruso replikacijos schema (a); adenoviruso
replikacijos iniciacijos schema (b)
216
menu. Kiekviename subrendusio viruso DNR 5gale kovalentiniu ryiu prijungtas TPbaltymas
taip pat veikia kaip cis reguliacinis elementas adenoviruso DNR replikacijoje.
Replikacij galima suskirstyti kelet etap (4.47pav., b). Pirmiausia viruso DNR padengiama DBPbaltymais. Tada DBPbaltymas kooperatyviai sveikauja su branduolio veiksniu, NFI,
kuris prisijungia prie adenoviruso savitos sekos DNR ori srityje. Tada prie ori prisijungia NFIII
branduolio veiksnys. Sveika tarp NFI baltymo ir adenoviruso DNR polimerazs (AdPol), taip
pat tarp pTP ir NFIII preiniciacijos kompleks jungia pTP-AdPol heterodimer (4.47pav., b).
Susidaro preiniciacijos kompleksas. Tada prie pTP baltymo kovalentiniu ryiu prijungiamas
dCMP nukleotidas. Tarp nukleotido fosfato grups ir pTP baltymo serino aminorgties liekanos hidroksigrups susidaro kovalentinis ryys. Ryio susidarym katalizuoja AdPol. dCMP
3OHgrup veikia kaip pradmuo komplementarios grandins sintezje. dCMP komplementarus ketvirtajam matricos nukleotidui. DNR sintez pradeda AdPol. Sintetinamas nukleotid
trejetas 5CAT3. Tai yra tarpinis replikacijos kompleksas. Dauguma pTP-AdPol kompleks tokioje stadijoje disocijuoja. Laisvos AdPol molekuls toliau ilgina grandin, tada pTP-CAT kompleksas grta atgal ir sudaro komplementari sveik su pirmaisiais trimis adenoviruso matricos nukleotidais (GTA). Grimas, manoma, reikalingas utikrinti iniciacijos tikslum. Kita motinin DNR grandin istumiama, judant DNR polimerazei priek (4.47pav., a). AdPol pereina i
replikacijos iniciacijos elongacijos etap. Grimas replikacijos iniciacijos metu yra bdingas
ir 29bakteriofago replikacijai, taip pat vyksta replikuojant kitas DNR, kai pradmens funkcij
atlieka baltymo molekul.
4.5.5. Telomeros ir j funkcijos

Kai vyksta eukariot chromosom linijins DNR replikacija, RNR pradmuo pirmaujaniojoje
grandinje, taip pat paskutiniojo Okazaki fragmento RNR pradmuo vluojaniojoje grandinje
yra paalinami. J vietoje DNR polimerazs negali de novo susintetinti DNR, nes sintez vykdo tik 53 kryptimi. Tokiu bdu dukterins DNR grandins lieka sutrumpjusios (4.48pav.).
Kitame replikacijos cikle, kur kaip matricos naudojamos sutrumpjusios DNR grandins, DNR
sintetinama taip pat trumpesn. Kiekvieno naujo replikacijos ciklo metu chromosom 5galai
trumpja, ir dukterines lsteles pakliva vis trumpesns chromosomos. Pvz., mogaus lsteli
chromosom 5galai po kiekvieno replikacijos ciklo sutrumpja ~150200 nukleotid. Toks
genetins mediagos praradimas jungia nuo p53 baltymo priklausom DNR paaid taisymo keli. Lstels visam laikui pasitraukia i ciklo (reikinys vadinamas replikaciniu senimu)
arba va apoptozs keliu. Kartais netgi pakanka vieno chromosomos galo sutrumpjimo, kad
bt sustabdyta lsteli proliferacija. Taigi, chromosom gal trumpjimas yra vienas navik
slopinani mechanizm.
Gamtoje egzistuoja molekulini bd, kurie apsaugo tam tikr lsteli chromosomas nuo
trumpjimo. Dauguma eukaruot tam pasitelkia telomeras ir telomeraz.
217
MOLEKULIN BIOLOGIJA
4.48pav. Linijins DNR 5gal trumpjimas dl

replikacijos
4.5.6.Telomer struktra
1930m. Hermanas Miuleris (Hermann Muller) ir Barbara MakKlintok (Barbara McClintock) tyrimais nustat, kad
eukariot chromosomose yra telomer. ios struktros
lstelms yra gyvybikai btinos.
Telomeros yra universalios baltym-DNR struktros eukariot

chromosom galuose.
Telomeros atlieka kelet svarbi biologini funkcij:

zz utikrina, kad dalyvaujant fermentui telomerazei chromosomos po kiekvieno DNR replikacijos ciklo netrumpt (taiau tik tam tikrose lstelse);
zz utikrina chromosom stabilum apsaugo linijini chromosom galus nuo rekombinacijos, sujungimo, nukleazi poveikio;
zz utikrina visik chromosom replikacij bei padalijim dukterines lsteles;
zz dalyvauja chromatino organizacijoje branduolyje;
zz dalyvauja valdant gen veikl.
Telomer sudtyje esantys molekuliniai komponentai sveikauja tarpusavyje ir sudaro vairius kompleksus (4.49pav.):
zz DNR-baltym kompleks, isidsius ties visa telomerine DNR;
zz subtelomerin heterochromatin, kurio sudtyje yra ir nukleosomos;
zz baltym kompleks, isidsius ties telomerinio pasikartojimo dvigrandins DNR galu;
218
zz DNR-baltym kompleksus, isidsiusius ties telomerinio pasikartojimo viengrandins

DNR galu;
zz telomerines DNR kilpas;
zz telomerazs nukleoproteino komponentus.
Daugelio eukariot chromosom galuose DNR yra trumpos kartotins (~58bp) G gausios
sekos. is pasikartojimas vadinamas telomeriniu pasikartojimu. Sekos gali pasikartoti nuo
maiau kaip imto iki keli tkstani kart. Nukleotid seka ir jos ilgis varijuoja tarp organizm, lsteli tip ir net tos paios lstels chromosom. Pvz., Tetrachymena pirmuonyje seka yra
(TTGGGG)n, kito iuelini klass atstovo, Oxytricha nova, DNR (TTTTGGGG)n, mogaus ir pels
DNR (TTAGGG)n. Kai kuriuose eukariotuose, pvz., mielse, telomerinis pasikartojimas yra nere-
4.49pav. Eukariot chromosom DNR gal struktra. Chromosom galo struktra (a); DNR-baltym
kompleksai kai kuri eukariot chromosom galuose (b) (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 8,
p.825, 2007)
219
MOLEKULIN BIOLOGIJA
guliarus (TG)1-6TG2-3 (4.8lentel). Telomeros sudaro iki 220kb moguje, iki 150kb kai kuriose
peli ryse, ~300bp mielse ir tik keliasdeimt bp Oxytricha pirmuonyje. Paiuose telomer
DNR galuose yra viengrandins DNR 3galo ikya, kurioje gausu Gnukleotid (2.18pav.). Telomer viengrandins DNR ikya gali bti vairaus ilgio ir yra svarbi telomer funkcijai.
4.8lentel. Telomeriniai pasikartojimai vairiuose organizmuose ir j struktra
Organizmas
53
pasikartojanti
seka
Pasikartojanias
sekas turinios
telomeros ilgis
Daug G turinios
ikyos 3 gale
ilgis
t kilpa
Pirmuonys
Tetrahymena
T2G4
250300bp
1415b
Oxytricha
T2G4
20bp (makrobranduolys)
16b
Nra
Euplotes
T2G4
320kb (mikrobranduolys)
Nenustatyta
Yra
Trypanosoma
T2AG3
28bp
1020kb
14b
~75225b
?
Yra
(TG)1-6 TG2-3
~300bp
1214b
Shizosaccharomyces pombe
T1-2ACA0-1C0-1G1-6
~300bp
Nenustatyta
T3AG3
24,5kb
~2030b
Homo sapiens
T2AG3
220kb
~75225b
Yra
Mus musculus
T2AG3
iki 100kb
~75225b
Daugelis kit
T3AG3
2100kb
~75225b
Grybai
Augalai
Arabidopsis
Stuburiniai
Telomer DNR nebtinai yra sudaryta i vienod daug G ir T turini pasikartojim: kai kuriuose eukariotuose, pvz., S.pombe mielse ir Paramecium pirmuonyje, yra ne vienas, o keletas
skirting telomerini pasikartojim. Subtelomerinms chromosomins DNR sekoms, kurios
yra netoli telomerini pasikartojim, taip pat bdingi sek pasikartojimai, taiau jie labai vairs tarp ri.
Prie telomerins DNR yra prisijung telomeroms savitieji baltymai (4.49 pav., b), kuriuos
pagal sveikos su DNR pobd bt galima suskirstyti dvi grupes: dvigrandinei telomer DNR
savituosius baltymus ir viengrandinei telomer DNR savituosius baltymus. Baltymai taip pat
skirstomi evoliucikai konservatyvias grupes. Baltymai, kurie tiesiogiai sveikauja su telomer
gal DNR, dar sveikauja su kitais baltymais, sudarydami didelius nukleoproteininius kompleksus chromosom galuose telomer kepures (angl. telomere cap).
Prie induoli telomer DNR yra prisijungs elterino (angl. shelterin) baltym kompleksas.
Komplekse yra ei baltymai: TRF1 (angl. telomeric repeat binding factor 1), TRF2, POT1 (angl.
protection of telomeres 1), TIN2 (angl. TRF1-interacting protein 2), TPP1 ir RAP1 (4.50pav., a). TRF1
ir TRF2 jungiasi prie telomerinio pasikartojimo dvigrandins DNR. POT1 jungiasi prie telomerinio pasikartojimo viengrandins DNR 3galo ikyos. TRF1 ir TRF2 pritraukia kompleks kitus
baltymus: TIN2, TPP1 ir POT1.
220
4.50pav. Telomer DNR ir baltym komplekso struktra. induoli elterino kompleksas ir telomerins DNR kilpos (a) (Nature Reviews Cancer, v.8, p. 451, 2008); tkilpa mogaus HeLa lsteli telomerinje
DNR. Vaizdas gautas elektronine mikroskopija (b) (Cell, v. 97, p. 510, 1999)
vairi organizm telomer tyrimais nustatyta, kad telomerins DNR 3galo viengrandin
ikya gali siterpti telomerins DNR dvigrandin srit ir sudaryti dupleks su viena i grandini, nes dl telomerini pasikartojim sveika yra komplementari. Antroji duplekso grandin
istumiama (4.50pav., a, b). Taigi, telomerin DNR primena las ir jos struktroje yra dvi kilpos
tkilpa (angl. t-loop) ir Dkilpa (angl. displacement loop). tkilpos vaidmuo yra svarbus apsaugant chromosom galus nuo j atpainimo kaip DNR dvigrandini trki. Lstels molekulin
maina, kuri atpasta tokius DNR trkius, turi prieiti prie pat DNR galo. Telomer galo paslpimas kilpoje gali j apsaugoti nuo atpainimo ir DNR paaid taisymo (chromosom gal
jungimo) mechanizmo aktyvinimo. Telomer kilpos gali bti nuo 0,3kb dydio tripanosom
organizmuose iki 30kb dydio peli organizmuose.
Daug informacijos apie chromosom gal struktr buvo gauta tiriant Tetrahymena ir Oxytricha
pirmuonis. Kitaip nei kit eukariot, pirmuoni mikrobranduoliuose genomas yra fragmentuotas. J
sudaro daug ma minichromosom, kuri yra nuo 40 iki 10 000. Oxytricha turi net 107 geno dydio
chromosom.
Oxytricha nova (dar vadinama Sterkiella nova) organizmo heterodimerinis TEBP baltymas (angl. telomere and binding protein) pirmasis baltymas, kurio sveika su telomerins DNR 3 galo viengrandine ikya buvo nustatyta. Viengrandin telomerins DNR ikya yra paslpta TEBP baltymo, sudaryto i
ir monomer, viduje. In vitro eksperimentais rodyta, kad TEBP apsaugo telomerin DNR nuo egzonukleazi poveikio. Taigi, Oxytricha nova TEBP baltymas, prisijungs prie viengrandins DNR telomer
galuose, atlieka j apsaugin funkcij. TEBP gali sudaryti heterodimerus ir homodimerus. Tiek vieno,
tiek kito tipo kompleksas gali jungtis ties Oxytricha 16 nukleotid viengrandine ikya. Heterodimeras
apsaugo telomeros gal nuo telomerazs, o homodimeras neapsaugo.
221
MOLEKULIN BIOLOGIJA
induoliuose elterino kompleksas funkcionuoja kartu su daugybe kit baltym, kurie daro
tak chromosom gal integralumui bei dinamikai. Tarp j nemaai DNR reparacijoje ir rekombinancijoje dalyvaujani lstels komponent. Nustatyta, kad jie svarbs telomer replikacijai, apsaugai ir stabilumui.
Trumpjant telomerinei DNR arba sutrikus baltym komplekso funkcionavimui, telomeros
praranda apsaugin funkcij tampa nefunkcionaliomis telomeromis (angl. dysfunctional telomeres). Tai sukelia genomin nestabilum (pvz., aneuploidij).
4.5.7. Telomerazs savybs ir funkcijos

Telomeros atlieka ne tik apsaugin chromosom gal funkcij, bet ir utikrina, kad telomerins DNR galai vykstant replikacijai netrumpt. Apsaugant DNR galus nuo trumpjimo
tiesiogiai dalyvauja fermentas telomeraz. Telomeraz yra ribonukleoproteinas, sudarytas i
baltyminio subvieneto telomerazs atvirktins transkriptazs, TERT (angl. telomerase reverse transcriptase) ir
Telomeraz yra ribonukleoRNR molekuls, TER RNR (angl. telomerase RNA) (4.50pav.
proteinas, kur sudaro RNR
ir 4.51pav.). ie komponentai sudaro erdin telomeraz.
ir baltyminis subvienetas
Tokia telomeraz yra aktyvi in vitro, bet in vivo jos akty(subvienetai).
vumui reikalingi kiti ribonukleoproteininio komplekso
struktr einantys baltymai.
4.51pav. Telomerazs struktra. mogaus telomerazs holofermento komponentai (a) (World Journal
of Stem Cells, v.3, 2011, p.89); telomerazs RNR antrin struktra. Domenai paymti (b) (Annual Review
of Biochemistry, v. 75, p. 493, 2006)
222
4.52pav. Telomerazs veikimo mechanizmas (T.D.Pollard, W.C.Earnshaw, J.Lippincott-Schwartz. Cell

Biology, second edition, 2007)
223
MOLEKULIN BIOLOGIJA
TERT yra specializuota DNR polimeraz, sintetinanti DNR pagal RNR matric. TERT baltymas pirm kart buvo aptiktas Euplotes aediculatus pirmuonyje. TERT evoliucikai artimiausia
ne-LTR tipo retrotranspozon ir retron atvirktinms transkriptazms. Nuo kit atvirktini
transkriptazi TERT skiriasi tuo, kad turi prijungt TER RNR, kuri naudoja kaip matric sintezei;
taip pat tuo, kad sintetina pasikartojimus. Be polimerazinio aktyvumo, bdingo atvirktinms
transkriptazms, TERT pasiymi ir endonukleaziniu aktyvumu, dl kurio yra nuskeliama DNR,
esanti duplekse su telomerazs RNR. Manoma, jog is aktyvumas gali atlikti klaid taisymo
funkcij.
TER RNR turi sek, kuri yra komplementari ~1,5 telomerinio pasikartojimo. RNR ilgis vairus pvz., Tetrahymena 146nt, o Candida albicans net 1544nt. TER RNR nukleotid sekos
gerokai skiriasi tarp organizm, taiau antrins struktros turi konservatyvi domen. Auktesniuosiuose eukariotuose, palyginti su emesniaisiais, telomerazs RNR ilgesns, be to, jose yra
funkcionali sek, pvz., H/ACA dut (angl. H/ACA box), bdinga maoms branduollio RNR
(snoRNR), kurios dalyvauja brstant ribosominms RNR (4.51pav., b). i dut, taip pat kiti
RNR molekuls domenai yra svarbs telomerazs aktyvumui, brendimui ir vidulstelinei
lokalizacijai.
Be baltyminio subvieneto ir RNR, in vivo telomeraz yra susijungusi su keletu baltym ir
sudaro telomerazs holoferment (4.51pav., a). ie baltymai skirtinguose organizmuose yra
skirtingi. Jie, greiiausiai, veikia tarsi telomerazs holofermento komponentai, darydami tak jos procesyvumui, sTelomeraz yra atvirktin
veikai su telomer DNR arba viso telomerazs komplekso
transkriptaz, turinti matric
susidarymui.
telomerazs RNR.
Telomeraz prisijungia ties telomerins DNR 3 ikya
ir savo RNR sritimi, komplementaria telomeriniam pasikartojimui, sudaro su ja dupleks (4.52 pav.). Kaip pradmen
naudodama iky, telomeraz ilgina telomerins DNR 3gal. Kai susintetinamas telomerins
DNR pasikartojimas, telomeraz disocijuoja ir vl prijungia savo RNR molekul ties naujai susintetintos DNR galu taip, kad telomeriniam pasikartojimui komplementari telomerazs RNR sritis
galt bti vl kopijuojama fermento.
Kokiu bdu yra ilginamas telomerins DNR 5galas? Manoma, kad telomerazei pakankamai
pailginus telomerins DNR 3viengrandin iky, RNR polimerazs susintetina pradmen, kur
jau gali ilginti DNR polimerazs. Likus ply sujungia DNR ligazs.
Telomerazs vykdomas DNR gal ilginimas yra valdomas, kad nebt prijungta per daug
nukleotid sek. domu, kad telomerazs veikimas yra slopinamas, kai tik fermentas susintetina sutrumpjusi telomerin DNR iki pradinio ilgio. Manoma, kad telomerazei nustatyti, kokio
ilgio DNR sintetinti, padeda RAP1 baltymas, kuris prisijungia prie susintetintos DNR ties daug G
turiniais pasikartojimais kas ~1518 nukleotid por.
4.5.8. Telomer ilgio reguliavimas, senimas ir vys

Esminis skirtumas tarp kultroje augani normali lsteli ir vini lsteli yra tas, kad
normalios lstels pasidalija tam tikr apibrt kart skaii (tai vadinama lsteliniu senimu),
224
4.53pav. mogaus fibroblast telomer trumpjimas lstelms senstant. Lsteli, pasidalijusi 16

kart, chromosom vaizdas, gautas FISH (angl. fluorescence in situ hybridisation) analizs metodu (a);
lsteli, pasidalijusi >60 kart, chromosomos. Kaip zondas analizei naudota telomerinio pasikartojimo
DNR (b)
o vins lstels dalijasi neapibrt kart skaii (yra nemirtingos, angl. immortal). Ikelta
hipotez, kad lstel turi molekulin laikrod, kuris skaiiuoja, kada laikas nustoti dalytis, pasenti ir mirti. Replikacinio senimo (angl. replicative senescence) hipotezje teigiama, kad molekulinio laikrodio funkcij atlieka telomeros ir j ilgio utikrinimo mechanizmas lstelse.
Mechanizmo esm tokia: sulig kiekvienu nauju replikacijos ciklu telomer DNR sutrumpja
~50200bp. Kai telomeros tampa kritikai trumpos, lstels nustoja dalytis ir pereina pirmj mirtingumo faz, dar vadinam M1 faze (angl. mortality stage 1), arba Haifliko riba (angl.
Hayflick limit) (4.53pav., 4.54pav.). fenomen 1961m. aptiko Leonardas Haiflikas (Leonard
Hayflick), tyrindamas mogaus embrioninio audinio lsteles. Jis nustat, kad iki M1fazs mogaus embrioninio audinio lstels pasidalija ~6080 kart.
Perjimo M1faz signalu gali bti sutrumpjusi telomer kaip chromosom trki atpainimas ir j taisymo mechanizmo aktyvinimas (pvz., dalyvaujant baltymams p53, p16, p21).
Dl sutrumpjusi telomer aktyvinus DNR paaid taisymo mechanizm, lstels va
apoptozs keliu arba nustoja dalytis pereina jau mint lstelinio senimo faz (M1faz). Lstelinio senimo fazje lstel, prastu atveju, negrtamai pasitraukia i lstels ciklo. Ciklas stab-
4.54pav. Replikacinio senimo

hipotez
225
MOLEKULIN BIOLOGIJA
domas veikiant DNR paaid kontrols tak mechanizmams. Senos lstels bna metabolikai aktyvios. Toki lsteli savitas molekulinis ymuo lizosom hidrolaz galaktozidaz,
SA-Gal (angl. senescence-associated -galactosidase). Manoma, kad SA-bGal senose lstelse
yra daug dl sutrikusi lizosom funkcij. Taigi, lstels pasitraukimas i dalijimosi ciklo funkcionuoja kaip apsauga nuo mechanizm, kurie lemia vini lsteli atsiradim. Kitaip tariant, tai
yra navik slopinantis mechanizmas. Senim gali sukelti ne tik nefunkcionalios telomeros, bet
ir tam tikros DNR paaidos (pvz., sukeltos oksidacinio streso), tam tikr onkogen aktyvinimas.
Lsteli dalijimsi M1 fazje vl gali suaktyvinti virusiniai bei lsteliniai onkogenai, kit
gen mutacijos. Lstels vl pradeda dalytis, nepaisant to, kad j telomeros trumpos, kol pasiekia kit faz M2, arba krizs faz (angl. crisis phase). Krizs fazje lstelms bdingas genominis nestabilumas. Didioji dalis lsteli ioje fazje nustoja dalytis ir va. Taiau tam tikros
lstels igyvena ir dalijasi toliau. Tokioms lstelms bdinga aktyvi telomeraz arba kiti mechanizmai, utikrinantys telomer ilg, nors lsteli fenotip (vin) nulemia ne jie. Telomer
ilgio utikrinimo mechanizmai tampa svarbs tolesniam pakitusi lsteli dalijimuisi ir igyvenimui, t.y. lsteli piktybjimui. Taigi, telomerazs aktyvinimas krizs fazs metu gali lemti lsteli supiktybjim.
Replikacinio senimo hipotez patvirtina pakankamai eksperimentini duomen. Nustatyta, kad sergant genetinmis ligomis, kurios lemia ankstyv senim (pvz., Vernerio sindromu,
Hatinsono ir Dilfordo pirmalaikio senjimo sindromu,
21 chromosomos trisomija), telomeros trumpja greiiau.
mogaus organizme telomemogaus fibroblast linijos lstelse ekspresavus tiek akrazs yra aktyvios lytinse lstyvios telomerazs, kad ji galjo ilginti telomer galus,
telse ir neaktyvios daugelyje
fibroblast, palyginti su kontrolini lsteli, gyvenimo laisomatini lsteli.
kas pailgjo apie 200 generacij. Panas rezultatai gauti
tiriant ir daugel kit eukariotini lsteli kultr. Peli,
turini iveiklint TERT koduojant gen, palikuonys pasiymjo sutrikusia kaul iulp ir odos regeneracine funkcija. J pusamis (angl. halflife) ir viso
gyvenimo trukm buvo trumpesni, mutacijos efektas rykjo vlesnse kartose.
Vis dlto ne visoms somatinms lstelms bdinga neaktyvi telomeraz: pvz., naudojant
jautr telomer kartotini sek aptikimo metod, aktyvios telomerazs buvo atrasta kai kuriose hemapoetins sistemos lstelse, epidermio lsteli baziniame sluoksnyje, plauk folikul
lstelse, kai kuriose arnyno lstelse, kaul iulp lstelse.
Mutacijos, dl kuri sutrinka mogaus telomerazs sintez, sukelia tam tikras su lsteli
proliferacija susijusias ligas. Keli sistem sutrikimais pasiyminti kongenitin diskeratoz
(Dyskeratosis congenita) ypatinga tuo, kad sergant ia liga neatsinaujina prastai dideliu regeneraciniu potencialu pasiymintys audiniai oda, arnyno epitelis, kaul iulpai. Kongenitin
diskeratoz slygoja mutacijos telomerazs RNR arba su ia RNR susijungusiame baltyme diskerine. ia liga sergani pacient telomeros yra trumpesns nei sveik moni.
Telomerazs yra aktyvios daugelyje (>90%) vini lsteli. Vini lsteli telomeros
daniausiai yra trumpos, nuo kritinio sutrumpjimo jas apsaugo telomeraz. Piktybinio naviko
lstels, uuot dl DNR paaid aktyvinusios ties mechanizm, dalijasi toliau.
226
Pastaruoju metu intensyviai kuriami ir klinikai tiriami telomerazs slopikliai: telomerazs RNR sekai prieprasms (angl. antisense) RNR; dominuojantys neigiami TERT subvieneto mutantai; molekuls,
kurios neleidia susidaryti telomer galuose savitosioms struktroms kvadrupleksams; taip pat nedidels molekuls, slopinanios telomerazs aktyvum.
Telomer ilg lemia ne tik aktyvi telomeraz, bet ir daugelis genetini bei epigenetini
veiksni. Pvz., seno mogaus lsteli telomeros gali bti ilgesns negu jauno mogaus to paties tipo lsteli telomeros. Taip pat manoma, kad telomer ilgis nra vienintelis signalas, kokio
amiaus yra lstel ir kiek dar jai liko gyventi. Tolesni tyrimai atskleid, kad telomerazi aktyvumas nuolat kinta ir yra sudtingai valdomas lstels ciklo metu ne tik normaliose lstelse,
bet ir nuolat besidalijaniose lstelse (tai vadinama telomer homeostaze). Telomeros gali
laikinai bti susijungusios su baltym kepurmis (angl. capped telomeres), ir tada jos yra neprieinamos telomerazei, arba bti be baltym kepuri (angl. uncapped telomeres), ir tada jos
yra prieinamos telomerazei.
Gamtoje egzistuoja ir kitokie chromosom ilgio utikrinimo mechanizmai, kuriuose telomeraz nedalyvauja. Pvz., Diptera genties vabzdiai, tarp j ir vaisin musel Drosophila, neturi
funkcionalios telomerazs. Drosophila chromosomos neturi ir eukariot telomeroms prast
kartotini sek. J chromosom galuose yra daniausiai dviej tip retrotranspozonai HeTA ir TART. Veikiant retrotranspozonams, terpiamos pasikartojanios sekos ir taip utikrinamas
stabilus chromosom gal ilgis.
mogaus lstels taip pat pasiymi gebjimu utikrinti stabilius chromosom galus nenaudodamos telomerazs. Toks telomer ilgio utikrinimo mechanizmas yra vadinamas alternatyvuoju telomer ilginimu, ALT (angl. alternative lengthening of telomeres). domu, kad
telomeros iuo atveju taip pat yra ilginamos prijungiant telomerinius pasikartojimus, taiau
ilginimo mechanizmas kitoks.
227
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Analitiniai klausimai ir udaviniai

1. Kuo rmsi Mezelsonas ir talis rodydami, kad DNR biosintez vyksta pusiau konservatyviuoju bdu?
2. Nubraiykite pausiau konservatyviuoju ir konservatyviuoju bdais vykstanios replikacijos schemas.
3. Kokia daniausia prieastis, dl kurios replikatyvins DNR polimerazs sintetinam
grandin jungia nekomplementarius nukleotidus?
4. Kokios yra DNR polimerazi aktyviojo centro delno domeno aspartat funkcijos per
kataliz?
5. greitai augani ir besidalijani bakterij kultr pripilama radioaktyv izotop (H3)
turinio timidino (DNR biosintezs pirmtako). Po keli sekundi augimas sustabdomas
(perkeliant kultr 4C temperatr). Iskiriama bakterij DNR, o H3 izotop turini
DNR tankis tiriamas centrifuguojant cezio chlorido tirpalo koncentracijos gradiente. I
ko bus sudaryta i DNR?
Paymkite teising atsakym:
1. Daugiausiai i ilg DNR ir nedidels dalies trump DNR molekuli.
2. Daugiausiai i trump DNR ir nedidels dalies ilg DNR molekuli.
3. Vien tik i radioaktyv izotop turini deoksinukleotid.
4. I ilg DNR molekuli.
6. Kodl DNR III polimeraz yra tinkamesn replikuoti E. coli chromosom nei DNR
Ipolimeraz?
7. Kuo panas ir kuo skiriasi replikacijos procesai bakterijose ir eukariotinse lstelse?
8. Kokia yra TLS DNR polimerazi biologin reikm?
9. Js atradote nauj archj Studentis lasiensis, kurios genomas yra ~1Mb dydio. Iklte
hipotez, kad genome gali bti daugiau nei viena replikacijos pradios sritis. Kaip tai
eksperimentikai patikrinsite?
10. Trumpai apibdinkite, kaip apsisaugoma nuo prielaikins replikacijos iniciacijos bakterij ir eukariot organizmuose?
228
V. RNR BIOSINTEZ (TRANSKRIPCIJA)

Biologin informacija, ukoduota DNR nukleotid sekoje, pirmiausiai raoma RNR molekul, kuri sintetinama per transkripcijos proces (lot. transcriptio perraymas).
Kaip ir DNR, taip ir RNR molekul yra linijinis polimeras,
Transkripcija tai procesas,
sudarytas i monomer ribonukleotid (rGMP, rAMP,
kurio metu pagal matric DNR
rCMP, rUMP), sujungt tarpusavyje fosfodiesteriniais
grandin sintetinama jai komryiais.
plementari RNR molekul.
Chemine sudtimi RNR molekul neymiai skiriasi nuo
DNR (r. vad), o genetins informacijos saugojimo principas nukleotid seka RNR molekulje yra toks pats,
kaip ir DNR molekulje. Taiau, nors sudarytos i panai struktrini komponent, RNR molekuls erdvin struktra labai skiriasi nuo dvigrandins DNR spirals struktros. Sintetinamos
RNR yra linijins, vliau jos gyja vairias erdvines struktras, kurios lemia RNR molekuli funkcijas.
Per transkripcij kaip matrica
Per transkripcij susintetinama RNR grandin yra idensintezei naudojama grandin,
tika vienai i dviej DNR duplekso grandini koduokomplementari koduojaniajai
janiajai DNR grandinei. RNR molekuls nukleotid seka
DNR grandinei, vadinama maskiriasi nuo koduojaniosios DNR grandins nukleotid setricine DNR grandine.
kos tuo, kad joje vietoje timidilo rgties (TMP) yra uridilo
rgtis (UMP).
5.1. RNR transkripcijos bendrieji bruoai

RNR transkripcijos procesas pagrindiniais bruoais panaus DNR sintez. Transkripcija prasideda, kai fermentas, sintetinantis RNR, RNR polimeraz, prisijungia prie savitosios reguliacins DNR srities, vadinamos promotoriumi (angl. promoter) (5.1pav.). Promotorius daniausiai isidsts prie struktrin gen. Struktriniai genai koduoja baltymus ir RNR.
Per transkripcijos iniciacij DNR duplekso grandins iskiriamos, o viena i grandini (matricin) naudojama kaip matrica RNR sintezei.
Kaip ir per DNR sintez, RNR molekuls sintetinamos pagal komplementarumo nukleotidams DNR matricoje princip. Ribonukleozidtrifosfatas (rNTP), komplementarus nukleotidui
DNR matricoje, kovalentiniu ryiu jungiamas prie sintetinamos RNR grandins 3OHgalo. Reakcijos metu atsipalaiduoja pirofosfatas, PPi (5.1pav.). Reakcija negrtama, nes atsipalaidavs pirofosfatas yra hidroliTik viena i dviej DNR grandizuojamas pirofosfatazs iki neorganinio fosfato (Pi). Taigi,
ni yra transkribuojama.
reakcijos metu vyksta nukleotidilgrups pernaa.
229
MOLEKULIN BIOLOGIJA
RNR transkripcija tam tikrais bruoais skiriasi nuo DNR replikacijos:

zz kitaip nei naujai sintetinamos dukterins DNR grandins, sintetinama RNR molekul nesudaro itisinio
duplekso su matricos DNR. Nedidelis dupleksas tarp
RNR ir DNR grandini susidaro tik sintezs vietoje
(transkripcijos burbule), o likusi susintetinta RNR
molekul istumiama i fermento;
zz susintetintos RNR molekuls nra tokios ilgos kaip genomins DNR molekuls, sintetinamos per replikacij.
Promotorius tai DNR nukleotid seka, aktyvinanti transkripcij. RNR polimeraz prijungiama
prie promotoriaus ir pradeda
RNR sintez.
Promotoriaus sritis DNR molekulje yra netoli pirmojo transkribuojamo DNR nukleotido
(5.2pav.). Nuo transkripcijos pradios srities RNR polimeraz juda per DNR matric, sintetindama RNR, kol pasiekia terminacijos srit.
5.1pav. RNR sintezs schema (G. Karp. Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments, fifth edition, 2008)
230
Transkribuojama sritis nuo promotoriaus (nuo +1) iki

Transkripcija vyksta 53
terminatoriaus vadinama transkripcijos vienetu. Transkryptimi.
kripcijos vienet gali sudaryti vienas transkribuojamas
struktrinis genas (tokie daniausiai yra eukariot gen
transkriptai), taip pat gali sudaryti daugiau transkribuojam struktrini gen (prokariot
gen transkriptai). Nukleotid sekos, isidsiusios prie pirmj transkribuojam nukleotid,
vadinamos priesrovinmis (angl. upstream), o sritys, esanios u pirmojo transkribuojamo nukleotido, pasrovinmis (angl. downstream) sritimis (5.2pav.).
DNR sekos daniausiai ymimos uraant tik koduojanij DNR sek. Nukleotidas, ties kuriuo prasideda transkripcija, ymimas +1. Nuo io nukleotido skaiiuojami transkribuojamo geno nukleotidai. Jie ymimi pliuso (+) enklu. Nukleotidai, esantys prie pirmj transkribuojam nukleotid, ymimi minuso () enklu ir numeruojami didjania tvarka kair nuo +1 nukleotido (5.2 pav.). Nulins
(0) pozicijos nra.
Didij dal lstelse susintetint RNR molekuli (transkript) sudaro gen, koduojani
baltymus, transkriptai informacins RNR molekuls, iRNR (angl. messenger RNA, mRNA). iRNR
molekuls naudojamos kaip matricos baltym biosintezei ribosomose.
Maesn transkript dal sudaro vairios kitos RNR molekuls (tRNR, rRNR, snRNR, snoRNR,
miRNR, siRNR ir kt.), kurios nekoduoja baltym, bet atlieka daugel kit funkcij lstelje.
RNR molekuls, sintetinamos transkripcijos metu ir i
karto po transkripcijos, vadinamos pirminiais transkripTranskripcija tai pirmoji genetais (pre-RNR). Lstelse greitai vyksta j brendimas.
tins informacijos raikos (gen
Brendimo metu pirminiai transkriptai modifikuojami. Taip
raikos) pakopa ir svarbiausias
susidaro subrendusios iRNR, rRNR, tRNR ir kitos RNR.
gen raikos valdymo taikinys.
Veikiant reguliaciniams baltymams, nustatoma, ar vyks
tam tikro geno transkripcija ar ne. Daniausiai toks ir yra
transkripcijos valdymo principas. Taigi, transkripcija daniausiai valdoma iniciacijos etape. Taiau transkripcijos proces sudaro keli etapai, todl yra galimyb valdyti transkripcij ir juose.
5.2pav. Transkripcijos vienetas
231
MOLEKULIN BIOLOGIJA
5.2. RNR polimerazi (RNAP) struktra ir savybs

Visi lsteliniai organizmai transkripcijai pasitelkia specializuotus baltymus nuo DNR priklausomas RNR polimerazes, RNAP (angl. RNA polymerases). Bakterij, archj, eukariot
RNR polimerazs yra konservatyvios struktros baltymai, atliekantys panaias funkcijas. Jos priklauso daugiasubvienetini RNAP eimai (angl. multisubunit RNAP family). Manoma, kad RNR
polimerazs kilo i vieno bendro protvio. 2006m. Roderiui Kornbergui (Roger Kornberg) skirta medicinos Nobelio premija u eukariot RNR IIpolimerazs ir transkripcijos tyrimus. 2008m.
pirm kart nustatyta archjos (S.sulfolactarius) RNR polimerazs erdvin struktra.
Bakterijose ir archjose vis gen transkripcijai pasitelkiama viena RNR polimeraz. Eukariot lstelse yra 47 RNR polimerazs, kurios dalyvauja skirting grupi gen transkripcijoje.
RNAP sudarantys subvienetai skirstomi kelias funkcines grupes:
1) subvienetai, reikalingi fermento susimontavimui;
2) subvienetai, kurie sudaro aktyvj centr ir prijungia bei idsto DNR bei RNR molekules;
3) pagalbiniai subvienetai.
Bazinms RNAP funkcijoms utikrinti utenka pirmj dviej grupi. Pagalbiniai subvienetai suteikia pavirius papildomoms sveikoms su transkripcijos veiksniais.
Archj ir eukarot RNAP turi subvienet, homologik bakterij subvienetams. Tai yra polimerazi erdiniai subvienetai, kurie sudaro fermento pagrind ir aktyvj centr (5.3pav. ir
5.1lentel). Bakterij, archj ir eukariot RNR polimerazs yra dideli fermentai, kuri molekulin mas gali siekti ~500000Da. Pvz., eukariot DNR I, II, IIIpolimerazes sudaro net 1217 sub
vienet. Bakteriofagams utenka ymiai maesni ferment. Kai kuri j dydis atitinka, pvz.,
penktadal eukariotini RNR polimerazi dydio.
Nuo DNR priklausomos RNR polimerazs utikrina ias funkcijas:
zz rNTP jungim;
zz fosfodiesterinio ryio susidarym;
zz pirofosfato atpalaidavim;
zz fermento perstmim matricos atvilgiu;
zz sintezs tikslum;
zz kitas funkcijas.
5.3pav. Bakterij, archj ir eukariot RNR polimerazi struktrin organizacija. Schemose tomis
paiomis spalvomis paymti konservatyvs (erdiniai) subvienetai
232
5.1lentel. Bakterij, archj ir eukariot RNAP baltyminiai subvienetai1

Bakterij
RNR Pol
Archj
RNR Pol
Eukariot
RNR PolII
Eukariot
RNR PolIII
Eukariot
RNR PolI
Augal
RNR PolIV
Augal
RNR PolV
subvienetas
Rpo1 (RpoA)
RPB1
C160
A190
NRPD1
NRPE1
subvienetas
Rpo2 (RpoB)
RPB2
C128
A135
NRPD/E2
NRPD/E2
subvienetas
Rpo3 (RpoD)
RPB3
AC40
AC40
NRB3
RPB3
subvienetas
Rpo11 (RpoL)
RPB11
AC19
AC19
NRB11
RPB11
subvienetas
Rpo6 (RpoK)
RPB6
RPB6
RPB6
NRB6
NRB6
Rpo5 (RpoH)
RPB5
RPB5
RPB5
NRB5
NRPE5
Rpo8 (RpoG)
RPB8
RPB8
RPB8
NRB8
NRB8
Rpo10 (RpoN)
RPB10
RPB10
RPB10
NRB10
NRB10
Rpo12 (RpoP)
RPB12
RPB12
RPB12
NRB12
NRB12
Rpo4 (RpoF)
RPB4
C17
A14
NRPD/E4
NRPD/E4
Rpo7 (RpoE)
RPB7
C25
A43
NRPD7
NRPE7
Rpo13 (kai
kurios)
RPB9
C11
A12
NRPD9b
RPB9
5.3. Transkripcija prokariotuose

5.3.1. Bakterij RNR polimerazs
Bakterijose viena RNR polimeraz sintetina visas RNR: iRNR (informacines RNR), tRNR (pernaos RNR), rRNR (ribosomines RNR) bei kitas RNR molekules. Bakterijoje yra apie 7000 RNR
polimerazs molekuli. Vienu metu transkripcijoje dalyvauja ~20005000 fermento molekuli. Daugiasubvienetini RNAP eimoje bakterij RNR polimerazs yra maiausi (~400000Da) fermentai.
Bakterij polimerazje iskiriaBakterij RNR polimerazs erdin dalel (~400kDa)
mi du struktriniai ir funkciniai
sudaro penki polipeptidai: subvienetas, subvienevienetai erdin dalel ir
tas, du vienodi subvienetai, I ir II, bei subvienetas
holofermentas.
(5.3pav.). Stechiometrin erdins dalels RNAP sudt galima urayti taip: 2.
5.3.2. Bakterij RNR polimerazs erdin dalel

Bakterij RNAP erdins dalels erdvin struktra primena krabo nyples (angl. crab claw)
(5.5pav., a). Tokia katalizini subvienet struktra pasiymi ir archj bei eukariot RNAP, taiau pastarosios dar turi papildom struktrini element.
Du nypli iuptuvai (angl. pincer) sudaro ply (angl. cleft), kurio viduje yra kanalas
(5.5pav., b). Kanalo skersmuo 2527. j patenka ir jame talpinama DNR. Pagrindinis kana Pagal: F. Werner, D. Grohmann. Nat Rev Microbiol, 2011.
233
MOLEKULIN BIOLOGIJA
las pereina RNR ijimo kanal. Plyio vidus yra iklotas teigiamai krautomis aminorgi
liekanomis. RNR polimerazs iorje gausu neigiamai kraut aminorgi liekan.
Plyio gale yra RNR polimerazs aktyvusis centras. Aktyvj centr supanios baltym sritys
yra konservatyvios vairi organizm RNR polimerazse. Mg2+ jonus ria trys asparto (Asp) aminorgi liekanos, kurios yra visikai konservatyviame tarp RNR polimerazi aminorgi
motyve NADFDGD. is motyvas yra didiausiame subvienete. Motyvo asparto aminorgi mutacijos yra letalios: mutacij turintis fermentas sudaro kompleks su DNR, taiau nepasiymi kataliziniu aktyvumu (negali sintetinti RNR). Vienas Mg2+ jon yra nuolat prisijungs
prie aktyviojo centro, o kitas, greiiausiai, yra atneamas su substratais. Didiausias molekuls
subvienetas sudaro vien iuptuv ir formuoja dal plyio (5.5pav., b). Didieji RNAP ir subvienetai sudaro ~60% erdins dalels molekulins mass ir visi kartu suformuoja katalizin
fermento centr.
RNR polimeraz nra statika struktra. Nors ir subvienet pagrindins dalys sudaro gana nejudri RNR polimerazs erd, fermento struktroje yra judri element. subvieneto dalyje, esanioje
prieais iuptuvus, yra elementas, keiiantis savo padt, votuvas (5.5pav., b) (angl. subunit flap).
Manoma, kad jis udaro kanal, kuriuo juda i fermento ieinanti sintetinama RNR. Kai susintetintoje
RNR susidaro terminacijos segtukai, kanalas atsidaro, transkriptas disocijuoja i RNAP, vyksta transkripcijos terminacija.
subvieneto, kuris formuoja vien RNAP iuptuv, struktroje yra gnybtas (angl. clamp).
Kitas judrus RNAP elementas yra nedidelis subvieneto aminorgi motyvas, vadinamas vairu
(angl. rudder). io elemento funkcija, manoma, yra fiksuoti RNAP kanale matricin DNR grandin ir neleisti jai susijungti su istumtja koduojanija grandine (5.5pav., b). subvieneto vidinje pusje yra
rifampicino kien. ia prisijungia antibiotikas rifampicinas (ir kiti rifamicinai) ir slopina transkripcijos
iniciacij. Rifampicinas utveria RNR keli DNR-RNR hibride, kai RNR tampa 23nt ilgio.
5.4pav. Bakterij RNR polimerazs sudtis ir subvienet funkcijos
234
RNAP molekulje yra dar vienas kanalas antrinis kanalas (angl. secondary chanel), kurio
forma primena piltuv. iuo kanalu laisvi rNTP patenka RNR polimerazs aktyvj centr. Kanalo skersmuo ~1012. Panaus kanalas rastas ir archj bei eukariot RNR polimerazse. Antrinio kanalo pamate (subvienete) yra du judrs RNAP elementai BHspiral (angl.
bridge helix) ir TLkilpa (angl. trigger loop) (5.5pav., b). ie struktriniai elementai labai svarbs komplementari nukleotid atrankai aktyviajame centre, katalizei ir perstmimui (angl.
translocation).
5.5pav. Bakterij RNR polimerazs struktra. Thermus aquaticus RNR polimerazs erdins dalels (A)
(kairje) ir Thermus aquaticus RNR polimerazs holofermento (deinje) erdvins struktros, nustatytos
didels skyros rentgenostruktrine analize. 12 iuptuvai; 3 plyys; rutuliukas ymi Mg2+ jon (a);
bakterij RNR polimerazs holofermento struktrin schema. Elementai paymti atskirai. vaigdut
ymi katalizin centr (b) (Trends in Microbiology, v.16, p.126, 2008)
235
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Du vienodi bakterins RNR polimerazs subvienetai I ir II yra isidst u plyio (5.5pav.,

a, b). subvienet dimeras lemia dviej didij RNAP ir subvienet isidstym. subvienetas sveikauja su subvienetu, o subvienetas sveikauja su subvienetu. subvienet
sudaro du domenai: Ngalinis domenas (D), kuris yra atsakingas u sveik su individualiais
subvienetais, ir Cgalinis domenas (CTD), kuris yra atsakingas u subvieneto sveik su promotori DNR, taip pat u sveik su aktyvikliais bei represoriais, prisijungusiais prie promotori.
T4bakteriofagui patekus eimininko (E.coli) lstel, kartu paklivantis fago fermentas ADP riboziltransferaz ribozilina vieno i dviej RNAP subvienet arginino aminorgties liekan. Taip sumainamas RNAP atrankumas gen promotoriams. Tai liudija, kad subvienetas reikalingas atrankiam
promotoriaus atpainimui.
Netoli RNAP iuptuvo, kur formuoja subvienetas, yra isidsts subvienetas. Nustatyta,
kad Taq RNAP molekulje subvienetas apsiveja apie subvieneto Cgal ir taip, manoma,
padeda pritvirtinti subvienet prie likusios fermento dalies. io maiausio RNR polimerazs
subvieneto funkcija nra iki galo iaikinta. Manoma, kad jis galt pasiymti aperon
savybmis.
Bakterij RNAP sudtyje esaniame subvienete nuBakterij (sigma) veiksnys
statytas Zn2+ suriimo centras trys konservatyvios cistai promotori atrankumo
teino aminorgi liekanos vadinamasis cinko pirto
2+
veiksnys. Bakterij RNRPol
(angl. zink finger) motyvas (5.5pav., b). Manoma, kad Zn
erdin dalel+veiksreikalingas susidaryti fermento erdvinei struktrai ir tam
nys=RNRPol holofermentas.
tikroms RNAP funkcijoms.
Taip pat RNAP paviriuje nustatyta ~250 H2O molekuli.
RNR polimerazs erdin dalel, nors ir pasiymi kataliziniu aktyvumu, negali pradti RNR sintezs ties genais. Tam reikia papildomo, atrankum promotoriams lemianio baltymo (sigma) veiksnio. Kartu su veiksniu erdin RNAP dalel
sudaro holoferment.
RNR polimerazi katalizuojama reakcija panai DNR polimerazi katalizuojam reakcij.
Skirtumas yra tas, kad RNR polimerazi reakcijoje dalyvauja ne dNTP, bet rNTP (5.1pav.). Pirmieji RNR jungiami nukleotidai paprastai yra purinai. Pirmasis RNR molekuls 5gale esantis
ribonukleotidas yra ribonukleozidtrifosfatas (ppp5NpNpN3). Substratai rNTP jungiami
substrat suriimo srityje (i+1). Sintetinamos RNR 3galas isidsto i srityje (5.7pav., b).
5.6pav. Transkripcijos
burbulas
236
RNR sintez vyksta transkripcijos burbule (angl. transcription bubble). Jame DNR grandins yra laikinai iskirtos (5.6pav.). Transkripcijos burbulas turi dvi viengrandins DNR atkarpas
ir jas ribojanias dvi dvigrandins DNR atkarpas. Viengrandini ir dvigrandini DNR fragment
susijungimo takas yra vadinamas akuts susikirtimo taku (angl. fork junction).
Vykstant RNR sintezei, transkripcijos burbulas juda kartu su polimeraze, o sintetinamos RNR
grandin ilgja. RNR polimeraz iskiria DNR duplekso grandines priekyje, o u transkripcijos
burbulo vl susidaro DNR dupleksas. Tai yra daug energijos
reikalaujantis procesas. Energija gaunama jungiant rNTP
DNR-RNR hibridas yra trumpas,
substratus RNR sintezs metu.
sintezs metu jis susidaro vis i
Transkripcijos burbulo dydis yra ~ 121 nukleotid
naujo, o RNR transkriptas atsi(5.6pav.). DNR dupleksas, patenkantis RNAP, ir i jos ieipalaiduoja kaip laisva molekul.
nantis DNR dupleksas, sudaro ~ 90 kamp. RNAP viduje
yra ~9 DNR-RNR hibrido nukleotid poros ir ~9 DNR grandins nukleotidai.
RNAP sintetina RNR i 5galo 3gal. Reakcijos greitis yra ~2070nt/s 37C temperatroje. Klaid danis 1 klaida/10000100000nt. Bakterijose transkripcijos greitis madaug sutampa su transliacijos greiiu (15ar/s).
Sintezs pradioje pirmasis ir antrasis nukleotidai, ypa
RNR polimerazs sintetina RNR
pirmasis, turi bti tiksliai idstyti fermento aktyviajame
molekul de novo. Kitaip nei
centre. RNAP sveikauja su nukleotidais daugeliu tarpmoDNR polimerazms, iems ferlekulini ryi (5.7pav., a, b).
mentams pradmens nereikia;
RNAP elementai TLkilpa ir BHspiral svarbs pirmojo
reikia tik DNR matricos.
nukleotido idstymui aktyviajame centre (5.6pav., b). Kai
aktyviajame centre prisijungia komplementarus nukleoti-
5.7pav. Bakterij RNR polimerazs aktyviojo centro struktra. Pagrindiniai Thermus thermophilus
RNAP aktyviojo centro struktriniai elementai. D743, D741, D739 subvieneto konservatyvios asparto aminorgi liekanos. Raudona spalva paymtas laisvas rNTP, alia jungtas rNTP, violetiniai rutuliukai Mg2+ jonai. Kitos subvieneto aminorgi liekanos paymtos ruda spalva, subvieneto
pilka (a); tarpmolekuliniai ryiai RNAP aktyviajame centre (b) (Trends in Microbiology, v.16, p.126, 2008)
237
MOLEKULIN BIOLOGIJA
das, TLkilpa netiesiogiai stimuliuoja kataliz, susidaro fosfodiesterinis ryys. Tuomet TLkilpa
pakeiia konformacij taip, kad kitas nukleotidas nepaklit aktyvj centr, ir polimeraz
pasislenka sintetinamo DNR-RNR duplekso atvilgiu per vien padt (vyksta translokacija).
Kai RNR jungiamas nekomplementarus nukleotidas, vyksta transkripcijos pauz. Prie tai
apraytas procesas yra viena i transkripcijos pauzi ri. RNR polimeraz grta atgal (angl.
backtracking). RNR polimerazei judant atgal, susintetinto transkripto 3 galas istumiamas i
aktyviojo centro per fermento antrin kanal (piltuv), kuriuo patenka nukleotidai. Transkripto
3galui umus kanal, NTP nebepatenka aktyvj centr, todl fermentas sustoja. Atsipalaidavus transkripto gal pasiekia sklimo veiksniai, kurie bna prisijung netoli kanalo (pvz.,
GreA ir GreB baltymai bakterijose, TFIIS veiksnys eukariotuose). Jie skatina silpn nukleazin RNR polimerazs aktyvum, ir istumtasis galas nuskeliamas. Nusklus istumtj RNR gal,
substratai vl patenka aktyvj centr, trankripcija tsiama toliau.
5.3.3. Bakterij RNR polimerazi transkripcijos ciklas

Transkripcijos procesas skirstomas kelet etap:
zz surandamas promotorius (promotoriaus atpainimas);
zz prasideda RNR sintez (iniciacija);
zz RNR polimeraz sintetina RNR molekul (elongacija);
zz pasiekusi terminacijos signal, transkripcija sustoja (terminacija).
DNR promotoriaus atpainimas (angl. promoter engagement). Bakterij RNR polimerazs holofermentas, kurio sudtyje yra veiksnys, atlieka promotoriaus atpainimo funkcij
(5.8 pav.). veiksnys atrankiai jungiasi prie tipini promotoriaus sek. Dl ios sveikos ties
promotoriaus 10 sritimi iskiriamos DNR grandins. Susidaro transkripcijos burbulas.
Promotori atpasta RNR polimerazs holofermentas erdin RNAP dalel su vienu i
veiksni. Vyksta grtamasis RNAP prisijungimas prie dvigrandins DNR promotoriuje. Susidaro udarasis RNAP ir promotoriaus DNR kompleksas, RPc (5.8pav.).
Fermentas udengia promotoriaus srit ~nuo 50 iki +6 nukleotido. ioje srityje DNR apsaugota nuo Ideoksiribonukleazs (IDNazs) ir hidroksilo radikal poveikio. RPc komplekse DNR
grandins yra susijungusios dupleks, transkripcijos burbulas dar nra susidars. veiksnio
struktrinis elementas 3.2kilpa isidsto RNAP pagrindiniame kanale, kur yra fermento aktyvusis centras (5.5pav., b). iame transkripcijos etape DNR nra idstyta fermento kanale, ji yra
fermento iorje (5.8pav.). Toliau veiksnys iskiria DNR grandines promotoriaus 10srityje
(~11+2). Susidaro atvirasis RNAP ir promotoriaus DNR kompleksas, RPo (5.8pav.). E.coli
70veiksnyje nustatytos bent trys konservatyvios aromatini aminorgi liekanos, svarbios
promotoriaus DNR iskyrimui. Jos, greiiausiai, prisijungia prie koduojaniosios grandins
10srityje. Pirmiausiai iskiriama promotoriaus A ir T nukleotid pora 11padtyje. Iskyrimui
nereikia ATP hidrolizs. Manoma, kad ilumini virsm ir trankripcijos komplekso vidins energijos pakanka iam procesui.
238
Tuo pat metu ir RNAP vyksta erdvins transformacijos. ~ 20 bp DNR, esanti prie +1, idstoma RNAP fermento kanale, kur yra aktyvusis centras (5.8pav.). Iskirtos DNR grandins
(transkripcijos burbulas) apima 11+2 srit ir yra pagrindiniame fermento kanale. +1 matricos
nukleotidas tiksliai idstomas aktyviajame centre. Komplementars rNTP idstomi pagal matricos +1 ir +2 nukleotidus.
Iniciacija. Prasideda sintez. Transkripcijos kompleksas virsta transkripcijos iniciacijos
kompleksu, RPinit (5.9pav.). Per iniciacij RNR polimeraz jungia RNR pirmuosius nukleotidus. Ji lieka prisijungusi prie promotoriaus, kol nesusintetinami pirmieji ~9 nukleotidai. DNR
pdsak analizs (angl. footprint analysis) metodu nustatyta, kad sintetindama transkript,
RNR polimeraz beveik nejuda DNR atvilgiu. Perjim i iniciacijos fazs sintezs faz stabdo
nutrkstamoji iniciacija (angl. abortive innitiation). Nutrkstamosios iniciacijos metu RNAP,
nedisocijuodama nuo matricos, sintetina trumpus (~710nt) transkriptus, atpalaiduoja juos,
bet nenukrinta nuo matricos, po to pradeda RNR sintez i naujo.
Iniciacijos etapas pasibaigia, kai fermentas susintetina ilgesn nei 10nt transkript. Tai sukelia veiksnio disociacij i holofermento. Disocijavus veiksniui, vyksta RNR polimerazs
atsilaisvinimas nuo promotoriaus (angl. promoter escape).
Disocijavus veiksniui, RNAP struktroje vyksta pokyi, galinani j palyginti lengvai
judti per DNR. Kartu fermentas sudaro su DNR labai tvirt kompleks, kuris gali vykdyti pro-
5.8pav. Bakterij RNR polimerazs transkipcijos ciklas: promotoriaus atpainimas ir udarojo bei
atvirojo komplekso susidarymas. Skaiiais paymtos promotoriaus DNR padtys transkripcijos pradios nukleotido atvilgiu (Trends in Microbiology, v.16, p.126, 2008)
239
MOLEKULIN BIOLOGIJA
cesyvi sintez. Kol veiksnys tvirtai prisijungs prie promotoriaus, matricos DNR negali laisvai
judti, ji suspaudiama (angl. scrunching) pagrindiniame kanale ir u jo (5.9pav.). RNR judti
trukdo ir kanale esanti veiksnio 3.2kilpa. Tik susintetinus trump (~>10nt ilgio) transkript, transkripcijos iniciacijos komplekse dl susikaupusios vidins energijos suyra ryiai tarp
ir DNR. disocijuoja, o RNR polimeraz atsiskiria nuo promotoriaus. Pastarj met tyrimais
nustatyta, kad veiksnys elongacijos metu gali ir nedisocijuoti nuo erdins dalels. Tokiu
atveju pakinta tik veiksnio srii, kurios trukdo polimerazei sintetinti RNR, 3.2srities ir 4
srities, sveika.
Elongacija. Visuose anksiau mintuose etapuose RNAP nebna statika struktra, judrieji
jos elementai keiia savo padtis. Dl vykstani erdvini pokyi RNAP gali palyginti lengvai
judti ir sintetinti RNR.
Transkripcijos elongacijos kompleksas, RPelong, arba TEC (angl. transcription elongation
complex), palieka promotori ir pradeda vykdyti procesyvi RNR sintez (5.9pav.). Fermento
iuptuvai udaro kanal, kuriame yra DNR ir sintetinti pradta RNR molekul. RNAP-DNR-RNR
kompleksai yra labai stabils daugelis TEC kompleks nedisocijuoja net esant 1M KCl 65C.
Tokius trinarius RNAP-DNR-RNR kompleksus galima iskirti i lsteli.
Per transkripcijos elongacij tiek transkripcijos burbulo dydis, tiek DNR-RNR duplekso ilgis ilieka daugiau ar maiau tokie pat. Vykstant RNR sintezei, DNR duplekso nukleotid poros prie polimeraz ir u jos iskiriamos ir vl susijungia sinchronikai. RNR sintez vyksta, kol
pasiekiama terminacijos sritis. Jeigu fermentas disocijuoja nuo DNR anksiau, nei pasiekiama
terminacijos sritis, transkripcija nutrksta.
Per elongacij transkripcijos elongacijos kompleksas, veikiant cis ir trans veiksniams, yra
ltinamas (angl. pause) arba sustabdomas (angl. arrest). Dl pauzi signal transkripcijos elongacijos kompleksas virsta i greitai sintetinanio komplekso alternatyvios konformacijos kompleksu, kuriame RNR sintezs greitis gali bti slopinamas 102104 eilmis. Sustabdytas transkripcijos elongacijos kompleksas grta atgal ir gali tsti sintez toliau.
Pauzs gali veikti kaip saviti reguliaciniai signalai, kurie reikalingi RNAP sveikai su reguliacinmis
molekulmis. Toki transkripcijos pauzi pavyzdiu gali bti pauzs, susidaranios dl plauk segtuk
RNR struktr E.coli ir S.typhimurium aminorgi biosintezs gen transkript lyderinse sekose.
Ties plauk segtuku, transliuodamos lyderin sek ir suardydamos segtuk, ustrigusi RNR polimeraz ilaisvina ribosomos. Individualios RNR polimerazi molekuls pasiymi skirtingomis savybmis
veikti transkripcijos pauzes.
Kai transkripcijos elongacijos kompleksas palieka promotori, prie jo gali prisijungti kitas
RNAP holofermentas. Proces, vykstani per iniciacij, greitis lemia, kaip greitai bus toliau
ilginama sintetinti pradta RNR ir kaip greitai RNAP paliks uimt promotori (angl. promoter
clearance), kad prie jo galt prisijungti kita RNAP holofermento molekul. Proces greit nulemia transkripcijos komplekso komponent tarpusavio sveika, o kai kuriais atvejais takos turi ir papildomi veiksniai.
RNR polimerazs nebegali
Pvz., RNR sklimo veiksniai GreA ir GreB baltymai in vitro
vl ilginti atsipalaidavusi
stimuliuoja RNAP atsilaisvinim nuo kai kuri promotori,
transkript.
vykdydami nutrkstamosios iniciacijos proces.
240
5.9pav. Bakterij RNR polimerazs transkipcijos ciklas: iniciacija ir elongacija. Skaiiais paymtos
promotoriaus DNR nukleotid padtys (Trends in Microbiology, v.16, p.126, 2008)
Terminacija. Terminacija vyksta, kai RNAP prieina savituosius terminacijos signalus, disocijuoja i transkripcijos komplekso ir RNR sintez nutrksta. Terminacijos signalai daro tak
transkripcijos komplekso stabilumui. Dl j veikimo kompleksas disocijuoja per kelias sekundes. Kai kuriuose terminatoriuose gali bti papildom reguliacini signal, galinani RNAP
tsti transkripcij (t. y. vykdyti antiterminacij). Transkripcijos terminacij taip pat gali vairiais
bdais valdyti (aktyvinti arba slopinti) baltyminiai veiksniai.
5.3.4. Bakterij promotori atpainimas

erdin RNAP dalel pasiymi nedideliu giminingumu (angl. affinity) DNR molekulei. Prisijungus erdinei RNAP, DNR molekulje nevyksta joki pokyi. Tokios prisijungimo sritys vadinamos silpnomis RNAP prisijungimo sritimis.
Prisijungs prie erdins RNAP, veiksnys esmingai pakeiia jos giminingum DNR molekulei. veiksnys sveikauja su erdine RNAP dalele, sudarydamas ryius su jos ir subvienetais
5.10pav. Bakterij
70eimos transkripcijos veiksni struktra
(J.D.Watson, T.A.Baker,
S.P.Bell, A.Gann, M.Levine,
R.Losick. Molecular Biology
of the Gene, seventh edition, 2013)
241
MOLEKULIN BIOLOGIJA
(5.5pav.). veiksnys, prisijungs prie erdins RNAP, labai

veiksnio sudtyje esantys
padidina RNAP giminingum promotori DNR. Tiesa,
konservatyvs motyvai sveiRNAP asociacijos su vairiais promotoriais konstantos gali
6
12
kauja su savitosiomis sritimis
svyruoti nuo 10 iki 10 .
promotoriaus DNR; i sveika
Sveikoje su promotoriumi taip pat dalyvauja ir RNR
nulemia RNAP isidstym
polimerazs subvienetai. Sritys, su kuriomis vyksta sveitranskripcijos pradios nukleoka, buvo nustatytos bakterij gen promotori mutacins
tido atvilgiu.
analizs bdu, o sveika su promotoriaus DNR patvirtinta
rentgenostruktrine analize.
Bakterij gen promotori elementai koduojaniojoje
DNR grandinje, lemiantys RNR polimerazs holofermento, kurio sudtyje yra pagrindinis
(E.coli 70) veiksnys, prisijungim ties promotoriaus DNR ir transkripcijos proceso iniciacij,
yra ie (5.10pav.):
zz heksamerinis nukleotidas, esantis prie transkripcijos pradios nukleotid 10 srityje
(10sritis);
zz heksamerinis nukleotidas, esantis prie transkripcijos pradios nukleotid 35 srityje
(35sritis);
zz sritis tarp 10 ir 35 srii (jungtukas);
zz A ir T nukleotid gausi DNR sritis, esanti 4060nt prie transkripcijos pradios nukleotid (UP elementas);
zz +1 transkripcijos pradios nukleotidas.
5.3.5. (sigma)veiksnys ir jo reikm bakterij RNAP

transkripcijai
RNAP holofermente veiksnys utikrina bakterij RNR polimerazs prisijungim prie promotori DNR. veiksni vairov bakterijose didel. Pvz., Mycoplasma genitalia turi 1, Escherichia coli 7, o Streptomyces celicolor net 60 veiksni.
Kiekviena bakterin lstel turi pagrindin veiksn, kuris dalyvauja gen, reikaling normaliam jos augimui, transkripcijoje, ir kelet ar daugiau alternatyvi veiksni. Pastarieji pasitelkiami gen, kuri raika aktyvinima vairi aplinkos veiksni, transkripcijai. Toki veiksni
sintez ir kiekis lstelje, sveika su RNR polimeraze yra valdomi.
Daugelis bakterij veiksni (iskyrus 54) priklauso vadinamajai 70eimai ir struktrine
organizacija yra panas E.coli 70veiksn. eimai priklausantys baltymai turi keturias lanksiomis baltym grandinmis sujungtas struktrines sritis 1.1, 2, 3 ir 4, kuriose yra konservatyvi aminorgi liekan, svarbi sveikai su promotori elementais (5.10pav.). 2, 3 ir 4
sritys dar skirstomos atskiras funkcikai svarbias posrites.
1.1 sritis atlieka autoslopinimo funkcij ir neleidia
veiksnio 2sritis sveikauja
veiksniui, esaniam ne RNAP holofermento sudtyje, atsu promotoriaus 10sritimi, o
rankiai prisijungti prie gen promotori. 1.1sritis bdinga
4sritis su 35sritimi.
tik pagrindiniams transkripcijos veiksniams, alternatyvs
242
5.11pav. Bakterij RNAP holofermento sveika su promotoriumi. CTD subvieneto Cgalinis

domenas; NTD subvieneto Ngalinis domenas (J.D.Watson, T.A.Baker, S.P.Bell, A.Gann, M.Levine,
R.Losick. Molecular Biology of the Gene, seventh edition, 2013)
veiksniai jos neturi. Autoslopinimas panaikinamas, veiksniui prisijungus prie RNAP erdins
dalels. Holofermente 1.1sritis keiia savo padt ir idstoma fermento kanale (5.5pav., b).
Manoma, kad toks domeno idstymas manomas dl neigiamo 1.1srities krvio (elektrostatins sveikos su RNAP baltymais). Neigiamai krauta baltymo sritis imituoja neigiamai kraut
DNR, kuri vliau ir idstoma iame kanale. Kai susidaro atvirasis RNAP-DNR kompleksas (t. y.
vyksta iniciacija), i sritis istumiama i fermento. Panaia sveika aikinamas ir 1.1srities vykdomas autoslopinimas laisvame veiksnyje: 1.1 imituoja DNR ir sveikauja su tomis sritimis,
kurioms bdinga sveika su neigiamai krauta DNR molekule (2 ir 4sritimis).
Rentgenostruktrine analize nustatyta, kad sveikos vietoje DNR yra lenkiama apie 4srities spirals-poskio-spirals motyv. Tai pakeiia DNR trajektorij, ir labiau nutolusios promotoriaus sritys (pvz., UP elementas) priartja prie RNAP, kad pastaroji galt sveikauti su iais
elementais (5.8 pav.). Tokiu bdu skatinama transkripcijos iniciacija. 2 2.4 posrit atpasta
10srit promotoriaus DNR (greiiausiai, dvigrandins formos). 22.3posrits dalyvavimas yra
svarbiausias iskiriant promotoriaus DNR grandines transkripcijos iniciacijos metu.
RNR polimeraz turi rasti tam tikrus promotorius visame bakterijos genome, pvz., ~60bp
promotori visame >4x106bp E.coli genome. Manoma, kad holofermentas skenuoja DNR
viena kryptimi arba okinja keisdamas sekas trimatje erdvje. Kai veiksnys atsiskiria nuo
holofermento, jis gali prisijungti prie kitos RNAP molekuls.
Didioji dalis erdini RNAP daleli sveikauja su maai giminingomis DNR sritimis, laisv daleli lstelje nra daug. veiksnio molekuli utenka madaug tredaliui RNAP erdini daleli.
Madaug pus erdini RNAP daleli vienu metu transkribuoja genus ir yra elongacijos fazje.
5.3.6. Bakterij promotori tipins sekos

Kaip seka, kuri turi atpainti transkripcijoje dalyvaujantys savitieji baltymai, promotorius
skiriasi nuo sek, kurios yra tik transkribuojamos arba tik transliuojamos. ioje DNR sekoje yra
informacija apie promotoriaus funkcijas: seka yra signalas. Taigi, promotori sekos veikia kaip
cis signalai.
243
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Palyginus daugyb prie bakterij struktrinius geGen promotoriams bdingos

nus esani DNR srii, nustatyta, kad daugelis j prie
trumpos tipins nukleotid
+1 transkripcijos nukleotid yra konservatyvios. Tai yra
sekos, esanios tam tikrose
trumpos sekos, svarbios subvieneto sveikai su promopadtyse.
toriaus DNR. Jos vadinamosios tipinmis (angl. consensus)
sekomis.
Gen promotoriuose, kuriuos atpasta E.coli RNAP holofermentas, savo sudtyje turintis
70, yra ios konservatyvios sritys:
zz transkripto pradios +1 nukleotidas (daniausiai (> 90 % atvej) tai yra purino
nukleotidas);
zz 10 srities nukleotid tipin seka TATAAT;
zz 35 srities nukleotid tipin seka TTGACA;
zz 1618 nukleotid ilgio atstumas tarp 10 ir 35 srities (>90% atvej optimalus atstumas sudaro 17 nukleotid).
Nepaisant gana didelio konservatyvumo, gen promotori sekos yra skirtingos. Taip yra todl, kad tipins sekos lemia promotori stiprum (angl. promoter strenght), t.y. transkripcijos
iniciacij skaii per laiko vienet. Evoliucijos procese tipins sekos susidar taip, kad atitikt
vieno ar kito geno transkripcijos poreikius. Gen, koduojani RNR ir baltymus, kuri lstelei
reikia didiuli kieki (pvz., rRNR ir ribosomini baltym), promotoriai daug stipresni nei t,
kuri produkt reikia nedaug. Gen, turini silpnus promotorius, transkripcijai aktyvinti pasitelkiami kiti valdymo bdai, pvz., traukiami baltymai transkripcijos aktyvikliai.
Jei lstels adaptacijai prie pasikeitusi aplinkos slyg reikia gen produkt, pagrindin E.
coli veiksn (70) RNAP holofermente gali pakeisti kiti veiksniai. E.coli, be 70veiksnio, nustatyti dar ei veiksniai, kurie pasitelkiami bakterijos gen transkripcijai tam tikromis aplinkybmis (5.2lentel). Kiekvienas i veiksni atpasta skirtingas promotori klases.
5.2lentel. E. coli lstels veiksniai ir j atpastam promotori tipins sekos
veiksnys
70
Slygos, kada naudojamas

transkripcijai
10srities tipin
seka
35srities tipin
seka
Jungtukas tarp
10ir 35srii
prastomis augimo slygomis,

kai transkribuojami nam kio
genai (angl. housekeeping)
TATAAT
TTGACA
1618bp
32 (H)
Temperatrinis okas
CCCGATNT
CCCTTGAA
1315bp
38 (S)
Stacionari augimo faz
TATAAT
TTGACA
1618 bp
24 (E)
Temperatrinis okas
YCTGA
GAA
16 bp
54 (N)
Azoto apykaita
TTGCA
CTGGNA
6bp
( )
iueli sintez
GCCGATAA
CTAAA
15bp
18 (FccI)
Geleies citrato transportas
Nenustatyta
Nenustatyta
Nenustatytas
28
Pagrindinio 70 veiksnio E.coli lstelje yra daugiausiai ~1000 molekuli, kit ymiai
maiau. Pvz., E ir Fveiksni yra tik po kelet molekuli lstelje.
244
5.3.7. Transkripcijos terminacija bakterijose

Kai RNAP, sintetindama RNR, pasiekia savituosius terminacijos signalus, ji sustoja, transkripcijos kompleksas disocijuoja. Tam, kad vykt transkripcijos terminacija, vandeniliniai ryiai, kuriais prie transkripcijos komplekso yra prijungtas DNR-RNR hibridas, turi bti suardyti, o transkripcijos burbulo vietoje turi vl susidaryti DNR dupleksas.
Bakterij, taip pat ir bakteriofag nukleotid sekos, reikalingos terminacijos reakcijai vykti,
vadinamos transkripcijos terminatoriais, arba transkripcijos terminacijos signalais. Skirtingi terminatoriai skirtingu veiksmingumu stabdo transkripcij, kai kuri j veikimas priklauso
nuo papildom baltymini veiksni. Bakterij gen transkripcijos terminatoriai skirstomi dvi
grupes:
zz nuo veiksni nepriklausomi transkripcijos terminatoriai transkripcijos terminatoriai, kuri veikimui nereikia joki papildom baltymini veiksni. Jie dar vadinami vidiniais terminatoriais (angl. intrinsic terminators);
zz nuo Rho baltymo priklausomi transkripcijos terminatoriai (angl. Rho dependent
terminators).
1grupei priklausantys transkripcijos terminacijos signalai yra koduojami DNR ir pasiymi
iomis struktrinmis savybmis:
zz transkripcijos terminacijos signalai sudaryti i invertuot G ir C gausi nukleotid sek ir
u j esanios T gausios nukleotid sekos;
zz susintetinus terminatoriaus RNR, G ir C gausus invertuotas pasikartojimas sudaro antrin
RNR plauk segtuko struktr netoli RNR 3galo (5.12pav., a);
zz u plauk segtuko RNR molekulje susintetinamas U nukleotid ruoas paiame transkripto 3gale. U nukleotid ruoe tam tikruose terminatoriuose gali bti siterpusi kit
nukleotid (5.12pav., a).
RNR molekulje plauk segtuko struktros stiebo dalis netoli pamato yra gausi G ir C nukleotid por. Tipikas atstumas tarp segtuko stiebo ir U ruoo yra 79 nukleotidai. Takins mutacijos, panaikinanios transkripcijos terminacij bakterijose, genome nustatomos btent segtuko stiebo srityje. Bioinformatine analize nustatyta, kad E.coli ~80% terminatori RNR yra vidiniai terminatoriai. Taiau kai kuriose kitose bakterijose ir archjose nra tokio tipo terminatori.
Kaip vidinis terminatorius stabdo transkripcij? Manoma, kad terminacija prasideda sintezs vietoje suirus nestabiliam DNR-RNR hibridui (dA-rU). RNR polimeraz sustabdoma. Tokia
pauz yra gana prasta ir elongacijos metu, taiau tada RNR polimeraz grta atgal. Sustojus
polimerazei terminacijos atveju, susintetintame RNR fermento RNR ijimo kanale susidaro
plauk segtuko struktra. Manoma, kad jos susidarymas skatina beveik visikai suirti DNR-RNR
hibrid, esant RNR polimerazje. Tai atidaro RNR ijimo kanal. RNR disocijuoja, transkripcija
sustabdoma.
Egzistuoja ir kitoki transkripcijos stabdymo mechanizm.
245
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Per transkripcijos elongacij TEC kompleksas taip pat gali bti sustabdomas terminatorius panai struktr, susidarani RNR molekulje. Tokiose struktrose atstumas tarp segtuko ir Uruoo
yra didesnis nei prastuose terminatoriuose t. y. 1011 nukleotid. Ties tokia struktra RNAP sustoja,
grta atgal, o atsipalaidavs U gausus transkripto 3galas nuskeliamas. RNR polimeraz toliau tsia
transkripcij.
Prokariotai pasitelkia ir kit nuo Rho baltymo priklausom transkripcijos terminacijos

bd. Rho yra gyvybikai svarbus baltymas daugelyje bakterij. Manoma, kad ~20% E.coli
trankript terminacija vyksta dalyvaujant Rho.
Rho baltymas yra homoheksamerins struktros (6x46,8kDa). Tai yra nuo ATP priklausoma
translokaz, kuri pasitelkia ATP hidroliz judjimui iilgai RNR. Kaip translokaz, ji galt arba
itraukti RNR i transkripcijos komplekso, nustumti RNR polimeraz, arba jos helikazinis aktyvumas galt iskirti DNR-RNR hibrid. Rho veikimo bdas dar yra tiriamas.
5.12pav. Transkripcijos terminacijos bdai prokariotuose. Vidinis terminatorius. Deinje vidinio

terminatoriaus antrin struktra, plauk segtuko struktra paymta apskritimu (a); transkripcijos terminacija dalyvaujant Rho veiksniui. Deinje hipotetinis RNR judjimo Rho helikaze modelis. Mlyna
spalva paymtos RNR jungimo sritys, raudona spalva ATPazs domenai (b) (L. A. Allison. Fundamental
Molecular Biology, second edition, 2012)
246
Tam, kad Rho galt funkcionuoti, jis turi prisijungti prie ne maiau kaip ~6080 nukleotid ilgio viengrandins antrini struktr neturinios RNR molekuls rut (angl. Rho utilization)
srities. rut srities sekose yra gausu pirimidin (C) nukleotid, taiau dar nra iaikinta toki
sekos savybi svarba Rho veikimui. Rho veikia ties netransliuojamomis, t.y. ribosom neudengtomis arba baltym neudengtomis RNR, sritimis.
Rho prisijungus prie rut srities, RNR pakliva baltymo vid, j prijungia RNR suriantys Rho
baltymo subvienet domenai. Aktyvinama Rho helikaz (5.11pav., b). Dl ATP hidrolizs, RNR
juda (53 kryptimi) iilgai baltymo ir taip Rho priartja prie stabteljusios RNR polimerazs.
Veikdamas kaip translokaz ar helikaz, Rho baltymas sukelia transkripcijos terminacij tais
atvejais, kai dl tam tikr prieasi ribosomos negali tuoj pat transliuoti susintetinto transkripto ir jis lieka neudengtas ribosom. prastais atvejais prokariotuose transkripcija ir transliacija
vyksta sinchronikai, ties susintetintu transkriptu tuoj pat prisijungia ribosomos, ir Rho baltymui tarp RNR polimerazs ir ribosomos nebelieka laisvos RNR, ties kuria jis galt prisijungti.
Sintetinant transkripto gal veikia kitoks mechanizmas. Kai ribosoma prieina transliacijos
STOP kodon, ji stabteli. Tuo metu RNR polimeraz dar sintetina RNR. Susidaro RNR fragmentas,
neudengtas ribosom, ties kuriuo ir prisijungia Rho.
Rho neaktyvus ir nesukelia transkripcijos terminacijos t gen, kurie nekoduoja baltym,
pvz., tRNR gen, nors ties j transkriptais nesijungia ribosomos. tRNR gen transkriptai greitai
gyja erdvin struktr, kuri nepasiymi viengrandinmis sritimis, pakankamomis prisijungti
Rho ir j aktyvinti.
Rho baltymo kristalo rentgenostruktrin analiz suteik informacijos, kaip Rho baltymas galt
prisijungti ties RNR. ~ 60 nukleotid RNR sritis udengiama ir apsaugoma nuo nukleazi poveikio.
Tokio ilgio RNR fragmento utenka sveikai su Rho baltymu in vitro. ei identiki Rho subvienetai
sudaro ied, taiau jame yra plyys, per kur vid gali patekti RNR. domu, kad Rho heksamere atskir
subvienet sritys, kuri reikia sveikai su RNR, yra isidsiusios taip, kad RNR vinguriuoja per ias
sritis Rho heksamere (5.11pav., b). Pirmosios 125 Ngalins Rho aminorgtys sudaro atskir domen,
kuris jungiasi prie C nukleotid turinios RNR ir DNR srii. Likusiame 290 aminorgi fragmente
yra ATP prijungimo sritis. domu, kad Rho gali prijungti tiek C gausi RNR, tiek DNR, taiau helikazinis
aktyvumas pasireikia tik prijungus RNR. Manoma, kad prijungus RNR, pakinta ATP suriani domen
konformacija, ir tai aktyvina ATP hidroliz.
5.4. Transkripcija eukariotuose

Kitaip nei bakterijose, eukariot lstelse RNR sintetina kelios RNR polimerazs. Didij
dal RNR sintetina trys RNR polimerazs:
zz rRNR sintetina RNR Ipolimeraz;
zz iRNR sintetina RNR IIpolimeraz;
zz tRNR, 5SrRNR ir kai kurias maas RNR sintetina RNR IIIpolimeraz.
247
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Archjose, panaiai kaip ir bakterijose, RNR sintetina viena RNR polimeraz. Ji panai eukariot RNR II polimeraz. 2008 m. nustatyta archj RNR polimerazs struktra. ydiniuose augaluose nustatytos dar dvi branduolio RNR polimerazs RNR IV ir Vpolimerazs. RNR
IVpolimeraz sintetina maas RNR endogenines siRNR, kurios yra svarbios gen raikos slopinimui. RNR Vpolimeraz dalyvauja nuo transkripcijos priklausomo DNR metilinimo procese.
Eukariotuose taip pat yra mitochodrij ir chloroplast RNR polimerazi. Visos eukariotins RNR
polimerazs yra dideli daugiasubvienets struktros baltymai, kuri molekulin mas siekia
500kDa. Paprastai tokios polimerazs turi 1214 subvienet.
RNR I ir IIpolimerazi transkribuojam gen promotoriai isidst prie transkripcijos pradios nukleotid, taiau tam tikr RNR IIIpolimerazs transkribuojam gen promotoriai yra
gen viduje, t.y. u transkripcijos pradios nukleotido. Kiekvienas promotorius, panaiai kaip
ir prokariot gen promotoriai, turi vairi nukleotid srii, kurias atpasta savitieji transkripcijos veiksniai.
Taigi, eukariot organizmuose gen promotorius atpasta transkripcijos veiksniai, o ne
RNR polimerazs. Prisijung ties promotoriais, transkripcijos veiksniai sukuria struktr, prie
kurios po to jungiama RNR polimeraz.
Prijungti RNR I ir IIIpolimerazes reikia palyginti nedaug transkripcijos veiksni jie atpasta
nedaug skirting promotori. Taiau i polimerazi sintetinami transkript kiekiai yra dideli.
Pvz., rRNR molekuli yra ~100000 kopij lstelje (~50% visos RNR). Gen, kuriuos transkribuoja RNR IIpolimeraz, transkriptai yra daug vairesni. Daugelyje eukariotini lsteli sintetinama ~20000 skirting iRNR. Transkripcijos veiksni, kurie utikrina promotori atpainim,
taip pat yra labai daug >2000.
5.4.1. Eukariot RNR polimerazs

Erdvins bakterij ir eukariot RNR polimerazi struktros bei j katalizuojamos reakcijos
yra panaios, bet transkripcijos procesuose yra skirtum. Bakterij RNR polimeraz (su vienu
i s veiksni) gali inicijuoti transkripcij in vitro nedalyvaujant pagalbiniams baltymams. Eukariot RNR polimerazms inicijuoti transkripcij reikia savitj transkripcijos veiksni, kurie
prisijungia prie promotoriaus.
Tam, kad eukariotuose prasidt transkripcija, reikia ipakuoti chromatin. ia svarb vaidmen atlieka chromatin pertvarkantys kompleksai ir histon acetilinimas.
Trys pagrindins eukariot RNR polimerazs lokalizuotos skirtingose eukariot lstels
branduolio vietose. RNR Ipolimeraz sutelkta savitoje branduolio struktroje branduollyje
(angl. nucleolus), kur sintetina rRNR pirmtak ilg, ~ 47S pre-rRNR. Toliau vyksta pre-rRNR
brendimas, susidaro funkcionalios rRNR molekuls 28S rRNR, 5,8S rRNR ir 18S rRNR. RNR Ipolimerazs sintetinamos RNR kiekis yra didiausias.
RNR II polimeraz yra sutelkta nukleoplazmoje. Ji sintetina vadinamj heterogenin
branduolio RNR (hnRNR), t. y. iRNR molekuli pirmtakus. RNR I ir II polimerazs susintetina
didij dal lstels RNR.
RNR IIIpolimeraz taip pat yra nukleoplazmoje. Ji sintetina tRNR, 5S rRNR bei kitas maas
RNR.
248
Pagrindins eukariot RNR polimerazs pasiymi skirtingu jautrumu amanitinui. amanitinas

yra oktapeptidas, sintetinamas alsvojoje musmirje Amanita phalloides (5.13pav., a). RNR Ipolimeraz yra nejautri amanitinui. RNR IIIpolimeraz skirtinguose organizmuose pasiymi skirtingu jautrumu iam junginiui: gyvn lsteli RNR PolIII yra labai jautri, o mieli ir vabzdi nejautri. RNR
II polimeraz yra labai greitai slopinama amanitinu. amanitino poveikis lstelms, apsinuodijus
A.phalloides, pasireikia ne i karto, bet po dienos ar dviej, kai ima trkti nauj iRNR, reikaling baltym biosintezei. amanitinas slopina RNR PolII transkripcijos elongacijos proces prisijungdamas
netoli fermento aktyviojo centro ir blokuodamas DNR-RNR perstmimo proces (5.13pav., b).
5.13pav. amanitinas ir jo veikimo bdas. amanitino struktra (a); mieli RNR IIpolimerazs ir
amanitino, prisijungusio netoli aktyviojo centro, komplekaso struktra, nustatyta 2,8 skyros rentgenostruktrine analize. Raudona spalva paymtas amanitinas. Raudonas rutuliukas Mg2+ jonas, mlyni rutuliukai Zn2+ jonai (b) (PNAS, v.99, p.1218, 2002)
Detaliau aptarsime eukariot RNR polimerazes ir j transkribuojam gen promotorius.
5.4.2. RNR Ipolimerazs transkripcijos kompleksas

RNR I polimeraz sintetina geno, kuris koduoja rRNR pirmtak, transkript pre-rRNR.
Transkripcijos veiksniai, dalyvaujantys RNR PolI transkripcijoje, atpasta vieno tipo promotori. Lstelms reikia didiulio kiekio ribosom, todl rRNR pirmtako genome yra imtai geno
kopij. Tam tikrais atvejais rRNR gen kopij skaiius genome gali padidti tkstanius kart, pvz., amfibij, uv
RNR Ipolimeraz sintetina rRNR
ovogenezs metu, kai lstels dalijasi labai greitai ir reikia
pirmtako RNR pre-rRNR.
didelio kiekio rRNR. i organizm rRNR pirmtak koduojantys genai labai tinkamas objektas tirti rRNR transkripcij ir brendim.
Ribosomins RNR pirmtak koduojantys genai susitelk tam tikrose keli chromosom vietose rRNR pirmtako gen sankaupose. ios sankaupos yra vadinamos branduollio organizavimo sritimis, NOR (angl. nucleolar organizer regions). J skaiius organizmuose skiriasi.
249
MOLEKULIN BIOLOGIJA
mogaus lstelse yra penkios tokios sritys. Kiekviena sritis yra skirtingoje chromosomoje (haploidiniame genome). NOR sritys per interfaz sudaro ypating branduolio struktr branduoll, kur vyksta rRNR pirmtako gen transkripcija ir pre-rRNR transkript brendimas. Branduollis turi aiki struktr, matom optiniu mikroskopu. Pre-rRNR sintezs vietoje i karto
montuojasi bsim ribosom subvienetai, telkiami rRNR brendimo veiksniai. Tai suteikia branduolliui savit pavidal.
Skirting eukariotini organizm rRNR gen promotori nukleotid sekos skirtingos, taiau reguliacins sritys konservatyvios visuose organizmuose nuo mieli iki mogaus. Reguliacins sritys konservatyvios netgi afrikietikoje tripanosomoje, kur vieninteliu inomu atveju RNR PolI sintetina ne tik pre-rRNR, bet ir dar du baltymus koduojani gen transkriptus.
Pre-rRNR pirmtako transkripcijos vienete rRNR isidsiusios tokia tvarka: 18S, 5,8S ir 28S
(5.14pav., ab). Pirmtakus koduojantys genai, kaip minta, sudaro dideles sankaupas. Genus
skiria tarpgeniniai tarpai, IGS (angl. intergenic spacer). Jie netranskribuojami (5.14 pav). Tarpgeniniuose tarpuose yra rRNR pirmtako gen promotoriai. mogaus lstelse tarpgeniniai tarpai
gali siekti iki 30kb.
Promotori sudaro dvi pagrindins reguliacins sritys: erdinis promotorius ir UCE sritis.
erdin (angl. core) promotori sudaro ~50 nukleotid sritis (45+20), persiklojanti su transkripcijos pradios sritimi (5.15pav.). Jis yra btinas bei pakankamas daugelyje organizm inicijuoti rRNR transkripcij. erdiniame promotoriuje yra transkripcijos pradios nukleotidas.
erdinis promotorius turi tik vien konservatyv element ribosomin iniciatori, rInr.
rInr sritis pasiymi A ir T nukleotid gausa.
5.14pav. Ribosomini RNR pirmtako (pre-RNR) transkripcija branduollyje. rRNR pirmtako geno
sankaupa (a); rRNR pirmtako geno ir tarpgenins srities (IGS) struktra. Juoda rodykl ymi 47S pre-rRNR
transkripcij, raudona rodykl transkripcij nuo tarpgenins srities. Pilki staiakampiai stiprikliai tarpgeninje srityje. Raudoni staiakampiai transkripcijos terminacijos sritys. ETS iorinis transkribuojamasis tarpas (angl. external transcribed spacer) (b); transkripcijos veiksniai ir RNR Ipolimeraz ties rRNR
geno pirmtako promotoriumi (c) (Annual Review of Pharmacology and Toxicology, v.50, p.135, 2010)
250
Transkripcijos iniciacija ties rRNR gen promotoriais ymiai veiksmingesn, kai prie erdin
promotori yra UCE (angl. upstream control element) elementas (5.15 pav.). Kartais jis vadinamas ir UPE (angl. upstream promoter element). UCE isidsts 107180 nukleotid srityje prie
transkripcijos pradios nukleotid. Jis labai veiksmingai stimuliuoja transkripcij, taiau daugeliu atveju nra btinas.
RNR Ipolimerazs vykdomai transkripcijai reikia dviej transkripcijos veiksni SL1 (angl.
selectivity factor 1) ir UBF (angl. upstream binding factor) bei daugelio pagalbini baltym (angl.
auxiliary proteins) (5.14pav., b). Bazinei transkripcijai vykti utenka SL1veiksnio, o veiksmingai
transkripcijai reikia abiej.
UBF dimeras prisijungia prie daug G ir C turinios UCE sekos. UBF lenkia DNR, ir i sudaro
~140bp kilp (5.15pav.). UBF skatina prie promotoriaus prisijungti SL1. UBF ir SL1 jungimuisi
prie promotoriaus bdingas kooperatyvumas.
SL1 sudaro keli polipeptidai. Skirtinguose organizmuose jis vadinamas skirtingai: SL1 mogaus lstelse, TIF-IB pels lstelse, ir t.t. Visuose iki iol tyrintuose organizmuose, iskyrus
5.15pav. RNR Ipolimerazs transkripcijos preiniciacijos komplekso

susidarymas ties mogaus rRNR pirmtako geno promotoriumi (T.D.Pollard,
W.C.Earnshaw, J.Lippincott-Schwartz.
Cell Biology, second edition, 2008)
251
MOLEKULIN BIOLOGIJA
mieles S.cerevisiae, erdin veiksn sudaro TBP baltymas ir trys arba keturi papildomi baltymai
savitieji su TBP baltymu susijung TAFI veiksniai (angl. TBP associated factors) (5.15pav.).
SL1 funkcija tiksliai prijungti RNR PolI prie rRNR pirmtako geno erdinio promotoriaus
(taip susidaro transkripcijos preiniciacijos kompleksas, PIC) ir nustatyti transkripcijos pradios
viet.
domu, kad vykstant pre-rRNR transkripcijai, pakartotin transkripcijos iniciacija (reiniciacija) yra labai veiksminga. Su erdiniu promotoriumi sveikaujantis veiksnys lieka prisijungs prie
promotoriaus ir gali transkripcijos kompleks jungti nauj RNR PolI molekul. Pvz., ameboje
kita RNR PolI gali prisijungti prie promotoriaus, prie tai prisijungusiai molekulei susintetinus
vos 17 nukleotid.
RNR PolI rRNR transkripcij stabdo terminatori sekos, isidsiusios pirmame 1000 nukleotid u rRNR pirmtako geno (5.14pav., c).
Eukariot 5S rRNR genai genome isidst atskirai nuo kitas rRNR koduojani gen. J
transkripcija taip pat vyksta atskirai, j vykdo RNR PolIII. io atskyrimo prieastis nra iaikinta.
Taiau kai kuriuose emesniuosiuose eukariotuose, pvz., mielse S.cerevisiae, 5S rRNR genai yra
isidst alia kitas rRNR koduojani gen.
5.4.3. RNR IIIpolimerazs transkripcijos kompleksas

Labiausiai isiskirianti RNR Pol III transkribuojam gen promotori savyb yra ta, kad
konservatyvieji promotori elementai yra isidst u transkripcijos pradios nukleotido, t.y.
gen viduje. ie promotoriai vadinami vidins kontrols sritimis, ICR (angl. internal control
regions). Promotoriai sudaryti i transkripcijos veiksni prisijungimo srii, kurias skiria maiau
transkripcijai svarbs jungtukai.
RNR PolIII transkribuojam gen promotorius galima
Kai kuri RNR IIIpolimerazs
suskirstyti tris tipus. I ir IItipo promotoriai btent ir pasiytranskribuojam gen promi anksiau mintais elementais. III tipo promotoriai toki
motori reguliacins sritys yra
element neturi.
isidsiusios gen viduje.
I tipo promotori pavyzdiu galt bti Xenopus laevis 5S rRNR geno promotorius. Btent X.laevis rRNR gen
transkripcijos tyrimais nustatyta, kad i gen promotori
reguliacins sritys yra isidsiusios rRNR gen viduje: 5S rRNR geno transkripcija vyko paalinus vis prie gen esani DNR srit. Itipo promotorius sudaro trys elementai, kuri pakanka
geno transkripcijai vykti (5.16 pav.):
zz Aelementas, esantis tarp +50 ir +64 nukleotido;
zz vidurinysis elementas, IE (angl. intermediate element), esantis tarp +67 ir +72 nukleotido;
zz C elementas, esantis tarp +80 ir +97 nukleotido.
Itipo promotoriai yra palyginti nejautrs skiriamj jungtuk tarp promotoriaus element
pokyiams. U 5S rRNR promotoriaus +5580 srities patalpinus bet kuri DNR, jos transkripcija
vyksta.
252
IItipo promotorius daniausiai turi tRNR genai. io tipo promotoriuose yra du konservatyvs A ir Belementai (5.16pav.). Aelementas panaus Itipo promotori A element, tik jis
yra daug ariau transkripcijos pradios nukleotido. Belemento padtis labai vairi, daniausiai
priklausoma nuo intron, esani tRNR gen viduje. Optimalus atstumas tarp A ir Belement
yra ~3060bp. Taiau inomas ir 365bp skirtukas. Prie A ir Belement IItipo promotoriuose
vienu metu prisijungia TFIIIC transkripcijos veiksnys, ir skirtukas istumiamas lauk.
Nedidel grup RNR PolIII transkribuojam gen promotori neturi joki tipik element,
esani gen viduje. Jie priklauso IIItipo promotori grupei. Geriausiai apibdintas tokio tipo
promotorius yra mogaus U6 geno promotorius. Genas koduoja splaisosomos RNR. Promotoriaus skos, reikalingos veiksmingai transkripcijai vykti, yra: TATA sritis (angl. TATA consesus
sequence), esanti 3025nt prie transkripcijos pradios nukleotid; artimasis sekos elementas, PSE (angl. proximal sequence element), esantis tarp 66 ir 47 nukleotido, ir tolimasis sekos
elementas, DSE (angl. distal sequence element), esantis tarp 244 ir 214 nukleotido (5.16pav.).
Reikia pastebti, kad kai kurie RNR PolIII transkribuojam gen promotoriai nra panas
n vien i mint trij promotori tip.
Prie RNR PolIII transkribuojam 5S rRNR ir tRNR gen I ir IItipo promotori A, B bei Celement prisijungia daugiasubvienetis TFIIIC transkripcijos veiksnys (5.17pav.). Prie Itipo (pvz.,
5S rRNR geno) promotori prijungti TFIIIC veiksn reikia pagalbinio veiksnio TFIIIA. TFIIIA prisijungia prie promotoriaus Aelemento ir tarpininkauja prijungiant TFIIIC veiksn prie Celemento. TFIIIC pats silpnai sveikauja su Itipo promotoriaus Celementu. IItipo promotoriams TFIIIA
veiksnio nereikia.
TFIIIC yra vienas didiausi inom transkripcijos veiksni. Mieli TFIIIC sudaro 6 subvienetai. N vienas subvienetas pavieniui negali prisijungti prie DNR. Subvienetai formuoja dvi baltym globules, kiekvienos skersmuo ~10nm. Fotossiuv eksperimentai parod, kad kone
visi TFIIIC veiksn sudarantys komponentai prisijungia iilgai viso tRNRTyr geno. IItipo promotoriuose TFIIIC prisijungia prie A ir Belement vienu metu. Jeigu jungtukas, skiriantis elementus,
yra per didelis (jame neretai yra intronas), DNR yra tiesiog istumiama lauk.
Pagrindin TFIIIC veiksnio funkcija prijungti transkripcijos veiksn TFIIIB (5.17pav.). TFIIIB
yra tikrasis transkripcijos iniciacijos veiksnys ir eina transkripcijos iniciacijos kompleks (PIC)
sudt atpastant vis tip RNR IIIpolimerazs promotorius. TFIIIB uima srit, esani ~40bp
5.16pav. RNR IIIpolimerazs

transkribuojam gen promotoriai. Tn terminacijos
sritis. Rodykl ymi transkripcijos pradi
253
MOLEKULIN BIOLOGIJA
5.17pav. mogaus lsteli RNR IIIpolimerazs preiniciacijos kompleksai, susimontav ties I

IIItipo promotoriais. Rodykls ymi transkripcijos pradios viet ir krypt (PLOS One, 2014)
prie transkripcijos pradios nukleotid. TFIIIB sudaro trys polipeptidai, kuri didiausias TBP
baltymas. TFIIIB sudtyje esantis TBP gali prisijungti prie TATA srii, taiau daugelis I ir IItipo
promotori i srii neturi. Prijungus TFIIIB prie DNR, TFIIIA ir TFIIIC tolesnei transkripcijos iniciacijai nebereikalingi.
TFIIIB veiksnys prie promotoriaus prijungia RNR IIIpolimeraz ir tiksliai j idsto ties transkripcijos pradios vieta. Su RNR PolIII tiesiogiai sveikauja TFIIIB veiksnio BRF subvienetas (angl.
TFIIB related factor).
5.4.4. RNR IIpolimeraz

RNR IIpolimeraz yra pagrindinis eukariot gen veikl valdantis fermentas, kuris (su retomis iimtimis) sintetina visas iRNR molekules. Eukariotinse lstelse RNR IIpolimeraz yra didiulis baltymas, kurio molekulin mas siekia ~500kDa. 2003m. 4,1 skyros rentgenostruktrine analize nustatyta S.cerevisiae RNR IIpolimerazs struktra, kuri sudaro 12 subvienet
(Rpb112, numeruojami nuo maiausio iki didiausio).
mogaus RNR IIpolimeraz panai mieli RNR IIpolimeraz. Atitinkamus RNR polimerazi
subvienetus koduojantys mogaus ir mieli genai pasiymi didele homologija. Daugelis mogaus RNR PolII subvienet gali pakeisti atitinkamus mieli RNR PolII subvienetus.
RNR PolII yra transkripcijos proceso erdis. Taiau pats vienas is fermentas, nors ir pasiymi polimeraziniu aktyvumu, negali inicijuoti transkripcijos nuo gen promotori. Tam btini
papildomi baltymai, kurie, kartu su RNR PolII, sudaro transkripcijos iniciacijos bei elongacijos
kompleksus, gali atpainti promotorius ir reaguoti transkripcijos signalus.
254
Transkripcijos preiniciacijos kompleksas, susimontuojantis ties eukariot gen promotoriais, yra itin didel struktra (5.3lentel). J sudaro:
zz RNR IIpolimeraz;
zz pagrindiniai transkripcijos veiksniai, GTF (angl. general transcription factors): TFIID, TFIIA,
TFIIB , TFIIF, TFIIE, TFIIH;
zz mediatoriaus kompleksas, sudarytas i daugelio baltym.
5.3lentel. RNR PolII transkripcijos iniciacijos komplekso komponentai
Komponentai
Subvienet skaiius
Molekulin mas (kDa)
RNR IIpolimeraz
12
515
Pagrindiniai transkripcijos veiksniai
26
1580
Mediatorius
21
1005
I viso
58
3080
RNR II polimerazs struktros bruoai. Eukariot RNR II polimerazs erdins dalies

struktra panai bakterij polimerazs, nepaisant to, kad j sudtyje esani baltym aminorgi sek panaumas nedidelis. Be to, eukariot baltymas dar turi papildom subvienet,
kurie suteikia jam savit struktrini ir funkcini ypatybi (5.18pav.). Labiausiai isiskiriantis
eukariot RNR PolII bruoas Rpb4 ir Rpb7subvienet formuojama kamino struktra (angl.
stalk). i RNR PolII dalis yra iorje; ji, beje, bdinga ir archj RNR polimerazei. Kaminui priskiriamos svarbios funkcijos per transkripcij vykstanio atvirojo komplekso susidarymo metu,
utikrinanios procesyvum ir pagrindinio transkripcijos veiksnio TFIIE veikim.
5.18pav. Bakterij bei archj RNR polimerazi ir eukariot RNR IIpolimerazs erdvins struktros. Mlynai paymti subvienetai, konservatyvs visose polimerazse, violetine spalva baltymai,
esantys eukariot ir archj, bet ne bakterij RNR polimerazse (Nature Reviews Microbiology, v.9, p.85,
2011)
255
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Du didiausi RNR PolII subvienetai Rpb1 ir Rpb2 sudaro fermento erd (5.19pav., ab).
domu, kad eukariotuose ir bakterijose abu subvienetus koduoja vienas genas, o archjose
du genai, organizuoti operon. Maesnieji RNR PolII subvienetai yra daugiausiai didij
subvienet iorje. Fermento erdvin struktra primena jau anksiau aprayt bakterij RNR
polimerazs erdvin struktr: Rpb5, Rpb9 subvienetai ir dalis Rpb1 subvieneto sudaro iuptuvus, o plyyje tarp j idstoma DNR. Plyyje esanio kanalo pamate suriami du Mg2+ jonai.
Kanalo skersmuo yra ~25. Jis gali talpinti ~20bp, i kuri ~9bp sudaro DNR-RNR hibridas.
RNR PolII aktyviojo centro struktros modelis pasilytas remiantis dviej metalo jon isids-
5.19pav. Eukariot RNR IIpolimerazs struktra. S.cerevisiae RNR PolII erdvin struktra, nustatyta
3,5 skyros rentgenostruktrine analize (nra Rpb4 ir Rpb7 subvienet). Subvienetai paymti skirtingomis spalvomis (a); RNR PolII struktros schema (b) (Science, v.292, p.411, 2001); RNR PolII, esanios
elongacijos etape, schema (pjvis i ono). Rodykl apaioje ymi transkripcijos krypt (c) (PNAS, v.99,
p.1218, 2002)
256
tymu RNR IIpolimerazje. Pagal model, laisvas rNTP kartu su vienu Mg2+ jonu prisijungia tarp
paskutins DNR-RNR hibrido bazi poros ir RNR IIpolimerazs struktrinio elemento BHspirals (angl. bridge helix) (5.19pav., ab, ir 5.20pav.). BHspiral yra svarbus RNR IIpolimerazs
funkcinis elementas. R.Kornbergas kartu su kolegomis nustat, kad BHspiral bna tiesi arba
ilenkta. Jie ikl hipotez, kad spirals konformacija kinta perstmimo (angl. translocation)
metu: kai spiral tiesi, aktyvj centr gali pakliti NTP. Prijungus NTP, upildomas plyys tarp
RNR 3galo ir BHspirals (5.20pav., a). Tikslus substrat idstymas aktyviajame centre skatina
fosfodiesterinio ryio susidarym ir pirofosfato atsipalaidavim. Vykstant perstmimui, BHspiral ilinksta, paskui grta pradin bsen. RNR IIpolimerazs elongacij slopinantis amanitinas prisijungia netoli BHspirals, trukdo jai ilinkti ir taip stabdo perstmim.
Aktyviojo centro kanal ustoja fermento struktroje esanti siena (angl. wall) (5.19pav., c).
Dl jos DNR, esanti fermento kanale, yra ne tiesi, bet ilinksta ~90 kampu. Fermento struktroje po aktyviuoju centru taip pat yra pora (angl. pore) (5.19pav., c). Pora platja iors link. Per
j rNTP patenka RNR polimerazs aktyvj centr. Tam tikrais atvejais j patenka ir yra ten
nuskeliamas RNR transkripto 3galas.
Transkripto 5 galas ieina per kit ijimo (angl. exit) kanal, kur jis atskiriamas nuo
DNR grandins keleto struktrini RNR IIpolimerazs element baltym kilp (5.19pav., c).
Svarbus RNR IIpolimerazs struktrinis elementas yra gnybtas (angl. clamp) (5.19pav., c). J
5.20pav. RNR IIpolimerazs aktyviojo centro funkciniai elementai. BHspiral (a) (Archaea, 2011);
BHspirals konformacijos kitimas elongacijos metu. Oranine spalva paymti purino, mlyna pirimidino nukleotidai aktyviajame centre (bd) (PNAS, v.104, p.12955, 2007; Science, v.292, p.411, 2001)
257
MOLEKULIN BIOLOGIJA
sudaro Rpb1, Rpb 6 ir Rpb2 subvienet dalys. Gnybtas apgaubia DNR dupleks, kai is patenka
ferment.
Dar vienas svarbus aktyviojo centro elementas yra TLkilpa (angl. trigger loop). Ji yra judri
ir fiksuoja komplementari laisvo rNTP ir matricos nukleotido por (5.20pav., d). TLkilpos aminorgtys sveikauja su visomis rNTP struktrinmis dalimis heterocikline baze, fosfatais ir
riboze. TL aminorgi mutacijos daro tak transkripcijos substrat atrankos procesui. Dl
tam tikr mutacij RNR PolII beveik nebeskiria rNTP nuo dNTP, nors prastai klaid danis yra
1 i tkstanio.
5.4.5. RNR IIpolimerazs transkripcijos preiniciacijos

kompleksas
Tipik geno, kurio transkripcij vykdo RNR Pol II, promotori sudaro daug reguliacini cis
element. Vienalsi eukariot gen promotori reguliaciniai elementai isidst arti transkripcijos pradios nukleotido (5gale) (5.21pav., a). Daugialsiuose eukariotuose j vairov
ymiai didesn ir padtis geno atvilgiu vairesn (5.21pav., b).
Eukariot gen transkript dydis plaiai svyruoja nuo keli imt iki milijon nukleotid
(pvz., mogaus distrofino geno transkriptas yra 2,5milijono nukleotid ilgio). Tiriant daugelio
eukariot gen, kuri transkripcij vykdo RNR PolII, promotori sekas, netoli +1nukleotido
buvo nustatytos tik gana nedidels konservatyvios sritys. Mutagenezs bdu buvo patvirtinta,
kad jos yra svarbios transkripcijos iniciacijai. ios sritys sudaro RNR PolII transkribuojam gen
erdin promotori (5.21pav., ab).
5.21pav. Vienalsi (a) ir daugialsi (b) eukariot gen, kuriuos transkribuoja RNR IIpolimeraz, promotoriai. UAS priesrovin aktyvinamoji seka (L.A.Allison. Fundamental Molecular Biology,
258
RNR PolII transkribuojam gen promotoriams bdingos ir kitos reguliacins sritys, esanios toliau nuo erdinio promotoriaus. Jos skirstomos ias grupes:
zz artimieji promotoriaus elementai (angl. proximal promoter elements), isidst 70
200bp prie transkripcijos pradios nukleotid (5.21pav., b);
zz tolimieji reguliaciniai elementai (angl. longrange regulatory elements), isidst
7001000 ir daugiau bp nuo tranksripcijos pradios nukleotido (5.21pav., b).
RNR IIpolimerazs erdin promotori sudaro ~60bp DNR sritis, kurioje yra transkripcijos
pradios nukleotidas (5.22pav.). Su ia sritimi sveikauja pagrindiniai transkripcijos veiksniai ir
RNR IIpolimeraz. Daugelio RNR PolII transkribuojam gen erdiniai promotoriai turi konservatyvi srit TATA dut, kuri yra nutolusi nuo +1 nukleotido ~25 nukleotidus. TATA dut
sudaro nukleotidai ATATAAA. Jos konservatyvi seka labai panai bakterij promotori 10
srit. TATA dut turi stiprs promotoriai. TATA buvo pirmasis nustatytas RNR PolII transkribuojam gen promotoriaus elementas. Dut yra gana danas induoli gen erdinio promotoriaus elementas. Taiau, pvz., mogaus genome io elemento neturi didesn pus gen
promotori (vadinamieji TATA neturintys promotoriai).
Greta TATA danai yra dar viena erdiniui promotoriui bdinga sritis BRE (angl. TFIIB recognition element) (5.22pav.). Prie BRE atrankiai jungiasi pagrindinis transkripcijos veiksnys TFIIB.
TATA dut utikrina tiksl transkripcijos pradios nukleotido nustatym per transkripcijos
iniciacij. Prie jos atrankiai jungiasi transkripcijos veiksnio TFIID sudtyje esantis TBP baltymas
(angl. TATA binding protein). Kiti TFIID subvienetai sveikauja su kitais erdinio promotoriaus
elementais.
Kiti inomi eukariot gen erdinio promotoriaus elementai yra:
zz iniciatorius, Inr (angl. initiator) (5.22pav.);
zz pasrovinis promotoriaus elementas, DPE (angl. downstream promoter element);
zz 10-ies nari motyvas, MTE (angl. motif ten element).
Iniciatoriaus Inr viduje yra transkripcijos pradios nukleotidas (5.22pav.). Inciatoriaus tipin
seka yra PyPyANT/APyPy (Py pirimidino nukleotidas, A transkripcijos pradios nukleotidas, N bet kuris nukleotidas). Prie iniciatoriaus jungiasi pagrindinio transkripcijos veiksnio
TFIID subvienetai TAF1 ir TAF2 (senja nomenklatra TAFII250 ir TAFII150). Iniciatorius Inr gali
5.22pav. Eukariot gen

erdinio promotoriaus
elementai (L.A.Allison.
Fundamental Molecular
Biology, second edition,
2012)
259
MOLEKULIN BIOLOGIJA
funkcionuoti vienas, be TATA duts. Bdami kartu, ie promotoriaus elementai veikia sinergetikai. Jei erdinis promotorius turi arba TATA, arba Inr (atrus promotorius, angl. sharp promoter), transkripcija prasideda tiksliai ties +1 nukleotidu.
Jeigu i element nra (platus promotorius, angl. wide
Eukariot RNR II polimerazs
promoter) transkripcija prasideda vairiose vietose.
bazinis transkripcijos aparaKitas eukariotuot gen erdinio promotoriaus eletas, prisijungs prie erdinio
mentas yra u +1 nukleotido esantis DPE (5.22pav.). DPE
promotoriaus, utikrina bazin
elementas yra erdinio promotoriaus +2832 srityje. Taigi,
transkripcij.
jis yra gen viduje. Kitaip nei Inr, DPE negali visikai pakeisti TATA, todl DPE turintys promotoriai prastai turi dar
TATA arba Inr.
Toki prie tai ivardyt element rinkiniai daniausiai ir sudaro erdin promotori, prie
kurio jungiasi RNR PolII transkripcijos kompleksas. erdinio promotoriaus elementai utikrina,
kad ties promotoriumi susiformuot bazinis transkripcijos aparatas ir vykt bazin transkripcija.
Bazin transkripcija nra veiksminga. Veiksmingai transkripcijai vykti reikia kit baltym
reguliacini transkripcijos veiksni, daniausiai transkripcijos aktyvikli (angl. activators).
Transkripcijos aktyvikliai skatina prie promotoriaus kooperatyviai jungtis transkripcijos aparato komponentus.
Transkripcijos veiksniai jungiasi prie savitj nukleotid sek, esani prie erdinius promotorius, prie artimj promotori element. Trumpi sek elementai, prie kuri jungiasi ie
baltymai, gali bti panas kitas prie genus esanias sekas, taiau jie taip pat gali funkcionuoti ir kaip labai saviti reguliaciniai elementai, kai reikia transkribuoti gen tam tikroje vietoje
ir tam tikru laiku.
Pvz., didel dalis mieli gen promotori turi vadinamj priesrovin aktyvinamj
sek, UAS (angl. upstream activating sequence). Sekoje yra 23 savitosios sritys, prie kuri jungiasi transkripcijos veiksniai (5.21pav., a).
Daugialsiuose eukariotuose artimj promotori element vairov daug didesn. Pavyzdys galt bti GCdut GGGCGG seka, esanti ~90bp prie transkripcijos pradios nukleotid. J turi 60% mogaus gen, daugiausiai nam kio gen (angl. housekeeping genes). Prie GC
duts jungiasi SP1baltymas ir pritraukia prie promotoriaus TFIID veiksn per vien jo baltym.
Kitas danas elementas yra nukleotid seka GGCCAATCT. Sritis vadinama CAAT dute.
CAAT taip pat prijungia savituosius transkripcijos veiksnius. Dar vienas promotori elementas,
isidsts ~100130np atstumu prie transkripcijos pradios nukleotid, yra oktameras, prie
kurio nukleotid ATTTGCAT sekos taip pat jungiasi savitasis transkripcijos veiksnys.
Reikia pastebti, kad didioji dauguma eukariot RNR PolII transkribuojam gen promotori turi kelet element, kurie daro tak transkripcijos iniciacijos veiksmingumui (iniciacijos
daniui), taiau n vienas j nra esminis visiems promotoriams. Promotori elementai greiiau primena mozaik, o reguliacini element organizacija gali bti labai vairi. Jie organizuoti
vadinamuoju sumaiyk ir pataikyk (angl. mix and match) principu.
Daugialsi eukariot baltymus koduojani gen bdinga savyb yra ta, kad prie j
transkripcijos valdymo prisideda tolimieji reguliaciniai elementai (angl. long range control
elements), kurie gali bti nutol nuo erdinio promotoriaus tkstanius bp ir valdyti konkretaus
geno transkripcij organizmo vystymosi ir diferenciacijos metu.
260
Yra inomi keli tip tolimieji reguliaciniai elementai:

zz stiprikliai (angl. enhancers);
zz slopikliai (angl. silencers);
zz izoliatoriai (angl. insulators);
zz srities kontrols elementai, LCR (angl. locus control regions);
zz upildo prisijungimo sritys, MAR (angl. matrix attachment regions).
Stiprikliai ir slopikliai. Daugialsi eukariot baltym koduojanio geno transkripcija
prastai valdoma bent keli stiprikli. Stiprikliai nutol ~ 7001 000 bp nuo geno (gali bti
nutol ir imtus tkstani bp). Neprasta j savyb yra ta, kad kitaip nei erdinio promotoriaus
elementai, jie gali bti isidst tiek prie gen, tiek u jo, tiek gali bti geno viduje (5.23pav.,a).
5.23pav. Daugialsi organizm transkripcijos tolimieji reguliaciniai elementai. Stiprikli padtys

geno atvilgiu (a); srities kontrols elementai (LCR), aktyvinantys u j esani mogaus individuali
globin gen raik vairiais vystymosi periodais. Apaioje galimas LCR veikimo modelis (b); izoliatori veikimas eritrocituose. Raudonos rodykls transkripcijos slopinimas, alia rodykl transkripcija (c)
(L.A.Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012)
261
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Stiprikliai gali bti terpiami prieinga orientacija neprarasdami funkcijos. Vidutinis stipriklis yra
~ 500 bp ilgio modulins struktros: turi ~ 10 nukleotid sek, prie kuri atrankiai jungiasi
vairs transkripcijos veiksniai bei kiti baltymai (pvz., histonus modifikuojantys baltymai, chromatin pertvarkantys baltym kompleksai ir kt.). Savo organizacija stiprikliai yra gana panas
artimuosius promotori elementus. Eksperimentais rodyta, kad stipriklis gali aktyvinti bet kok
promotori, jeigu tas promotorius bus patalpintas arti jo. Pasilyti keli stiprikli veikimo modeliai, pagal kuriuos stiprikliai veikia keisdami DNR topologij, palengvindami transkripcijos
veiksni prijim prie erdinio promotoriaus.
Panas, taiau transkripcij ne stiprinantys, o slopinantys reguliaciniai elementai vadinami
slopikliais. Slopikliai yra DNR sekos, kurios neigiamai veikia geno transkripcij. Prie slopikli
jungiasi baltymai represoriai.
Izoliatoriai. Eukariot chromatin sudaro gen gausa pasiymintis euchromatinas ir kondensuotas heterochromatinas, kur gen nra daug ir kur j raika slopinama. Heterochromatinas plinta gretimas chromatino sritis, todl ikyla btinyb nuo struktrinio slopinimo
apsaugoti gretimose euchromatino srityse esani aktyvi gen transkripcij. 1970m. drozofiloje buvo nustatyti tolimieji reguliaciniai elementai, kurie pasiymjo btent tokia apsaugine
funkcija.
Izoliatoriai yra 3002000bp sekos, kurioms bdingos ios savybs (5.23pav., c):
zz patalpintas tarp stipriklio ir promotoriaus, izoliatorius slopina stipriklio poveik
promotoriui;
zz patalpintas tarp heterochromatino ir aktyvaus geno, izoliatorius stabdo heterochromatino plitim aktyvi gen srit.
Tam tikri izoliatoriai pasiymi abiem savybmis, kiti tik viena j. Izoliatoriai turi kelet DNR
srii, prie kuri atrankiai jungiasi savitieji baltymai. Izoliatori veikimas nra iki galo iaikintas. Silomi keli veikimo modeliai. Vienas modelis sieja izoliatorius ir transkripcijos komponentus. Pagal model, prie izoliatoriaus prisijungs transkripcijos aktyviklis nebegali sveikauti su
savo taikiniu promotoriuje. Apsaugos nuo heterochromatino plitimo atveju siloma, kad prie
izoliatori pritraukiami gen raik aktyvinantys baltymai bei histonus modifikuojantys baltymai, kurie neleidia tose srityse susidaryti heterochromatinui. Kitas modelis sieja izoliatorius ir
chromatino struktrin organizacij. Pagal j, izoliatoriai fizikai atskiria chromatino sritis ir taip
neleidia sveikauti, pvz., stiprikliui ir geno promotoriui.
Srities kontrols elementai (LCR). Srities kontrols elementai, LCR, priklauso valdymo
element (toki kaip stiprikliai, slopikliai, izoliatoriai, upildo prisijungimo sritys), vykdani
chromatino srities ar gen sankaup transkripcijos valdym, grupei. Prie ios element grups
jungiasi transkripcijos aktyvikliai, koaktyvikliai, chromatin pertvarkantys baltym kompleksai.
LCR daniausiai esti prie valdom gen grup, bet, pvz., randami ir intronuose.
1980 m. nustatyti ir gerai itirti mogaus LCR. Jie yra prie globin gen sankaup
(5.23pav., b). Sankaupos individuali bglobin gen transkripcija vyksta vairiais vystymosi
periodais ir valdoma pasitelkiant LCR bei vairius transkripcijos veiksnius. LCR yra labai jautrs
I DNazs poveikiui, tai liudija apie j dalyvavim transkripcijoje. Chromatino imunoprecipita-
262
cijos eksperimentais nustatyta, kad bazinis transkripcijos aparatas (RNR Pol II ir pagrindiniai
transkripcijos veiksniai) pirmiausiai pritraukiami prie LCR pasitelkiant transkripcijos veiksnius,
o po to RNR PolII nukreipiama promotoriaus link (5.23pav., b).
Upildo prisijungimo sritys (MAR). iandien neabejojama, kad chromatino erdvin struktra yra gen raikos valdymo eukariotuose pagrindas. Chromatino auktesnij struktr
elementai, pvz., chromatino kilpos, tvirtinasi prie branduolio savitj baltym. Kilpas tvirtinani baltym sudtis interfazje ir metafazje skiriasi. Interfazje, kai vyksta intensyvi gen
transkripcija, chromatino kilpos tvirtinasi prie baltym per vadinamsias upildo prisijungimo
sritis, MAR. MAR bdinga A ir T nukleotid gausa, jos yra netoli stiprikli. Manoma, kad MAR
gali pritraukti chromatino sritis prie kit srii, kur vyksta aktyvi gen transkripcija ir yra gausu
transkripcijos komponent.
5.4.6. RNR PolII transkripcijos preiniciacijos komplekso (PIC)

susimontavimas
Per transkripcijos iniciacij pagrindiniai transkripcijos
Pagrindiniai tanskripcijos veiksveiksniai jungiasi tam tikra tvarka ir ties promotoriumi
niai ir RNR PolII ties geno prosudaro transkripcijos preiniciacijos kompleks, PIC (angl.
motoriumi jungiasi tam tikra
preinitiation complex), kur jungiama RNR II polimeraz.
tvarka bei sudaro transkripcijos
PIC (kurio molekulin mas ~ 2 MDa) svarbus nustatant
preiniciacijos kompleks, PIC.
transkripcijos pradios nukleotid, iskiriant DNR grandines ir atlaisvinant RNR PolII nuo promotoriaus.
Tyrimais in vitro nustatytos PIC komplekso montavimosi ypatybs. Formuojantis transkripcijos preiniciacijos kompleksui pirmasis prie promotori,
kurie turi TATA element, prisijungia pagrindinis transkripcijos veiksnys TFIID. TFIID sudtyje esanius baltymus galima skirstyti dvi pagrindines grupes:
zz prie TATA prisijungiantis baltymas TBP (~30kDa);
zz TAF veiksniai (angl. TBP associated proteins). TFIID sudt eina 1014 TAF veiksni, kuri
molekulin mas 30250kDa. TAF veiksni rinkinys TFIID sudtyje gali bti vairus. Skirtingus TAF veiksni rinkinius turintys TFIID atpasta skirtingus promotorius.
TBP baltymas, bdamas TFIID veiksnio sudtyje, atrankiai prisijungia prie gen promotori
TATA srities (5.25pav., a). Tokiu bdu, prisijungus TBP baltymui, nustatoma transkripcijos pradios
nukleotido padtis. Kiti TFIID veiksnio subvienetai sveikauja su kitomis promotoriaus sritimis.
TBP baltymas yra vis RNR polimerazi (RNR PolI, RNR PolII, RNR PolIII) transkripcijos veiksni
sudtyje. Nors jis RNR PolI ir RNR PolIII transkribuojam gen promotoriuose nebtinai jungiasi prie
sek, panai TATA, taiau yra pagrindinis prie i promotori prisijungiani transkripcijos veiksni
komponentas.
TBP yra konservatyvus eukariot baltymas. Jo konservatyvumas didiausias baltymo Cgale

(~180 aminorgi). TBP jungiasi prie promotori TATA srities DNR i maojo griovio puss.
263
MOLEKULIN BIOLOGIJA
TBP apgaubia vien DNR pus tarsi balnas ir ilenkia DNR ~8090 (5.25pav., b). Lenkimas
vyksta didiojo DNR griovio link, tad yra praplatinamas maasis griovys. Toks DNR ilenkimas
turi funkcin prasm: ties ilenkta DNR gali geriau prisijungti transkripcijos veiksniai ir RNR polimeraz, dalyvaujantys transkripcijos iniciacijoje. Manoma, kad TBP baltymas geriausiai sveikauja su daug A ir T turinios DNR srities oninmis grupmis, o ne su jos savitomis heterociklinmis bazmis. Tai paakint, kodl vairios A ir T gausios sritys prijungia TBP ir gali veikti kaip
TATA duts.
Prisijungus TFIID transkripcijos veiksniui, toliau jungiasi kiti transkripcijos veiksniai, vienas
paskui kit. DNR ir baltym sveikos pdsak (angl. footprint) metodu atlikti tyrimai liudija,
kad prisijungiant vis didesniam veiksni skaiiui, vis didesn promotoriaus sritis yra udengiama. Prie TFIID-TATA komplekso prisijungia TFIIA veiksnys (5.24pav., a). Jis atlieka bent dvi funkcijas: stabilizuoja TBP-DNR sveik ir neleidia prisijungti slopikliams, kurie stabdo tolesn PIC
komplekso susidarym. TFIIA skatina PIC kompleks sijungti transkripcijos veiksn TFIIB. TFIIB
veiksnys yra vieno polipeptido baltymas. TFIIB Cgalinis domenas sveikauja su TBP, DNR ir RNR
PolII. TFIIB Ngalinis domenas (NTD) sveikauja su RNR PolII. TFIIB prisijungia prie TATA dut,
alia TBP baltymo prie savitosios BRE srities ir u TATA srities (5.25pav., a), pailgindamas TFIID
sveikos su promotoriaus DNR paviri. Prisijungus TFIIB, DNR ilinkimas, atsirads prisijungus
TFIID (TBP) transkripcijos veiksniui, dar labiau padidja.
TFIIB jungiamojo domeno dalis Bpirtas (angl. Bfinger) siterpia RNR PolII srit, kuri sintezs metu uima DNR-RNR dupleksas (5.25pav., a). Manoma, kad B pirtas gali atlikti panai
funkcij kaip ir veiksnio 3.2sritis.
Prie TFIIB-TFIID (TBP) komplekso ties promotoriumi prisijungia RNR PolII, kuri kompleks
jungia TFIIF veiksnys (5.24pav.). TFIIF veiksn sudaro du dideli (TFIIF-RAP74) ir du mai (TFIIRAP74) subvienetai. Didieji subvienetai turi daugel funkcikai svarbi domen, kuri vaidmuo
iniciacijoje, elongacijoje ir tam tikr baltym kinazi aktyvumo valdyme yra skirtingas. TFIIF
veiksnio funkcija, susidarant transkripcijos preiniciacijos kompleksui, yra tiksliai prijungti prie
5.24pav. RNR IIpolimerazs transkripcijos preiniciacijos komplekso susidarymas. Promotoriaus

schema. BRE, TATA, Inr elementai paymti. Rodykl ymi transkripcij (a); pagrindini transkripcijos
veiksni jungimosi tvarka (b); transkripcijos preiniciacijos komplekso tarpiniai kompleksai (c) (Nature,
v.495, p.481, 2013)
264
promotoriaus RNR PolII ir neleisti jai sveikauti su ne promotoriaus DNR. Manoma, kad TFIIFRNR Pol komplekso prisijungimas prie promotoriaus yra btinas, kad vliau prisijungt TFIIH
ir TFIIE veiksniai. Pastarieji sijungia PIC kompleks paskutiniai. TFIIE veiksnys reikalingas prijungti TFIIH veiksn ir vliau TFIIH veiksnio aktyvumams pasireikti.
Mieli TFIIH veiksn sudaro 10 subvienet (5.4lentel). Jo molekulin mas prilygsta RNR PolII
molekulinei masei. TFIIH yra pats sudtingiausias pagrindinis transkripcijos veiksnys ir kol kas vienintelis, kuriame nustatyti fermentiniai aktyvumai 2 prieingomis kryptimis veikianios nuo ATP
priklausomos DNR helikazs (XPB ir XPD) ir nuo ciklin priklausoma baltym kinaz (ciklinasHcdk7)
(5.26pav., 5.4lentel). TFIIH galima slygikai suskirstyti dar maesnius subkompleksus:
zz erdin TFIIH kompleks (6 subvienetai);
zz ciklino-kinazs kompleks, CAK (3 subvienetai);
zz jungiamj baltym (1 subvienetas).
5.4lentel. Mieli pagrindiniai transkripcijos, vykdomos RNR PolII, veiksniai
Veiksnys
Molekulin
mas (kDa)
Gyvybikai
svarbus
TBP*
27
Taip
Prisijungia prie TATA srities, pradeda iniciacijos komplekso montavimsi

ties promotoriumi, jungia transkripcijos kompleks TFIIB
TFIIB
38
Taip
Stabilizuoja TATA-TBP sveik, jungia transkripcijos kompleks RNR PolIITFIIF, lemia transkripcijos pradios nukleotido nustatym
TFIIF
2x74
Taip
2x30
Taip
Pagreitina RNR PolII prijungim prie promotoriaus, stimuliuoja transkripcij elongacijos etape, sveikauja su TFIIB; homologikas veiksniui, neleidia RNR PolII sveikauti su ne promotoriaus DNR
Yra TFIID, TFIIF ir SWI-SNF kompleks sudtyje
95
Taip
Nuo DNR priklausoma ATPaz, nuo DNR priklausoma helikaz (35);

dalyvauja DNR grandini iskyrimo, transkripcijos burbulo susidarymo,
elongacijos, DNR reparacijos procesuose
85
Taip
Nuo DNR priklausoma ATPaz, nuo DNR priklausoma DNR helikaz

(53), dalyvauja DNR reparacijoje
73
Taip
Dalyvauja DNR reparacijoje
59
Taip
50
Taip
47,45
Taip
37
Taip
32
Taip
33
Taip
Baltym kinaz, fosforilinanti RNR PolII didiojo subvieneto CTD domen
66x2
Taip
43x2
Taip
jungia transkripcijos TFIIH kompleks, stimuliuoja TFIIH aktyvum, dalyvauja susidarant transkripcijos burbului ir atsilaisvinant RNR PolII nuo
promotoriaus
Dalyvauja susidarant transkripcijos burbului ir atsilaisvinant RNR PolII nuo
promotoriaus
TFIIH
TFII E
Charakteristika ir funkcijos
* Lentelje yra tik TFIID sudtyje esantis TBP baltymas. TFIID, nors ir dalyvauja transkripcijos iniciacijoje ties daugeliu
eukariot promotori, nra unikalus: ties kai kuriais promotoriais pasitelkiamas kitas kompleksas, kuris turi savo sudtyje baltym, pana TBP.
265
MOLEKULIN BIOLOGIJA
TFIIH veiksnys reikalingas RNR Pol II transkripcijos iniciacijos (DNR grandini atskyrimo,
transkripcijos burbulo susidarymo), atsilaisvinimo nuo promotoriaus (angl. promoter escape)
ir elongacijos etapams. Nuo DNR priklausoma XPB helikaz sveikauja PIC komplekse su DNR
sritimis, esaniomis prie transkripcijos pradios nukleotid ir u jo. DNR apsukama apie PIC
kompleks. Manoma, kad nuo ATP priklausoma XPB helikaz galt iskirti DNR grandines
promotoriaus srityje, nors tai patvirtinani eksperimentini rodym trksta. Susidarius transkripcijos burbului, udarasis transkripcijos iniciacijos kompleksas virsta atviruoju transkripcijos
iniciacijos kompleksu, kuris gali vykdyti transkripcijos iniciacij.
TFIIH transkripcijos veiksnio helikazs aktyvumas pasireikia ir DNR NER reparacijoje (angl.
nucleotide excision repair). Kai RNR PolII transkripcijos metu prieina DNR paaidas, tam tikri TFIIH
veiksnio subvienetai tampa komplekso, kuris dalyvauja i paaid reparacijoje, sudtine dalimi.
TFIIH veiksnio sudtyje esanti nuo ciklino priklausoma kinaz (ciklinas H-Cdk7) fosforilina
RNR Pol II didiojo subvieneto CTD domeno (angl. carboxy terminal domain) serino aminorgtis. Modifikacija yra grtama. CTD domenas tai eukariot RNR PolII didiojo subvieneto
5.25pav. TBP baltymas ir jo

sveika su erdinio promotoriaus TATA sritimi. TBP sveika
su TFIIB, DNR ir RNR PolII (a)
(Cell, v.149, p.1432, 2012); TBP
baltymo struktrin organizacija (b); TBP-TATA DNR komplekso erdvin struktra (c)
(http://www.web-books.com/
MoBio/Free/Ch4E.htm)
266
5.26pav. TFIIH veiksnio struktra.

Subkompleks baltymai nuspalvinti
skirtingomis spalvomis (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v.13,
p.343, 2012)
5.27pav. RNR IIpolimerazs CTD domenas. CTD domeno hipotetin (spirals pavidalo) erdvin struktra (Nature, v.430, p.223, 2004) (a); CTD domeno aminorgi motyvo pasikartojimai eukariotuose (b)
267
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Cgale esantys septyni aminorgi Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser (YSPTSPS) pasikartojimai

(5.27pav., b). CTDdomenas polimerazs struktroje yra isidsts atskirai nuo pagrindins baltymo dalies (5.27pav., a). Domeno aminorgi seka yra konservatyvi daugelyje eukariot,
taiau CTD pasikartojim skaiius skiriasi. Pvz., mielse jis pasikartoja 2627 kartus, C.elegants
34 kartus, D.melanogaster 45 kartus, o mogaus RNR PolII 52 kartus. Akivaizdu, kad kuo
didesnis genomas, tuo CTD pasikartojim RNR PolII subvienete daugiau. Mieli CTD domeno
ikrita yra letali. mogaus Blstelse RNR PolII Rpb1subvieneto, neturinio CTD domeno, raika lemia ymius transkripcijos defektus.
CTD neturi archj RNR polimeraz, pirmuoni RNR PolII, taip pat eukariot RNR PolI ir
RNR PolIII.
Be TFIIH veiksnio kinazs, CTD aminorgi liekanas fosforilina dar bent kelios lstels
kinazs, kuri aktyvumas valdomas ciklin. Fosforilinimas sustiprina CTD domeno rgtines
savybes. Dl CTD fosforilinimo vyksta transkripcijos komplekso erdviniai pokyiai ir skatinamas
pirmj nukleotid jungimas RNR. Fosforilint CTD domen defosforilina CTD fosfataz. CTD
yra fosforilinamas ir defosforilinamas skirtingais transkripcijos etapais. Beto, fosforilinimas priklauso ir nuo gen, kuri transkripcij vykdo RNR PolII, promotori.
5.28pav. RNR IIpolimerazs CTD domeno fosforilinimas transkripcijos ciklo metu
268
CTD vaidmuo svarbus pereinant RNR PolII i iniciacijos etapo elongacijos etap bei paliekant promotori. Lstelje yra dvi RNR PolII formos. Pirmoji forma RNR PolII, kurios CTD domenas yra palyginti maai fosforilintas; tokia RNR PolII jungiama transkripcijos preiniciacijos
PIC kompleks. Tai yra hipofosforilinta RNR PolII forma RNAP IIA (5.28pav.).
Pereinant i transkripcijos iniciacijos elongacijos etap (arba tuo paiu metu, arba tuojau
po to), CTD fosforilinamas. Taip susidaro hiperfosforilinta RNR PolII forma RNAPIIO (5.28pav.).
Hiperfosforilintoje CTD uodegoje induoli RNR PolII yra >50 fosfato grupi (~po 1grup
heptadiniam CTD domeno pasikartojimui). Serino 5 aminorgties liekana heptadinio pasikartojimo padtyje fosforilinama, RNR PolII esant ties promotoriais iniciacijos metu, o serino
2aminorgties liekana fosforilinama, RNR polimerazei transkribuojant gen elongacijos metu
(5.28pav.).
RNR PolII CTD domenas yra svarbus RNR pirmini transkript (pre-iRNR) brendimui. Prie
domeno atrankiai jungiasi brendime dalyvaujantys baltymai ir fermentai.
RNR Pol II iniciacijos kompleksui, kaip ir prokariot transkripcijos iniciacijos kompleksui,
yra bdinga nutrkstamoji sintez nedideli transkript sintez, kol susintetinami ilgesni
nei 1015 nukleotid transkriptai. RNR Pol II transkripcijos kompleksas atsilaisvina nuo promotoriaus ir pereina transkripcijos elongacijos etap. I transkripcijos komplekso iame etape
atsipalaiduoja daugelis transkripcijos veiksni. TFIID lieka ties promotoriumi ir gali dalyvauti
pakartotinje transkripcijos iniciacijoje.
RNR PolII transkripcijos kompleksas elongacijos etape pasiymi dideliu procesyvumu. Jis,
pvz., gali susintetinti 2 milijon nukleotid ilgio distrofino geno iRNR pirmtak nedisocijuodamas nuo matricos.
RNR Pol II transkripcijos elongacijos kompleksas, kaip ir bakterins RNR polimerazs TEC
kompleksas, gali bti stabdomas vairi signal. Elongacijos komplekse veikia papildomi baltyminiai veiksniai (pvz., ELL baltymas, elonginas ir kt.), kurie arba aktyvina stabteljusi polimeraz, arba apsaugo j nuo transkripcijos pauzi. Jeigu RNR PolII yra sustabdoma, ji grta atgal,
prie tai susintetintas transkripto 3galas nuskeliamas panaiai kaip ir bakterijose. i RNR PolII
funkcij stimuliuoja elongacijos komplekse esantis dar vienas transkripcijos veiksnys TFIIS.
Manoma, kad is veiksnys terpia savo segtuko struktr aktyvj centr ir tokiu bdu idsto
vien i metalo jon bei nukleofil RNR hidrolizs reakcijai. Veiksnys TFIIS stimuliuoja ir elongacij, apsaugodamas RNAP II nuo transkripcijos pauzi.
5.4.7. Mediatoriaus kompleksas ir jo vaidmuo RNR PolII

transkripcijoje
Transkripcijos erdis, kuri sudaro RNR PolII ir pagrindiniai transkripcijos veiksniai, yra labai
konservatyvi eukariotuose. Taiau in vitro tyrimai parod, kad be i transkripcijos proceso dalyvi, transkripcijoje dalyvauja ir kiti komponentai, kurie veikia kaip tarpininkai tarp RNR PolII
bei transkripcijos veiksni ir savit genams transkripcijos reguliatori. R.Kornbergas su kolegomis mielse nustat didel baltymin kompleks, kuris didino nuo transkripcijos aktyviklio priklausom transkripcij in vitro. Be transkripcijos aktyviklio komplekso veikimas nepasireik,
vyko tik bazin geno transkripcija. Netrukus buvo nustatyta funkcin ssaja tarp komplekso
269
MOLEKULIN BIOLOGIJA
baltymus koduojani gen ir RNR PolII: gen supresorins mutacijos panaikino efektus, sukeliamus sutrumpjusio RNR PolII CTDdomeno. i gen koduojami baltymai kartu su papildomais baltymais sudaro ~2530 baltym kompleks (Mw=1000000Da), kuris buvo pavadintas
mediatoriumi (angl. mediator). Kompleksas nustatytas eukariotuose nuo mieli iki mogaus. Auktesnieji eukariotai
Mediatorius sujungia transkripturi kelet panai kompleks. Mediatoriaus struktra yra
cijos aktyviklius ties tolimaisiais
konservatyvi. Iskiriamos trys pagrindins komplekso
reguliaciniais elementais su
struktrins dalys: galva (angl. head, h), vidurys (angl.
RNR IIpolimerazs transkripcimiddle, m), uodega (angl. tail, t) ir kinazs (CDK8) komplekjos komplekso komponentais
sas (5.29 pav., a). Pastarojo asociacija su kompleksu silir tokiu bdu skatina susimonpnesn nei likusi dali.
tuoti transkripcijos preiniciMediatoriaus komplekso baltymai sukuria paviri,
acijos kompleks ties gen
su kuriuo sveikauja transkripcijos aktyvikliai, RNR Pol II,
promotoriais.
pagrindiniai transkripcijos veiksniai, koaktyvikliai, modifikuoti histonai chromatine (5.29 pav., b.). Mediatoriaus
kompleksas yra vienas esmini transkripcijos valdymo
komponent. Jis netgi traukiamas pagrindini transkripcijos veiksni grup. Aikja, kad mediatorius veikia ne tik transkripcijos iniciacijos, bet ir elongacijos, terminacijos metu, vykstant
pre-iRNR brendimui ir chromatino pertvarkai.
Eukariot RNR PolII transkripcijos kompleks sudaro >60 baltym (5.30pav.). Kodl jis toks
sudtingas? Manoma, kad kompleksas utikrina daugyb reguliacini funkcij ir yra reikalingas gen transkripcijai btent chromatine.
5.29pav. Mediatoriaus struktra vienalsi ir daugialsi eukariot lstelse. Mediatoriaus komplekso sudtis (a) (Molecular Cell Biology, sixth edition, 2007); mediatoriaus ir RNR PolII komplekso struktra (b) (Nature Structural Molecular Biology, v.11, p.394, 2004)
270
5.30pav. RNRII polimerazs transkripcijos preiniciacijos komplekso schema (Current Biology, v.19,
R153, 2009)
5.5. Transkripcijos valdymas prokariotuose

Prokariotuose gen raika gali bti valdoma transkripGen veikla valdoma atrankiai
cijos, transkript brendimo ir transliacijos etapuose. Gen
sveikaujant trans veiksniams
raikos valdymas transkripcijos metu daniausiai vyks(daniausiai baltymams) su cis
ta iniciacijos etape, elongacijos etape jis retas. Valdymas
veiksniais (daniausiai DNR).
pasireikia ir terminacijos metu, kai RNR polimeraz arba
reaguoja savitus terminacijos signalus, arba toliau tsia
transkripcij.
Pamatinius gen valdymo principus bakterijose 1961 m. suformulavo Fransua akobas
(Francois Jacob) ir akas Mono (Jacques Monod), atlik E.coli lacoperono ir bakteriofago tyrimus. Tolesni tyrimai parod, kad ie principai galioja ir eukariotuose. akobas ir Mono pasil,
kad gen veikla yra valdoma atrankiai sveikaujant
trans veiksniams (angl. trans-acting factors) (daniausiai
baltymams) su cis veiksniais (angl. cis-acting factors) (daReguliatoriaus genas koduoja
niausiai DNR sritimis).
baltym reguliatori (arba
Genas yra DNR seka, koduojanti tam tikr produkt
RNR), kuris valdo kit gen
baltym arba RNR. Geno produktas palieka sintezs viet ir
transkripcij prisijungdamas
funkcionuoja kitur jis yra trans veikiantis. Cis veikanios
prie tam tikros DNR srities
sekos yra tos DNR sekos, kurios nepaveriamos kokiu nors
(srii).
produktu ir funkcionuoja kaip sekos, daranios tak su jomis susijusiai DNR.
271
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Apibdinant gen veiklos valdymo mechanizmus yra vartojami terminai struktrinis genas (angl. structural gene) ir reguliatoriaus genas (angl. regulator gene). Struktrinis genas koduoja produkt baltym arba RNR. Struktrini gen produkt funkcijos lstelje yra paios
vairiausios. Reguliatoriaus genas koduoja produkt baltym ar RNR, kuris dalyvauja valdant
kit gen transkripcij.
Transkripcijos reguliavimo pobdis gali bti dvejopas. Teigiamasis reguliavimas pasireikia, kai prisijungus baltymui reguliatoriui prie DNR, vyksta geno transkripcija. Neigiamojo reguliavimo atveju, prisijungus baltymui reguliatoriui, iki tol
vykusi geno transkripcija yra stabdoma. Baltym reguliaGen transkripcijos valdymo
tori prisijungimo vietos daniausiai (bet ne visuomet) yra
pobdis gali bti teigiamasis
isidsiusios prie struktrin gen netoli promotoriaus.
arba neigiamasis.
Bakterij transkripcijos valdymui bdingas ir teigiamasis, ir neigiamasis valdymo pobdis. Neigiamojo gen
transkripcijos valdymo atveju baltymas reguliatorius represorius (angl. repressor) prisijungia prie savitosios DNR srities netoli promotoriaus ir neleidia prie jo prisijungti RNR polimerazei (5.31pav.). Seka, prie kurios jungiasi baltymas represorius, yra cis seka. Ji yra greta promotoriaus, kartais persikloja su jo nukleotid seka. i seka vadinama operatoriumi
(5.31pav).
Operatorius tai prokariot
Esant teigiamajam gen transkripcijos valdymui, balDNR seka, prie kurios jungiasi
tymas aktyviklis prisijungia netoli geno promotoriaus ir
baltymas represorius.
galina RNR polimeraz pradti transkripcij.
Baltymai transkripcijos represoriai ir aktyvikliai yra trans
veiksniai, atpastantys cis sekas, esanias daniausiai prie genus. Cis sekos yra labai trumpos,
daniausiai maesns nei 10bp. ios sekos yra svarbiausios atrankiam baltym represori ir aktyvikli prisijungimui, taiau i tikrj prisijung baltymai reguliatoriai udengia didesn DNR
fragment.
5.31pav. Bakterij operono organizacija (G.Karp.

Cell Biology, sixth edition,
2010)
272
5.5.1. Operonas
Esminis skirtumas tarp gen organizacijos prokariotuose ir eukariotuose yra tas, kad, kitaip
nei daugumos eukariot gen, kuri transkripcija vyksta atskirai, prokariot struktriniai genai
danai sudaro gen sankaupas, kuri transkripcija valdoma koordinuotai ir vyksta nuo vieno
promotoriaus.
Tokios prokariot gen sankaupos vadinamos operonais. Operono molekulin valdymo model 1966m. pasil F.akobas ir .Mono. Operon sudarantys genai transkribuojami kartu susintetinant policistronin transkript. Cistronas reikia vien gen. Operonas danai turi 26 genus, taiau yra operoOperonas yra reguliacinis vien, turini 20 ir daugiau gen. Operonas yra reguliacinis
netas, kur sudaro struktriniai
vienetas, kur sudaro struktriniai genai ir elementai, valdangenai ir j transkripcij valdantys j transkripcij (promotorius, operatorius, terminatorius,
tys elementai.
baltymai represoriai ir / ar aktyvikliai) (5.31pav.).
5.5.2. Laktozs operonas

Bakterij struktriniams genams, koduojantiems funkcikai susijusius baltymus, yra bdinga operono organizacija ir transkripcijos valdymas. Tokie, pvz., yra genai, koduojantys metabolizmo fermentus. Bakterij lacoperonas ir jo transkripcijos valdymas yra tipikas prokariot
gen transkripcijos valdymo pavyzdys. Inagrinsime j detaliau.
Laktozs operon lacZYA sudaro trij struktrini gen sankaupa. Gen produktai nea
lstel ir skaldo (metabolizuoja) galaktozidus, pvz., laktoz (5.32pav., a). Operono struktrini gen funkcijos yra ios:
zz lacZgenas koduoja ferment galaktozidaz. Aktyvus fermentas yra ~500kDa tetrameras. Fermentas skaldo galaktozidus monosacharidus. Pvz., laktoz suskaldoma iki
galaktozs ir gliukozs, kurios lstelje toliau metabolizuojamos (5.32pav., a);
zz lacY genas koduoja laktozs permeaz. Baltymas (30 kDa) yra lstels membranoje
esanios transporto sistemos, kuri nea galaktozidus lstel, komponentas;
zz lacAgenas koduoja tiogalaktozido transacetilaz. Fermentas katalizuoja acetilgrups
perna nuo acetil-CoA (Aacetilkofermento) ant galaktozid. Manoma, kad jo katalizuojama modifikacija sumaina tiogalaktozid toksikum.
Laktozs operon gen transkripcij valdo baltymas reguliatorius, kur koduoja lacIgenas, isidsts kitoje chromosomos vietoje. Pasitaiko, kad lacIgenas bakterijose yra isidsts
netoli lacoperono gen, taiau visais atvejais jo transkripcija vyksta atskirai nuo lacoperono
gen. lacIgenas turi savo promotori ir terminatori. lacIgeno transkripcija nra valdoma ir
priklauso nuo RNR polimerazs savybs jungtis ties geno promotoriumi ir inicijuoti transkripcij. lacoperono transkripcijos valdymo pobdis yra neigiamasis. Transkripcija vyksta, kol jos
nesustabdo baltymas reguliatorius. Baltymo reguliatoriaus mutacijos lemia nuolatin operono
transkripcij. lacIgeno produktas dar vadinamas lacrepresoriumi (angl. lac repressor). Repre-
273
MOLEKULIN BIOLOGIJA
5.32pav. Bakterij lacoperono transkripcijos valdymas. Laktozs skaidymas galaktoz ir gliukoz

(a); lacoperono indukcijos schema (b) (G.Karp. Cell Biology, sixth edition, 2010)
274
sorius yra homotetrameras, kur sudaro 38kDa monomerai. Laukinio tipo E.coli lstelse yra
~10 represoriaus molekuli (tetramer).
Kaip veikia lacIrepresorius? LacIbaltymas prisijungia ties savitomis operatoriaus sekomis
lac operone (5.32 pav., b). lac operono struktroje yra ne viena, bet trys operatoriaus sekos
(O1, O2 ir O3), prie kuri gali jungtis baltymas represorius. Kiekvienas tetramerinio baltymo
sudtyje esantis dimeras gali prisijungti prie vienos operatoriaus sekos. Taigi, tetrameras vienu
metu gali prisijungti prie dviej operatoriaus DNR sek. O1operatoriaus seka yra isidsiusi
ties pirmuoju struktriniu operono lacZgenu. O2 ir O3 operatoriaus sekos yra isidsiusios u
O1operatoriaus sekos (+410bp u transkripcijos pradios nukleotido) ir prie O1operatoriaus
sek (81 bp prie transkripcijos pradios nukleotid). Baltymo represoriaus giminingumas
O1operatoriaus sekai yra didiausias.
Operatoriaus DNR seka yra palindromin seka, kuri atpasta ir prie kurios jungiasi baltymas represorius (5.33pav., a). Ties kiekvienu palindromins sekos invertuotu pasikartojimu
prisijungia represoriaus monomeras. Su DNR sveikauja baltymo monomero spirals-poskiospirals motyvas: dvi jo spirals sveikauja su savitosiomis DNR heterociklinmis bazmis
didiajame DNR griovyje. is motyvas yra baltymo monomero N gale galvos domene (angl.
headpiece). Galvos domenui priklauso ir maa spiral svara (angl. hinge) (5.33pav., b). Svara gyja struktr tik prisijungusi prie operatoriaus DNR maojo griovio. Centrin baltymo
struktros dalis yra erdis (angl. core), o Cgale yra spiral, turinti du heptadinius leucino aminorgi liekan pasikartojimus. i sritis lemia baltymo represoriaus oligomerizacij.
Ties viena operatoriaus seka jungiasi vienas baltymo dimeras. Baltymo represoriaus tetrameras vienu metu gali prisijungti ties dviem i trij (O1, O2, O3) operatoriaus DNR sek. Prisijungus represoriaus tetramerui prie dviej operatoriaus sek, jas skirianti DNR sudaro kilp.
Baltymo represoriaus jungimasis ties daugiau nei viena operatoriaus seka didina transkripcijos slopinim. Paalinus O2 arba O3 operatoriaus sek, slopinimas sumaja 24 kartus, o
paalinusjas abi net 100 kart. Nra nustatyta, kodl represoriaus jungimasis ties dviem operatoriaus sekomis didina transkripcijos slopinim.
Prisijungs prie operatoriaus, baltymas represorius neleidia prie promotoriaus prisijungti
RNR polimerazei ir pradti lacoperono struktrini gen transkripcijos. Kaip tuomet ji vyksta? Lac operono transkripcija yra indukuojama. Gen, koduojani metabolizmo fermentus,
transkripcijos indukcija vyksta, kai aplinkoje yra savito substrato. Nesant substrato, transkripcija stabdoma. Toks gen transkripcijos valdymas yra labai paplits bakterijose ir vienalsiuose eukariotuose (mielse). Taip mikroorganizmai geriau prisitaiko prie aplinkos pokyi.
Nesant augimo terpje galaktozid (laktozs), bakterijose nesintetinama ir juos skelianti
galaktozidaz. Lstelje yra tik kelios fermento molekuls. Esant terpje galaktozid, fermento sintez iauga iki keli tkstani molekuli. Pakeitus augimo terp terp, kurioje nra
galaktozid, pvz., laktozs, galaktozidaz toliau nebesintetinama.
Kokiu bdu induktorius laktoz pakliva lstel, jeigu lacoperono transkripcija yra slopinama
ir nesintetinamas laktozs naai reikalingas fermentas galaktozido permeaz? Lstelje visuomet
yra kelios baltymo molekuls, kuri utenka, kad tam tikras kiekis induktoriaus molekuli paklit
lstel. RNR polimeraz, atsitiktinai disocijavus baltymui represoriui, prisijungia ir sintetina iRNR (vyksta bazin operono transkripcija). To utenka, kad bt sisusintetinta tam tikras kiekis baltymo. Be to,
induktorius gali pakliti lstel ir kitais pernaos keliais.
275
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Laktoz, tiksliau jos izomeras alolaktoz, yra lacoperono induktorius. Induktorius sveikauja su laisvu baltymu represoriumi ir su represoriumi, prisijungusiu ties operatoriaus DNR.
Dl sveikos su induktoriumi represorius tampa neaktyvus sumaja jo giminingumas DNR.
Baltymai represoriai praranda gebjim jungtis su operatoriaus DNR sekomis (laisvas represorius nebesijungia su DNR, o prisijungs disocijuoja). Tuomet prie lacoperono promotoriaus
5.33pav. Bakterij lacoperono transkripcijos represoriaus struktra ir veikimas. lacoperono

operatoriaus DNR struktra (a); LacIrepresoriaus monomero bei tetramero komplekso su DNR erdvins
struktros (b) (http://bio3400.nicerweb.com/Locked/media/ch16/lac_repressor.html)
276
DNR, iki tol uimtos represoriaus, prisijungia RNR polimeraz: vyksta operono gen transkripcija (5.32pav., b).
Laktozs operono represorius turi dvi savitas sritis: viena sritimi jis jungiasi prie operatoriaus DNR, kita prijungia induktoriaus laktozs molekul. Prisijungus laktozei, keiiasi represoriaus molekuls konformacija, kartu ir sveikos su DNR sritis. Represorius nebegali prisijungti
prie operatoriaus DNR. Toks baltymo aktyvumo valdymo bdas, kai viena jo sritis keiia kitos
srities aktyvum, vadinamas alosteriniu valdymu (angl. allosteric control).
Veikiant induktoriui, lac operono genai transkribuojami kartu, o ribosomose vyksta vis
operono koduojam polipeptid sintez. Kai ferment koncentracija didel, induktorius (laktoz), kuris kartu yra ir galaktozidazs substratas, yra suskaidomas. Laktozs koncentracija
sumaja. Sumajus vidulstelinei induktoriaus koncentracijai, jis disocijuoja nuo baltymo
represoriaus, o is tampa aktyvus ir jungiasi prie lac operatoriaus. lac operono transkripcija
slopinama (5.32pav.).
Ne visos molekuls, indukuojanios ferment sintez, yra j ir metabolizuojamos kaip, pvz., laktoz. Induktoriai, kurie, patek lstel, ilgai lieka nesuskaldyti ir indukuoja gen transkripcij, vadinami
nemokamais induktoriais (angl. gratuitous inducers). Tam tikru cheminiu bdu susintetinti induktoriai
yra panas gamtinius induktorius ir plaiai naudojami biotechnologijoje reikaling gen transkripcijai indukuoti. Toks yra, pvz., tiogalaktozidas izopropiltiogalaktozidas IPTG. IPTG nra galaktozidazs substratas, taiau labai veiksmingai indukuoja lacoperono, arba gen, patalpint u lac promotoriaus, transkripcij. IPTG prisijungia plyyje tarp LacI baltymo represoriaus monomer erdini
domen ir juos iskiria. Esant IPTG, tik vieno monomero DNR prijungiantis domenas sveikauja su DNR
didiuoju grioviu, todl represoriaus sveika su operatoriaus DNR silpnja.
Bakterij lac operono transkripcija yra ne tik neigiamojo valdymo taikinys. Transkripcijai
bdinga ir teigiamoji reguliacija. Teigiamoji reguliacija bakterijose buvo atrasta tiriant vadinamj gliukozs efekt. Bakterijoms augant terpje, kurioje greta kit anglies altini, pvz.,
laktozs, yra gliukozs, pirmiausiai yra metabolizuojama gliukoz. Gliukoz tiesiogiai skaidoma
glikolizs cikle, j metabolizuoti bakterijoms paprasiau negu kitus sacharidus, kuri metabolizmui reikia susintetinti papildom ferment. Kol augimo terpje yra gliukozs, laktozs metabolizme dalyvaujani ferment (lacoperono transkripcija) sintez slopinama. Kai gliukoz
sunaudojama, indukuojama gen, koduojani kit terpje esani sacharid metabolizmo
fermentus, transkripcija.
Reikinys, kai operono gen transkripcij valdo ne j koduojam ferment substratas, bet
kitas katabolitas, vadinamas kataboliniu slopinimu. Transkripcijos valdymas katabolinio slopininimo bdu bdingas daugeliui bakterij operon (lac, gal, ara, kt.), koduojani cukr metabolizmo fermentus.
Kai katabolinio slopinimo molekulinis mechanizmas buvo itirtas, paaikjo, kad i tikrj
jis yra ne slopinimo, bet transkripcijos aktyvinimo mechanizmas. lacoperono transkripcijos aktyvinimas vyksta, kai gliukozs koncentracija augimo terpje yra maa. Transkripcijos aktyviklis
yra CRP baltymas (angl. cyclic AMP receptor protein), prijungiantis nedidel molekul ciklin
adenozino monofosfat, cAMP (5.34 pav., a). CRP baltymas (anksiau vadintas CAP) yra 210
aminorgi polipeptid homodimeras. cAMP atradimas bakterij lstelse 1965m. buvo ne-
277
MOLEKULIN BIOLOGIJA
tiktas: iki tol manyta, kad jis dalyvauja tik eukariot metabolizme. cAMP koncentracija bakterijose priklauso nuo gliukozs koncentracijos: kuo gliukozs koncentracija augimo terpje yra
didesn, tuo cAMP koncetracija lstelje yra maesn, ir atvirkiai. cAMP sintetina fermentas
adenilato ciklaz, ciklizuodamas 3-5 fosfoediesterin ry (5.34pav., a). Adenilato ciklaz aktyvina fosforilintas IIAbaltymas. Kai gliukozs koncentracija lstelje yra didel, IIAbaltymas
defosforilinamas, adenilato ciklaz neaktyvinama, o cAMP sintez sumaja.
Transkripcijos aktyviklis CRP baltymas atrankiai prisijungia prie DNR greta lacpromotoriaus
tik bdamas komplekse su cAMP (5.34pav., bc). Taigi, CRP baltymas yra aktyvus tik prisijungus
prie jo maai molekulei induktoriui. Prie DNR prisijungia CRP baltymo dimeras. Konservatyvios sritys, prie kuri jungiasi CRP-cAMP kompleksas, nra didels. Svarbiausias sekos elementas yra pentameras 5TGTGA3. Mutacijos iose srityje slopina CRP veikim.
5.34pav. CRP baltymo erdvin struktra ir sveika su DNR. cAMP struktra ir sintez (a); cAMP-CRPDNR komplekso erdvin struktra (b) (M. K. Campbell and S. O. Farrell, Biochemistry, seventh edition,
2012); cAMP-CRP sveika su promotoriaus DNR ir RNR polimeraze. CTD RNR Pol subvieneto Cgalinis domenas, NTD Ngalinis domenas (c) (R.F.Weaver. Molecular Biology, fifth edition, 2012)
278
CRP dimeras jungiasi prie dviej (invertuot) pentamer, taiau daugelyje prisijungimo viet antrojo pentamero nra, ir antrasis CRP baltymo monomeras prisijungia prie kitokios DNR
sekos. CRP prisijungimo sekos gen transkripcijos pradios nukleotido atvilgiu isidsiusios
vairiai: lacoperone jos greta promotoriaus (61), galoperone promotoriuje (41), araoperone gerokai nutolusios nuo promotoriaus (92).
Prisijungs prie promotoriaus DNR, transkripcijos aktyvikis keiia DNR struktr lenkia
j ~ 90 kampu (5.34 pav., b). Manoma, kad DNR lenkimas arba palengvina CRP sveik su
RNR polimeraze ties promotoriumi ir galina j pradti transkripcij, arba tiesiogiai daro tak
tranksripcijai. Nesant transkripcijos aktyviklio, RNR polimerazs sveika su promotoriumi silpna, transkripcijos iniciacija nevyksta. Panaiu principu veikia ir kiti transkripcijos aktyvikliai,
kurie prisijungia prie promotori bei gretim srii DNR: jie galina RNR polimeraz transkribuoti gen.
Taigi, lacoperono indukcijai reikia laktozs (iaktyvinti LacI represori) ir sumajusios gliukozs koncentracijos (aktyvinti cAMP sintez ir kartu aktyvinti CRP). CRP baltymas yra ne tik
lacoperono, bet daugelio bakterijos gen transkripcijos aktyviklis.
5.5.3. Triptofano operonas

Bakterij laktozs operono genai koduoja fermentus, katabolizuojanius galaktozidus.
lacoperono transkripcija indukuojama, kai yra induktori substrat. Kitokiu bdu yra valdoma tam tikr aminorgi biosintezs fermentus koduojani gen transkripcija. Kol aminorgi lstelje pakanka, j biosintezs gen transkripcija slopinama. Kai aminorgi ima
stigti, transkripcijos slopinimas nevyksta. Tokio transkripcijos valdymo pavyzdys yra bakterij
triptofano (trp) operonas.
Triptofano operon sudaro penki struktriniai genai ir promotoriaus-operatoriaus sritis
(5.35 pav. ir 5.36 pav., a). Struktriniai genai koduoja fermentus, sintetinanius triptofan i
chorizmins rgties. Operono transkripcij slopina baltymas Trp represorius (58kDa), kur
koduoja trpRgenas, isidsts kitoje chromosomos srityje.
Triptofano operono represoriaus dimeras prisijungia prie savitos operatoriaus srities trp
operone, tik sudars kompleks su ligandu triptofanu, ir stabdo transkripcij. Triptofanas yra
trpoperono korepresorius (angl. corepressor). Laisvas Trp represorius yra neaktyvus (aporepresorius). Kai triptofano koncentracija lstelje sumaja, triptofanas disocijuoja i komplekso, o baltymas represorius nuo operatoriaus DNR srities. RNR polimeraz jungiasi prie promotoriaus, vyksta triptofano biosintezs gen transkripcija.
Trp represorius valdo ne tik trp operono, bet ir dar keli operonui nepriklausani gen
(aroH ir savo paties geno trpR0) transkripcij, prisijungdamas prie juose esani operatori srii. Toks valdymo bdas yra autogeninis valdymas.
Triptofano operono transkripcija valdoma dar ir kitu bdu ateniuacijos (5.36pav., b). Ateniuacijos bdu valdomi dar maiausiai ei E.coli operonai. Transkripcijai valdyti pasitelkiamas
ateniuatorius RNR struktra (segtukas), kuri gali susidaryti transkripcijos vieneto pradioje.
Jeigu RNR segtukas susidaro, RNR polimeraz nebegali tsti struktrini gen transkripcijos,
vyksta transkripcijos terminacija; jeigu ne RNR polimeraz tsia transkripcij.
279
MOLEKULIN BIOLOGIJA
5.35pav. trp operono transkripcijos valdymas (G.Karp, Cell Biology, sixth edition, 2010)
280
5.36pav. Bakterij trpoperono transkripcijos valdymas ateniuacijos bdu. trpoperono struktrin

organizacija (a); lyderins sekos ir lyderinio peptido struktra (b); ateniuacijos schema (c) (R.F.Weaver.
Molecular iology, fifth edition, 2012)
281
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Inagrinsime bakterij trp operono transkripcijos valdym ateniuacijos bdu. Apie trpoperono valdym ateniuacijos bdu buvo suinota, kai paalinus DNR sek tarp operatoriaus ir
pirmojo operono struktrinio geno trpE, gen transkripcija padidjo. is efektas nepriklaus
nuo operono slopinimo: paalinus sek, transkripcija padidjo tiek vykstant, tiek nevykstant
slopinimui. Tai paliudijo, kad paalintoji seka dar tak jau prasidjusiai operono transkripcijai.
Triptofano operono ateniuatorius vidinis terminatorius yra tarp promotoriaus ir
trpEstruktrinio geno (5.36pav., a). Susidars susintetintoje RNR, jis stabdo tolesn transkripcij. Ties vidiniu terminatoriumi nutrksta trpoperono gen transkripcija tiek in vivo, tiek in vitro.
Susidaro ~140 nukleotid ilgio transkriptas.
Ar vyks terminacija ties ateniuatoriumi ar ne, priklauso nuo triptofano koncentracijos lstelje. Kai yra daug triptofano, operono transkripcija stabdoma. Dauguma (~90%) RNR polimerazi, po transkripcijos iniciacijos palikusios promotori, ties ateniuatoriumi yra stabdomos.
Kai triptofano yra maai, sintetinamas visas policistroninis trpoperono transkriptas (5.36pav.,
a). Be to, jei trksta triptofano, transkripcijos slopinimas ties operatoriumi nevyksta, taigi, transkripcijos iniciacijos danis ties promotoriumi taip pat iauga. I viso trp transkripcijos veiksmingumas iauga iki 700 kart.
Kokiu bdu ateniuacija priklauso nuo triptofano koncentracijos? Signalai ateniuacijai vykti
yra trp operono lyderinje sekoje (angl. leader sequence). Lyderin seka yra isidsiusi vadinamojoje trpLsrityje (5.36pav., a). Seka koduoja 14 aminorgi polipeptid, kuriame yra dvi
viena alia kitos esanios triptofano aminorgtys. Lyderin seka turi ribosom prisijungimo
srit ir transliacijos terminacijos (STOP) kodon (5.36pav., b).
Lyderin seka, po to, kai susintetinama jos iRNR, gali sudaryti dvejop antrin struktr
(5.36pav., c). Kokia antrin iRNR struktra susidarys, priklauso nuo ribosom gebjimo transliuoti iRNR. Pirmoji lyderins sekos RNR struktra susidaro tarp 1 ir 2 bei 3 ir 4 srii.
Tarpusavyje komplementarios 3 ir 4 sritys sudaro segtuko struktr, u kurio yra 8 uridino
nukleotidai. i struktra veikia kaip prastas transkripcijos terminatorius: ji yra esminis ateniuacijos elementas. Antroji lyderins sekos struktra susidaro, kai susintetintos RNR 1sritis negali
sudaryti komplementarios sveikos su 2sritimi. Taip nutinka tuo atveju, kai dl triptofano stygiaus ribosomos sustoja ties Trp kodonais (kol ribosomas nepaklius triptofanil-tRNRTrp) ir udengia 1 srit. RNR polimeraz sintetina vis ~7000 nukleotid trpoperono iRNR (5.36pav., c).
Kai triptofano koncentracija maa, ribosomos jungiasi prie pradtos sintetinti trpLiRNR. Pasiekusios Trpkodonus, ribosomos ties jais sustoja, nes lstelje nepakanka triptofan turini
tRNR (triptofanil-tRNRTrp). Tuo pat metu RNR polimeraz tsia trp gen iRNR sintez. Transkripte, ties kuriuo nra prisijungusi ribosom (~90 nukleotid fragmentas), susidaro antrin RNR
struktra segtukas (tarp komplementari iRNR 2 ir 3 srii) (5.36pav., c). Segtukas netrukdo
RNR polimerazei pabaigti transkripto sintezs.
Kai triptofano yra pakankamai, ribosomos greitai jungiasi prie lyderins sekos, vyksta transliacija. 1 ir 3 sritys tampa laisvos ir sveikauja atitinkamai su 2 sritimi ir 4 sritimi. Lyderinje sekoje susidaro struktra, veikianti kaip RNR polimerazs terminatorius. RNR polimeraz sustoja.
Tuo metu ribosomos, pasiekusios lyderinio peptido STOP kodon, disocijuoja. Sustabdyta vidinio terminatoriaus, i transkripcijos komplekso disocijuoja ir RNR polimeraz. Susintetinama
133 nukleotid iRNR.
282
5.5.4. Kiti bakterij operonai

Prajusio amiaus antrojoje pusje atlikti bakterij lac, trp, SOS sistem, bakteriofago reguliacini sistem tyrimai patvirtino F.akobo ir .Mono teigin, kad gen raika daniausiai
yra valdoma gen transkripcijos metu, ir valdymo principas yra atranki baltym reguliatori
ir DNR sveika. Nustatyta didel transkripcijos valdymo bd vairov: valdymas pasitelkiant
kelet operatori bei promotori, daugelio operon valdymas vienu represoriumi, baltym
reguliatori sveika su DNR j lenkiant, ankstyvoji transkripcijos terminacija ir t.t.
Pvz., bakterijos galaktozs operono (gal), kurio koduojami genai skaldo galaktoz (galaktoz yra lacoperono koduojamos galaktozidazs reakcijos produktas), transkripcijai valdyti pasitelkia du promotorius. galoperonas yra neigiamai reguliuojamas baltymo represoriaus
5.37pav. Bakterij araoperono transkripcijos valdymas. ara operono transkripcija, esant ir nesant
arabinozs (a); AraCrepresori koduojnio geno tanskripcijos valdymas (b) (R.F.Weaver. Molecular
iology, fifth edition, 2012)
283
MOLEKULIN BIOLOGIJA
panaiu bdu kaip ir lac operonas. gal operone prie struktrinius genus yra isidst du promotoriai, S1 ir S2, kuri tipikos sekos persikloja. Transkripcijos pradios nukleotid padtys
skiriasi 5 nukleotidais. Transkripcija nuo S1promotoriaus yra valdoma katabolinio slopinimo
bdu. Kai augimo terpje yra gliukozs, transkripcija nevyksta. Tuo metu kitas S2promotorius
yra aktyvus.
Bakterij ara operono transkripcijos valdymas yra dar kitoks. Trys operono struktriniai
genai araB, araA ir araD koduoja fermentus, metabolizuojanius arabinoz ksilulozs
5fosfat. araCgenas koduoja reguliacin baltym, kuris jungiasi su arabinoze. Arabinoz yra
araoperono induktorius. Prisijungs arabinoz, reguliatorius tampa aktyvus, jungiasi ties savitja araIsritimi (5.37pav., a). Taiau to nepakanka transkripcijai indukuoti. Gretimoje srityje turi
bti prisijungs cAMP-CRP kompleksas. Tuomet vyksta aragen transkripcija.
Kai arabinozs augimo terpje yra maai, AraCbaltymas veikia kaip represorius ir prisijungia prie dviej operatoriaus srii araO1 araO2, taip pat prie srities araI (5.37pav., a). AraCmolekuls, prisijungusios prie araO2 ir araI srii DNR, sveikauja tarpusavyje: susidaro DNR kilpa,
ara operono gen transkripcija stabdoma. araO2sritis yra araCgeno promotoriuje: prisijungus
AraCbaltymui ties ia sritimi, stabdoma araCgeno transkripcija (5.37pav., b). Taigi, araCgeno
transkripcij valdo pats geno produktas AraCbaltymas. Toks transkripcijos valdymo bdas
yra vadinamas transkripcijos autoreguliavimu.
Taigi, AraCtranskripcijos reguliatorius veikia ir kaip transkripcijos aktyviklis, ir kaip represorius. Tokiu valdymo bdu reguliuojama ir kai kuri kit prokariot gen transkripcija (pvz.,
bakteriofago transkripcijos cIrepresorius veikia panaiai).
5.5.5. Grietasis atsakas

Kai trksta mediag apsirpinti lstelei aminorgtimis, lstelje slopinami tam tikri gyvybikai svarbs procesai. Toks valdymo bdas vadinamas grietuoju atsaku (angl. stringent
response). Grietojo atsako metu lstels metabolizmas yra minimalus, o kai maisto mediag aplinkoje padaugja, metaboliniai procesai suaktyvja. Grietojo atako metu rRNR ir tRNR
sintez sumaja 1020 kart, o vis RNR sintez 510%. Iauga baltym ardymas, tai, savo
ruotu, sumaina nukleotid, angliavandeni, lipid sintez. Grietj atsak sukelia arba kurios nors aminorgties trkumas, arba mutacija aminorgtis prie tRNR jungianiose aminoacil-tRNR sintetazse.
Grietojo atsako metu yra sintetinami du netipiki nukleotidai, vadinami alarmonais. Alarmonas ppGpp turi prijungtus difosfatus nukleozido 3 ir 5galuose. Alarmonas pppGpp turi
prijungt trifosfat guanozino 3 gale ir difosfat 5 gale. Alarmonai yra maos molekuls
efektoriai, kurie prisijungia prie baltym ir keiia j aktyvum.
Alarmonas ppGpp valdo kelet proces, tarp j transkripcijos slopinim. Pvz., ppGpp slopina transkripcijos iniciacij ties rRNR gen promotoriais, taip pat slopina transkripcijos elongacij ties daugeliu gen, sukeldamas RNR polimerazi pauzes.
284
5.6. Transkripcijos valdymas eukariotuose

Fenotipinius skirtumus, kuriais pasiymi eukariot lstels, lemia skirtinga gen, kuri
transkripcij vykdo RNR PolII, raika. Ji valdoma keliais pagrindiniais bdais reguliuojant:
zz chromatino struktr;
zz transkripcijos iniciacij ir elongacij;
zz transkript brendim;
zz transkript na citozol;
zz transkript transliacij;
zz transkript skaidym ir apykait.
Gen raika pirmiausiai priklauso nuo chromatino struktros geno promotoriaus vietoje
ir DNR srityje aplink j. Aktyviai transkribuojami genai yra euchromatino srityse, j DNR jautri
DNazi poveikiui. Daniausiai gen raika valdoma darant tak transkripcijos iniciacijai. Transkripcijos iniciacijos metu daugelis baltym, prisijungusi ties gen promotori ir stiprikli sritimis, sveikauja tarpusavyje ir su RNR IIpolimeraze. Veiksnius, dalyvaujanius transkripcijoje ir
jos valdyme, galima skirstyti kelias grupes:
zz pagrindiniai transkripcijos veiksniai: jie kartu su RNR II polimeraze sudaro bazin
transkripcijos aparat ir prisijungia ties geno promotoriumi;
zz transkripcijos aktyvikliai (angl. activators);
zz transkripcijos represoriai (angl. repressors).
Aktyvikliai ir represoriai eukariotuose atpasta savitas trumpas sekas promotoriuose ir stiprikliuose. Iskiriamos trys transkripcijos aktyvikli klass:
zz tikrieji aktyvikliai (angl. true activators), tiesiogiai arba netiesiogiai (pvz., per koaktyviklius, angl. coactivators) sveikaujantys su pagrindiniais transkripcijos veiksniais ir RNR
PolII ties gen promotoriais;
zz antirepresoriai (angl. antirepressors), kurie, prisijung prie stiprikli sek, pritraukia chromatin pertvarkanius baltymus, o pastarieji ipakuoja chromatin, t.y. apsaugo j nuo
slopinamos bsenos;
zz architektriniai chromatino baltymai (angl. architectural proteins), galintys lenkti DNR ir
taip suartinti transkripcijai aktyvinti reikalingus baltymus.
Eukariot transkripcijos represoriai veikia vairiais bdais. Jie gali prisijungti prie transkripcijos
veiksni, udengdami j naos branduol sekas, kad pastarieji nepaklit branduol. Panaiu bdu
gali bti valdoma ir paties represoriaus naa i citozolio branduol. Represorius gali prisijungti prie
transkripcijos aktyviklio, prisijungusio prie DNR (pvz., stipriklio), ir udengti jo funkcinius domenus.
Represorius ir aktyviklis taip pat gali konkuruoti dl prisijungimo vietos stipriklio DNR sekoje.
Skirting eukariot gen transkripcijos iniciacija valdoma pasitelkiant vairius anksiau mint veiksni derinius.
285
MOLEKULIN BIOLOGIJA
5.6.1. Transkripcijos aktyvikli savybs

Eukariot transkripcijos aktyvikliai yra modulins struktros baltymai, turintys kelis domenus. Svarbiausi domenai yra: prie DNR prisijungiantis domenas (angl., DNA binding domain),
trans aktyvinamasis domenas (angl. trans-acitvating domain) ir domenas, atsakingas u dimerizacij (angl. dimerization domain) (5.38pav.). Kai kurie transkripcijos aktyvikliai dar turi domen, kuriais sveikauja su kitomis molekulmis ligandais (pvz., hormonais). Aktyvikliai taip pat
turi inaos i branduolio (angl. nuclear export sequence) ir naos branduol (angl. nuclear localization sequence) sekas. Paaikjo, kad kiekvienas aktyviklio domenas, patalpintas alia kito tipo domeno, veikia
Baltymai transkripcijos aktynepriklausomai. Su DNR sveikaujantys domenai utikrina
vikliai skatina bazinio transatrank prisijungim prie DNR netoli gen promotori. Akkripcijos aparato susidarym
tyvinamaisiais domenais transkripcijos aktyvikliai sveities gen promotoriais ir tokiu
kauja su baziniu transkripcijos aparatu. Dl i sveik skabdu greitina transkripcijos
tinamas veiksmingesnis bazini transkripcijos komponeniniciacij.
t jungimasis prie geno promotoriaus. Pvz., TFIID veiksnys
yra danas transkripcijos aktyviki taikinys, nes j sudaro
daugelis baltym TAF. Tai paaikina, kodl TBP baltymas, esantis TFIID sudtyje, utikrina tik bazin transkripcij nuo gen promotori, o veiksmingai transkripcijai vykti reikia viso TFIID veiksnio. vairs jo sudtyje esantys baltymai suteikia
savo pavirius vairiems baltymams aktyvikliams prisijungti.
5.38pav. Eukariot transkripcijos aktyvikli domenai. Domen vairov

(a); eukariot transkripcijos
aktyvikli domenin organizacija (b) (L.A.Allison. Fundamental Molecular Biology,
286
Tam tikri transkripcijos aktyvikiai turi tik domen, utikrinant j atrank prisijungim prie
gen promotori bei stiprikli, taiau neturi aktyvinanio domeno. Todl tokie transkripcijos
aktyvikliai prijungia baltymus koaktyviklius (angl. coativators), turinius tokius domenus.
Transkripcijos aktyvikiai gali turti savituosius koaktyviklius.
5.6.2. Transkripcijos aktyvikli atpastami atsako elementai

Eukariot genai, kuri transkripcijos valdymo pobdis yra panaus (pvz., vis j transkripcija aktyvinama atsakant kok nors aplinkos veiksn, hormon ir t.t.), turi promotori ar stiprikli
reguliacines sekas, kurias atpasta tas pats transkripcijos aktyviklis. Tokie sek elementai yra
vadinami atsako elementais (angl. response elements). Prisijungus prie atsako elemento savitam transkripcijos aktyvikliui, yra aktyvinama transkripcija. Gen atsako element pavyzdiai
5.39pav. Zinko pirto motyvo struktra ir sveika su DNR. Zinko pirto motyvo schema (a) (T. Brown.
Introduction to Genetics: a olecular Approach, first edition, 2012); mogaus transkripcijos aktyviklio
Zif268, turinio tris zinko pirto motyvus, ir DNR komplekso struktra. Raudonos rodykls ymi struktr, ali rutuliukai Zn2+ jonai (b) (http://en.wikipedia.org/wiki/EGR1); TFIIIA transkripcijos veiksnio ir
DNR komplekso struktra (c) (PNAS, v.95, p.2938, 1998)
287
MOLEKULIN BIOLOGIJA
yra temperatrinio oko atsako elementas, HSE (angl. heat shock response element), gliukokortikoid atsako elementas, GRE (angl. glucocorticoid response element), serumo atsako elementas,
SRE (angl. serum response element).
Atsako elementai pasiymi trumpomis tipikomis sekomis, prie kuri jungiasi transkripcijos
aktyvikliai. Skirtinguose genuose tie patys atsako elementai yra panas, bet j nukleotid sekos nebtinai yra identikos. Promotoriuose atsako elementai yra isidst prie transkripcijos
pradios nukleotid <200np. Vieno atsako elemento kopijos paprastai utenka transkripcijos
atsakui pasireikti, taiau j gali bti ir daugiau. Atsako element yra ne tik promotoriuose, bet
ir stiprikliuose.
Tipikas atvejis, kai grups gen transkripcija valdoma to paties transkripcijos reguliatoriaus, yra genomo atsakas temperatrin ok. Koordinuotas gen transkripcijos atsakas
aplinkos veiksn yra bdingas ir eukariotams, ir prokariotams. Bakterijose sintetinamas vienas i
RNR polimerazs veiksni 32veiksnys. Jis RNR polimerazs holofermento sudtyje jungiasi
ties savitosiomis promotori sritimis (10 ir 35) temperatrinio oko atsako genuose. Esant
temperatriniam okui, vyksta i gen transkripcija.
Eukarotuose temperatrinio oko genai promotoriuose turi HSE atsako elementus. Toki
gen yra ~ 20. Elementai isidst gen promotoriuose vairiose padtyse. Prie HSE atsako
element atrankiai jungiasi transkripcijos aktyviklis HSTF. HSE atsako elementai ir prie j prisijungiantis transkripcijos veiksnys yra konservatyvs eukariotuose: temperatriniu oku galima
aktyvinti D.melanogaster temperatrinio oko genus, terptus jr eio, induoli lsteles.
Kitas atsako elemento pavyzdys yra GRE elementas (5AGAACANNNTGTTCT3, kur N bet
kuris nukleotidas). GRE seka yra palindromas. Joje yra dvi konservatyvios sritys ir vidurin nekonservatyvi sritis. Prie dviej GRE elemento srii jungiasi dvi transkripcijos aktyviklio gliukokortikoido receptoriaus baltymo molekuls (5.39pav.).
Gliukokortikoidai (pvz., kortizolis) yra steroidiniai hormonai, gaminami antinksi ievje.
Hormon gamyba iauga streso, badavimo metu, esant dideliems fiziniams krviams. Hormono veikimas pasireikia tuo, kad jis skatina kepen lsteles gaminti gliukoz i aminorgi
ir kit ma molekuli. Tam reikia sintetinti metabolizmo fermentus, prie tai aktyvinus juos
koduojani gen transkripcij. Gliukokortikoidai lengvai patenka lstels branduol, ten sveikauja su savituoju receptoriumi. Gliukokortikoido receptorius kartu yra ir transkripcijos aktyviklis. Susijungs su savo ligandu hormonu, baltymas jungiasi prie GRE atsako elemento,
esanio grups gen stiprikliuose ir smarkiai aktyvina gen transkripcij. Sumajus hormono
kiekiui, transkripcija silpnja.
5.6.3. Transkripcijos aktyvikli sveikos su DNR motyvai

Nustaius daugelio transkripcijos aktyvikli erdvines struktras, paaikjo ir j domen, sveikaujani su DNR, struktros. Juose esantys motyvai pagal j erdvines struktras skirstomi
kelet grupi:
zz cinko pirto motyvai;
zz steroidiniai receptoriai;
288
zz spirals-poskio-spirals motyvai;
zz spirals-kilpos-spirals motyvai;
zz leucino utrauktuko motyvai.
Motyv struktr vairov liudija, kad eukariot baltymai pasitelkia vairi bd sveikauti
su DNR. Transkripcijos aktyvikliai (danai j erdvin struktra yra spirals) tokiais motyvais
atrankiai sveikauja su didiuoju DNR grioviu 36bp srityse. Susidarant nekovalentiniams ryiams (VanderValso, joniniams, vandeniliniams ryiams) tarp baltymo aminorgi onini
grupi ir DNR heterociklini bazi didiajame griovyje, atpastama savitoji DNR seka. Sveika
tarp aminorgi onini grupi ir deoksiribozi bei fosfatini grupi taip pat stabilizuoja
DNR-baltymo kompleks.
Cinko pirto motyvai (angl. zink finger). Cinko pirto struktrinis motyvas pirm kart buvo
nustatytas pagrindiniame TFIIIA transkripcijos veiksnyje, kuris reikalingas RNR PolIII 5S rRNR
gen transkripcijai. Motyvo pavadinimas susijs su jo struktros ypatumais. Cinko pirt sudaro baltymo ~23 aminorgi grup, kurioje dvi cisteino ir dvi histidino aminorgi liekanos
kartu koordinuoja po vien cinko jon (Zn2+) (5.39pav., a).
Cinko pirto motyve cisteino aminorgi liekanos yra struktroje, o histidino prieingoje pusje esanioje spiralje (5.39pav., ab). Aminorgtys, neprijungianios cinko, sudaro
kilp. Cinko pirto motyvas savo spirale (Cgalinje motyvo dalyje) jungiasi ties didiuoju DNR
grioviu. Cinko pirto motyv daniausiai yra ne vienas, o keli. Pvz., jau mintame TFIIIA veiksnyje yra net 9 motyvai: jie uima kone vis baltymo erdvin struktr (5.39pav., bc).
Steroidiniai receptoriai. Steroidiniai receptoriai sudaro savit transkripcijos aktyvikli grup, nes juos sieja funkcinis panaumas: kiekvienas receptorius yra aktyvinamas prisijungus tam
tikram steroidui (ligandui). Steroidiniai receptoriai priklauso dar didesnei ligandais aktyvinam aktyvikli grupei.
Antinksi ievs lstels gamina daugiau nei 30 skirting steroid. Dvi didiausias grupes
sudaro jau mintieji gliukokortikoidai ir mineralokortikoidai. Steroidini receptori (ir kai kuri
kit baltym) motyv, sveikaujani su DNR, erdvin struktra yra panai jau mint cinko
pirto motyv. Taiau is motyvas turi tik cisteino aminorgi liekanas, kurios suria cinko
(Zn2+) jon. Kitaip nei Cys ir His aminorgi liekanas turintis motyvas, vien tik Cys liekanas
5.40pav. mogaus progesterono receptoriaus

dimero ir DNR komplekso erdvin struktra
(PDB:2C7A). Pilki rutuliukai Zn2+ jonai
289
MOLEKULIN BIOLOGIJA
turini cinko pirto motyv pasikartojim baltymuose nra daug: pvz., gliukokortikoid ir estrogen receptoriai j turi po du. Du cinko pirtai sudaro dviej spirali struktras, kurios
kartu sudaro didel globul. Aromatins spirali aminorgi grups kartu su jas jungiania
struktra sudaro hidrofobin centr.
Du gliukokortikoid receptoriai sudaro dimer, kiekvienas monomeras sveikauja su atsako elemento palindromins sekos konservatyvia sritimi (5.40 pav.). Kiekviename monomere
esantys du cinko pirtai pasiymi dvejopa funkcija. Vieno cinko pirto aminorgtys sveikauja
su palindromins sekos konservatyvia sritimi, o kito reguliuoja atstum tarp kiekvieno monomero atpastam DNR srii atsako elemente.
Kai kurie steroidiniai receptoriai veikia kaip homodimerai, kiti kaip heterodimerai. Homodimerins struktros steroidiniai receptoriai sveikauja su palindrominmis sekomis atsako
elementuose. Heterodimerins struktros receptoriai atpasta tiesioginius sek pasikartojimus, t.y. orientuotus ta paia kryptimi.
Kaip steroidiniai receptoriai kartu su ligandu, prisijung ties atsako elementu, reguliuoja
transkripcij? Jie tiesiogiai sveikauja ne su baziniu transkripcijos aparatu, bet su baltymais
koaktyvikliais, kurie, savo ruotu, sveikauja su transkripcijos komplekso komponentais.
Spirals-poskio-spirals (angl. helix-turn-helix, HTH) motyvai. ie transkripcijos reguliatori motyvai pirmiausiai buvo nustatyti bakteriofag transkripcijos represori erdvinje
struktroje, vliau aptikti ir transkripcijos aktyvikliuose. Viena motyve esanti spiral isidsto
atsako elemento didiajame DNR griovyje, kita pasisukusi kampu iilgai DNR (5.41pav., a).
Vienas io tipo motyv variant yra homeodomenas. Homeodomenas pirm kart buvo
nustatytas D. melanogaster genuose (homeotiniame lokuse), reguliuojaniuose ankstyvj vystymsi. Homeodomen turi ir induoli transkripcijos veiksniai. Motyv sudaro ~60 amino-
5.41pav. Transkripcijos veiksni spirals-poskio-spirals motyvo struktra. Motyvo schema (a)

(http://oregonstate.edu/instruct/bb350/ahernmaterials/a11/11p55.jpg); Drosophila melanogaster homeodomeno motyvo ir DNR komplekso erdvin struktra (b) (PDB: 1AHD)
290
rgi liekan. Jos formuoja tris spirales. Didiausiu aminorgi konservatyvumu pasiymi 3-ioji spiral (17 aminorgi liekan). i spiral sveikauja su didiuoju DNR grioviu ji
sudaro didij dal ryi tarp baltymo ir DNR (5.41pav., b).
domu, kad spiral idstoma DNR griovyje susidarant ryiams tarp baltymo ir onini
fosfatini grupi. Kitos dvi spirals yra DNR iorje. Ngalin motyvo dalis, esanti prie 1-j
spiral, yra nukreipiama maj DNR griov. Savitj saveik su DNR heterociklinmis bazmis lemia tik nedidel dalis homeodomeno aminorgi, esani motyvo N bei Cgaluose.
Spirals-kilpos-spirals motyvai (angl. helix-loop-helix, HLH). Su DNR sveikaujani baltym HLH motyvo struktr sudaro dvi spirals, kurias jungia kilpa (5.42pav., a). Baltymams,
turintiems HLH motyv, bdinga ir kita savyb: jie sudaro dimerus (5.42pav., ab). HLH motyve
yra ~4050 aminorgi liekan. Dvi motyvo spirals yra amfipatins, t.y. vienoje spirali
pusje yra hidrofobini aminorgi liekanos, kitoje hidrofilini. Kilpos, skirianios dvi spi-
5.42pav. Baltym spirals-kilpos-spirals ir leucino utrauktuko motyvai. Spirals-kilpos-spirals

motyvo struktrin schema (a); motyv turinio Myc-Max baltymo dimero ir DNR komplekso erdvin
struktra (b) (L.A.Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012); leucino utrauktuko
motyvo ir DNR komplekso erdvin struktra (c) (http://en.wikipedia.org/wiki/Leucine_zipper)
291
MOLEKULIN BIOLOGIJA
rales, dydis bna vairus. HLH motyv turintys baltymai gali bti homodimerai arba heterodimerai priklausomai nuo to, kokiomis hidrofobinmis spirali aminorgtimis jie sveikauja.
Daugeliui HLH motyv turini baltym yra bdinga bazinmis savybmis pasiyminti 15 aminorgi sritis, esanti prie HLH motyv. Joje yra ~ 6 konservatyvios aminorgtys. Btent
i sritis nulemia baltymo sveikos su DNR atrankum. Toki baltym spirals-kilpos-spirals
motyvas dar vadinamas bHLH motyvu. bHLH motyv turintys baltymai visuomet sveikauja
su DNR kaip dimerai. Galimyb sudaryti heterodimerus ypa padidina DNR taikini vairov.
Lstelje, sintetinanioje penkis skirtingus polipeptidus su HLH motyvais, gali susidaryti 32
skirtingi transkripcijos veiksni dimerai, sveikaujantys su skirtingomis DNR sekomis. Ne vis
kombinacij dimerai vienodai stipriai sveikauja su DNR sekomis. Nra nustatyta, kaip vairi
kombinacij dimerai atpasta maai besiskirianias nukleotid sekas. HLH motyvus turintys
transkripcijos veiksniai yra vieni i pagrindini gen, lemiani tam tikr audini (pvz., raumen) diferenciacij, transkripcijos reguliatori. ie veiksniai svarbs kontroliuojant lsteli proliferacij ir yra susij su tam tikrais vio tipais.
Leucino utrauktuko motyvas (angl. leucine zipper motiv). Motyv turintys transkripcijos
veiksniai taip pat pasiymi savybe dimerizuotis. Motyv sudaro 3040 aminorgi liekan,
kurios formuoja amfipatin spiral. Jo pavadinimas susijs su tuo, kad spiralje kas 7 aminorgties liekana yra leucinas. spirals skyje telpa 3,5 aminorgties liekanos, todl leucino
utrauktuko motyve leucino aminorgi liekanos isidsto vienoje (hidrofobinje) spirals
pusje (5.42pav., c). Du leucino utrauktuko motyvus turintys polipeptidai sveikauja tarpusavyje sudarydami superspirals struktros dimer. Superspiralje vieno monomero spirals
leucino aminorgi liekan onins grups siterpia tarp kito monomero spirals leucino
onini grupi.
Kaip leucino utrauktuko motyvas sveikauja su DNR? Kiekvieno baltymo monomero struktroje alia spirals yra bazini aminorgi liekan sritis, kuri sveikauja su DNR. Sekos, su
kuriomis sveikauja motyv turintys baltymai, yra palindromai, j neskiria joks tarpas. Baltym
dimero, sveikaujanio su DNR, struktra primena apverst Y raid: stieb sudaro dviej spirali superspiral, o kiekvieno monomero bazini aminorgi fragmentai dvi rankas (angl.
arm) (5.42pav., c). i struktra vadinama bZIP. AP1 transkripcijos aktyviklis yra leucino utrauktuko motyv turinio transkripcijos veiksnio pavyzdys. AP1 yra heterodimeras, sudarytas i
dviej polipeptid, koduojam gen c-fos ir c-jun. Abu genai yra svarbs lsteli proliferacijai,
j mutacijos sukelia vin transformacij.
5.6.4. Maosios RNR ir gen raikos valdymas

Gen raika prokariotuose ir eukariotuose valdoma pasitelkiant ne tik baltymus, bet ir
RNR. Kai kuriuos tokio valdymo pavyzdius bakterijose (ribojungiklius, ateniuacij) aptarme
ankstesniuose skyriuose. Prokariotuose transkripcijos ir transliacijos procesai vyksta citozolyje,
o eukariotuose jie atskirti erdvje (transkripcija vyksta branduolyje, transliacija citozolyje).
Eukariot iRNR molekuls daug stabilesns nei eukariot, todl yra galimyb iplsti t gen
raikos valdym, kurio taikiniai yra btent iRNR. Tam pasitelkiamos trumpos (2030 nukleotid)
RNR molekuls maosios RNR (angl. small RNA), kurios, sudariusios kompleks su savitaisiais
292
baltymais (Argonaut eimos baltymais, Ago), slopina trankripcij, RNR molekuli brendim
arba transliacij.
Maj RNR fenomenas buvo atrastas tyrinjant kirmls Cenorhabditis elegans vystymosi
mutantus. Mutacijos buvo nustatytos ne baltymus koduojaniuose genuose, bet maj RNR
genuose. Toki RNR kodavo reguliacinis lin-4genas, kurio taikinys lin14genas. C. elegans lin14genas reguliuoja jos vystymsi pirmose vystymosi stadijose. lin-4genas koduoja 22 nukleotid lin-4RNR. 10 ios RNR nukleotid yra komplementars lin-14 iRNR 3sriiai. lin-14geno
raika slopinama, prie lin-14 iRNR komplementari srii prisijungus kelioms lin-4 molekulms
(5.43pav.). Susidarius tokiam kompleksui, slopinama lin-14 iRNR transliacija. Vliau paaikjo,
kad iRNR gali bti ir suardoma. Po keleri met C. elegans atrasta dar viena maoji reguliacin
RNR let-7. Taip iaikjo, kad maosios RNR yra universalus eukariot gen raikos valdymo
bdas.
Maj RNR veikimo fenomen 1999 m. paaikino Endriu Fairas (Andrew Fire) ir KreigasMelu (Craig Mello). Jie injekavo kirmles dvigrandin RNR. i slopino geno taikinio raik tais atvejais, kai turjo iRNR molekulei komplementari srii. Fenomen tyrjai pavadino
RNR interferencija (angl. RNA interference, RNAi). U atradim jiems 2006m. paskirta Nobelio medicinos premija.
Maj RNR sukeliamas efektas augaluose, konkreiai, petunijose, buvo pastebtas dar anksiau,
taiau jo nesugebta paaikinti. 1990m. Riardas Jorgensenas (Richard Jorgensen) su kolegomis terp petunijas genus (transgenus), nordami padidinti chalkono sintazs geno raik. Panaudodami
ferment antocianino pigment gamybai, jie siek gauti rykesnes gles. Netiktai iaugo baltos su
rykiu pieiniu arba visikai baltos gls. Tai paliudijo, kad u pigmento sintez atsakingo geno raika
ne padidjo, bet, atvirkiai, buvo slopinama. Reikinys pavadintas kosupresija, nes pasireik tiek
endogenini, tiek terpt gen raikos slopinimas. iRNR sintez sumajo apie 50 kart. ie eksperimentai sukl susidomjim, ir efektas imtas tyrinti kituose eukariotiniuose organizmuose.
Prajus daugiau nei dvideimiai met po maj RNR atradimo, iandien inome, kad j
lstelse yra tkstaniai. Maosios RNR yra svarbs eukariot gen raikos valdymo komponentai. Iskiriamos trys maj RNR klass:
zz miRNR (angl. micro RNA, miRNA);
zz siRNR (angl. small interfering RNA, siRNA);
zz piRNR (angl. PIWI-interacting RNA, piRNA).
Didiausia miRNR molekuli klas. J rasta vis gyvybs domen organizmuose bei virusuose. miRNR koduojantys genai sudaro ~1% auktesnij eukariot genomo. Nustatyt
eukariot miRNR skaiius jau perkop 20000. mogaus lstelse yra >1500 vairi miRNR, o
numanom j taikini >30000. Kai kurios miRNR konservatyvios tarp ri. Genome miRNR
koduojantys genai gali bti isidst telkiniais ir transkribuojami kartu. miRNR gali bti koduojamos baltymus koduojani gen egzonuose ir intronuose (induoliuose ~70% miRNR
koduojamos toki gen intronuose); taip pat ilgose nekoduojaniose RNR; kai kurios, manoma, gali bti transkribuojamos nuo sav promotori. Didiosios dalies miRNR transkripcijoje
293
MOLEKULIN BIOLOGIJA
dalyvauja RNR PolII, kai kurias miRNR (esanias Alu pasikartojimuose) transkribuoja RNR PolIII.
Augaluose kai kurias miRNR transkribuoja RNR PolIV. Pirminiai miRNR transkriptai yra vairaus
ilgio, vidutinis j ilgis ~1000nt. RNR PolII transkribuojam miRNR galas modifikuojamas kaip
ir pre-iRNR molekuli. Funkcionalios yra subrendusios miRNR.
5.5lentel. Eukariot maj RNR savybs ir funkcijos2
Savybs
miRNR
siRNR
piRNR
Ilgis
~22nt
~21nt
~2430nt
Brendime dalyvaujantys
fermentai
Drosha ir Dicer
Dicer
Zucchini ir kiti neinomi

fermentai
Susij Ago baltym

poeimai
AGO
AGO
PIWI
Veikimo mechanizmas
Transliacijos slopinimas;
iRNR ardymas
iRNR skaldymas
Transpozon transkripcinis arba posttranskripcinis

slopinimas
Funkcijos
Baltymus koduojani
gen raikos valdymas
Baltymus koduojani
gen raikos ir transpozon valdymas; prievirusin
apsauga
Transpozon slopinimas
lytinse lstelse (nelytini lsteli piRNR funkcijos menkai itirtos)
Iskiriami keli miRNR molekuli brandinimo etapai. Pirmojo etapo vykiai vyksta branduolyje (5.44pav.). Nesubrendusios pri-miRNR sudaro stiebo-kilpos struktr. Stiebo ilgis apie 30
35bp. Struktr atpasta ir skelia branduolio nukleaz Drosha. Drosha yra dvigrandinei RNR
atranki endonukleaz, priklausanti RNazs III tipo baltym eimai. Baltymas yra dimerins arba
pseudodimerins struktros, turintis du RNazs III domenus (RIIID). Drosha veikia Mikroprocesoriaus komplekse (angl. Microprocessor complex) kartu su baltymu kofaktoriumi (mogaus
lstelse tai yra DGCR8 baltymas). Kofaktorius sveikauja su pri-miRNR ir su Drosha. Mikroprocesoriaus komplekso baltymai yra konservatyvs gyvn organizmuose, o augal lstelse
brendime dalyvauja tik Drosha panas baltymai.
Drosha skelia dvigrandin pri-miRNR dviejose vietose ~11bp atstumu nuo viengrandini fragment (5.44pav.). Atskeliama segtuko pavidalo ~70nt ilgio pre-miRNR. Po sklimo
pre-miRNR 3gale lieka 2 nukleotid ikya, o 5gale fosfato grup. Iky atpasta baltymas eksportinas 5. Jeigu miRNR yra koduojamos intronuose, j brendimas vyksta kartu su
transkripcija.
Po sklimo pre-miRNR ineamos citozol. Inaai reikia eksportino5 ir GTP surianio Ran
baltymo. Perneus pre-miRNR citozol, GTP hidrolizuojamas.
Citozolyje pre-miRNR ties kilpa skelia Dicer endonukleaz, susidaro ~22np dvigrandin
miRNR. Dicer endonukleaz turi tandemin endonukleazs aktyvj centr, pana Drosha.
Dicer pasiymi ir helikazs domenu Cgale bei PAZ domenu, kuris prisijungia prie pre-miRNR
galo (5.45pav., a).
Ikelta hipotez, kad PAZ ir endonukleazs domenai veikia kaip molekulin liniuot skeliant pre-miRNR.
Pagal: M. Ha and V. N. Kim. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014.
294
Nustatyta ir netipik miRNR brendimo bd, kuriuose nedalyvauja Mikroprocesoriaus kompleksas ar Dicer endonukleaz. miRNR pirmtakai mirtronai gali bti ikerpami laso pavidalo introno
struktroje vykstant pre-iRNR splaisingui branduolyje. Laso struktra atidaroma, RNR susilanksto stiebo-kilpos struktr, panai miRNR. miRNR brendimo metu vyksta ir kitos modifikacijos: pvz., augal
miRNR 3gal metilina metiltransferaz HEN1.
Po Dicer sklimo dvigrandin subrendusi miRNR prijungiama prie vieno i Ago eimos baltym susidaro RISC kompleksas (angl. RNA-induced silencing complex, RISC). RISC komplekso susimontavimas apima du vykius dvigrandins miRNR jungim, vliau jos grandini atskyrim.
AGO baltymai skirstomi tris poklasius: AGO, PIWI ir kirmlms savitus Ago baltymus (angl.
worm-specific AGO proteins, WAGOs). AGO baltym turi bakterijos, archjos, eukariotai. AGO
baltymai yra tridomenins struktros: PAZ domenas atsakingas u sveik su miRNR vienos
5.44pav. miRNR brendimas (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v.15, p.509; 2014; Nature Reviews
Molecular Cell Biology, v.10, p.126, 2009)
295
MOLEKULIN BIOLOGIJA
5.45pav. AGO baltym struktra. AGO2 baltymo domenin organizacija (a); AGO2 baltymo ir miRNR
grandins vedaniosios RNR komplekso erdvin struktra (b) (Nature Reviews Molecular Cell Biology,
v.15, p. 509, 2014)
5.46pav. miRNR taikini atpainimas augal (a) ir gyvn (b) lstelse. ORF atvirasis skaitymo
rmelis (Nature Reviews Genetics, v.12, p.99, 2011)
296
RNR grandins vedaniosios RNR (angl. RNA guide) grandins 3galu, MID domenas atsakingas u sveik su jos 5galu, o PIWI domenas yra panaus RNaz H ir gali skelti taikin
iRNR (5.45pav., ab). Taiau sklimo aktyvumu pasiymi ne visi AGO baltymai: pvz., i keturi
mogaus AGO baltym tok aktyvum turi tik AGO2.
Prisijungus AGO baltymams, vyksta RISC komplekso brendimas. Brendimo metu viena
miRNR grandin vadinamoji keleivin grandin (angl. passenger strand) atskiriama ir greitai suardoma, o kita grandin jau minta vedanioji grandin paliekama. Kai kuriuose RISC
kompleksuose keleivin grandin skeliama. Grandini atranka vyksta pagal nedidelio RNR duplekso gal stabilum. Grandin, kurios 5 galas yra maiau stabilus, paprastai pasirenkama
kaip vedanioji grandin. Kitas kriterijus pasirenkant grandines yra pirmasis grandins nukleotidas grandin su U pirmoje pozicijoje pasirenkama kaip vedanioji grandin. Pasirenkant
miRNR grandin turi reikms Dicer baltymas ir su juo sveikaujantys baltymai.
Subrend RISC kompleksai prijungia taikinius iRNR. Prijungimas vyksta dl komplementarios sveikos tarp miRNR ir iRNR molekuli. Svarbiausia miRNR dalis yra 58nt seka molekuls
5.47pav. Egzo- ir endo-siRNR biogenezs bdai (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v.10, p.126,
2009)
297
MOLEKULIN BIOLOGIJA
5gale, kuria ji prisijungia prie taikinio iRNR molekuls 3galo. Pvz., augaluose miRNR yra visikai komplementari taikiniui, kuris daniausiai skeliamas per iRNR-miRNR duplekso vidur ir
suardomas (5.46pav., a). Augal miRNR 3galas yra modifikuojamas prijungiant prie 2Ometilgrup, kuri apsaugo miRNR molekul nuo suardymo.
Gyvn miRNR seka tik i dalies komplementari iRNR taikiniui (5.46pav., b). Prijungiant taikin toki miRNR 5gale esanti grdo seka (angl. seed sequence) nukleotidai 27 padtyse yra
pagrindin. iuo atveju RISC kompleksas veikia dvejopai: skatina iRNR 3galo deadenilinim ir
iRNR suardym arba slopina transliacij iniciacijos ar elongacijos etapuose (5.44pav.). Transliacijos iniciacijos etape RISC kompleksas gali prisijungti prie kepurs (angl. cap) struktros iRNR
5gale ir trukdyti jungtis iniciacijos eIF4E veiksniui arba didiajam ribosomos subvienetui, taip
pat trukdyti kepurs ir poli(A)galo sveikai ciklizuojantis iRNR.
Informacins RNR RISC kompleksuose taip pat gali bti telkiama citozolyje Pkneliuose (angl.
Pbodies) ir taip ivengti transliacijos (5.44pav.). Pkneliai yra RNR ir baltym sankaupos citozolyje, kuriuose pradedama ardyti iRNR. ia gausu 3poli(A)gal ir 5kepur alinani ferment.
Kitos maj RNR klass siRNR molekuls (~21nt) daniausiai nra koduojamos genome.
Jos susidaro i egzogenins dvigrandins RNR (virus RNR, taip pat terptos lstel dvigran-
5.48pav. piRNR biogenez (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v.12, p.246, 2011)
298
dins RNR) arba endogenins dvigrandins RNR vadinamosios endo-siRNR. Endogenins

kilms siRNR susidaro i genome koduojam transpozon transkript, prieprasmi (angl. antisense) ir prasmini (angl. sense) tos paios genomo srities RNR por, ilg, stiebo-kilpos struktros transkript (5.47pav.). Endo-siRNR rasta vabzdiuose, augaluose, kirmlse, induoliuose. Kitaip nei miRNR, egzogenins ir endogenins kilms siRNR brendime citozolyje dalyvauja
tik Dicer endonukleaz. Prie siRNR prisijungia vienas i Ago baltym. siRNR ir Ago2 kompleksas
skelia iRNR; nustatyti kompleksai, kurie slopina iRNR transliacij.
Egzogenins siRNR plaiai naudojamos eksperimentinje lstels biologijoje eukariot gen raikai slopinti. Taikiniui komplementarios siRNR gali bti tiesiogiai terpiamos lsteles ilg RNR pirmtak
pavidalu arba koduojamos rekombinantiniuose raikos vektoriuose, kurie terpiami, pvz., transfekcijos
bdu. Indukavus prasmins ir prieprasms grandini, klonuot vektoriuje, transkripcij, lstelje susidaro dvigrandin RNR, kuri citozolyje skelia Dicer. Susidaro funkcionali siRNR, komplementari taikiniui iRNR. siRNR molekuls slopina geno taikinio raik vairiais laipsniais (angl. knockdown).
prastai raika nra visikai slopinama, kaip, pvz., iveiklinus (angl. knockout) gen mutacijomis.
Treio maj RNR klass piRNR molekuls (2430nt) brandinamos i viengrandini RNR,
koduojam tarpgeninse srityse, kuriuose yra pasikartojani element, aktyvi transpozon
gen ir vadinamj piRNR telkini (angl. piRNA clusters) (5.48 pav.). vairi piRNR molekuli
lstelje yra tkstaniai. piRNR susijungia su PIWI baltymais, kurie yra Ago eimos poeimio
baltymai, bdingi lytinms lstelms. Pagrindin piRNR funkcija yra transpozonini element
(transpozon, retrotranspozon), kurie gali siterpti vairiose genomo vietose ir tokiu bdu trikdyti jo integralum, slopinimas (angl. silencing) lytinse lstelse. i piRNR savyb konservatyvi
gyvn organizmuose, ir tai liudija jos svarb. induoliuose ir vabzdiuose piRNR yra komplementarios transpozono prasminei ir prieprasmei RNR grandinms.
Drosha ar Dicer nukleazs piRNR brendime nedalyvauja. Brendimas apima du etapus: pirmin ir antrin brendim. Pvz., vykstant pirminiam brendimui induoliuose ir vabzdiuose, ilgas
transpozono transkriptas, kuriame yra piRNR molekul, skeliamas savitosios nukleazs. Antrinis
brendimas vyksta vadinamuoju ping pong ciklo mechanizmu (angl. ping-pong cycle). Prasmin pirmin piRNR molekul nukreipia PIWI baltymus prie komplementari prieprasmi RNR,
nurayt nuo tos paios genomo srities. PIWI baltymai skelia taikin, susidaro RNR su nauju 5
galu. Ji prisijungia prie kito PIWI baltymo. Skeliamas tokios prieprasms piRNR molekuls 3
galas. Tokia subrendusi prieprasm piRNR gali nukreipti PIWI baltymus prie prasmini transkript ir t.t. (5.48pav.). Taigi, tokiu mechanizmu ne tik skaldoma transpozon RNR ir slopinama transpozicija, bet ir gausinamas piRNR molekuli kiekis. Eukariotuose nustatyta ir kitoki
piRNR brendimo bd.
299
MOLEKULIN BIOLOGIJA

1. Kokios bendrosios savybs bdingos visoms RNR polimerazms?
2. Kurie bakterij RNR polimerazs struktros elementai yra svarbs transkripcijos tikslumui ir perstmimui?
3. A geno seka: 5 ATTGCCATTATGAAAGCG 3. Kuris i toliau pateikt transkript yra A
geno transkriptas?
a) 5UAACGGUAAUACUUUCGC3;
b) 3UAACGGUAAUACUUUCGC5;
c) 5AUUGCCAUUAUGUUUGCG3;
d) 3AUUGCCAUUAUGUUUGCG5.
4. Js tiriateE. coligeno transkripcijos terminacij. Geno 3gale yra tokia seka (pateiktos
abi grandins):

5CGAAGCGCCGATTGCCGGCGCTTTTTTTTT3
3GCTTCGCGGCTAACGGCCGCGAAAAAAAAA5
Js sukonstravote geno mutantus, kuriuose geno seka pakeista tokiu bdu (parodyta
koduojanti grandin):

Amutantas: 5CGAAACTAAGATTGCAGCAGTTTTTTTTT3
Bmutantas: 5CGAAGCGCCGTAGCACGGCGCTTTTTTTTT3
Cmutantas: 5CGAAGCGCCGATTGCCGGCGCTTACGGCCC3
Js tyrte, kaip kiekviename mutante vyksta transkripcijos terminacija. Gavote tokius
transkripcijos terminacijos rezultatus:
Mutantas
Su Rho
baltymu
Be Rho
baltymo
Laukinio tipoE. coli
100%
100%
Amutantas
40%
40%
Bmutantas
95%
95%
Cmutantas
20%
40%
Padarykite ivad apie transkripcijos terminacij, remdamiesi rezultatais.
5. Koks yra labiausiai tiktinas vyki scenarijus, kai sintetinanioje bakterij RNR polimerazje susidaro RNR-DNR hibridas, kuris viename gale yra iirs?
300
6. Toliau paveiksle yra pateikti bakterij promotoriai, kuriuos atpasta RNR polimerazs
holofermentas su pagrindiniu veiksniu (70) (N bet kuris nukleotidas). Kuris i promotori yra stipriausias?
7. Js iklte hipotez, kad nukleotid seka, esanti prie gen, veikia kaip stipriklis, o ne
kaip promotorius. Kaip tai eksperimentikai patikrinsite?
8. Koks yra amanitino, slopinanio eukariot RNR II polimeraz, veikimo molekulinis
mechanizmas?
9. Ivardykite, kokia tvarka in vitro susimontuoja RNR II polimerazs preiniciacijos
kompleksas?
10. Koks TATA sekos vaidmuo RNR IIpolimerazs vykdomoje transkripcijoje?
301
MOLEKULIN BIOLOGIJA
VI. RNR brendimas

RNR kiekiai, sintetinami lstelje, yra itin dideli: pvz., greitai augani mieli lstels susintetina ~2000 ribosomini RNR pirmtako molekuli per minut. Daugelis RNR molekuli modifikuojamos dar transkripcijos metu arba tuoj pat po transkripcijos. Dl modifikacij RNR molekuls gyja savit gamtin erdvin struktr ir gali atlikti biologines funkcijas. Didioji dauguma
RNR molekuli funkcionuoja kompleksuose su baltymais ribonukleoproteininse dalelse.
Procesas, per kur pirminiai transkriptai (pre-RNR) virsta
funkcionaliomis RNR, vadinamas brendimu (angl. procesBrendimas tai modifikacijos,
sing). Nesubrendusios RNR molekuls vadinamos pirmidl kuri pirminiai RNR transniais transkriptais, arba RNR pirmtakais, pre-RNR. RNR
kriptai (pre-RNR) virsta funkciomolekuls brendimo metu patiria tokias modifikacijas:
naliomis RNR molekulmis.
zz RNR sek paalinim i pirmini transkript;
zz RNR sek, kurios nra koduojamos genuose, prijungim;
zz tam tikr nukleotid kovalentines modifikacijas.
RNR brendimas yra sudtin gen raikos dalis. RNR brendimo funkcijos yra ios:
zz RNR molekuli brendimas yra gen raikos valdymo taikinys;
zz tam tikri brendimo vyksmai padidina RNR molekuls stabilum jos tampa labiau apsaugotos nuo lstels ribonukleazi;
zz per brendim susidaro funkcionalios RNR molekuls, kurias gali atpainti ir su kuriomis
gali sveikauti kiti lstels komponentai;
zz tam tikri brendimo vyksmai eukariot branduolyje yra tiesiogiai susij su RNR molekuli
inaa citozol.
6.1. Pre-tRNR brendimas

Pagrindinis tRNR molekuli biologinis vaidmuo bti baltym biosintezs tarpininkmis
(angl. adaptors). iai funkcijai atlikti tRNR molekuls turi bti subrendusios. tRNR molekuls turi
bti struktrikai panaios, kad su jomis galt sveikauti transliacijos elongacijos veiksniai, ribosomos komponentai, taiau kartu ir skirtingos, kad jas atpaint skirtingos aminoacil-tRNR
sintetazs (jungianios aminorgt prie tRNR 3galo). Pre-tRNR brendimo vyksmai apima:
zz 5galo sklim dalyvaujant Pribonukleazei;
zz 3galo sklim ir ardym dalyvaujant endonukleazms ir egzonukleazms;
zz 5CCA3 sekos tRNR 3gale jungim eukariotuose, daugumoje bakterij, kai kuriose archjose;
zz intron paalinim didiojoje daugumoje eukariot, kai kuriose archjose;
zz kovalentines nukleotid modifikacijas.
302
VI. RNR brendimas
6.2. Pre-tRNR brendimas prokariotuose

Prokariotuose, pvz., E.coli, daugumos pre-tRNR molekuli sudtyje yra daugiau negu vienas tRNR pirmtakas (policistroniniai transkriptai) (6.1pav.). Madaug pusje toki transkript
yra rRNR ir iRNR molekuli.
Pre-tRNR molekuls atskeliamos nuo didelio pirminio transkripto ir sutrumpinamos iki subrendusi tRNR molekuli ilgio. iame procese dalyvauja endoribonukleazs ir egzoribonukleazs. 6.1lentelje yra ivardytos inomos nukleazs, kurios dalyvauja E.coli pre-tRNR brendime.
6.1 lentel. E.coli pre-tRNR brendime dalyvaujanios ribonukleazs
Ribonukleaz
Aktyvumas
Funkcija
RNaz PC
Endonukleaz
Skelia monomerinius tRNR pirmtakus i pirminio

transkripto
RNaz E
Endonukleaz

transkripto
RNaz P
Endonukleaz
Skelia pre-tRNR lyderin sek 5gale
RNaz II
35 egzonukleaz
Ardo 3gal
RNaz D
35 egzonukleaz
Ardo 3gal
RNaz T
35egzonukleaz
Ardo 3gal
RNaz Z
Endonukleaz
Skelia pre-tRNR priekabos sek 3gale
RNaz PH
35 egzonukleaz
Ardo 3gal
Polinukleotidfosforilaz (PNPaz)
35 egzonukleaz
Ardo 3gal
RNaz III
Endonukleaz

transkripto, atskiria pre-rRNR, jeigu ji yra alia
pre-tRNR
6.2.1. tRNR 3 ir 5 gal susidarymas

Bakterijose, archjose, eukariotuose, taip pat ir mitochondrijose bei chloroplastuose tRNR
pirmtak subrend 5galai susidaro dl Pribonukleazs (RNazsP) veikimo. RNazP yra pretRNR atranki endoribonukleaz. RNazP atpasta pre-tRNR transkripto dalis, kurios pasiymi
savita erdvine struktra (6.2pav.). i endoribonukleaz skelia lyderin sek (angl. leader sequence) pre-tRNR molekuls 5gale (6.1pav. ir 6.2pav.). Susidaro tRNR pirmtakai su funkcionaliu
5galu. 5gal RNazP skelia dar tuo metu, kai tRNR pirminis transkriptas sintetinamas, nes tRNR molekuli su nesuRNazP yra vis organizm
brendusiais 5galais nemanoma iskirti i bakterij. RNalstelse, kuriose vyksta tRNR
zP buvo viena pirmj isamiai tiriam ribonukleazi.
sintez: bakterijose, archBakterij RNazP sudaro ~120 aminorgi baltymas
jose, eukariot branduolyje,
(E. coli C5, 119 aminorgi) ir 350450 nukleotid ileukariot mitochondrijose ir
gio RNR molekul (E.coli M1 RNR, 377 nt). RNaz P yra
chloroplastuose.
ribonukleoproteinas, kurio RNR komponentas pasiymi
kataliziniu aktyvumu.
303
MOLEKULIN BIOLOGIJA
6.1pav. Pre-tRNR brendimas prokariotuose
Archj (~4 baltymai) ir eukariot (~10 baltym) RNazsP baltyminis sstatas sudtingesnis, RNR molekuls ilgis vairus, ji nepasiymi dideliu panaumu bakterij RNazsP RNR, taiau
turi konservatyvi struktros element.
Bakterij (taip pat ir kai kuri archj) RNazsP RNR molekul yra katalizikai aktyvi su tam
tikrais substratais in vitro net ir tada, kai molekuls sudtyje nra baltymo. rodyti fakt
Sidniui Altmanui (Sidney Altman) ir jo kolegoms prireik
daugiau nei 10 met.
RNazsP RNR molekul pasiyIn vivo RNazs P RNR molekul atrankiai skelia tRNR,
mi kataliziniu aktyvumu RNataiau aktyvumui pasireikti btina baltymin molekuls
zP yra ribozimas.
dalis. Baltymas (baltymai) RNazs P molekulje padeda
304
VI. RNR brendimas
6.2pav. Bakterij pre-tRNR 5galo brendimas dalyvaujant RNazeiP (Nature Reviews Microbiology,
v.4, p.724, 2006)
RNR gyti aktyvi konformacij ir skatina tiksl substrato pre-tRNR jungim bei idstym
(6.3pav.). RNazsP ir substrato komplekso susidarymui ir molekuls kataliziniam aktyvumui btini bent du metalo jonai (Mg2+) aktyviajame centre. Lsteli gyvybingumui RNazP yra btina.
RNazsP RNR molekul sveikauja S domenu (angl. specificity domain) su substratu pretRNR (6.3pav.). Susidaro stekingo sveika tarp heterociklini bazi pre-tRNR TC ir Dkilpose ir
Aminorinis motyvas ties akceptoriniu stiebu bei kanonins nukleotid poros pre-tRNR 3gale.
Pastaruoju atveju, jeigu pre-tRNR yra koduojama 5CCA3 seka, kurios priekyje yra purino nukleotidas (5RCCA3, 6.2pav.), RNazsP RNR molekuls konservatyvs GGU nukleotidai sudaro
komplementarias poras su pre-tRNR RCC nukleotidais. Kitas svarbus pre-tRNR elementas sveikai su RNazeP yra lyderin seka. Jos pirmasis nukleotidas (danai U arba C), esantis prie
sklimo viet, sveikauja su konservatyviu A nukleotidu RNazsP RNR molekulje.
6.3pav. Thermotoga maritima

RNazsP ir pre-tRNR komplekso erdvin struktra.
RNazsP RNR molekuls S ir C
domenai, baltymas, pre-tRNR
paymti. Rodykl ymi lyderins sekos 5gale sklimo viet
(PDB: 3Q1R)
305
MOLEKULIN BIOLOGIJA
6.4 pav. Pre-tRNR 3galo brendimas prokariotuose. Egzonukleolitinis 3galo brendimas E.coli ir
B.subtilis. Pagrindins egzoribonukleazs parykintos, N nukleotidas diskriminatorius (a); endonukleolitinis brendimas dalyvaujant RNazeiZ (b) (Nature Reviews Microbiology, v.4, p.724, 2006)
RNazP dalyvauja pre-tRNR pirmtak brendime vis gyvybs domen organizmuose. Taiau pastaraisiais metais atskleista nauj domi fakt. Augal organels ir mogaus mitochondrijos turi RNazP, kurioje nra RNR komponento yra tik baltymas. Eksperimentais parodyta, kad baltymo sveika
su substratu yra panai kaip ir RNazsP RNR komponento ir yra esmin jos funkcionavimui.
Bakterij tRNR pirmtak 3galas susidaro dviem bdais. Jeigu 5CCA3 seka, kuri yra btina tRNR molekulei prijungti aminorgt, yra koduojama tRNR gene, pre-tRNR priekabos seka
suardoma dalyvaujant endoribonukleazms ir egzoribonukleazms (6.1pav., 6.4pav., a). Jeigu
5CCA3 seka nekoduojama, pre-tRNR priekabos sek skelia Zendoribonukleaz, RNazZ. Sklimas vyksta u nukleotido diskriminatoriaus (angl. discriminator), kuris yra paskutinis nukleotidas pre-tRNR 3gale prie jungiant CCA sek (6.4pav., b).
Visos subrendusios prokariot ir eukariot tRNR molekuls turi 3gale 5CCA3 sek. Jeigu
seka nekoduojama gene, ji turi bti jungiama po transkripcijos, kai visi 3galo brendimo procesai yra vyk (6.5pav.). 5CCA3 sek jungia fermentas tRNR nukleotidiltransferaz. tRNR
nukleotidiltransferazei matricos nereikia. E.coli tRNR nukleotidiltransferaz taip pat katalizuoja
6.5pav. 5CCA3 sekos jungimas bakterij ir eukariot tRNR. D nukleotidas diskriminatorius (Cell
and Molecular Life Sciences, v.64, p.2404, 2007)
306
VI. RNR brendimas
galinio Anukleotido jungim, jeigu j skelia RNazT arba kitos egzonukleazs. CCA seka 3gale
panaiu bdu jungiama prie vis prokariot tRNR. Pagal aminorgi sek panaum iskiriamos dvi CCA sek jungiani ferment klass: archj fermentai (Iklas) ir eubakterij/eukariot fermentai (IIklas).
6.3. Pre-tRNR brendimas eukariotuose

Eukariotuose pre-tRNR molekules sintetina RNR III polimeraz. Augal ir gyvn lstelse yra ~50 skirting tRNR, kuri kiekvien koduoja atskiras genas. Kiekvieno geno genome
yra kelios kopijos. Pvz., mieli genome yra ~275 tRNR genai, vaisins musels ~850, o mogaus ~1500. tRNR genai sudaro nedideles sankaupas, kuriose esti po kelis skirtingas tRNR koduojanius genus. T pai tRNR koduojantis genas pasitaiko vairiose sankaupose. Eukariot
pre-tRNR brendime dalyvauja daug ferment. Pvz., mieli Saccharomyces cerevisiae pre-tRNR
brendime dalyvauja 38 gen produktai. Kai kurie brendimo vykiai yra bendri visoms pre-tRNR
molekulms, kiti unikals.
Pre-tRNR 5gale turi ilg lyderin sek, o 3gale priekabos sek (angl. trailer sequence).
Abi sekos brendimo metu skeliamos arba palaipsniui ardomos dalyvaujant ribonukleazms,
kol molekuls sutrumpinamos iki funkcionalioms tRNR bdingo ilgio. Pre-tRNR lyderin sek
skelia RNazP. tRNR 3galo brendimas prasideda, kai pre-tRNR transkripcija, kuri vykdo RNR
IIIpolimeraz, stabdoma susintetinus vairaus ilgio U sek 3gale. Branduolyje prie pre-tRNR
molekuli 3galo ( 3U) i karto, kai pre-tRNR susintetinama, prisijungia Labaltymas. La yra
daugiafunkcinis baltymas, jo kiekiai branduolyje labai dideli (~20mln. kopij). Baltymas apsaugo pre-tRNR 3gal nuo suardymo egzonukleazmis ir skatina endonukleolitin sklim. Jo
taip pat reikia RNazsP sklimui. Priekabos sek u nukleotido diskriminatoriaus skelia RNazZ (6.4pav.). U jo tRNR nukleotidiltransferaz prijungia 5CCA3 sek.
6.3.1. Intron paalinimas i eukariot pre-tRNR

1977m. Filipas arpas (Phillip Sharp) su bendradarbiais tirdami adenoviruso transkripcij
nustat, kad viruso transkriptai nra visikai komplementars jo DNR. Tais paiais metais Alikas
Defris (Alec Jeffreys) ir Riardas Flavelas (Richard Flavell) aptiko sek globino gene, kurios nebuvo geno transkripte. Taip buvo suprasta, kad eukariot genuose yra siterpusi sek, kurios
vliau paalinamos i pirmini transkript.
Nukleotid sekos, randamos DNR, pirminiame transkripte, bet neaptinkamos subrendusioje RNR, vadinamos intronais. Apibriant gen kaip DNR, kuri yra transkribuojama, intronus
taip pat galima laikyti geno dalimi, nors jie ir paalinami i RNR brendimo metu. Nukleotid
sekos, aptinkamos ir DNR, ir subrendusioje RNR, vadinamos egzonais.
Intron yra genuose, kurie koEgzonin-intronin gen organizacija yra itin bdinga
duoja tRNR, rRNR ir iRNR.
eukariotams, tiek emesniesiems, tiek auktesniesiems.
Prokariot genuose intron pasitaiko retai.
307
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Nustaius, kad genuose koduojaniose srityse yra intron, buvo aikinamasi, kokiu bdu
vyksta j paalinimas.
RNR splaisingas (angl. splicing) yra iRNR, tRNR ir tam tiIntronai i transkript paalinakr rRNR brendimo proceso dalis. i RNR splaisingo memi, o egzonai sujungiami vykschanizmai yra skirtingi.
tant RNR splaisingui.
Pirminiame transkripte intronas skiria 2 egzonus
(6.6pav.). Vienas egzonas yra priekyje, arba introno 5galo
pusje, o kitas u introno, arba jo 3galo pusje. Sritis, kur egzonas ribojasi su introno 5galu,
vadinama 5splaisingo sritimi. Sritis, kur kitas egzonas ribojasi su introno 3galu, vadinama
3splaisingo sritimi.
Pagal intron ikirpimo mechanizm ir struktr, jie skirstomi penkias grupes:
zz Igrups savaime isikerpantys intronai;
zz IIgrups savaime isikerpantys intronai;
zz pre-tRNR intronai, kurie ikerpami savituoju bdu dalyvaujant fermentams;
zz archj pre-tRNR intronai, kurie ikerpami savituoju bdu dalyvaujant fermentams;
zz pre-iRNR intronai, ikerpami dalyvaujant splaisosomai.
Mieli genome apie penktadalis tRNR gen turi po vien intron. Augal, mogaus genome intron turini tRNR gen esti daug maiau. Intron ilgis pre-tRNR svyruoja nuo 14 iki
4246 nt (pasitaiko ir 60 nt ilgio intron). Intronai pre-tRNR
molekulse isidst u vieno nukleotido po antikodono
Pre-tRNR intron ikirpimas ir
(6.7pav., a).
likusi dali sujungimas vyksta
Intron nukleotid sekos pre-tRNR nra panaios. Nra
dalyvaujant fermentams.
konservatyvi sek nei intron viduryje, nei j galuose, ar
srityse, ribojaniose intronus su greta esaniais egzonais.
6.6pav. Intron paalinimo i pre-RNR ir egzon sujungimo schema. Lenkta rodykl ymi transkripcijos pradi ir krypt
308
VI. RNR brendimas
6.7pav. Mieli pre-tRNRPhe introno struktra ir ikirpimas. Pre-tRNRPhe ir subrendusios tRNR antrin struktra. Parodytos tik tos tRNR dalys, kur vyksta introno ikirpimas (a) (J.E.Krebs, E.S.Goldstein,
S.T.Kilpatrick. Lewins Genes X, 2011); pre-tRNRPhe tretin struktra. Raudonai intronas, aliai antikodono nukleotidai (b)
Tai bdinga pre-tRNR intronams visuose eukariotuose. Taiau bendras vis organizm tRNR
intron bruoas yra tas, kad jie turi sek, komplementari tRNR antikodonui (6.7pav., a). Dl
ios savybs pre-tRNR molekuls, turinios intron, gyja savit erdvin struktr. J atpasta
endoribonukleaz, skelianti intron.
Intron ikirpimas i mieli pre-tRNR vyksta 2 etapais, juose dalyvauja daugiafunkcinis baltym kompleksas. iam procesui reikia ATP.
Pirmajame etape pre-tRNR skeliama ties introno ir j supani sek sritimis 5 ir 3splaisingo srityse. iam etapui ATP nereikia. Reakcij vykdo savita endonukleaz. Ji atpasta intron
pre-tRNR molekulje. Pvz., mieli endonukleaz yra multimerinis fermentas: du fermento sub
vienetai (Sen34 ir Sen42) skelia intron (6.7pav., b). Dar vienas subvienetas, Sen54, veikia kaip
matuoklis, nustatantis atstum tarp introno gal. domu tai, kad mielse tRNR introno ikirpimas ir likusi dali jungimas vyksta ne branduolyje, bet citozolyje (6.11pav.). Endonukleaz yra
sutelkta mitochondrij paviriuje, kiti fermentai citozolyje.
Endonukleazei nusklus intron, pirmojo egzono 3gale lieka 2, 3ciklofosfatas, o introno
5gale 5OH grup (6.8pav.). Antrojo egzono 5gale lieka hidroksigrup, o introno 3gale
2, 3ciklofosfatas. Vliau daugiafunkcinio komplekso sudtyje esanti ciklofosfodiesteraz hidrolizuoja 2, 3ciklofosfat pirmajame egzone. Susidaro 2fosfato esteris. Komplekso sudtyje
esanti kinaz pernea fosforilgrup nuo GTP prie antro egzono 5OH grups. Ikirpus intron,
dvi tRNR molekuls dalys neatsiskiria dl savitos erdvins pre-tRNR molekuls struktros.
Kitam brendimo etapui reikia ATP. RNR ligaz katalizuoja fosfodiesterinio ryio susidarym
tarp dviej tRNR molekuls dali. Pirmiausiai fermentas katalizuoja AMP perna nuo ATP prie
antrojo egzono 5fosfato. Pernet grup atakuoja 3O atomas pirmajame egzone. Susidaro 3,
5fosfodiesterinis ryys. 2fosfato esteris, susidars introno ikirpimo metu ties 1 egzono galu,
paalinamas 2fosfatazs (6.8pav.).
Savitas intron ikirpimo i pre-tRNR mechanizmas nustatytas kai kuriose archjose. ~70%
archj tRNR gen turi intron (1644nt). ia intronai ikerpami dalyvaujant savitai endonu-
309
MOLEKULIN BIOLOGIJA
6.8pav. Introno ikirpimo

ir likusi dali jungimo
pre-tRNR, dalyvaujant
fermentams, mechanizmas. Introno sklimo vietos paymtos rodyklmis,
fosfato grup apskritimu
ir trikampiu
6.9pav. Pre-tRNR cis ir

trans splaisingo bdai
archjose (PNAS, v.102,
p.17934, 2005)
310
VI. RNR brendimas
6.10pav. Kai kurie modifikuoti nukleotidai tRNR molekuli sudtyje
311
MOLEKULIN BIOLOGIJA
kleazei, kuri yra homodimerins arba homotetramerins struktros. Kiekvienas endonukleazs

subvienetas turi aktyvj centr, kuriame vyksta introno sklimas. Endonukleaz archj pretRNR atpasta savitas pupso-spirals-pupso (angl. bulge-helix-bulge, BHB) struktras introne
kiekvienoje sklimo vietoje. Sklimas vyksta pups sekose (6.9pav.). Likusias molekuls dalis
sujungia RNR ligaz.
Archjose nustatytas dar vienas domus pre-tRNR brendimo atvejis tRNR trans splaisingas (angl. trans-splicing). Parazitinje archjoje Nanoarchaeum equitans keli tRNR molekuli
6.11pav. Pre-tRNR brendimas ir pernaa i branduolio citozol. Taip pat parodytas mieli pre-tRNR
splaisingas citozolyje (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v.8, p.761, 2007)
312
VI. RNR brendimas
dalys genome koduojamos atskirai. Susintetinus j transkriptus, molekuls susijungia savo

komplementariomis sritimis. Tokia pre-tRNR turi pupso-spirals-pupso struktras, kurias atpasta ir skelia endonukleaz, o likusias molekuls dalis sujungia RNR ligaz (6.9pav.).
Anksiau aptartas intron ikirpimo i pre-tRNR ir egzon sujungimo mechanizmas dalyvaujant fermentams labai skiriasi nuo intron ikirpimo ir egzon sujungimo mechanizm kitose pre-RNR. Pastarieji aptariami tolesniuose poskyriuose.
6.3.2. Kovalentins tRNR nukleotid modifikacijos

Prokariotuose ir eukariotuose subrendusios tRNR molekuls turi kovalentikai modifikuot nukleotid (6.10pav.). Kiekviena tRNR molekul turi ~8 tokias modifikacijas. Nustatyta
~100 skirting modifikacij. Modifikacijos yra vairaus sudtingumo: nuo metilgrups iki, pvz.,
2-metiltio-N6-treonilkarbamoilgrups, prijungtos prie adenozino. Modifikacij tRNR molekulje, manoma, reikia jos stabilumui utikrinti ir transliacijai. Pvz., kovalentins modifikacijos
molekuls erdinje dalyje (D, TC, antikodonin kilpos) stabilizuoja L pavidalo tRNR erdvin
struktr. Kitos modifikacijos daro tak ikodavimo proceso tikslumui ribosomoje.
Hipermodifikuotam uridinui, mnm5s2U (6.9pav.), esaniam tRNRLys ir tRNRGlu molekulse, bdinga nevienareikm sveika (angl. wobble, r. VII skyriuje Baltym biosintez). Dl 2-tiogrups U34
nukleozido riboz gyja 3endo konformacij, dl kurios nukleozidas sveikauja tik su purinais. Taigi,
mnm5s2U modifikacija leidia tRNRLys ir tRNRGlu ikodavimo metu atskirti purinus nuo pirimidin ir nesveikauti su iRNR NNY kodonais (Y pirimidinas).
Kovalentines modifikacijas tRNR atlieka vairs fermentai. tRNR molekulse yra daugiausiai
ir vairiausi modifikuot nukleotid i vis RNR molekuli, nors jos palyginti nedidels.
6.3.3. Eukariot pre-tRNR brendimo etap eilikumas

Pre-tRNR brendimo etapai vairiuose organizmuose vyksta skirtingu eilikumu: mielse visos modifikacijos vyksta iki intron paalinimo, o Xenopus laevis ovocituose prie kitus brendimo etapus vyksta splaisingas. Eukariot pre-tRNR pirmiausia sukuriami 3 ir 5galai, tuomet
paalinami intronai (mielse jie alinami citozolyje), modifikuojami nukleotidai, susintetinamas
5CCA3 galas, ir galiausiai subrendusios molekuls perneamos i branduolio citozol. Nustatyta, kad 5 ir 3gal susidarymas ir 5CCA3 sekos jungimas yra btinos modifikacijos veiksmingai tRNR molekuli pernaai citozol, o intron paalinimas nebtinas. Taip pat nustatyta,
kad kai kurios tRNR molekuls gali bti aminoacilinamos jau branduolyje ir tai palengvina j
perna per branduolio membran.
Subrendusios tRNR atpastamos ir ineamos i branduolio citozol dalyvaujant savitajam tRNR inaos receptoriui eksportinuit, kuris yra karioferin baltym supereimos narys
(6.11pav.). Toks tRNR atpainimas yra dalis kontrols mechanizmo, kuris utikrina, kad nevisikai subrendusios tRNR nepaklit citozol. Receptoriaus atpainimui yra svarbi tRNR molekuls antikodono ir pseudouridinins kilpos (TC) struktra. Pvz., eksportinas t in vitro 10
313
MOLEKULIN BIOLOGIJA
kart geriau sveikauja su tRNR, turinia subrendusius 3 ir 5galus, palyginti su nesubrendusia.

GTPaz Ran padidina eksportinot giminingum subrendusioms tRNR, taip pat kitoms RNR molekulms kroviniams (angl. cargo), kuri eksporto receptorius jis yra. Citozolyje tRNR eksportinot ir Ran-GTP kompleksas suyra vykus GTP hidrolizei. tRNR paleidiama citozol.
6.4. Pre-rRNR brendimas

Ribosomini RNR molekuls visuose organizmuose yra sintetinamos ilg pre-rRNR transkript pavidalu, tada vyksta j brendimas. Pre-rRNR brendimas apima iuos vykius:
zz pirmini transkript skaldym maesnius dalyvaujant endonukleazms ir egzonukleazms;
zz kovalentines nukleotid modifikacijas (ribozi metilinim 2 padtyje, tam tikr heterociklini bazi metilinim, uridino heterociklins bazs modifikacij pseudouridin);
zz intron paalinim.
6.4.1. Pre-rRNR brendimas prokariotuose

Prokariot ribosom sudtyje yra trij ri rRNR molekuls: 16S, 23S ir 5S rRNR. Bakterijos chromosomoje ias rRNR koduojantys genai yra dalis didelio operono, kurio transkripcija
vyksta nuo vieno promotoriaus. rRNR gen isidstymo tvarka operone yra tokia: 16S, 23S, 5S.
Prokariot genomai prastai turi kelet toki rRNR gen operon (pvz., E.coli turi 7). rRNR operonai savo sudtyje dar turi tRNR gen, kuri skaiius kiekviename operone gali skirtis. tRNR
genai bna daniausiai siterp tarp 16S ir 23S rRNR koduojani gen (6.12pav.).
Bakterij pre-rRNR yra ilga 30S RNR molekul, kuri sudaro ~6000 nukleotid. io transkripto brendimas prasideda dar nepasibaigus jo sintezei. Pirminiame transkripte bsimos 16S
ir 23S rRNR molekuls sudaro antrines segtuko pavidalo struktras, kurias atrankiai atpasta IIIendoribonukleaz (RNazIII) ir i abiej segtuko stiebo pusi skelia pirmin transkript
individualias 16S ir 23S rRNR molekules (6.12 pav.). Taiau po sklimo 16S ir 23S rRNR dar
nra galutinai subrendusios. Molekuli 3 ir 5galai dar kart skeliami endonukleazi. 16S rRNR
3gal dar syk skelia RNazE ir RNazG, abi sekoms atrankios endoribonukleazs. 5S rRNR i
ilgo pirminio transkripto skelia endoribonukleaz RNazE. Po io sklimo 5S rRNR molekuls
galuose lieka po tris nukleotidus, kuriuos nuo 3galo paalina egzoribonukleaz RNazT, o
nuo 5galo nenustatyta nukleaz (6.12pav.).
Kovalentikai modifikuojam nukleotid prokariot rRNR yra ymiai maiau nei eukariot.
Pvz., E.coli rRNR molekulse yra tik keturios 2padtyje metilintos ribozs ir 10 pseudouridin.
6.4.2. Pre-rRNR brendimas eukariotuose

Eukariot ribosomose yra 18S, 28S, 5S rRNR molekuls, homologikos bakterij 16S, 23S
ir 5S rRNR molekulms. Be i rRNR, eukariotai turi dar 5,8S rRNR. 18S, 5,8S, 28S rRNR pirm-
314
VI. RNR brendimas
takas (mielse ~6500nt, o moguje ~13000nt) sintetinamas RNR Ipolimerazs, o 5S rRNR

atskirai RNR IIIpolimerazs. 18S, 5,8S, 28S rRNR pirmtako 5 ir 3galuose yra vadinamosios iorins transkribuojamosios sekos, ITS (angl. external transcribed spacer), o viduje vidins
transkribuojamosios sekos, VTS (angl. internal transcribed spacer). Jos paalinamos brendimo metu (6.13pav.).
Pirmasis pre-rRNR brendimo vykis transkripto sklimas u 28S rRNR, kur vykdo fermentas, panaus bakterij RNazIII. Tada greitai vyksta nukleotid modifikacijos: ribozi metilinimas ir uridino izomerizacija pseudouridin (bus aptariami kitame poskyryje).
Po to, kai pirminis transkriptas visikai susintetinamas, pradedamos alinti sekos. Pirmiausiai pre-rRNR skelia endoribonukleazs. domu, kad tam tikras nukleazes prie taikini nukreipia
maos branduollio RNR snoRNR (angl. small nucleolar RNA), sveikaujanios su nukleotid
sekomis pre-rRNR. Pvz., U3 snoRNR sveika su ITS seka 5gale ir su 18S RNR yra svarbi 5ITS
sekos sklimui. rRNR prie 5,8S skelia RNaz MRP (6.13pav.). ios RNazs sudtis panai RNa-
6.12pav. Pre-rRNR brendimas bakterijose (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v.2, p.514, 2001)
315
MOLEKULIN BIOLOGIJA
6.13pav. Pre-RNR brendimas

eukariotuose. ITS iorins
transkribuojamosios sekos,
VTS vidins transkribuojamosios sekos (Nature Reviews
Molecular Cell Biology, v.2, p.
514, 2001)
zsP sudt atuoni i devyni baltym subvienet yra tokie patys. Manoma, kad RNazMRP
kilo i bakterij RNazsP. Toliau individuali transkript galus palaipsniui ardo egzonukleazs,
kuri atrankumas ir veikimo eilikumas nra gerai iaikinti. Pre-rRNR brendime dalyvaujanios
egzonukleazs branduolyje sudaro ~11 ferment kompleks egzosom. Kitokios nukleazi
sudties egzosoma egzistuoja ir citozolyje.
Eukariot 5S rRNR posttranskripcinis brendimo mechanizmas paprasiausias i vis rRNR.
Kartais i viso jokio molekuls brendimo nra; kitu atveju endonukleaz skelia 5S rRNR molekuls 3gal. Molekuls 5galas lieka su trifosfatu, kuris buvo pirmajame jungtame sintetinam RNR grandin nukleotide. 5S rRNR molekulje nevyksta nei 3galo adenilinimas, nei
splaisingas.
6.4.3. Kovalentins nukleotid modifikacijos eukariot

pre-rRNR
Daniausios rRNR kovalentins modifikacijos eukariotuose ribozi metilinimas 2O padtyje ir uridino izomerizacija pseudouridin (6.14pav.). Pre-rRNR nukleotidai yra modifikuojami pirminio transkripto sintezs metu. Ikelta hipotez, kad ribozi metilinimas stabilizuoja rRNR molekul, padidindamas molekuls hidrofobin paviri. Uridino izomerizacija
pseudouridin sukuria galimyb susidaryti papildomam vandeniliniam ryiui ties molekuls
316
VI. RNR brendimas
N1 atomu, o tai gali turti reikms rRNR molekuls erdviMaosios branduollio RNR
nei struktrai. Modifikuoti nukleotidai rRNR molekulje yra
(snoRNR) dalyvauja eukariot
konservatyviose padtyse.
pre-rRNR brendime.
Eukariot rRNR kovalentini nukleotid modifikacij
mechanizmai skiriasi nuo bakterij. Auktesniuosiuose eukariotuose rRNR molekuls turi ~110 2O padtyje metilint ribozi ir ~95 pseudouridinus. Mieli rRNR i modifikacij yra dvigubai maiau. Modifikacijas atlieka vairs fermentai. Modifikacij taikiniai rRNR molekulse nustatomi pasitelkiant
masias branduollio RNR snoRNR.
Maj branduollio RNR snoRNR molekuli dydis 70300nt. inoma ~150 skirting
snoRNR molekuli stuburiniuose, grybuose, augaluose, pirmuonyse. ~70 snoRNR galt bti
mielse (i viso ~1000 kopij), daugiau nei 100 stuburiniuose (~100000 kopij). snoRNR sintetinamos nukleoplazmoje, bet telkiamos branduollyje rRNR sintezs vietoje. ia jos funkcionuoja kompleksuose su baltymais snoRNP dalelse (angl. small nucleolar ribonucleoprotein,
sno RNP).
Mechanizmas, kuriuo nustatomos modifikacij vietos rRNR molekulje, dalyvaujant
snoRNR, gana neprastas. Modifikacijos vieta rRNR molekulje nustatoma komplementarumo
principu: snoRNR molekulse yra sritys, komplementarios tam tikroms pre-rRNR sritims. Netoli
i srii rRNR molekulje yra nukleotidas-modifikacijos taikinys. Nustaius daugelio snoRNR
nukleotid sekas, snoRNR molekuls buvo suskirstytos dvi pagrindines grupes.
Pirmoji grup tai snoRNR, turinios konservatyv element C/D dut (angl. C/D box).
snoRNR molekuls gali turti ir antr toki dut C/D, 6.15pav., a). Jos dalyvauja nustatant
taikinius 2O ribozs metilinimui rRNR molekulse.
C duts konservatyvi seka yra RUGAUGA/U (R bet kuris purinas). D duts konservatyvi seka yra CUGA. snoRNR prisijungia prie jai komplementari rRNR srii, kurios sudaro
~1021bp dupleks, tuomet metilaz metilina rRNR molekulje penktj nukleotid u D arba
Dduts (6.15pav., a). Visa snoRNR nra btina tiksliam ir veiksmingam rRNR metilinimui.
6.14pav. Uridino izomerizacijos

pseudouridin ir ribozs 2O metilinimo schema
317
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Pvz., jeigu snoRNR yra ilikusi tik viena C/D dut turinti sritis, utenka, kad taikinys rRNR bt
atpaintas ir metilintas. Mieli Saccharomyces cerrevisiae genome yra 51 snoRNR koduojanti
seka (mieli rRNR yra metilinamos 55 ribozs).
Antrj grup sudaro snoRNR, turinios konservatyv element H/ACA dut (6.15pav.,
b). Pasitelkiant ias snoRNR rRNR molekulje yra nustatomi uridino nukleotidai. Tokie nukleotidai modifikuojami (izomerizuojami) pseudouridin (U).
i snoRNR struktrai yra bdinga tai, kad H dut (nukleotid seka ANANNA, kur N bet
kuris nukleotidas) yra isidsiusi linkyje tarp dviej segtuk (segtuko-linkio-segtuko-uodegos
motyve, 6.15pav., b), o ACA sritis nutolusi per tris ribonukleotidus nuo snoRNR molekuls
3galo. snoRNR sudaro su rRNR komplementarias sritis dviejose vietose. Susidaro dupleksas
tarp komplementari snoRNR ir rRNR molekuls srii. iame duplekse U rRNR nukleotidai yra
nesuporuoti ir isidsto vadinamosiose pseudouridin kiense (angl. pseudouridine pocket)
ir ten modifikuojami. snoRNR susijungia su baltymu diskerinu, kuris pasiymi pseudouridino
sintazs aktyvumu ir kitais baltymais.
6.15pav. snoRNR molekuli struktra ir rRNR taikini modifikavimas. rRNR ribozs 2O metilinimas
(a); uridino modifikacija pseudouridin (b) (L.A.Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition,
2012)
318
VI. RNR brendimas
Brendime dalyvaujanios snoRNP dalels telkiamos nukleoplazmoje Kajalo kneliuose1

(angl. Cajal bodies). ia vyksta rRNR modifikacijos. Stuburini H/ACA snoRNR turi sek, nukreipiani snoRNP Kajalo knelius.
Nustatyta, kad antrin snoRNR molekuli struktra yra svarbi: paalinus molekuls dal
(pvz., vien antrojo tipo snoRNR segtuk), jos stabilumas sumaja, ji nebegali atlikti savo funkcijos. Maosios branduollio RNR paios neatlieka rRNR modifikacij. Jos keiia pre-rRNR erdvin struktr, kad molekul atpaint modifikacijas vykdantys fermentai.
Kai kurios snoRNR, kaip jau minta, nustato taikinius endoribonukleazms, skaldanioms
pre-rRNR. Archjoms taip pat bdingas rRNR ribozi metilinimas ir uridino izomerizacija pseudouridin. Taikinius trijose archj rRNR molekulse (23S rRNR, 16S rRNR ir 5S rRNR) nustato
eukariot snoRNR panaios molekuls kartu su archj baltymais.
Genetin snoRNR molekuli organizacija ir biogenez yra labai neprastos. snoRNR gali bti koduojamos genuose (kartais kelios snoRNR nuraomos vienu policistroniniu transkriptu), taip pat gali bti skeliamos i intron, esani kituose genuose (genuose eimininkuose). 1994 m. buvo nustatyta, kad U22
snoRNR, dalyvaujanti 18S rRNR brendime, yra geno eimininko introne. Buvo nustatyta, kad enkli introno
sek dalis yra komplementari rRNR. Lik sujungti egzonai baltymo nekoduoja: tokia RNR greitai suardoma
citozolyje. Taip pat paaikjo, kad geno eimininko intronuose koduojamos dar bent 8 skirtingos snoRNR.
6.4.4. rRNR susimontavimas ribosomas

Beveik visuose organizmuose rRNR montavimasis ribosomines daleles yra konservatyvus
procesas. rRNR molekuls subrandinamos i ilg pirmini transkript vykstant kovalentinms
modifikacijoms, 3 ir 5 gal brendimui. Subrendusios molekuls kartu su ribosominiais baltymais sumontuojamos ribosomas. Montavimasis prasideda jau rRNR sintezs branduollyje
metu: ia neama ir telkiama nukleoplazmoje susintetinta 5S rRNR. Brendimo metu rRNR patiria gausyb struktrini persitvarkym. Pvz., eukariotuose nustatyta keliolika RNR helikazi,
kurios, manoma, dalyvauja tokioje pertvarkoje. Prokariotuose ie procesai vyksta citozolyje, o
eukariotuose ribosominiai baltymai perneami i citozolio branduol; tuomet i branduolio
ribosominiai subvienetai vl ineami citozol, kur susimontuoja funkcionalias ribosomas.
6.4.5. Intron alinimas i eukariot pre-rRNR

Intron eukariot pre-rRNR yra kai kuri vienalsi
Intron savaiminis isikirpimas
organizm branduolio pre-rRNR, mitochondrij bei chlovyksta trans esterinimo reakcij
roplast pre-rRNR. ie intronai ikerpami kitokiu mechakeliu.
nizmu negu intronai, esantys pre-tRNR sudtyje. Pre-rRNR
esantys intronai in vitro isikerpa savaime, nedalyvaujant
fermentams. Toks intron isikirpimo bdas dar vadinamas autosplaisingu (angl. self-splicing). Isikirpimas ir likusi RNR dali sujungimas vyksta dviej trans esterinimo reakcij keliu
(6.16pav.). Vykstant ioms reakcijoms, fosfodiesterini ryi skaiius lieka nepakits.
Knelius atrado Santjagas Ramonas Kajalas (Santiago Ramn y Cajal).
319
MOLEKULIN BIOLOGIJA
6.16pav. Intron savaiminio isikirpimo trans esterinimo reakcijos. R nukleotidas RNR grandinje
Savaiminis intron isikirpimas i RNR pirmtak yra bdingas ne tik rRNR intronams, bet ir
kai kuriems pre-iRNR intronams. Savaiminis intron isikirpimas gali vykti dviej tip mechanizmais.
Intron savaiminio isikirpimo
Itipo mechanizmu isikerpa Igrups intronai. Tokiam
reakcijas katalizuoja paios preisikirpimui reikia guanozino kofaktoriaus (angl. guanoRNR molekuls.
sine cofactor). inoma ~ 1500 Igrups intron, ~90% i
j rasta grybuose, augaluose, rausvuosiuose ir aliuosiuose
dumbliuose. Igrups intron yra vienalsi eukariot branduolio rRNR, emesnij eukariot mitochondrij bei chloroplast iRNR, auktesnij augal mitochondrij iRNR, taip pat kai
kuriose bakterijose, bakteriofaguose ir virusuose. Gyvnuose Itipo intronai nustatyti tik pavieniuose organizmuose. Branduolio genomuose Igrups intronai yra daugiausia rRNR genuose,
o organeli genomuose j yra iRNR, rRNR ir tRNR genuose. Igrups intron nerasta archjose.
Igrups intron nukleotid sekos nra homologikos, taiau jiems bdinga panai savita
antrin struktra, turinti kelet konservatyvi element. Mutagenezs metodu nustatyta, kad
6.17pav. Igrups savaime isikerpani intron antrin ir tretin struktros. Kairje introno antrin struktra. alia spalva intron ribojantys egzonai, pilka katalizin erdis. Dvigrandiniai RNR struktros elementai paymti (P); deinje introno katalizins erdies erdvin struktra. Geltonai paymta
G jungimo vieta (D.L.Nelson, M. L. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry, sixth edition, 2012)
320
VI. RNR brendimas
Igrups intron erd sudaro P3, P4, P6 ir P7 sritys (6.17pav.). Savaime isikerpantys intronai
gyja erdvin struktr, kuri lemia molekuls katalizin aktyvum. Pirmasis savaime isikerpantis intronas buvo nustatytas pirmuonies Tetrahymena thermophila pre-rRNR.
IItipo mechanizmu isikerpa IIgrups intronai. Reakcijoms vykti reikalinga adenilato liekana, kuri yra paioje pre-RNR molekulje. IIgrups intronai daug maiau paplit nei Igrups
intronai. J yra tik kai kuri pirmuoni, augal, gryb, dumbli mitochondrij bei chloroplast
iRNR. Keli IIgrups intronai rasti tRNR ir rRNR sudtyje. IIgrups intronams taip pat bdinga
konservatyvi antrin ir tretin struktra (6.18pav.).
6.4.6. Igrups intron isikirpimo mechanizmas

Tetrahymena thermophila pre-rRNR pirmtako genas turi didel 413bp intron. Pirmtako transkripto brendim in vitro 1980m. tyrus Tom ech (Tom Cech) ir jo bendradarbius itiko didiul
nuostaba, kai jie pastebjo, kad pre-rRNR intronas ikerpamas, o likusios rRNR molekuls dalys
sujungiamos reakcijos miinyje, kuriame nra joki baltym! Mokslininkai nustat, kad reakcijas
vykdo pati pre-rRNR molekul. Buvo isiaikinta, kad reakcijai vykti reikia pre-rRNR, metalo jon ir
kofaktoriaus guanozino. Igrups intronai isikerpa vykstant dviems trans esterinimo reakcijoms:
zz pirmoje reakcijoje guanozino kofaktoriaus 3hidroksigrups deguonis atakuoja fosfato
grup rRNR molekuls 5splaisingo srityje (6.19pav.);
zz antroje reakcijoje pirmojo egzono 3hidroksigrup atakuoja Gnukleotido fosfato grup
rRNR molekuls 3splaisingo srityje paskutinje introno pozicijoje (6.19pav.).
Savaiminio isikirpimo reakcijoje guanino kofaktoriuje kita heterociklin baz negali pakeisti, taiau trifosfatas nebtinas: reakcija vyksta su GTP, GDP, GMP arba guanozinu. Guanino
nukleotidas arba nukleozidas turi turti laisv ribozs 3OH grup. Metalo jonai (Mg2+) yra btini katalizinei reakcijai vykti. Jie padeda aktyvinti 3OH grups deguon pirmai trans esterinimo reakcijai. 5 splaisingo sritis pre-rRNR priartinama prie nukleofilo susidarant dupleksui
6.18pav. IIgrups savaime isikerpani intron antrin struktra.

Lactococcus lactis IIgrups introno
antrin struktra. Introno IVI domenai pavaizduoti skirtingomis spalvomis, introno VIdomenas, koduojantis
atvirktin transkriptaz, paymtas
punktyrine linija, I ir II egzonai storesne linija, akojimosi tako Anukleotidas parodytas (Mobile DNA, v.5,
2014)
321
MOLEKULIN BIOLOGIJA
tarp pirmojo egzono galo ir jai komplementarios introno nukleotid sekos, IGS (angl. internal
guide sequence, 6.17 pav.). Guanozino kofaktorius prisijungia guanozino prisijungimo srityje
introne guanozino prisijungimo kienje (angl. guanosine binding pocket) (6.19pav.). Ji yra katalizinje introno erdyje, netoli Mg2+ jungimo vietos. Guanozino 3hidroksigrups deguonies
atomas atakuoja fosfat 5splaisingo srityje. Susidaro kovalentinis ryys tarp guanozino ir introno 5galo. Skeliamas Iegzonas. Jis lieka duplekse su introno IGSsritimi. Guanozino kofaktorius
disocijuoja i guanozino kiens. Tada prie Iegzono 3OH grups priartja 3splaisingo sritis,
esanti tarp introno 3galo ir IIegzono 5galo. Paskutinis introno nukleotidas 3splaisingo srityje yra G (6.19pav.). Jis idstomas guanozino kienje antrai trans esterinimo reakcijai. Antroje
reakcijoje Iegzono 3hidroksigrups deguonies atomas atakuoja fosfat 3splaisingo srityje
tarp introno ir IIegzono. Trans esterinimo reakcij metu intronas ikerpamas, o I ir II egzonai
sujungiami. i reakcij metu vienas fosfato esteris virsta kitu, tarpiniai produktai nesusidaro.
6.19pav. Igrups introno isikirpimo schema. Deinje trans esterinimo reakcij schema; kairje
guanozino, prisijungusio introno guanozino kienje, schema. Punktyru paymti po reakcij sujungti
egzonai (Nature, v.418, p.222, 2002)
322
VI. RNR brendimas
Trans esterinimo reakcijoms nereikia papildomos energijos didiaenergi ATP arba GTP jungini pavidalu. Tai yra grtama reakcija, taiau jos metu pusiausvyra tarp pre-rRNR ir reakcijos
produkto rRNR, kurioje intronas jau paalintas, nenusistovi dl didels guanozino kofaktoriaus koncentracijos. Dl jos trans esterinimo reakcija stumiama produkto susidarymo pus.
Be to, pasikeiia antrin rRNR struktra, ir tai taip pat turi takos reakcijos eigai.
Ribozim katalizuojamos reakcijos labai panaios baltym katalizuojamas chemines reakcijas. Pvz., Tetrahymena pre-rRNR ribozimo katalizuojama savaimin introno isikirpimo reakcija yra keliomis eilmis greitesn negu chemin trans esterinimo reakcija. Kaip ir fermentai,
ribozimas (pre-rRNR) atrankus savo substratui. Taiau introno savaiminio isikirpimo reakcija
nra iki galo fermentin reakcija, nes katalizatorius (iuo atveju pati rRNR) reakcijos metu pakinta. Fermentai po reakcij lieka nepakit ir vl gali dalyvauti naujose reakcijose.
Reikia pastebti, kad trans esterinimo reakcij metu ikirptas intronas gali dalyvauti dar
keliose cheminse reakcijose, pvz., tam tikroms aplinkybmis Iintronai gali katalizuoti endonukleolitinio sklimo, RNR jungimo reakcijas.
6.4.7. IIgrups intron isikirpimo mechanizmas

II grups intron, kaip ir I grups intron, isikirpimas prasideda trans esterinimo reakcija, taiau kofaktorius reakcijoje nedalyvauja. Nukleofilas yra adenilato liekanos 2OH grup
paiame introne (6.20 pav.). 2 OH grup yra isidsiusi segtuko struktroje introno viduje
6.20pav. IIgrups introno isikirpimo schema. Punktyru paymti po reakcij sujungti

egzonai (Nature, v.418, p.222, 2002)
323
MOLEKULIN BIOLOGIJA
(6.18 pav.). i vieta vadinama akojimosi taku (angl. branch point). RNR molekul, turinti
IIgrups intron, sudaro savit erdvin struktr, dl kurios trans esterinimo reakcijose dalyvaujanios grups ir nukleotidai idstomi tiksliai. 2hidroksigrups deguonies atomas atakuoja fosfat tarp I egzono ir introno 5splaisingo srityje (6.20pav.). Skeliamas Iegzonas, susidaro
tarpin akota laso (angl. lariat) struktra, kurioje yra 2, 5fosfodiesterinis ryys. Tada Iegzono
3OH grups deguonies atomas atakuoja fosfat tarp introno ir IIegzono 3splaisingo srityje. Vykstant antrai trans esterinimo reakcijai, ikerpamas intronas, o Iir IIegzonai sujungiami
(6.20pav.). Reakcij metu antrin introno molekuls struktra ilieka stabili.
IIgrups intron savaiminio isikirpimo mechanizmas labai panaus intron ikirpim i
branduolio pre-iRNR, kur vykdo splaisosoma (angl. spliceosome).
IIgrups intronai savaime veiksmingai isikerpa in vitro. Reakcijai vykti reikia didels (nefiziologins) drusk koncentracijos. Veiksmingam savaiminiam isikirpimui in vivo btini baltymai jie sulanksto (angl. folding) intron katalizikai aktyvi molekul.
6.4.8. Judrieji I ir II grups intronai

Kai kurie I ir II grups savaime isikerpantys intronai pasiymi domiomis savybmis. Jie yra
judrs (angl. mobile) ir gali siterpti kitame geno alelyje, jeigu ten nra introno (angl. homing).
Tad intronai gali plisti i organeli branduolio DNR ir atvirkiai, taip pat tarp organizm.
Igrups intron judjimui reikalinga sekai atranki endonukleaz (angl. homing endonuclease). Nukleaz gali koduoti ir pats intronas, taiau Igrups intronuose ji pasitaiko retai.
Didioji dauguma IIgrups intron koduoja atviruosius skaitymo rmelius, homologikus
atvirktinms transkriptazms. Ikirptas intronas siterpia homologik DNR viet, o introno
koduojama atvirktin transkriptaz sintetina DNR, kaip matric naudodama introno RNR. Introno isikirpimui ir siterpimui reikia ne tik atvirktins transkriptazs, bet ir kit baltym, pvz.,
maturazs (angl. maturase). Maturazs danai koduojamos intron, jos reikalingos introno
struktrai stabilizuoti.
Manoma, kad IIgrups judrieji intronai yra tam tikr tip retrotranspozon pirmtakai.
6.5. Pre-iRNR brendimas eukariotuose

Eukariot iRNR molekuls pasiymi iomis bendromis savybmis:
zz koduoja baltymus;
zz funkcionuoja citozolyje;
zz prisijungia ribosomose baltym biosintezs metu;
zz dauguma pre-iRNR turi fragment, kurie nekoduoja baltym ir yra paalinami brendimo
metu;
zz eukariot iRNR 3 ir 5galai yra savitai modifikuojami.
324
VI. RNR brendimas
6.5.1. Eukariot pre-iRNR 5galo modifikacijos. Kepurs

struktra
Eukariotini iRNR sintez daniausiai prasideda nuo A (kartais G) nukleotido. Pirmas
RNRIIPol jungtas nukleotidas turi trifosfato grup 5gale. Taiau ios grups subrendusioje
iRNR nra. Vietoje jos iRNR molekuls turi neprast struktr. Molekuls 5 gale yra du nukleozidai, sujungti 5-5
Kepures 5gale turi visos eutrifosfatiniu ryiu. i struktra susidaro, kai prie iRNR mokariot RNRPol II susintetintos
lekuls 5galo trifosfato yra prijungiamas guanozinas. PaiRNR molekuls.
skutiniai trys nukleotidai iRNR molekuls 5gale gali bti
dar ir metilinti vairiose padtyse. Tokia struktra vadinama
kepure (angl. cap).
Kepur iRNR molekuli 5 gale, kaip ir poli (A) sintez 3 gale, sintetinama tik RNR Pol II
transkriptuose. Kepur pradedama sintetinti, kai RNRIIPol susintetina ~2030 iRNR nukleotid (6.21pav.).
Kepurs struktra utikrina ias iRNR funkcijas:
zz kepur padeda nustatyti 5 splaisingo srit pirmojo introno sklimui ir utikrina tiksl
splaising;
zz kepur reikalinga iRNR pernaai i branduolio citozol;
zz kepur dalyvauja transliacijos iniciacijoje prisijungdama prie eIF-4E transliacijos veiksnio ir taip utikrina, kad baltymo sintez prasidt ties pirmuoju AUG kodonu iRNR
molekulje;
zz kepur stabilizuoja iRNR apsaugodama j nuo 5egzonukleazi poveikio.
Kepurs sintez vykdo trys fermentai:
zz trifosfataz paalina fosfat, hidrolizuodama trifosfat 5gale iki difosfato;
zz guanililtransferaz jungia GMP;
zz 7-metiltransferaz metilina galinio nukleotido (GMP) guanino heterociklin baz.
ie fermentai yra RNRPolII komplekse kartu su kitais pre-iRNR pirmtak brendime dalyvaujaniais baltymais. Pirmiausia yra nuskeliamas pre-iRNR 5 galinio nukleotido (pppNp)
monofosfatas ir prie likusio difosfato (ppNp) per 5-5 ry jungiamas GMP (GpppGpppNp)
(6.21pav.). i modifikacija vyksta tik tuo atveju, jeigu pre-iRNR 5gale yra di- arba trifosfatas.
Tada paskutin heterociklin baz G modifikuojama metilinant j 7padtyje. Taip modifikuotas nukleotidas ir sudaro kepur. Tokias kepures, dar vadinamas cap 0, turi visos eukariot
iRNR. Kiekvienas i kepur sintetinani ferment gyvybikai svarbus mielms. Daugialsiai
organizmai turi vien bifunkcin polipeptid, pasiymint fosfataziniu ir guanililtransferaziniu
aktyvumais, o miels turi du polipeptidus, kurie sudaro heterodimer.
Daugelio eukariot (iskyrus vienalsius) iRNR kepurje dar gali bti modifikuojami kiti
nukleotidai 5gale. Antrajame nukleotide (pirmajame iRNR 5galo nukleotide) metilinama ri-
325
MOLEKULIN BIOLOGIJA
boz 2O padtyje (6.21pav.). Reakcij vykdo 2O metiltransferaz. Tokia struktra vadinama

cap 1. Kai kurios auktesnij eukariot iRNR turi dar vien metilgrup. Ji prijungiama prie
heterociklins bazs, jeigu pastaroji yra adeninas ir jeigu nukleotide prie tai jau yra metilinta
riboz. Metilinamas Natomas 6padtyje. Kai kuri organizm iRNR kepurje dar metilinama
riboz 2 O padtyje treiajame nukleotide molekuls 5 gale. Tokia struktra yra vadinama
cap2. Auktesnij eukariot iRNR dar yra metilinamos adenino (N6) heterociklins bazs visoje RNR molekulje (madaug viena metilinta heterociklin baz tkstaniui nukleotid).
6.21pav. Kepurs sintez RNRPolII transkript 5gale. Kepurs struktra (a); kepurs sintezs etapai
(b) (Nature Reviews Microbiology, v.10, p.51, 2012)
326
VI. RNR brendimas
Kepurs btinos veiksmingai eukariot virus iRNR transliacijai. Daugeliu atveju kepurs sintez
vyksta taip pat kaip ir eimininko iRNR. Taiau kai kuriuose virusuose rasta alternatyvi iRNR kepurs
sintezs keli. Pvz., pslelinio stomatito virusas VSV (angl. vesicular stomatitis virus, VSV) panaudoja
savo baltymo nuo RNR priklausomos polimerazs vien i aktyvum (oligoribonukleotidiltransferazs aktyvum) 5fosforilintos iRNR jungimui prie GDP susidarant tarpiniam kovalentiniam ryiui tarp
baltymo ir RNR. Kepurs metilinimo eiga taip pat skiriasi nuo lstels eiminks iRNR.
Fermentai, kurie sintetina iRNR kepur, labai anksti prisijungia prie transkripto 5galo paioje transkripcijos elongacijos pradioje (6.22pav.). iRNR molekuls gal modifikacijoms labai
svarbus RNRIIPol didiojo subvieneto CTD domenas. CTD yra vieta, kur jungiasi brendime dalyvaujantys lstels komponentai. Nustatyta, kad RNRPolII CTD koduojanio fragmento ikrita
slopina kepurs sintez, splaising, poli (A) jungim 3gale. Brendime dalyvaujani veiksni
jungimasis prie CTD valdomas fosforilinant CTD aminorgtis. Nustatyta, kad induoli ir mieli guanililtransferazs jungiasi tik prie fosforilinto CTD domeno. Mieli metiltransferaz taip
pat prisijungia prie CTD nuo fosforilinimo priklausomu bdu (6.22pav.).
Tuojau po to, kai susintetinama pre-iRNR kepur, prie jos prisijungia CBC baltym kompleksas (angl. cap binding complex). Jis aktyvina tolesn splaising ir iRNR molekuls 3galo
susidarym. Keli CBC komplekso subvienetai lieka prisijung prie iRNR vis transkripcijos bei
brendimo laik ir disocijuoja nuo jos tik citozolyje, kur prie iRNR kepurs prisijungia transliacijos veiksnys eIF-4E.
6.22pav. RNRIIPol CTD domenas ir iRNR kepurs sintez mielse. Mieli kepur sintetinantys fermentai paymti. Lenkta rodykl ymi transkripcijos pradi ir krypt (Current Opinion in Structural Biology, v.15, p.99, 2005)
327
MOLEKULIN BIOLOGIJA
6.5.2. Pre-iRNR 3galo modifikavimas

Baltymus koduojani gen transkripcijos, kurioje dalyvauja RNRPolII, terminacija yra susijusi su pre-iRNR 3galo brendimu. Pirmiausiai, RNRIIPol, baigdama sintetinti pre-iRNR, susintetina reguliacines sekas poliadenilinimo sek, PAS
(angl. polyadenylation sequence), ir G ir U gausi sek. Prie
Poli (A) sek 3gale turi visos, su
i iRNR cis element jungiasi trans veiksniai baltymai,
retomis iimtimis, subrendusios
kuri, kartu su kitais brendime dalyvaujaniais baltymais,
eukariot iRNR, kurias sintetina
3galo brendimo komplekse gali bti iki 80. pre-iRNR yra
RNRPolII.
skeliama tarp PAS ir G ir U sek (6.23pav.). Prie nuskeltos
pre-iRNR 3galo prijungiama poli (A) seka, o kita nuskeltos pre-iRNR dalis suardoma.
Poli (A) sek 3gale turi beveik visos subrendusios eukariot iRNR, kurias sintetina RNRPolII.
Toki sek nra daugialsi eukariot histon iRNR ir dumbli iRNR. iRNR molekuli 3galo
modifikacijos utikrina ias funkcijas:
zz padidina iRNR molekuls stabilum;
zz utikrina veiksming iRNR transliacij;
zz yra reikalinga iRNR pernaai i branduolio citozol.
Pre-iRNR molekulje PAS seka tai heksanukleotidas 5AAUAAA3, nutols 1030 nukleotid atstumu nuo sklimo-poliadenilinimo vietos.
AAUAAA seka yra viena i konservatyviausi inom reguliacini sek. Nevisikai atitinkani sek poliadenilinimo element yra ~10%. Dauguma j turi vien pakitus nukleotid (daniausiai vietoje A yra U).
6.23pav. Pre-iRNR 3galo brendimas eukariotuose. Parodyti sklimo-poliadenilinimo komplekso baltymai (erdiniai veiksniai), pagalbiniai veiksniai, iRNR reguliacins sekos (Nature Reviews Genetics, v.11,
p.75, 2010)
328
VI. RNR brendimas
Prie histon iRNR poli (A) seka 3gale nra prijungiama. pre-iRNR 3gal skelia endonukleaz. Tam,
kad vykt sklimas, pre-iRNR molekulje prie sklimo viet turi susidaryti RNR segtukas. Prie segtuko
prisijungia savitas baltymas SLBP. Prie kito iRNR elemento, esanio 1017 nukleotid u sklimo srities,
prisijungia U7 snRNR molekul ji nustato sklimo viet. SLBP baltymas lieka prisijungs prie histon
iRNR ir jos pernaos citozol metu.
Pre-iRNR 3galo brendimas prasideda, kai prie PAS sekos prisijungia sklimo ir poliadenilinimo atrankumo veiksnys CPSF (angl. cleavage and polyadenylation specificity factor), o
prie G ir U gausios sekos CstF veiksnys (angl. cleavage stimulatory factor) (6.23pav.). CPSF
komplekso sudtyje yra endoribonukleaz ji skelia pre-iRNR. Sklimo vieta yra apie 2530nt
u PAS sekos ir apie 30nt prie G ir U sek. Prie nuskeltos pre-iRNR 3galo poli (A) polimeraz,
PAP (angl. polyA polymerase), jungia A nukleotidus. induoliuose komplekso sudt eina tvirtinamasis baltymas simplekinas (angl. symplekin) (6.24pav.).
Poli (A) polimeraz yra nukleotidiltransferazi supereimos nar, nuo matricos nepriklausanti polimeraz. AMP nukleotid jungimui poli (A) polimeraz naudoja t pat katalizin mechanizm kaip ir DNR bei RNR polimerazs. Poli (A) polimeraz jungiasi prie RNR-CPSF-CstF
komplekso, sveikaudama su CPSF didiuoju subvienetu. Prie iRNR 3galo prijungiami pirmieji
~10 Anukleotid. Tada prie susintetinto fragmento prisijungia PABPN1 (angl. polyA binding
protein 1, N branduolys) baltymai ir sudaro kompleks su iRNR pirmaisiais A nukleotidais,
CPSF ir poli (A) polimeraze. Tokiame komplekse PAP polimerazs procesyvumas iauga ji nedisocijuodama prijungia dar ~200 nukleotid. Manoma, kad PABPN1 baltymas lieka prisijungs prie iRNR 3galo tol, kol molekul perneama citozol. Citozolyje prie poli (A) sekos jungiasi citozolio PABP analogas PABPC baltymas. Jis apsaugo iRNR nuo suardymo ir yra svarbus
transliacijos iniciacijai prijungia transliacijos iniciacijos veiksn eIF4G. Todl citozolyje subrendusios iRNR 3 ir 5galai suartja, sudarydami kilp.
Manoma, kad iRNR molekuls poli (A) ilgis 3gale lemia iRNR gyvavimo pusam. Kuo ilgesnis is galas, tuo ilgiau jis deadenilinamas lstels egzonukleazi. Kaip ir pre-iRNR kepur
6.24pav. Eukariot pre-iRNR 3galo brendime

dalyvaujantys baltymai. SV pre-iRNR sklimo
vieta, CTD RNRPolII Cgalinis domenas (Nature
Structural and Molecular Biology, v.19, p.577,
2012)
329
MOLEKULIN BIOLOGIJA
5gale, taip ir 3galo poliadenilinimas priklauso nuo RNRPolII CTD domeno. Eksperimentais
sutrumpinus domen, lstelse pre-iRNR transkriptai neskeliami 3gale transkripcija stabdoma kitose vietose. Nustatyta, kad iRNR 3galo sklimo ir poliadenilinimo komplekso komponentai prisijungia prie RNRPolII CTD domeno.
Citozolyje tam tikru lstels diferenciacijos momentu poli (A) vl sintetina citozolio fermentai. Nustatyta, kad toks procesas vyksta per ovocit brendim ir ankstyvuoju peli bei varli vystymosi periodu. Panau, kad citozolio poliadenilinimo aparatas aktyvinamas tam tikru brendimo ir diferenciacijos
momentu.
6.5.3. iRNR splaisingas eukariotuose

Kol nebuvo inoma eukariot gen struktra, manyta, kad jie organizuoti taip pat, kaip ir
prokariot, t.y. visa geno DNR seka koduoja baltym arba RNR. Taiau paaikjo, kad daugelis
eukariot gen, koduojani baltymus, turi terpt sek,
kurios per transkripcij ar po transkripcijos yra paalinaDaugeliui eukariot gen,
mos i pre-iRNR. Iskiriamos dviej tip sekos:
koduojani baltymus, bzz egzonai, t.y. sekos, kurios po kirpimo sujungiamos;
zz intronai, t.y. sekos, kurios, po ikirpimo i pre-iRNR,
lieka fizikai atskirtos.
dinga egzonin-intronin
organizacija.
6.25 pav. Intron egzistavimo rodymas Rkilp metodu. Adenoviruso heksono geno struktrin
organizacija (a); heksono geno DNR dalies, hibridizuotos su subrendusia heksono iRNR, elektronins
mikroskopijos nuotrauka ir j paaikinanti schema. AC ymi intron DNR (b) (PNAS, v.74, p.3173, 1977)
330
VI. RNR brendimas
Toki sek turintiems transkriptams bdingas savitas brendimas branduolyje vykstantis

splaisingas (angl. nuclear splicing). Splaisingo metu intronai paalinami i pre-iRNR, o egzonai sujungiami. ios
Sek paalinimas i pre-iRNR ir
reakcijos vyksta branduolyje transkripcijos metu arba tuoj
likusi dali sujungimas vyksta
pat po transkripcijos. Pre-iRNR virsta subrendusia iRNR, ji
splaisingo proceso metu.
perneama citozol, ten naudojama kaip matrica baltym
biosintezei.
Pirmiausiai buvo pastebta, kad branduolio RNR molekuls heterogenin branduolio
RNR, hnRNR (angl. heterogeneous nuclear RNA), yra ilgesns nei iRNR, esanios citozolyje.
Pirmasis intron egzistavimo rodymas gautas sulyginus adenoviruso sintetinam heksono
geno iRNR ir gen koduojani DNR. iRNR ir DNR buvo hibridizuojamos tarpusavyje, o hibridai
irykinti elektronins mikroskopijos metodu. Pasirod, kad didel dalis adenoviruso DNR nesihibridizavo su iRNR: tokios DNR sritys hibride buvo istumtos kaip didels kilpos (6.25pav.).
is intron ir egzon nustatymo bdas yra vadinamas Rkilp technika. iRNR ir DNR hibridai
vliau nustatyti tyrinjant ir kit eukariotini organizm iRNR ir DNR. Taigi, buvo rodyta, kad
DNR egzistuoja sritys, kuri nra subrendusiose iRNR. Splaisingo atradimas 1977m. buvo vienas svarbiausi atradim eukariot molekulinje biologijoje.
6.5.4. Pre-iRNR intronai splaisingo reakcij substratas

Nra n vieno iki iol inomo eukariot genomo, kuriame nebt rasta intron ir splaisosomos ar jos komponent. Vidutinis eukariot genas turi ~8 egzonus, jo pre-iRNR yra apie
410 kart ilgesn u subrendusi iRNR. Egzonai yra palyginti trumpi (100400nt), o intron
ilgis gali siekti ir 700000 nt. Auktesniuosiuose eukariotuose intron skaiius vienoje pre-iRNR
svyruoja nuo 0 iki >50, o genomuose tik nedidel dalis gen (~6%) neturi intron (6.26pav.).
6.26pav. Intron skaiius eukariot genuose (Nature Reviews Genetics, v.7, p.211, 2006)
331
MOLEKULIN BIOLOGIJA
emesniuosiuose eukariotuose, prieingai, tik nedidel dalis gen turi intron pvz., mieli
Saccharomyces cerevisiae tik 235 genuose i 5885 (<4%) yra intron; genuose j nedaug, intronai daniausiai yra trumpi ir isidst ariau geno 5galo.
Iki iol diskutuojama dl intron kilms eukariotuose. Buvo ikeltos dvi hipotezs. Pirmoji
yra vadinamoji anksti atsiradusi intron hipotez (angl. introns early). Ji teigia, kad eukariot
genai intronus gijo i prokariot, paskui kai kurie organizmai juos prarado, todl genomuose
j dydis ir skaiius vairus. Prokariotai taip pat prarado intronus ir splaisom, nes dl evoliucinio
spaudimo turjo didinti DNR replikacijos greit ir intron bei splaisosomos atsisakyti.
Kita vadinamoji vlai atsiradusi intron (angl. introns late) hipotez teigia, kad archjos
ir bakterijos niekada neturjo intron ir splaisosomos ir kad ie atsirado i karto eukariotuose
kaip genomo patobulinimas, kuris funkcionuoja iki iol kuriant naujus genus. Genom sekoskaitos tyrimai atskleid, kad i ties intron gijimas ir praradimas vyksta iki iol, pvz., intron
transpozicijos, intron terpimo, gen duplikacijos bdais.
iandien vystoma intron kilms teorija, jungianti abi anksiau mintas teorijas. Ji teigia,
kad dauguma intron eukaruot genomuose atsirado labai ankstyvuose evoliucijos etapuose.
Genai, turintys intron, pasiymi iomis savybmis:
zz egzon eilikumas yra toks pats ir gene, ir subrendusioje iRNR. Pvz., jeigu egzon tvarka
gene yra a, b, c, d, f, po splaisingo ji lieka tokia pati;
zz intron turintis genas ilaiko t pai struktr vis audini lstelse, taip pat ir lytinse
lstelse, nesvarbu, vyksta jo raika ar ne;
zz branduolio genuose intronai prastai koduoja terminacijos kodonus visuose skaitymo rmeliuose. Jeigu intronai i pre-iRNR nepaalinami, jie anksiau laiko stabdo baltym sintez.
6.5.5. Splaisingui reikmingos konservatyvios nukleotid

sekos intronuose ir egzonuose
Intronai branduolyje paalinami i iRNR molekuli dalyvaujant molekulinei mainai splaisosomai (angl. spliceosome), kurios komponentai (splaisingo trans veiksniai) atpasta trumpas
konservatyvias sritis egzon ir intron sandros srityse bei intron ir egzon viduje (splaisingo
cis veiksnius). Splaisingo cis ir trans veiksniai utikrina splaisingo tikslum ir veiksmingum.
Splaisingo cis veiksniai skirstomi dvi grupes konservatyvisias sekas egzon ir intron sandros srityse bei reguliacines sekas egzonuose ir
intronuose.
Eukariot pre-iRNR splaisingas
Konservatyviosios sekos egzon ir intron sandros
vyksta dalyvaujant cis veikssrityse yra ios:
niams nukleotid sekoms
zz 5splaisingo sritis AG/GURAGU (R purinas, pasvirasis brknelis skiria egzon ir intron) (6.27pav., a);
zz 3 splaisingo sritis introne YAG (Y pirimidinas)
(6.27pav., a).
332
pre-iRNR, ir trans veiksniams

splaisosomai ir splaisingo
veiksniams.
VI. RNR brendimas
Konservatyviosiose srityse intron 5ir 3galuose esantys dinukleotidai GU ir AG bei akojimosi sekos A nukleotidas yra labai konservatyvs. Sritys buvo nustatytos mutagenezs metodu gavus mutacijas, kurios sukl vairaus laipsnio splaisingo slopinim. Sritys yra panaios stuburiniuose, augaluose ir mielse. Pastarosiose jos dar konservatyvesns. Toks nukleotid sek panaumas
liudija, kad intronin-egzonin organizacij turintys genai ir splaisingas egzistavo labai seniai.
zz akojimosi tako seka, BPS (angl. branch point sequence). Ji yra netoli (1840nt) nuo
3splaisingo srities introne. Jos seka yra YNCURAY (N bet kuris nukleotidas) (6.27pav.,
ab). Ties A nukleotidu, vykus pirmai trans esterinimo reakcijai, susidaro introno kilpa.
Kilpos susidarymo mechanizmas yra toks pats kaip ir IIgrups savaime isikerpani intron kilpos susidarymas pirmos trans esterinimo reakcijos metu.
zz Polipirimidin ruoas (Y)n (6.27pav., a). J sudaro 1012 pirimidino nukleotid. Sritis
bdinga auktesnij eukariot intronams. Ji yra tarp akojimosi tako sekos ir 3splaisingo srities.
Mielse akojimosi tako seka (UACUAAC) yra labai konservatyvi, o polipirimidin ruoo
kartais i viso nra. Tai galima paaikinti tuo, kad palyginti nedaug mieli pre-iRNR turi intronus.
Anksiau ivardyti konservatyvij sek elementai yra svarbs katalizinms reakcijoms
splaisosomoje vykti.
induoli genuose aptikta nedidel grup intron, kuri galuose esantys konservatyvs
elementai skiriasi nuo anksiau aptart vadinamj GU-AG intron. ie intronai 5splaisingo
srityje turi dinukleotid AU, o 3 splaisingo srityje AC (6.27 pav., a). Toki intron sklimas
vyksta panaiai kaip ir GU-AG sekas turini intron. domu, kad AU-AC intron splaisinge daly-
6.27pav. Splaisingui reikmingos konservatyvios sekos pre-iRNR. Konservatyviosios sekos induoli

ir mieli pre-iRNR intronuose. Konservatyviausi nukleotidai pabraukti (a); konservatyviosios splaisingo
sekos kai kuriuose eukariot genuose (b)
333
MOLEKULIN BIOLOGIJA
vauja vadinamoji alternatyvioji splaisosoma, kurios sudtis skiriasi nuo GU-AG intron splaisinge dalyvaujani splaisosom sudties. Alternatyviojoje splaisosomoje nustatytos kitokios
snRNR (angl. small nucleolar RNA) molekuls U11 ir U12, kuri nra GU-AG intron sklime
dalyvaujanioje splaisosomoje (vadinamojoje U2 splaisosomoje).
Antroji svarbi splaisingo cis veiksni grup yra reguliacins sekos egzonuose ir intronuose splaisingo stiprikliai ir slopikliai (angl. splicing enhancers and silencers). Jie yra svarbs
alternatyviojo splaisingo (angl. alternative splicing) reguliatoriai. Prie splaisingo stiprikli ir
slopikli jungiasi splaisingo veiksniai. Jie valdo alternatyviojo splaisingo vyksmus.
6.5.6. Splaisingo reakcijos

Eksperimentais, atliktais su in vitro susintetintais pre-iRNR substratais, nustatyta, kad intronai
yra skeliami i pre-iRNR, o lik egzonai jungiami vykstant dviems trans esterinimo reakcijoms.
Pirmojoje trans esterinimo reakcijoje konservatyvaus A nukleotido, esanio akojimosi tako sekoje, 2hidroksigrups deguonies atomas atakuoja fosfat 5splaisingo srityje. Iegzonas
skeliamas, o 5gale esantis Gnukleotidas jungiamas prie Anukleotido 2, 5fosfodiesteriniu
ryiu. Susidaro introno lasas (angl. lariat) (6.28pav.).
Kitoje trans esterinimo reakcijoje Iegzono gale esanio nukleotido 3hidroksigrups deguonies atomas atakuoja fosfat 3splaisingo srityje. Laso intronas skeliamas, o abu egzonai
sujungiami (6.28pav.).
Splaisingui vykti btina splaisosoma megadalton molekulins mass sudtingas baltym, maj branduolio RNR snRNR ir splaisingo veiksni kompleksas. Splaisosoma tiksliai ir
veiksmingai vykdo intron kirpimo ir egzon sujungimo reakcijas.
6.28pav. Pre-iRNR splaisingo trans esterinimo reakcij, kurias vykdo splaisosoma, schema
334
VI. RNR brendimas
6.5.7. Splaisosomos struktra

Paviens splaisosomos, ultracentrifuguojamos drusk tankio gradiente, sedimentuoja kaip
4060S dalels. 2004m. atliktos vienos splaisosomos 20 skyros krioelektronins mikroskopijos vaizdai liudija, kad splaisosom sudaro 2 dalys ir ertm (tunelis) tarp j (6.29pav., a). Splaisosoma yra iek tiek pailgos globuls formos. Didiausia splaisosomos komponent (snRNP)
koncentracija didiajame subvienete. Dydiu splaisosomos panaios ribosomas. induoli
lsteli branduoli tyrimai atskleid, kad splaisosomos gali bti organizuotos dar didesnius
kompleksus. Igrynintos i branduoli splaisosomos sedimentuoja kaip 200S dalels. Tokios
dalels pavadintos lnRNP (angl. large nuclear ribonucleic particles) (6.29pav., b). Elektronins
mikroskopijos metodu nustatyta, kad jos gali bti sudarytos i keturi vienod struktr. Toks
kompleksas pavadintas suprasplaisosoma (angl. supraspliceosome). Manoma, kad suprasplaisosomoje vienu metu galt vykti keli intron ikirpimas.
U2, arba GU-AG,splaisosom sudaro penkios snRNP dalels (angl. small nucleolar ribonucleic particles) U1, U2 ir U4-U6 ir U5. Pagrindiniai snRNP daleli komponentai yra:
zz U1, U2, U4-U6 ir U5 snRNR molekuls (U pavadinimuose yra dl U nukleotid gausos, o
numeracija atitinka atradimo eilikum).
U4 ir U6 snRNR molekuls tam tikrose srityse yra komplementarios viena kitai ir in vivo sudaro vien snRNP dalel (6.31pav.). Kitos snRNP turi po vien snRNR molekul. snRNR nukleotid
sekos skiriasi tarp ri, bet j antrins struktros yra konservatyvios.
U6 snRNR nukleotid sekos yra panaios moguje ir mielse. U6 snRNR genas transkribuojamas RNR IIIpolimerazs. Molekul turi kitaip modifikuot 5gal nei kitos snRNR. i RNR po
transkripcijos lieka branduolyje, o visos kitos snRNR keliauja citozol, kur yra modifikuojamos
(montuojasi splaisosomos snRNP daleles). Kaip minta, U6 su U4 snRNP sudaro vien dalel,
kuri vliau susijungia su U5 snRNP dalele.
6.29pav. Splaisosomos struktra.

Splaisosomos erdvin struktra,
nustatyta krioelektronins mikroskopijos metodu (a) (Molecular Cell,
v.15, p.833, 2004); suprasplaisosomos struktros modelis. Raudonai
paymti egzonai (b) (Structure,
v.16, p.1605, 2008)
335
MOLEKULIN BIOLOGIJA
zz Smbaltymai erdiniai splaisosomos baltymai. Kiekvienoje snRNP dalelje, iskyrus U6,

yra vienodas septyni Sm baltym rinkinys: B/B, D3, D2, D1, E, F ir G.
Smbaltymai atlieka svarbias funkcijas splaisingo valdyme jie yra branduolio pernaos signalai, nukreipiantys splaisosomos snRNP daleles splaisingo vietas. Jie taip pat palaiko splaisosomos daleli integralum. Smbaltym dydis svyruoja tarp 929kDa. Jie tam tikra tvarka
prisijungia prie konservatyvios viengrandins nukleotid sekos RAU4-6GR snRNR molekulse.
U6 snRNR turi kitok Sm baltym rinkin (LSm).
zz Be erdini Smbaltym, kiekviena snRNP dalel dar turi kiekvienai bding savitj baltym. Pvz., U1 snRNP dalel turi tris savitus baltymus: U1-A, U1 70kDa ir U1-C (6.30pav.).
Splaisosom sudaranios snRNP dalels i viso turi apie 40 baltym (6.31pav.). Manoma,
kad kai kurie splaisosomos baltymai tiesiogiai dalyvauja katalizs reakcijose, kiti atlieka struktrizavimo funkcij arba yra reikalingi splaisosomos susimontavimui.
Splaisinge dalyvauja ir daug kit baltym splaisingo veiksni, kurie atlieka vairias funkcijas. Splaisingo veiksniai skirstomi dvi grupes:
zz SR baltymai. SR baltymai yra labai konservatyvs stuburiniuose, bestuburiuose, taip
pat j rasta augaluose. Mielse nustatyti tik kai kuri SRbaltym analogai. SRbaltym
C galo RS domene (R argininas, S serinas) gausu serino ir arginino aminorgi.
Domen daniausiai sudaro SR arba RS tvarka isidst dipeptidai. Serino aminorgtys
fosforilinamos vairiais lstels ciklo tarpsniais. Nuo fosforilinimo priklauso SRbaltym
giminingumas RNR ir sveika su kitais baltymais. Kiekvieno tipo lstels sintetina skirting SRbaltym rinkin. SRbaltymai Ngalu sveikauja su pre-iRNR. Ngale yra sveikos
su RNR motyvas (motyvai) RRM (angl. RNA recognition motif), kur sudaro 7090 aminorgi. SRbaltymai atrankiai jungiasi prie splaisingo stiprikli savitj sek, esani
egzonuose ir intronuose. Baltymai yra svarbs alternatyviojo splaisingo, iRNR inaos i
branduolio, iRNR ardymo, transliacijos reguliatoriai.
zz Heterologinis branduolio ribonukleoproteinas, hnRNP (angl. heterologous nuclear
ribonucleoprotein). Tai yra vairs baltymai, prisijungiantys prie pre-iRNR per transkripcij arba po transkripcijos ir darantys tak splaisingo eigai. hnRNP baltymams taip pat
bdingas RRM motyvas.
6.30pav. U1splaisosmos snRNP dalels erdvin struktra. snRNR struktros elementai

(stiebai), Smbaltymai, dalelei saviti baltymai
(U1 70kDa, U1-A, U1-C) paymti (G.Karp. Cell
and Molecular Biology: Concepts and Experiments, fifth edition, 2008)
336
VI. RNR brendimas
Splaisingo komponentus koduoja didel dalis eukariot genomo. Pvz., mielse splaisingo
komponentus koduoja daugiau nei 100 vairi gen , tai sudaro apie 2% mieli genomo, nors
intronus turini gen dalis mielse yra labai nedidel.
Splaisosomos erdvin struktra ir komponent sudtis splaisingo metu kinta. Ties preiRNR, kuri turi intron, splaisosoma susimontuoja tam tikra tvarka. Jeigu intronai yra nedidelio dydio (~200250nt), splaisosoma susimontuoja iilgai introno. Jeigu intronai yra dideli
(> 250 nt), kaip, pvz., yra induoliuose, splaisosomos komponentai pirmiausiai jungiasi ties
egzonais.
6.5.8. Splaisosomos susimontavimas ties pre-iRNR

Kaip susimontuoja funkcionali splaisosoma, kurios kataliziniuose centruose gali vykti preiRNR intron sklimas ir egzon sujungimas? Vienas pagrindini io proceso bruo tas, kad
splaisosomos komponentai sveikauja tarpusavyje ir su pre-iRNR tam tikra tvarka: susidarant
vieno tipo ryiams, kiti suardomi.
Pirmame etape susidaro ankstyvasis Ekompleksas (angl. early complex). U1 snRNP dalel prisijungia prie pre-iRNR 5splaisingo srityje (6.32pav.). iame etape pre-iRNR atpastama
kaip substratas bsimoms splaisingo reakcijoms. U1 snRNP dalels snRNR molekul sveikauja
su komplementaria GU seka introne ir aplink j. U1 snRNP prisijungimui ATP nereikia. Auktesniuosiuose eukariotuose i sveik stabilizuoja SRbaltymai ir U1 snRNP dalels baltymai.
Pvz., pirmajame splaisosomos montavimosi etape prie introno akojimosi tako sekos ir poli-
6.31pav. Splaisosomos snRNP daleli sudtis (Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2011,
3:a003707)
337
MOLEKULIN BIOLOGIJA
pirimidin ruoo prisijungia SF1/BBP ir pagalbinis U2AF veiksnys. U2AF veiksn sudaro du sub
vienetai (65kDa ir 35kDa baltymai). SF1/BBP sveikauja su 65kDa baltymu, o 35kDa baltymas jungiasi prie AG dinukleotido 3splaisingo srityje (6.32pav.). Tokiu bdu nustatomos 3ir
5splaisingo sritys.
Mieli intronuose, taip pat nedideliuose daugialsi organizm intronuose iame etape
introno 5ir 3galai priartja vienas prie kito.
Kitame etape introne prie akojimosi tako sekos prisijungia U2 snRNP dalel. Prisijungimui
reikia ATP, kaip ir visiems tolesniems vyksmams. Dl komplementarios sveikos tarp U2 snRNR
ir introno akojimosi tako sekos susidaro RNR-RNR dupleksas (6.32pav.). iame duplekse akojimosi tako sekoje esantis nesuporuotas Anukleotidas yra istumiamas i duplekso. Taigi,
komplementari sveika tarp U2 snRNR ir pre-iRNR akojimosi tako sekos lemia tai, kad Anukleotido ribozs 2hidroksigrups deguonies atomas tampa nukleofilu pirmojoje trans esterinimo reakcijoje. U2 snRNP sveikauja su U1 snRNP. Prisijungus U2 snRNP dalelei, E kompleksas
virsta A kompleksu (6.32pav.).
Anksiau aprayti vykiai buvo nustatyti tyrinjant splaising mielse. Daugialsi organizm genuose egzonai daniausiai yra trumpi, o intronai daug ilgesni, todl U1 snRNP ir U2
snRNP dalels prisijungia i abiej egzon pusi. Tai vadinamasis egzon nustatymo (angl.
exon definition) procesas.
Toliau Akompleks sijungia dar viena snRNP dalel. Ji sudaryta i U4-U6 snRNP ir U5 snRNP daleli (6.33pav.). Susidaro splaisingo Bkompleksas. U4-U6 snRNP dalelje U4 ir U6 snRNR
molekuls tarpusavyje sudaro RNR-RNR dupleks. Pvz., mielse dupleks sudaro net 24 nukleotid poros.
6.32pav. Splaisosomos E ir A
kompleks susidarymas
338
VI. RNR brendimas
Tada splaisosomos Bkomplekse vyksta struktrini pokyi, kuri metu susidaro RNR-RNR
sveik tinklas, utikrinantis tolesnes katalizines introno sklimo ir egzon sujungimo reakcijas. Veikiant DExD/H helikazms (j veikimui reikia ATP), pirmiausiai nuo 3splaisingo srities
disocijuoja U1 snRNP dalel. Tada suardomas U4-U6 snRNR molekuli dupleksas, ir U6 snRNR
sudaro dupleks su U2 snRNR (6.33pav., a, b), o U4 snRNP dalel disocijuoja i splaisosomos.
Splaisosomos B kompleksas virsta katalizikai aktyviu B* kompleksu, kuriame gali vykti
pirmoji trans esterinimo reakcija. Istumtojo Anukleotido 2hidroksigrups deguonies atomas
atakuoja fosfat 5splaisingo srityje. Intronas ties 5splaisingo sritimi skeliamas, susidaro laso
struktra. Iegzono 3gale lieka hidroksigrup (6.28pav.).
vykus pirmai trans esterinimo reakcijai, splaisosomos B*kompleksas virsta Ckompleksu.
Prie antrj trans esterinimo reakcij Ckomplekse vl vyksta nuo ATP priklausomi struktriniai
persitvarkymai. Ckomplekse egzono 3hidroksigrup isidsto arti 3splaisingo srities. Reakcijai vykti labai svarbi sveika tarp konservatyvios U5 snRNR kilpos ir egzon sek 5ir 3splaisingo srityse (6.33pav., ab). Sveika tarp U5 snRNR ir 5egzono isilaiko abiej reakcij metu. U5
snRNR kilpa laiko 5egzono splaisingo tarpin produkt po pirmos trans esterinimo reakcijos ir
6.33pav. Splaisosomos Bir B*kompleks susidarymas. Splaisosomos A, B, B*kompleks montavimosi schema (a) (Nature Reviews Molecular Cell Biology, v.15, p.108, 2014); sveikos tarp U snRNR molekuli ir pre-iRNR splaisosomos B ir B*kompleksuose (b) (Cell, v.136, p.701, 2009)
339
MOLEKULIN BIOLOGIJA
padeda idstyti 5ir 3egzonus antrajai trans esterinimo reakcijai. Tai, kad U5 snRNR kilpoje yra
keli U nukleotidai, galintys sudaryti ne Votsono-Kriko nukleotid poras, liudija, kad splaisingo
metu kilpa gali laikyti abu egzonus. U5 snRNR, greiiausiai, tiesiogiai nedalyvauja katalizje,
nes dalis jos sek in vitro nra svarbios.
vykus antrajai trans esterinimo reakcijai, susidaro laso struktros intronas, egzonai sujungiami (6.28pav.). Tada nuo iRNR disocijuoja U2, U5 ir U6 snRNP dalels. iuose vyksmuose dalyvauja vairios RNR helikazs.
Pasibaigus splaisingo reakcijoms, iRNR turi pasialinti i splaisosomos ir pereiti citozol.
Splaisosomoje vl vyksta pertvarka, suardomi katalizini reakcij metu sudaryti RNR-RNR ryiai ir atstatomi tarpmolekuliniai ryiai, buv iki susimontuojant splaisosomai.
Splaisosomos struktrai ir funkcijoms svarbs dvivaleniai metalo jonai (Mg2+). Jie tiesiogiai
dalyvauja katalizinse reakcijose ir yra reikalingi RNR molekuli struktrai palaikyti.
6.5.9. Splaisosomos katalizinis centras

Remiantis vidumolekulini struktr, kurios susidaro pre-iRNR molekulje splaisingo metu
splaisosomoje ir savaime isikerpant IItipo intronams, taip pat chemini reakcij abiej proces metu tyrim duomenimis, manoma, kad pre-iRNR splaising katalizuoja RNR, nors splaisosomos sudtyje yra didesnis kiekis baltym nei RNR.
U2 ir U6 snRNR molekuls sveikauja tarpusavyje ir su pre-iRNR. Jos sudaro aktyviojo centro
pamat splaisosomoje. Nustatyta, kad U2 ir U6 RNR molekuli fragmentai in vitro gali sudaryti
komplementari sveik ir gyti struktr, panai t, kuri abi molekuls sudaro katalizikai
aktyvioje splaisosomoje. Kai reakcijos miinyje yra nedidelis oligonukleotidas, turintis nukleotid sek, panai akojimosi tako sek introne (angl. branch oligo), vyksta lta reakcija, panai
pirmj trans esterinimo reakcij splaisosomoje. Reakcijoje susidaro laso struktra tarp U6 ir
oligonukleotido.
6.34pav. IIgrups savaime isikerpanio introno Vdomeno ir splaisosomos U6snRNR aktyvieji

centrai ir katalizini reakcij schemos. M metalo jonai; vaigduts nukleotid fosfato grupi deguonies atomai, su kuriais yra koordinuoti metalo jonai (Nature, v.503, p.201, 2013)
340
VI. RNR brendimas
U6 snRNR yra viena konservatyviausi snRNR, tiek savo nukleotid seka, tiek dydiu. Mutacijos ioje RNR, pvz., vienintelio deguonies atomo pakeitimas sieros atomu fosfodiesteriniame
ryyje U6 snRNR molekuls centre, visikai stabdo splaising.
U6 RNR molekul prijungia Mg2+ jonus, ie isidsto konservatyvioje stiebo-kilpos struktroje (angl. intramolecular stem loop, ISL). is U6snRNR struktros elementas labai panaus
IIgrups savaime isikerpani intron V domeno struktr (6.34pav.). Manoma, kad metalo
jonai tiesiogiai dalyvauja splaisingo reakcijose arba aktyvindami 2hidroksigrups deguonies
atom, arba stabilizuodami nueinanij grup (angl. leaving group).
Netoli splaisosomos katalizinio centro esantys baltymai taip pat svarbs katalizei. Eksperimentais parodyta, kad U5 snRNP dalels Prp8 baltymas yra netoli splaisosomos katalizinio
centro, kur formuoja snRNR molekuls. Baltymo domen struktra panai kai kuri IIgrups
savaime isikerpani intron koduojamos atvirktins transkriptazs ir IItipo restrikcijos endonukleazs domenus. Tai dar labiau sustiprina prielaid, kad branduolio splaisingas ir IIgrups savaime isikerpani intron splaisingas yra bendros kilms.
Pasirenkant sklimo vietas svarb vaidmen atlieka baltymai. Didioji dauguma daugialsi organizm lsteli pre-iRNR intron turi splaisingo srii, pasiymini nedideliu konservatyvumu. Manoma, kad splaisingo viet atpainim iose RNR lemia ne tiek konservatyvios
sritys, kiek egzonai (~200nt). Egzonuose yra reguliacini element, vadinamj egzonini
splaisingo stiprikli, ESE (angl. exonic splicing enhancers), bei egzonini splaisingo slopikli, ESS (angl. exonic splicing silencers) (6.35 pav.). Jie prijungia splaisingo veiksnius, pvz.,
SRbaltymus ar hnRNP, taip pat jungia splaisosom jos komponentus. Toks splaisingo viet atpainimas yra bdingas tiek konstitutyviai, tiek alternatyviai (t.y pasirinktinai) kerpamiems
egzonams. Intronuose taip pat yra reguliacini splaisingo srii intronini splaisingo stiprikli, ISE (angl. intronic splicing enhancers), bei intronini splaisingo slopikli, ISS (angl.
intronic splicing silencers) (6.35pav.).
6.35pav. Splaisingo valdymo schema. Rodykls ymi aktyvinanius komponentus, raudona linija buku
galu slopinanius komponentus (L.A.Allison. Fundamental Molecular Biology, second edition, 2012)
341
MOLEKULIN BIOLOGIJA
6.5.10. Splaisingo kompleks lokalizacija branduolyje

Tyrimais nustatyta, kad didioji dalis splaisingo komponent sutelkti branduolio dmse (angl. speckles) ir Kajalo kneliuose, kurie pasklid po branduol, iskyrus branduoll
(6.36pav., ab). induoli branduolys turi 2050 dmi ir 15 Kajalo knelius. Fluorescencins in situ hibridizacijos metodu nustatyta, kad pre-iRNR molekuls ir subrendusios iRNR yra
sutelktos dmi kratuose. Branduolio dmi struktros sutampa su branduolio sritimis, kurios yra vadinamos interchromatino granuli telkiniais ir perichromatino fibrili tinklu. In situ
hibridizacijos eksperimentai atskleid, kad brandinama ir perneama i branduolio citozol
pre-iRNR juda iomis struktromis.
Nustatyta, kad splaisosomos komponentai pradeda montuotis ties pre-iRNR, kai molekuls
3galas dar nra susintetintas, o intron ikirpimas prasideda dar nepasibaigus transkripcijai.
Aktyviai transkribuojam gen vietose vyksta ir transkript splaisingas.
6.5.11. Alternatyvusis splaisingas

Vienas didiausi prajusio amiaus antrosios puss molekulins biologijos atradim yra
alternatyviojo splaisingo (angl. alternative splicing) atradimas. Genuose, turiniuose daugiau
nei vien intron, su intronais pasirinktinai gali bti ikerpami ir egzonai. Fenomenas pirm
kart pastebtas 1977m. tiriant adenoviruso pre-iRNR transkript brendim, o vliau 1981m.
rastas tiriant lsteli pre-iRNR. Didiosios dalies auktesnij eukariot pre-iRNR intron ikirpimas ir egzon sujungimas vyksta ne vienu, bet keliais bdais. vairios to paties geno transkripto
subrendusios formos (iRNR izoformos) gali bti sintetinamos skirtinguose to paties organizmo
audiniuose bei skirtingais vystymosi tarpsniais. Auktesniuosiuose eukariotuose alternatyvusis
splaisingas vyksta >90% gen, kurie turi intron, pre-iRNR. Alternatyvusis splaisingas yra eukariot transkriptom ir proteom vairovs prieastis. Manoma, kad, pvz., mogaus genome
apie 100000 baltym gali bti susintetinama i vairi alternatyviojo splaisingo keliu susintetint iRNR, kurias koduoja ~24000 gen.
6.36pav. Lsteli branduoli sritys, kuriose sutelkti kai kurie splaisingo komponentai. HeLa lsteli branduoli dms, vaizdintos imunofluorescencine analize su antiknais prie splaisingo veiksn
SC35 (a) (Cold Spring Harb Perspect Biol, 2011, 3:a000646); Kajalo kneliai pels lsteli branduoliuose,
vaizdinti imunofluorescencine analize su aliai fluorescuojaniais antiknais prie p80/koilino baltymus
(b) (http://en.wikipedia.org/wiki/Cajal_body)
342
VI. RNR brendimas
mogaus ir pels tyrimai liudija, kad alternatyvusis splaisingas yra susijs su nesenu egzon
gijimu ar praradimu genuose. Silomi keli galimi alternatyviojo splaisingo kilms mechanizmai: egzon maiymo (angl. exon shuffling), intron sek egzonizacijos ir konstitutyvi egzon virtimo alternatyviais mechanizmai.
Alternatyvusis splaisingas gali vykti keliais, eukariotuose nevienodai paplitusiais bdais
(6.37pav.). Egzono alinimo (angl. exon skipping) atveju i pre-iRNR paalinamas egzonas kartu su j ribojaniais intronais. Tokiu bdu vyksta apie 40% splaisingo vyki auktesniuosiuose
eukariotuose.
Alternatyvios 5 ar 3 splaisingo srities pasirinkimo atveju splaisingas vyksta pasirenkant
vien ar kit sklimo viet pre-iRNR 5ar 3gale egzonuose.
Dar vienas alternatyviojo splaisingo bdas yra introno ilaikymas (angl. intron retention),
kai intronas paliekamas subrendusioje iRNR. iuo bdu alternatyvusis splaisingas stuburiniuoe
ir bestuburiuose vyksta retai (~5% splaisingo vyki), taiau jis vyrauja augal, gryb, pirmuoni lstelse.
Gana reti yra kiti alternatyviojo splaisingo bdai: nesuderinam egzon (angl. mutually
exclusive exons), alternatyvi promotori (angl. alternative promoters) ir alternatyvi poli (A)
srii (angl. alternative polyadenylation) naudojimo bdai.
Vienas ypatingesni alternatyvaus splaisingo atvej nustatytas drozofilos DSCAM gene (angl.
Downs syndrome cell adhesion molecule), koduojaniame membranos receptori. DSCAM baltymai reikalingi neuron tarplsteliniams ryiams susidaryti ir imunins sistemos funkcionavimui. Drozofilos
genas turi 115 egzon; i j 95 kerpami alternatyviai. Teorikai gali susidaryti 38016 geno transkripto variant! Alternatyvusis splaisingas vyksta nesuderinam egzon bdu: keturiuose geno egzon
telkiniuose pasirinktinai paliekamas tik vienas egzonas, kiti paalinami i pre-iRNR (6.38pav.). Geno
4-ame, 6-ame, 9-ame ir 17-ame telkiniuose yra atitinkamai 12, 48, 33 ir 2 egzonai. 4, 6 ir 9 telkiniai koduoja baltym imunoglobulin domenus.
6.37pav. Alternatyviojo splaisingo bdai eukariotuose. Plona linija ymi intronus, duts egzonus
(Nature Reviews Genetics, v.11, p.345, 2010)
343
MOLEKULIN BIOLOGIJA
6.38pav. Drosophila melanogaster DSCAM geno pre-iRNR alternatyvusis splaisingas nesuderinam egzon bdu (http://bio3400.nicerweb.com/Locked/media/ch17/alternative_splicing-Dscam.html)
6.5.12. iRNR kokybs kontrol

Didioji dalis eukariot lstels baltym yra sintetinami kaip matricas naudojant iRNR, patyrusias daugel anksiau aptart brendimo vyksm. Brendimo procesai yra dalis vadinamojo
iRNR kokybs kontrols, QC (angl. quality control), proceso, kuris vyksta iki pat transliacijos
pradios ir net transliacijos metu. Transkriptai, kurie nepereina kurio nors brendimo etapo, yra
suardomi nukleazi ar kitu bdu ivengia transliacijos. Subrendusios iRNR perneamos i branduolio citozol. iRNR pernaos procesas taip pat yra vienas i iRNR kokybs kontrols etap,
kurio metu tikrinama, ar iRNR yra perjusi brendimo procesus ir ar gali dalyvauti transliacijoje.
6.6. RNR redagavimas

Iki 9 prajusio amiaus deimtmeio manyta, kad informacija apie eukariot baltymus ukoduota intronins-egzonins struktros eukariot genome. Taiau buvo nustatyta, kad parazitini pirmuoni tripanosom Trypanosoma brucei ir Crithidia fasciculata mitochondrij
citochromo c oksidazs pre-iRNR, kuri koduoja cox2 genas, po transkripcijos terpiami ir paalinami uridino nukleotidai. biologin fenomen mokslininkai pavadino redagavimu (angl.
editing). Vliau paaikjo, kad transkriptuose toki modifikacij gali bti dar vairesni ir jos vyksta vis ri RNR
RNR redagavimas tai per
molekulse vairiuose eukariotuose.
transkripcij arba po transkripiandien inoma, kad redagavimo fenomenas bdincijos vykstantys RNR transkripto
gas vis gyvybs domen organizmams: eukariotams, arnukleotid sekos keitimai, kuchjoms, bakterijoms. Jis nustatytas vairiuose eukariotuoriais keiiamas RNR ukoduotos
se nuo vienalsi iki mogaus. Daniausiai redaguojamos
biologins informacijos turinys.
iRNR molekuls, reiau tRNR ir rRNR molekuls. Redagavimas yra pre-RNR brendimo dalis.
344
VI. RNR brendimas
6.6.1. Redagavimo tipai

Eukariotuose RNR redaguojamos vykstant skirtingoms biocheminms reakcijoms. 6.2lentelje pateikti RNR redagavimo tipai ir kai kuri j charakteristikos.
Redaguojant RNR nukleotid pakeitimo (konversijos) bdu fosfodiesteriniai ryiai nesuardomi, modifikuojami RNR esantys nukleotidai. Redaguojant RNR terpim (insercij) ar
paalinim (delecij) bdu yra sudaromi arba suardomi fosfodiesteriniai ryiai. Tolesniuose
poskyriuose ie tipai aptariami isamiau.
6.6.2. Nukleotido pakeitimas

Redagavimas nukleotid keitimo (konversijos) bdu daniausiai vyksta augal lsteli organeli (mitochondrij) transkriptuose, taip pat branduolio iRNR transkriptuose, taiau pasitai6.2 lentel. Eukariot RNR redagavimo tipai
Redagavimo tipas
Organizmas
Molekul
Mechanizmas
Nukleotid terpimai (insercijos) arba paalinimai (delecijos)

U nukleotidai
Kinetoplastids*
(mitochondrijos)
iRNR
Grandins sklimas /
sujungimas
C nukleotid terpimas
U, UA, AA, CU, GU, GC terpimas
G terpimas
A terpimas
Physarum polycephalum*
(mitochondrijos)
iRNR, tRNR, rRNR

iRNR, tRNR, rRNR
?
?
Paramiksovirusai
Ebola virusas
iRNR
iRNR
?
?
Acanthamoeba castellanii
Grybai
(mitochondrijos)
tRNR
Ikirpimas / prijungimas
Egzonukleaz / nukleotidiltransferaz (?)
Auktesnieji augalai (mitochondrijos, chloroplastai)
iRNR, tRNR, rRNR
Deamininimas
Physarum polycephalum
iRNR
induoliai
iRNR
Deamininimas
induoliai
iRNR
Auktesnieji augalai
iRNR
induoliai
iRNR
Deamininimas
Naujo nukleotido terpimas vietoje paalintojo

CA, AG, UG, UA
Nukleotid pakeitimai (konversijos)

CU
UC
AI
mogaus hepatito delta

virusas
GA
Pel
iRNR
UA
mogus
iRNR
* Kinetoplastids pirmuonys, priklausantys Euglenozoa tipui.

** Grybo Physarum polycephalum RNR molekuli redagavimas yra sudtingiausias i vis organizm, kuriuose is reikinys buvo tyrintas, jam bdingos vairi tip reakcijos.
345
MOLEKULIN BIOLOGIJA
ko ir vienalsi, gryb, augal ir gyvn tRNR molekulse. Yra inomos tokios RNR redagavimo metu vykstanios nukleotid modifikacijos:
zz citidino pakeitimas uridinu (CU);
zz adenozino pakeitimas inozinu (AI);
zz uridino pakeitimas citidinu (UC);
zz guanino pakeitimas adeninu ir uridino pakeitimas adeninu (GA ir UA).
AI ir CU pakeitimai daniausiai yra deamininimo (6.39pav., a, b), o UC amininimo
reakcij pasekm.
Citidino pakeitimas uridinu pirm kart buvo nustatytas stuburini iRNR, kuri koduoja baltym apolipoprotein B, ApoB. mogaus ApoB baltymas yra labai didelis sudarytas i 4536
aminorgi, jo molekulin mas yra 512kDa. Baltym koduojanti DNR sritis sudaro 43kb, joje
yra net 29 egzonai! ApoB baltymas yra vienas pagrindini apolipoprotein mao tankio lipoproteinuose (angl. low density lipoprotein, LDL), kurie prijungia cholesterol. ApoB funkcionuoja
kaip ligandas lsteli receptoriams atpastant LDL taip cholesterolis patenka lsteles. Dl padidjusios ApoB koncentracijos kraujagyslse formuojasi aterosklerozins ploktels. 512kDa
ApoB baltymas sintetinamas kepen lstelse. Jis sekretuojamas kraujo plazm ir ten prijungia
lipidus. arnyno lstelse apoB transkripte dl deamininimo glutamino kodonas CAA pakeiiamas STOP kodonu UAA. Todl arnyne sintetinamas daug maesnis 250kDa ApoB baltymas.
Maesnis baltymas reikalingas riebal rgi prijungimui ir rezorbcijai plonojoje arnoje.
Apolipoprotein B koduojanios iRNR redagavimo mechanizmas yra sudtingas. Kodono
pakeitimui vykti reikia reguliacini nukleotid sek (6.40pav., a), esani aplink deamininam
heterociklin baz, taip pat baltym komplekso editosomos (angl. editosome). Editosomos sudtyje yra citidino deaminaz, APOBEC-1 (angl. apoB mRNA editing enzyme catalytic subunit 1).
is dimerinis baltymas, kartu su pagalbiniais baltymais, atlieka citidino deamininim. Milinika-
6.39pav. Adenozino ir citidino deamininimo reakcijos

(http://quizlet.com/31534458/
chapter-27-slides-flash-cards/)
346
VI. RNR brendimas
me (14kb) apob geno transkripte is citozinas, esantis 6666 pozicijoje 27-ame egzone, yra labai
tiksliai redaguojamas. Mutagenezs metodu nustatyta, kad redagavimui reikia trans veikiani
sek, kurios yra isidsiusios netoli redaguojamo nukleotido. Viena j tai 11 nukleotid ilgio
tvirtinamoji seka (angl. mooring sequence), kuri nuo redaguojamo nukleotido skiria madaug 4
nukleotid seka (angl. spacer). Dar dvi redagavimui svarbios iRNR molekuls sritys yra vadinamieji 3 ir 5 efektyvumo elementai. Tvirtinamoji seka ir 3efektyvumo elementas sudaro dvigrandin stieb (6.39pav., b). Jame redaguojamas iRNR citozinas isidsto taip, kad patenka APOBEC-1
aktyvj centr. APOBEC-1 idstymui btinas komplementacijos veiksnys ACF.
Kitas inomas nukleotid pakeitimo bdas redaguojant RNR yra adenozino pakeitimas inozinu (6.39pav., b). Jis vyksta lsteli iRNR, tRNR molekulse, taip pat virus transkriptuose (pvz.,
paramiksovirusuose). Inozinas sudaro por su citidinu, kuri yra panai G-C por, todl I gali
bti atpastamas kaip G. Taigi adenozino pakeitimas inozinu galt pakeisti kodon ir daryti
tak transliacijai arba splaisingui. Vis dlto daniausiai keitimas vyksta netransliuojamose preiRNR dalyse 5ir 3galuose, introniniuose Alu (90% keitim) arba LINE (10% keitim) tipo
retrotranspozon elementuose.
Pirm kart pre-iRNR adenozino pakeitimas inozinu buvo nustatytas induoli smegen
lsteli transkripte, kuris koduoja neuron AMPA receptoriaus subvienet GluR B. Neuron
AMPA (angl. alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate) receptori i viso sudaro 4 subvienetai (GluR AD). Receptorius reguliuoja neuron laidum Ca2+ ir kitiems jonams.
Visuose GluR B pre-iRNR transkriptuose A yra keiiamas I. Dl tokio redagavimo glutamino Q
kodonas (CAG) pakeiiamas arginino R kodonu (CIG). Redaguojama sritis yra baltymo 2-ame
membran perverianiame domene. Pelse, kurios turi i modifikacij vykdanio fermento
adenozino deaminazs ADAR2 geno mutacij, gluRB transkripto redagavimas nevyksta. Pasekms yra letalios: lsteli laidumas Ca2+ padidja, gyvnams yra bdinga epilepsija, jie neigyvena keli savaii.
6.40pav. Nukleotid pakeitimas (konversija) redaguojant pre-iRNR. Citidino deaminimas uridin

APOB pre-iRNR, dalyvaujant editosomai (a); adenozino pakeitimas inozinu pre-iRNR, dalyvaujant adenozino deaminazei ADAR (b) (Nature Reviews Genetics, v.2, p.869, 2001)
347
MOLEKULIN BIOLOGIJA
induoliuose adenozino keitim inozinu vykdo dviej baltym eim adenozino deaminazs ADAR (angl. adenosine deaminases that act on RNA ) ir ADAT (angl. adenosine deaminases that act on tRNA), kurios pasirenkamos priklausomai nuo to, kurios ries RNR molekuls
redaguojamos. Reakcijai vykti svarbios ne sritys, isidsiusios apie deamininam adenozin,
bet antrin pre-RNR struktra dupleksas (6.40 pav., b). Dupleksas susidaro tarp redaguojamos
srities ir jai komplementarios srities, kuri yra isidsiusi u jos esaniame introne. ADAR adenozino deaminazs atpasta tok RNR dupleks. Ikelta hipotez, kad deamininama adenozino
heterociklin baz i duplekso yra isukama (angl. flipping) ior.
iandien inoma, kad adenozino deamininimas yra danas brendimo vykis eukariot transkriptomoje. Deamininimo vykiai itin dani auktesnij eukariot smegen lsteli
transkriptuose. Pvz., ityrus mogaus, impanzs ir Rezus makakos smegenli audinio lstelse sintetinam iRNR deamininim, paaikjo, kad mogaus pre-iRNR redaguojamos kelet
kart daniau nei bedioni.
Uridino pakeitimas citidinu redaguojant RNR yra reiau aptinkamas, taiau kai kuri emesnij augal chloroplast ir mitochondrij transkriptuose jis yra danas.
6.6.3. Nukleotid sek terpimas arba paalinimas

RNR redagavimas terpiant arba paalinant nukleotid sekas vyksta pirmuoni, gryb, kirmli mitochondrij RNR, taip pat minus RNR grandin turini virus transkriptuose (pvz.,
paramiksovirusuose). Tokio tipo pre-iRNR modifikacijos pirm kart buvo aptiktos parazitiniuose pirmuonyse. Tripanosomos vienintels mitochondrijos DNR (kinetoplasto DNR) sudaryta
i daugelio tkstani DNR ied, sujungt katenanus. Toki DNR sudaro maksi iedai (15
25kb) ir mini iedai (0,92,5kb). Mini ied yra 1000020000, o maksi ied 2050.
Maksi iedas koduoja 2 rRNR genus ir 17 baltym. Tyrinjant maksi ied DNR buvo pastebta, kad joje trksta kai kuri labai svarbi mitochondrij baltym. Baltymus koduojaniuose genuose trko START kodon, rasta skaitymo rmelio poslinkio mutacij. Nustaius mitochodrijos DNR gen transkript sekas, buvo rasti skaitymo rmeliai, koduojantys trkstamus
baltymus. Paaikjo, kad iRNR buvo terpta daug papildom nukleotid, kuri nebuvo DNR.
Fenomenas pirm kart nustatytas 1987m. tiriant tripanosomos citochromo c oksidazs IIsub
vienet koduojani iRNR joje buvo terpti 34 uridino nukleotidai, nekoduojami DNR. Kituose
mitochondrij gen transkriptuose terpti U nukloeotidai sudar net pus visos nukleotid
sekos. Tokie genai, kuri DNR sekoje nemanoma nustatyti koduojamo baltymo, dar vadinami
kriptogenais (angl. cryptogenes). iandien inoma, kad 12 i 17-os maksi ieduose koduojam
baltym pre-iRNR yra redaguojamos. Daniausiai yra terpiami U nukleotidai, reiau vyksta U
paalinimas.
Netrukus buvo nustatytas mechanizmas, kuriuo vyksta redagavimas terpiant arba paalinant U nukleotidus. Jame dalyvauja 5080nt ilgio RNR molekuls RNR gidai, gRNR (angl.
guide RNAs, gRNAs), koduojamos mitochondrij mini ieduose. Kiekvienas iedas koduoja 25
gRNR.
RNR gid (gRNR) 5gale yra 515nt ilgio inkaro seka (angl. anchor), komplementari redaguojamos pre-iRNR 3galui (6.41pav., ab). gRNR 3gale turi poli (U) sek. Susidarius pre-iRNR-
348
VI. RNR brendimas
gRNR dupleksui, lieka nesuporuot RNR srii, kurios atpastamos kaip redagavimo vietos.
Viena gRNR gali nustatyti 110 redagavimo viet.
Redagavimas vyksta dalyvaujant ~ 20S dydio baltym kompleksui editosomai, kurioje,
manoma, galt bti iki 20 baltym (6.41pav., ab). Editosom prie redaguojam viet nukreipia gRNR molekuls.
Pirmasis redagavimo vykis yra taikinio pre-iRNR sklimas ties pirmuoju nesuporuotu
nukleotidu prie pre-iRNR-gRNR dupleks. RNR skelia endonukleaz. Tada terpiami arba alinami U nukleotidai.
U terpia galin uridililtransferaz, TUTaz (angl. terminal uridilyltransferase) (6.41pav., a).
Sintez vyksta nuo skeltos pre-iRNR 3galo. Matrica sintezei yra gRNR. Prijungus nukleotidus,
ply sujungia redagavimo RNR ligaz.
U nukleotidus alina U atranki 35egzoribonukleaz, ExoUaz (angl. U-specific
35exoribonuclease), tada ply sujungia taip pat redagavimo RNR ligaz (6.41pav., b).
Vienas didiausi redagavimo privalum yra galimyb vairiu laipsniu keisti konkrei RNR
molekul. Individualaus geno transkripto molekuli redagavimo laipsnis lstelje gali svyruo-
6.41pav. U nukleotid terpimas (a) ir alinimas (b) pre-iRNR, dalyvaujant editosomai. REN endonukleaz, REX egzonukleaz, REL redagavimo RNR ligaz, RET galin uridililtransferaz (TUTaz),
MP mitochondrij baltymai. Viruje editosomos struktrins shemos (Research in Microbiology,
v.162, 2011)
349
MOLEKULIN BIOLOGIJA
ti nuo keli iki 100%. Pvz., skirting smegen srii lstelse serotonino receptoriaus 5-HT2C
transkripto molekuli redagavimo laipsnis skiriasi. vykus RNR nukleotid sek pakeitimams
sukuriami nauji transliacijos pradios, pabaigos kodonai, nauji atvirieji skaitymo rmeliai (r.
skyri Baltym biosintez). Tokiu bdu modifikuojama iRNR koduojamo baltymo aminorgi seka ir keiiasi sintetinamo baltymo savybs. Pvz., nustaius Arabidopsis thaliana genomo
sek, paaikjo, kad organeli (mitochodrij, chloroplast) iRNR molekulse apie 456 citidin
pakeiiami uridinus. 441 pakeitimas vyksta atviruosiuose skaitymo rmeliuose, kiti intronuose bei savitose tRNR sekose. Pakeitimai iRNR koduojamuose atviruosiuose skaitymo rmeliuose lemia Arabidopsis thaliana mitochondrij baltym hidrofobikum.
350
VI. RNR brendimas
ANALITINIAI KLAUSIMAI IR UDAVINIAI:

1. Js gavote uduot apibdinti in vitro susintetinto RNR transkripto, kuriame yra intronas,
brendim. Kaip Js nustatysite:
a) ar is intronas isikerpa savaime?
b) jeigu intronas isikerpa savaime, kuriai I ar II savaime isikerpani intron grupei jis priklauso?
2. Js nustatte, kad tas pats genas koduoja ilgesn baltym embriono lstelse, trumpesn suaugusio mogaus lstelse. Kaip eksperimentikai patikrinsite, ar geno sutrumpjimas yra alternatyviojo splaisingo ar redagavimo rezultatas?
3. Atrasta nauja grup intron, kuri splaisinge dalyvauja alternatyvioji splaisosoma. Splaisosomos sudtyje yra U110, U120 ir U140 snRNP. Atliktas eksperimentas, kuriuo siekta
nustatyti splaisosomos susimontavimo ties substratu eig. Pre-iRNR buvo imobilizuota
ant agarozs daleli ir inkubuota su igrynintomis splaisosomos dalelmis. Tam tikrais
laiko momentais imti mginiai ir atlikta Northern analiz su radioaktyviais zondais, savitais pre-iRNR ir splaisosomos U RNR molekulms. Tyrim duomenys pateikti paveiksle.
Atsakykite:
a) kokia tvarka montuojasi splaisosoma?
b) ar vyksta pre-iRNR splaisingas?
4. Nustaius organizmo Nanoarcheum equitans genom paaikjo, kad jame trksta kai
kurias tRNR koduojani gen, nors ias tRNR archja turi. Paaikinkite fenomen.
5. Kaip Js sitikinsite, kad eukariot iRNR turi kepurs struktr molekuls 5gale?
351
MOLEKULIN BIOLOGIJA
6. In vitro buvo susintetinta C.elegans geno X pre-iRNR su kepure ir be kepurs. Abi molekuls turjo traukt radioaktyvi ym (P32 izotop). Buvo tirtas i molekuli brendimas in vitro naudojant lsteli branduoli ekstrakt. Po inkubavimo RNR molekuls
iskirstytos elektroforeze poliakrilamido gelyje pagal j dyd. Apie j santykin kiek
sprsta pagal radioaktyvios yms kiek. Lentelje toliau pateikti tyrimo rezultatai (+
atitinka radioaktyvios yms kiek). Pasilykite hipotez, remdamiesi iais rezultatais.
Pre-iRNR
iRNR, kurioje
vyks splaisingas
iRNR su poli (A)
Pre-RNR be kepurs
+++
Pre-iRNR su kepure
+++
+++
7. Js klonavote eukariotinio organizmo gen, taiau isami DNR sekos analiz atskleid,
kad gene trksta egzono, kur turi homologiki genai kituose organizmuose. Pasilykite
hipotez, kuri paaikint tok fakt.
8. Eukariotins DNR fragmentas, koduojantis gen X, hibridizuotas su jo iRNR. Hibridizacijos rezultatai, pateikti paveiksle, vaizdinti elektronine mikroskopija. Atsakykite:
a) kuri linija, storoji ar plonoji, atitinka iRNR?
b) kaip atrodyt eksperimento rezultatai, jeigu su DNR bt hibridizuota
pre-iRNR?
9. Js tyrinjate talazemij lig, kuria sergant negaminamas baltymas globinas. Js

nustatte, kad moni, sergani ia liga, globino gen koduojanti DNR yra tokio
pat ilgio kaip ir sveik moni, taiau iRNR yra keliais imtais nukleotid ilgesn. Atlik
globino geno DNR sekoskait nustatte, kad sergani moni gene yra vieno nukleotido pakeitimas pirmajame introne. Remdamiesi gautais rezultatais, paaikinkite, kodl
sergani moni lstelse negaminamas globino baltymas?
10. Js tyrinjate intron turinios pre-iRNR splaising. Kokius eksperimentus atliksite, nordami sitikinti, ar intronas ikerpamas kaip linijin molekul ar kaip laso pavidalo udara molekul?
352
VII. BALTYM BIOSINTEZ (TRANSLIACIJA)

Dauguma organizmo gen koduoja baltymus. Lstelje transkripcijos metu susintetintos ir subrendusios
Nuo iRNR priklausomas baliRNR molekuls veikia kaip matricos baltym biosintetymo sintezs procesas yra
zje transliacijoje. iRNR nukleotid sekoje talpinama
transliacija.
informacija apie baltymo aminorgi sek. Transliacija
yra paskutinis biologins informacijos perdavimo i DNR
etapas.
Informacija i DNR RNR molekul perduodama sintetinant RNR molekul nukleotid
komplementarumo principu (kaip matric naudojant vien DNR grandin), o genetins informacijos perdavimo i iRNR baltym, t.y. transliacijos, procesas yra sudtingesnis ir vyksta
kitaip.
Keturi skirting iRNR nukleotid sekos perraymas dvideimt skirting aminorgi
sek transliacijos metu vyksta pagal tam tikras taisykles genetin kod. Kod 19611966m.
nustat Maralas Nirenbergas (Marchal Nirenberg) ir Henrikas Matjus (H. Matthaei).
7.1. Genetinis kodas ir jo savybs

Informacija, esanti iRNR nukleotid sekoje, ribosomoje
skaitoma nuosekliai po tris nukleotidus nuo pradios iki
galo.
Trij nukleotid seka iRNR molekulje (pvz., AUA,
AUG ir t.t.) lemia tam tikros aminorgties jungim sintetinam baltym. Toks nukleotid trejetas yra vadinamas
kodonu. Taiau nukleotid trejet kodon kombinacij yra daugiau (4x4x4=64) nei baltymuose yra skirting
aminorgi (20) (7.1pav., a).
Aikinantis genetin kod buvo nustatyta, kad kai kurias aminorgtis koduoja kelios nukleotid trejet kombinacijos (pvz., eios kombinacijos koduoja aminorgt
arginin), o tam tikros kombinacijos i viso nekoduoja aminorgi. Pastarieji, terminacijos, arba STOP, kodonai
(angl. nonsense codons) veikia kaip transliacijos terminacijos signalai (7.1 pav., a). Pavelgus genetin kod matyti,
kad daugeliu atvej pakanka dviej nukleotid atrinkti
tam tikr aminorgt.
(DNR) nukleotid seka yra

kopijuojama iRNR, kuri funkcionuoja kaip tarpininkas transliuojant nukleotid sek baltymo aminorgi sek pagal
genetinio kodo taisykles.
Kodonas yra nuoseklus nukleotid trejetas iRNR molekulje, kuris lemia tam tikr
aminorgt arba yra transliacijos baigties (terminacijos)
signalas.
353
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Supratimas, kad nukleotid trejetai koduoja informacij apie aminorgtis, buvo vienas didiausi
molekulins biologijos atradim prajusio amiaus 7 deimtmeio pusje. Dviej tip eksperimentai
padjo 19611966m. iaikinti E.coli genetin kod. Pirmojo tipo eksperiment panaudodami nelstelin baltym sintezs sistem (angl. cell free system) atliko M.Nirenbergas ir H.Matjus. Jie naudojo E.coli lsteli ekstraktus, kuriuose buvo visi komponentai, reikalingi baltym biosintezei (ribosomos, ATP, radioaktyvi ym turinios aminorgtys), iskyrus RNR. Baltym biosintez sistemoje vyko,
ekstraktus pripylus cheminiu bdu susintetintos RNR, kurios nukleotid seka buvo inoma, todl
nustaius susintetinto peptido aminorgi sek, buvo galima nustatyti, kuri aminorgt kuris nukleotid trejetas koduoja.
Pirmiausiai kaip matrica sintezei buvo naudotas homopolimeras uridilo rgtis, poli (U) (5UUU
UUU3). Buvo sintetinamas polipeptidas polifenilalaninas, nes RNR 5UUU3 nukleotid trejetas koduoja aminorgt fenilalanin. Panaudojus adenilo rgt, poli (A) (5AAA...AAA3), ribosomose buvo
sintetinamas polilizinas (5AAA3 nukleotid trejetas koduoja aminorgt lizin). Tuo metu, kai buvo
atliekami eksperimentai, dar nebuvo itobulj RNR sekoskaitos metodai, todl nebuvo galima tiksliai
nustatyti susintetint RNR heteropolimer, sudaryt i vairi nukleotid, sekos, taiau ir tokie RNR
heteropolimerai buvo naudojami eksperimentams. Nustaius individuali nukleotid, naudojam
RNR sintezei, stechiometrin kiek, buvo statistikai apskaiiuojamas galim kodon pasiskirstymas.
Naudojant cheminiu bdu susintetintus RNR homo- ir heteropolimerus, buvo iaikinta, kurias aminorgtis koduoja madaug pus vis nukleotid trejet. Lik kodonai buvo iaikinti, kai buvo imokta
kryptingai sintetinti RNR.
Deja, viso genetinio kodo pirmojo tipo eksperimentais iaikinti nepavyko nebuvo manoma pasiekti, kad atsitiktinai ar kryptingos sintezs bdu susintetintos RNR turt visas manomas kodon
kombinacijas. M.Nirenbergas ir Filipas Lederis (Philip Leder) panaudojo kit nukleotid trejet jungimo eksperiment (angl. triplet binding assay). Jie nustat, kad ribosomos prijungia RNR nukleotid
trejet tik tada, kai dalyvauja atitinkama tRNR molekul su prijungta aminorgtimi. Taigi, genetin
kod iki galo iaikinti buvo galima tik susintetinus vis manom kombinacij trejetus ir kiekvien j
ityrus su skirtingomis aminoacil-tRNR.
iuo metodu nebuvo manoma nustatyti, kurie nukleotid trejetai koduoja terminacijos (STOP)
kodonus. SidnisBreneris (SydneyBrenner) su kolegomis juos iaikino, nustat T4bakteriofago supresorines mutacijas mutacijas, kurios lm terminacijos kodon kaip aminorgt koduojani trejet
atpainim.
Transkripto iRNR nukleotid seka ribosomoje gali bti skaitoma trejopai, t.y. atvirasis skaitymo rmelis (angl. reading frame), arba kodon sek, gali bti trys skirtingi variantai priklausomai nuo to, kuris nukleotidas bus pasirinktas skaityti pirmuoju. Pirmasis nukleotidas skaitymo rmelyje nulemia ir tolesnius skaitomus nukleotid trejetus, kurie transliuojami aminorgtis (7.2pav.).
Nukleotid trejetai, koduojantys skaitymo rmel, nepersikloja, t.y. vienas nukleotid trejetas koduoja vien aminorgt, toliau u jo einantis kit, ir t.t. (7.2pav.). Taigi genetinis
kodas yra nesanklotinis. Taiau genome yra sanklotini
gen, t.y. toki gen, kuri nukleotid sekoje yra koduoAtvirasis skaitymo rmelis yra
jamas kitas genas. Tokiu atveju abiej gen koduojami
nepersiklojani nukleotid
atvirieji skaitymo rmeliai turi savo atskirus pradios ir
trejet seka, koduojanti politerminacijos kodonus. Sanklotini gen yra bakteriofag,
peptid (be terpt terminacijos
mitochodrij genomuose.
kodon).
Bdinga, kad tik vienas skaitymo rmelis konkreioje
nukleotid sekoje koduoja baltym. Transliacijos iniciaci-
354
jos metu prokariotuose ir eukariotuose skaitymo rmelyje

Skaitymo rmelis prasideda
tam tikru bdu yra nustatomas pirmasis iniciacijos koiniciacijos kodonu ir baigiasi
donas. is kodonas daniausiai yra ATG (AUG) nukleotid
terminacijos kodonu.
trejetas ir koduoja aminorgt metionin. Reiau aptinkamas GUG iniciacijos kodonas.
Skaitymo rmelis, kuriame siterp terminacijos kodon, yra blokuotasis. Jeigu nukleotid sekoje visi trys galimi skaitymo rmeliai yra blokuotieji, tokia nukleotid seka nekoduoja
baltymo.
Genetinis kodas yra universalus, t.y. visuose organizmuose tie patys iRNR kodonai koduoja tas paias aminorgtis ir transliacijos baigties signalus. Dl tokio universalumo bakterijos gali sintetinti terpto, pvz., mogaus insulino, geno koduojam baltym. Kodo universalumas liudija apie jo ankstyv evoliucin kilm. F. Krikas pavadino genetin kod usialdymu
(angl. frozen accident) ir ikl mint, kad jis kilo i bendro protvio.
Taiau gamtoje aptikta nukrypim nuo universalaus genetinio kodo (7.1pav., b). Lsteli
organeli DNR genuose, pvz., mitochodrijose, rasta 16 nukrypim nuo genetinio kodo, da-
7.1pav. Universalus genetinis kodas (a) ir nukrypimai nuo jo mitochondrij genome (b)
355
MOLEKULIN BIOLOGIJA
niausiai STOP kodonuose. Jie vieninteliai nekoduoja aminorgi, todl ir yra tinkami perkodavimui. UGA vienintelis daugiareikmis kodonas vis gyvybs domen organizmuose.
Kai kurie baigties kodonai perprogramuoti taip, kad koduot netipikas aminorgtis. Alternatyvi genetini kod, turini nedideli nukrypim nuo universalaus genetinio kodo, jau nustatyta daugiau nei deimt (pvz., pirmuonyse Tetrahymena, Euplotes, bakterijoje Mycoplasma,
grybe Candida ir kt.).
Mitochondrijos turi individualias savo palyginti nedidelio genomo transkripcijos ir baltym biosintezs sistemas, kurios nepriklauso nuo visos lstels transkripcijos ir transliacijos sistem. Taigi,
atsiradusius nukrypimus nuo universalaus genetinio kodo galima paaikinti mitochondrij autonomikumu. Mitochondrijos turi maiau skirting tRNR nei lstel 22. Mitochondrij 4 i 64 kodon turi
kitoki prasm negu universalaus kodo kodonai (7.1pav., b). Nukrypimas nuo universalaus genetinio
kodo aptiktas ir mogui patogeniniame grybe Candida albicans. iame organizme CUG kodonas transliuojamas serin, nors kituose organizmuose koduoja leucin.
Nuokrypis nuo universalaus genetinio kodo yra ir vadinamasis perkodavimo (angl. recoding) fenomenas. Perkodavimas daniausiai vyksta transliacijos elongacijos ir terminacijos
etapuose. Vykstant transliacijos elongacijai, perkodavimas pasireikia programuotu skaitymo
rmelio perstmimu (+1 / 1) arba kodono perokimu (angl. ribosome hopping) transliuojant iRNR. Vykstant transliacijos terminacijai perkodavimas pasireikia ties iRNR STOP kodonais
jungiant kuri nors aminorgt ir taip toliau tsiant baltymo sintez. Reikia pastebti, kad
perkodavimo procesas baltym biosintezs metu konkuruoja su transliacija, kuri vyksta pagal
universalaus genetinio kodo taisykles ir tik dalies iRNR transliacija vyksta perkoduojant. Perkodavimas nustatytas bakterijose, archjose, eukariotuose ir virusuose.
doms yra transliacijos baigties metu vykstantys perkodavimo atvejai. Aptarsime juos isamiau. Standartinis genetinis kodas transliuojamas baltymus panaudojant 20 aminorgi.
Taiau bakterijos, archjos ir eukariotai turi 21-j aminorgt, kuri gali bti jungiama polipeptidin grandin vykstant perkodavimui. i aminorgtis yra selenocisteinas, Sec (U). Ji yra
svarbi vairi ferment aktyvumui.
7.2pav. Trys galimi skaitymo rmeliai iRNR
356
Seleno baltym rasta vis gyvybs domen organizmuose, taiau kai kurie j neturi, pvz., grybai ir auktesnieji augalai. Rasta daugiau nei 100 gen, koduojani baltymus su Sec. Selenocisteinas
daniausias oksidacijos-redukcijos fermentuose, pvz., oksidoreduktazse. Fermentai svarbs reakting deguonies form ROS (angl. reactive oxygen species) iaktyvinimui. Selenocisteinas reikalingas oksidoreduktazi katalizinms funkcijoms. Manoma, kad selenolin (SeH) grup selenocisteine (kurios
pK=5,2) yra reaktingesn nei tiolin SH grup cisteine (kurios pK=8,3).
Selenocisteino sintez prasideda prie selenocisteinui savitos tRNR prijungiant serino aminorgt. J prijungia serinui savita aminoacil-tRNR sintetaz (apie aminorgi prijungim
prie tRNR r. 7.2. poskyryje). Tada, dalyvaujant fermentui selenocisteino sintazei, serinas veriamas selenocisteinu. Selenocisteinui savitos tRNR antikodonas yra ACU komplementarus
vienam i STOP kodon UGA (7.1pav., a). Tam, kad vykstant UGA kodono transliacijai kodon
atpaint ne savitas terminacijos veiksnys, o selenocisteino tRNR, t.y. tam, kad vykt perkodavimas ir bt jungtas selenocisteinas, dar reikia savitojo transliacijos elongacijos veiksnio
ir antrins iRNR struktros netoli UGA kodono (angl. selenocysteine insertion sequence, SECIS).
Pvz., bakterijose elongacijos veiksnys SelB prisijungia prie SECIS srities iRNR i karto u UGA
nukleotid trejeto ir prie tRNRSel (7.3pav.). Eukariotuose tokiame perkodavime dar dalyvauja
baltymas SBP2, o SECIS sritis yra isidsiusi netransliuojamoje 3iRNR dalyje.
Kitas transliacijos terminacijos metu vykstanio perkodavimo atvejis nustatytas bakterijose
ir archjose. Pvz., Methanosarcina genties archjos priklauso vadinamj metanogenini organizm grupei ir klesti esant metanogenini substrat mono-, di-, trimetilamin. Substratams
skaidyti reikia metiltransferazi. Nustatyta, kad vis iki iol inom metanogeno metilaminometiltransferazi gen koduojamame skaitymo rmelyje esantys UAG (amber) kodonai lemia
ne transliacijos terminacij, o aminorgties L-pirolizino, Pyl (7.4pav., a), jungim baltym.
Tai buvo iaikinta tik nustaius monoaminometiltransferazs erdvin struktr ir aptikus L-pirolizin fermento aktyviajame centre (7.4pav., b).
L-pirolizino jungimo efektyvumas ties iuo kodonu transliuojant metiltransferazi iRNR
siekia 97%. Methanosarcina barkeri nustatyta pirolizinui savita netipikos erdvins struktros
7.3pav. Perkodavimas vykstant transliacijai. S serinas, CS selenocisteinas (Pagal B. Alberts, D. Bray,

K. Hopkin et. al. Essential Cell Biology, fourth edition, 2014)
357
MOLEKULIN BIOLOGIJA
7.4pav. L-pirolizino struktra (a)

ir isidstymas (L-pirolizinas
O202) (b) archjos Methanocarcina
barkeri monoaminometiltransfrazs aktyviajame centre (http://
microbiology.osu.edu/faculty/
krzycki-joseph)
tRNRPyl (jos antikodonas yra 3AUC5, ji yra supresorin tRNR) ir genas, koduojantis savit aminoacil-tRNR sintetaz. Taigi pirolizinas galt bti laikomas 22-ja aminorgtimi, jungiama
baltym sudt transliacijos metu.
Pirolizino jungimas archj baltymus yra genetinio kodo pltimo ortogonaliuoju bdu
pavyzdys. E.coli terpus Methanosarcina barkeri tRNRPyl ir jai savitj aminoacil-tRNR sintetaz,
ie komponentai veik kaip ortogonalioji pora: E.coli tRNR-aminoacil sintetazs neacilino ios
poros tRNR, o poros tRNR aminoacil-sintetaz neacilino kit tRNR, tik savo poros.
7.2. Pernaos RNR molekuls (tRNR) baltym

biosintezs tarpininkai
Kodonai, esantys iRNR molekulje, tiesiogiai neatpasta aminorgi, kurias jie koduoja. Transliacijos procesui reikia, kaip minta, tRNR molekuli. tRNR molekuls yra adaptoriai,
kuri vienas struktrinis elementas antikodonas sveikauja su iRNR kodonu (7.5 pav.), o
kitas elementas akceptorinis stiebas turi kovalentiniu ryiu prijungt aminorgt. IIskyriuje
aptarme tRNR molekuli struktrines ypatybes. Molekuls atranki sveik su iRNR kodonu
lemia ne aminorgtis, prijungta prie tRNR molekuls, bet tRNR antikodonas.
Genetin kod sudaro 64 kodon kombinacijos. Individuali aminorgt gali koduoti kelios skirtingos nukleotid kombinacijos. Tik triptofan ir metionin koduoja atitinkamai AUG
ir UGG trejetai; kitas aminorgtis koduoja du, trys ir daugiau skirting nukleotid trejet. Keli
kodonai, koduojantys t pai aminorgt, vadinami sinonimais.
Taigi turt egzistuoti ir panaus skaiius individuali tRNR, kuri antikodonai komplementars iRNR kodonams. Ilgainiui paaikjo, kad individualios tRNR atpasta daugiau nei vien kodon.
Tam tikros aminorgtys prijungiamos tik prie vienos ries tRNR molekuli (turini vienod antikodon). Taiau lstelje kai kurios tos paios aminorgtys prijungiamos prie daugiau
nei vienos tRNR, kuri antikodonai yra skirtingi. Tokios iRNR vadinamos izoakceptorinmis
tRNR ir j yra maiausiai 32.
358
Kai kuri tRNR antikodonai sudaro tikslias Votsono-Kriko nukleotid poras tik su pirmaisiais
dviem iRNR kodono nukleotidais. Treiasis nukleotidas tiksliai kodono ir antikodono sveikai
nra toks svarbus, todl ioje pozicijoje sveika gali susidaryti ir tarp nekomplementari nukleotid (7.5pav.). is feNevienareikm sveika tai
nomenas vadinamas nevienareikme sveika (angl. wobtRNR molekuls antikodono
ble svyruoti). Nevienareikms sveikos hipotez dar
treiojo nukleotido (5gale)
1966m. ikl F. Krikas.
heterociklins bazs gebjimas
Dl nevienareikms sveikos ta pati tRNR molekul
sudaryti vandenilinius ryius
gali sveikauti savo antikodonu su komplementariu iRNR
su iRNR kodono ne visikai
kodonu ir su keliais iRNR nukleotid trejetais, besiskiriankomplementaraus nukleotido
iais paskutiniu trejeto nukleotidu (3gale). Tarp kodono ir
heterocikline baze (3gale).
antikodono nukleotid treiojoje pozicijoje susidaro vandeniliniai ryiai, taiau ne Votsono-Kriko tipo sveika.
Egzistuoja tam tikr struktrini apribojim nevienareikmei sveikai (7.5 pav., a), kuri
toleruoja ribosoma. Pvz., atstumas tarp sveikaujani nukleotid ribozi turi bti panaus
atstum tarp ribozi standartinse Votsono-Kriko porose. Todl purino ir purino (iskyrus I ir A
por) bei pirimidino ir pirimidino sveikos nra toleruojamos.
7.5pav. Nevienareikm sveika tarp iRNR kodon ir tRNR antikodon. Nevienareikms sveikos
bendroji schema. I inozinas (a); nevienareikms sveikos pavyzdiai tarp fenilalanil-tRNR bei leuciltRNR ir skirting kodon (b) (B. Alberts, A., Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter. The Molecular
Biology of the Cell, fifth edition, 2007)
359
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Ne visikai komplementaria kodono ir antikodono sveika galima paaikinti, kodl t pai aminorgt koduojantys nukleotid trejetai skiriasi tik vienu nukleotidu. Bakterijose 20
aminorgi koduoja 61 kodonas. Jeigu bt grietai paisoma nevienareikms sveikos,
lstelje utekt 31 skirtingus antikodonus turinios tRNR, prie kuri gali bti prijungiamos
aminorgtys. I ties skirting tRNR lstelje yra daugiau. Tikslus individuali tRNR molekuli
skaiius organizmuose skiriasi. Pvz., mogaus lstelje yra 497 tRNR genai, kurie koduojatik 48
individualias tRNR, besiskirianias savo antikodonais. Bakterija Mycoplasma genitalium turi tik
36 genus, koduojanius tRNR, kurios atpasta 33 skirtingus kodonus.
7.2.1. Aminorgi aktyvinimas. Aminoacil-tRNR sintetazs

Aminorgtis prie tRNR molekuli 3galo kovalentiniu ryiu jungia fermentai. Jie atrankiai
atpasta ir prijungia tas aminorgtis, kurias koduoja su tRNR molekuls antikodonu sveikaujantis iRNR kodonas. ie fermentai yra aminoacil-tRNR sintetazs. tRNR, prie kuri yra prijungtos aminorgtys, vadinamos aminoacilintomis tRNR aminoacil-tRNR. Aminorgties
prijungimas yra pirmasis biologins informacijos ikodavimo etapas.
Daugumoje lsteli skirtingas aminorgtis prie tRNR prijungia skirtingos aminoacil-tRNR
sintetazs. Pvz., glicin prie vis tRNR, kuri antikodonas sveikauja su glicin koduojaniais
kodonais iRNR molekulje, prijungia glicinui savita aminoacil-tRNR sintetaz ir t.t. E.coli bakterija turi 21 skirting aminoacil-tRNR sintetaz. Kiekvien skirting aminorgt prie tRNR prijungia skirtinga aminoacil-tRNR sintetaz, iskyrus lizin, kur prijungia dvi skirtingos aminoaciltRNR sintetazs.
Taiau daugelis bakterij turi maiau nei 20 skirtingo atrankumo aminoacil-tRNR sintetazi.
Todl viena sintetaz neretai prijungia aminorgt prie jai savitos tRNR molekuls ir taip pat
prie kitos tRNR molekuls. Pastaroji aminorgtis vliau modifikuojama taip, kad atitikt antikodon tRNR, prie kurios yra prijungta.
Manoma, kad aminoacil-tRNR sintetazi sveikos su
Aminoacil-tRNR sintetazs pritRNR atrankum lemia tRNR molekuls struktros ypatyjungia aminorgt prie tRNR
bs. ia svarbus vaidmuo tenka 73 tRNR nukleotidui. Pvz.,
akceptorinio stiebo 3galo
tRNR, turinios ioje pozicijoje A nukleotid, prijungia hi(5CCA3).
drofobines aminorgtis, o molekuls, turinios G, prijungia polines aminorgtis. Mutagenezs bdu pakeitus nukleotid, keiiasi ir tRNR atrankumas.
vairi tRNR molekuli erdvins struktros nepaprastai panaios, taiau iek tiek skiriasi
molekuls viet, su kuriomis sveikauja aminoacil-tRNR sintetazs (pvz., antikodonins kilpos,
Dkilpos ir akceptorinio stiebo bei 3galo), erdvinis isidstymas.
Aminorgi jungimui prie tRNR naudojama energija, kuri gaunama hidrolizuojant ATP
(7.6pav.). Aminoacil-tRNR sintetazs turi aminorgties, tRNR ir ATP prijungimo sritis. Pirmajame aminorgties jungimo etape aminorgtis aktyvinama prijungiant prie jos AMP. Susidaro
aminoaciladenilatas (aminoacil-AMP). Toliau prie fermento prisijungia tRNR molekul, ir aminorgtis perkeliama nuo AMP prie tRNR 3galo (7.6pav.).
360
Tarp aminorgties karboksigrups ir tRNR ribozs 3OH grups susidaro daug energijos
turintis esterinis ryys, todl ir sakoma, kad aminorgtis yra aktyvinama. io ryio hidrolizs
energija vliau naudojama ribosomoje jungiant aminorgt prie sintetinamos polipeptidins
grandins.
Aminoacil-tRNR sintetazs pagal aminorgi sek ir struktros panaum skirstomos
dvi klases I ir II. Abiej klasi fermentams bdingi trys struktriniai ir funkciniai skirtumai:
zz Iklass sintetazi aktyvj (ATP prijungimo) centr sudaro penkios lygiagreios struktros, o IIklass eios;
zz antikodono prijungimo srit Iklass fermentuose sudaro tik struktros, o IIklass sintetazse struktros ir spirals;
zz I klass fermentai pasiekia tRNR akceptorin stieb i maojo griovio puss, o II klass
fermentai i didiojo.
I klass aminoacil-tRNR sintetazs aminoacilina tRNR galinio adenozino 3 OH grup, o
IIklass fermentai 2OH grup. Aminoacil-tRNR sintetazs bna monomerins, dimerins,
kartais tetramerins struktros baltymai, j dydis svyruoja nuo 40 iki 110kDa. Daugelio ami-
7.6pav. Aminorgties prijungimas prie tRNR dalyvaujant aminoacil-tRNR sintetazei (ad)
361
MOLEKULIN BIOLOGIJA
noacil-tRNR sintetazi erdvin struktra nustatyta. Bakterij fermentai skiriasi nuo mieli ir
auktesnij eukariot ferment. Eukariotuose kelios aminoacil-tRNR sintetazs gali sudaryti
kompleks.
Tiksl aminoacil-tRNR sintetazs veikim prijungiant reikaling aminorgt prie tRNR
3galo utikrina keli mechanizmai. Pirmiausiai fermentas suranda reikaling aminorgt tarp
kit aminorgi: tam tikrai aminoacil-tRNR sintetazei jai savita aminorgtis giminingiausia ji geriausiai tinka fermento prijungimo srities kienje (angl. pocket). Didesns aminorgtys nebetelpa kienje ir nra jungiamos (7.6pav.).
Taiau atskirti aminorgtis, kuri struktros labai panaios, pvz., izoleucin nuo valino, tokiu bdu sunku, todl yra dar vienas aminorgties atrankum aminoacil-tRNR sintetazei utikrinantis mechanizmas. Kai prie aminorgties kovalentikai prijungiamas AMP ir susidaro
aminoacil-adenilatas, prie fermento prisijungia tRNR. tRNR molekul stumia aminorgt kit
fermento srit redagavimo srit (angl. editing site). Joje, kitaip nei pirmojoje, savita fermentui
aminorgtis netelpa, taiau j patenka struktrikai panaios nesavitos aminorgtys. Joms
patekus redagavimo srit, vyksta ryio tarp aminorgties ir AMP hidroliz, ir aminorgtys
disocijuoja nuo fermento. Jeigu iki tol jau buvo susidars ryys tarp aminorgties ir tRNR, toks
ryys taip pat skeliamas. Tokiu bdu vyksta savotikas klaid taisymo procesas. Toks hidrolitinis
redagavimas labai padidina aminorgi jungimo prie savit tRNR tikslum padaroma tik
1klaida ~40000 aminorgi jungim.
7.2.2. Supresorins tRNR

Pernaos RNR yra bdingas supresijos fenomenas. vykus mutacijai baltym koduojaniame gene, baltymas tampa nefunkcionalus, nes mutacij turinio kodono iRNR molekulje neatpasta jam savita aminoacil-tRNR. vykus tRNR
koduojaniame gene antrajai supresorinei mutacijai,
Supresorins mutacijos tai
tRNR molekul (supresorin tRNR) gyja savyb atpainti
mutacijos, dl kuri panaikinamutacij turint iRNR kodon, ir funkcionalus baltymas gali
mi kit mutacij sukelti efektai.
bti sintetinamas.
Priklausomai nuo pirmins mutacijos prigimties iRNR
iskiriami vadinamieji nonsense ir missense supresoriai.
Normaliose lstelse nonsense mutacijos (i viso toki inomos 3) atpastamos kaip baltym
biosintezs STOP kodonai (kodonus atpasta baltym biosintezs paleidimo veiksniai (angl.
release factors)). Taiau vykus supresorinms mutacijoms tRNR gene, aminoacil-tRNR atpasta
transliacijos STOP kodonus kaip aminorgtis koduojanius nukleotid trejetus ir sintetinam baltym jungiama aminorgtis. Supresorin tRNR gali turti prijungt aminorgt, kuri
iRNR kodavo iki mutacijos (sintetinamas baltymas nesikeiia), taiau gali turti ir kit aminorgt (sintetinamas baltymas pasikeiia). Pvz., E. coli nustatytos 6 mutavusios supresorins
tRNR, kurios atpasta UAG STOP kodonus (amber klass supresorins tRNR). Vis amber klass
supresorinini tRNR antikodone yra mutacija (CUA), dl kurios jos atpasta tik STOP kodon.
Taigi, supresijos atveju baltymo sintez vyksta u terminacijos kodono (angl. readthrough) ir
sintetinamas ilgesnis baltymas. Supresorins tRNR konkuruoja dl STOP kodon iRNR moleku-
362
lje su paleidimo veiksniais. Supresorins tRNR, supresuojanios nonsense tipo mutacijas, tam
tikra prasme valdo transliacijos terminacijos veiksmingum.
Dl missense mutacij kodonas, koduojantis vienoki aminorgt, keiiamas kodonu, koduojaniu kit aminorgt: gali bti jungiama iki mutacijos koduota aminorgtis arba kita
aminorgtis, dl kurios baltymo funkcija ilieka tokia, kokia pasiymjo baltymas iki mutacijos.
7.3. Ribosom struktra ir funkcijos

Baltym biosintez yra vienas sudtingiausi proces gamtoje. Kaip ir DNR bei RNR sintez,
baltym sintez vyksta nuo matricos iRNR. Baltym sintezs proces galima suskirstyti iuos
etapus:
zz iniciacijos;
zz elongacijos (ilginimo);
zz terminacijos (baigties).
Baltym biosintez ribosomose

vyksta trimis etapais: iniciacijos,
elongacijos ir terminacijos.
Kaip ir DNR bei RNR, baltymus sintetina sudtingas ribonukleoproteininis kompleksas. J

sudaro ribosomos, baltymai transliacijos veiksniai, iRNR ir aminoacil-tRNR molekuls. Taiau
ribosomos skiriasi nuo replisomos ir transkripcijos kompleks tuo, kad net du tredalius j mass sudaro ne baltymai, bet rRNR molekuls.
Ribosomins RNR aktyviai dalyvauja daugelyje transliacijos etap ir utikrina svarbiausi ribosomos funkcij
Ribosomos tai ribonukleopeptidinio ryio susidarym. Todl prie praddami naproteinai, kuri du tredalius
grinti baltym biosintezs vyksmus, trumpai aptarsime
mass sudaro rRNR.
ribosom struktrines ir funkcines ypatybes.
Ribosomos yra evoliucikai labai senos, daugiau nei
prie 3 milijardus met atsiradusios, sudtingos molekulins mainos, sudarytos i rRNR ir baltym. Ribosomas pirm kart ~1950m. aptiko Dordas E.Paladis (GeorgeE.Palade), todl jos
pirmiausiai buvo pavadintos Paladio dalelmis. Buvo pastebta, kad induoli lstelse yra
daugyb daleli, sudaryt i rRNR ir baltym. Jose pirmiausiai telksi radioaktyvios aminorgtys. Po kurio laiko radioaktyvi ym jau buvo aptinkama visame citozolyje. Buvo nustatyta, kad
ribosomose vyksta baltym biosintez genetin informacija, esanti iRNR molekuls nukleotid sekoje, transliuojama aminorgi sek (peptid ar baltym). Substratai iose reakcijose
yra tRNR molekuls, turinios antikodon viename gale ir prijungt aminorgt kitame.
Baltym biosintezs metu tRNR molekuls sveikauja su ribosoma. Vykstant transliacijai
iRNR kodono nukleotid heterociklins bazs sveikauja su atitinkamos tRNR antikodono heterociklinmis bazmis. Aminorgi jungimas polipeptidin grandin vyksta ribosomos
peptidiltransferaziniame centre, PTC (angl. peptidyltransferase centre), kuris yra didiajame
ribosomos subvienete.
Baltym biosintezei reikia transliacijos veiksni, kurie veikia iniciacijos, elongacijos ir terminacijos etapuose.
363
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Panaiai kaip ir kiti fermentai, katalizuojantys polimerizacijos reakcijas, ribosomos utikrina,

kad visi reakcijoje dalyvaujantys komponentai (dvi aktyvintos aminorgtys ir j antikodonus
atitinkantys kodonai iRNR molekulje) bt tiksliai idstyti ir galt susidaryti peptidinis ryys (angl. peptide bond). Taiau tuo ribosomos vaidmuo neapsiriboja. Ji pati, kaip minta, aktyviai dalyvauja transliacijoje atlikdama ias funkcijas:
zz tiksliai idsto iRNR vykstant transliacijos iniciacijai;
zz dalyvauja nustatant iniciacijos kodon;
zz dalyvauja peptidinio ryio sudaryme;
zz valdo transliacijos tikslum (kodono ir antikodono sveika);
zz dalyvauja transliacijos terminacijoje ir atpalaiduojant polipeptidin grandin.
Prokariot ir eukariot ribosomos, taip pat eukariot organeli ribosomos yra sudarytos i
dviej didiojo ir maojo subvienet, o ie yra sudaryti i ribosomini baltym ir ribosomini RNR (7.7pav.). Ribosoma disocijuoja atskirus subvienetus in vitro, sumainus Mg2+ jon
koncentracij.
Ribosom dydis apibdinamas j sedimentacijos greiio vienetais Svedbergais,S. E.coli
70S ribosomos bendra molekulin mas yra apie 2,5MDa. E.coli lstel turi apie 20000 ribosom, o daugelis dideli eukariotini lsteli turi apie kelis imtus tkstani ribosom. Eukariot ribosomos molekulin mas virija 4Mda.
7.7pav. Prokariot ir eukariot ribosom sudtis
364
Ultracentrifugavimo metod ~1920m. sukr Teodoras Svedbergas (Theodor Svedberg). Svedbergo vienetais matuojamas daleli sedimentacijos greitis jas ultracentrifuguojant sacharozs tankio
gradiente. Vienas svedbergas lygus 1013s.
Eukariot, archj, bakterij ribosomos iek tiek skiriasi savo forma, baltym rinkiniu ir
rRNR molekuli rimis. Organeli ribosomose didesn dal mass sudaro ne rRNR, bet baltymai. Ribosom pavidal daugiausia lemia rRNR molekuli erdvins struktros. Ribosominiai
baltymai isidst tose ribosomos vietose, kurios sveikauja su aplinka, taip pat dviej subvienet slyio kratuose.
Ribosomos subvienetai sukuria aplink transliacijai. Maasis ribosomos subvienetas svarbus transliacijos iniciacijai. Jis prijungia transliacijos matric iRNR ir tiksliai idsto pirmuosius transliuojamus iRNR kodonus ribosomoje. Maasis ribosomos subvienetas utikrina tiksli
sveik tarp iRNR molekuls kodon ir tRNR molekuls antikodon, t.y. atlieka ikodavimo
funkcij (angl. decoding). i funkcija lemia sintezs tikslum. Maasis ribosomos subvienetas
taip pat dalyvauja iRNR ir tRNR molekuli perstmime (angl. translocation) transliacijos metu.
Didysis ribosomos subvienetas utikrina peptidinio ryio susidarym transliacijos metu.
Didiajame subvienete yra kanalas, kuriuo susintetintas polipeptidas ieina i ribosomos. Didiajame subvienete yra transliacijos veiksni Gbaltym (GTP ir GDP suriani baltym)
prijungimo sritis. ie veiksniai veikia vairiuose baltym biosintezs etapuose.
7.3.1. Ribosomos struktros tyrimai

Ribosom struktros tyrimai buvo pradti daugiau kaip prie 30 met. Nuo to laiko nuolat tobuljo ribosomos ir jos subvienet kristalizavimo technika ir kristal analizs skyra.
Tyrimus vainikavo 2009 m. Nobelio chemijos premija, kuri buvo skirta Adai E. Jonat (Ada
E.Yonath), Venkatramanui Ramakrinanui (Venkatraman Ramakrishnan) ir Tomui A.Steicui
(Thomas A.Steitz).
Ribosomos struktros tyrimus ypa paspartino krioelektronin mikroskopija, krio-EM.
iuo metodu galima per kelet sekundi ualdyti ribosomas ir gauti vairi bsen ribosom
vaizdus. Ribosom analiz iuo metodu kol kas riboja elektronins mikroskopijos skyros galimybs (~20).
Kitas ribosom struktros tyrimo bdas ribosom kristalizavimas ir j kristal rentgenostruktrin analiz. Ribosom kristalografin analiz apsunkina tai, kad ios makromolekuls yra labai didels ir sudarytos i daugelio komponent. Ribosomos dalels neturi
vidins simetrijos, keiia savo konformacij ir yra labai jautrios spinduliuots, kuri naudojama tokiuose tyrimuose, poveikiui. 19992002m. buvo gauta labai svarbi duomen apie
ribosom struktr, tiriant jas rentgenostruktrins analizs ir krio-EM analizs metodais
(7.1lentel). Tai pavyko padaryti A.Jonat vadovaujamai tyrj grupei, gavusiai tvirt ribosom kristalus. Ribosomos buvo iskirtos i bakterij bei archj, gyvenani ekstremaliomis
slygomis, pvz., auktos temperatros, didels radiacijos slygomis, didels koncentracijos
drusk tirpaluose, todl toki ribosom kristalai buvo palyginti atspars ardaniam rengeno
spinduli poveikiui tyrimo metu.
365
MOLEKULIN BIOLOGIJA
7.1lentel. Svarbiausi ribosom struktros tyrim etapai

Metai
Organizmas
Skyra,
(metodas)
Ribosoma / subvienetas
Nuoroda
1999
Thermus thermophilus
4,5 (rentgeno)
30S
PNAS, v.96, p.14252, 1999
3,3 (rentgeno)
30S
Cell, v.102, p.615, 2000
Haloarcula marismortui
2,8 (rentgeno)
50S
Science, v.11, p.878, 2000
Escherichia coli
11,5 (krio)
70S
Cell, v.100, p.537, 2000
15,0 (krio)
80S
Cell, v.107, p.373, 2001
5,5 (rentgeno)
70S-iRNR-tRNR kompleksas
Science, v.292, p.868, 2001
2000
2001
Deinococcus radiodurans
3,1 (rentgeno)
50S
Cell, v.107, p.679, 2001
2005
Escherichia coli
3,5 (rentgeno)
70S
Science, v.310, p.827, 2005
2006
2,8 (rentgeno)
70S-iRNR-tRNR kompleksas
Science, v.313, p.1935, 2006
2009
Nobelio chemijos premija u ribosomos tyrimus
7.8pav. Bakterijos Thermus thermophilus ribosomos didiojo subvieneto erdvin struktra, nustatyta krioelektronins mikroskopijos ir rentgenostruktrins analizs metodais (The Journal of
Biology, v.8, p.8, 2009)
366
7.9pav. Bakterij ribosomos subvienet kontaktai. Kairje ir viduryje kontru apvestos 30S ir 50S subvienet slyio sritys ribosomos viduje, deinje 70S ribosomos struktra (Science, v.285, p.2095, 1999)
ie labai svarbs ribosom struktros analizs rezultatai atskleid atomin didiulio molekulinio komplekso struktr (7.8pav.). Buvo nustatytos tikslios ribosomini RNR bei ribosomini baltym ir baltym biosintezje dalyvaujani tRNR bei iRNR padtys ir j tarpusavio
sveika ribosomoje.
Nustatyta ertm tarp abiej subvienet, kurioje isidsto iRNR ir aminoacil-tRNR. Parodyta,
kad ribosomos subvienetai tarpusavyje sveikauja palyginti maai. Pvz., bakterijos ribosomoje
yra tik apie 12 tilteli, kurie jungia vien ribosomos subvienet su kitu (7.9pav.). Palyginti nedidelis kontakt tarp ribosomos subvienet skaiius paaikina, kodl ribosomos subvienetai
lengvai disocijuoja, o pati ribosoma keiia savo konformacij vairi transliacijos etap metu.
Daugelyje nustatyt sveik tarp ribosomos subvienet dalyvauja rRNR molekuls. ia svarbus
vaidmuo tenka 16S rRNR. 16S rRNR molekuls antrinje struktroje 3 gale yra vadinamasis
priepaskutinysis segtukas (angl. penultimate stem), kur sudaro 1 4091 491 nukleotidai. i
struktra sudaro vadinamj RNR 44spiral. Spiral isidsiusi vertikaliai 30S ribosomos sub
vieneto (jo vidinje pusje), ji sveikauja su didiojo ribosomos subvieneto 23S rRNR. tRNR molekuli judjimas ribosomoje yra siejamas su kontakt tarp ribosomos subvienet pokyiais.
Ribosomos subvienet slyio paviriuje daniausiai yra RNR molekuls. Nustatytos tikslios
ribosomos srii (angl. sites), kur isidsto tRNR ir vyksta peptido (baltymo) sintez, padtys.
Air Psrityse tRNR molekuls isidsiusios beveik lygiagreiai viena kitai, o Ecentre pasisukusios onu (7.10pav.).
367
MOLEKULIN BIOLOGIJA
7.10pav. tRNR molekuli padtys Thermus thermophilus ribosomos A,Pir Esrityse (Science, v.292, p.893,
2001)
A,Pir Esritis formuoja abu ribosomos subvienetai. 30S subvienete esanias tRNR ir iRNR
jungimo sritis, kur tRNR antikodonai sveikauja su iRNR kodonais, sudaro iskirtinai 16S rRNR
molekuls struktriniai elementai. Vienintelis baltymas, esantis arti ikodavimo centro, yra S12.
7.3.2. Ribosomins RNR

Nustaius rRNR nukleotid sekas, buvo pasilytos rRNR molekuli antrins struktros (r.
2.1. skyri). Kaip parod vlesn rentgenostruktrin ribosom analiz, jos buvo gana tikslios.
Didels skyros rentgenostruktrine analize nustatyta, kad rRNR molekulje yra daugiau tretins struktros element, nei anksiau manyta. Bdingas rRNR erdvins struktros elementas yra Aminorinis motyvas. Motyvuose esantys konservatyvs rRNR nukleotidai liudija apie
j funkcin svarb. ei 23SrRNR domenai su 5SrRNR susimontuoja kompaktik struktr
(2.32pav., ac), kurioje rRNR molekuls sudaro apie 100 spirals pavidalo stieb. Verta pastebti, kad beveik visos 23SrRNR molekuls sritys, kurios sveikauja su tRNR molekuli ribosomos
A,Pir Esritimis arba yra alia j, yra Vdomene (2.32pav.). 5SrRNR molekul ribosomoje isidsto ties centriniu kyuliu (angl. central protuberance, PC) didiajame ribosomos subvienete (7.9
ir 2.32pav.). 5SrRNR nra kai kuri gryb, stuburini ir pirmuoni mitochondrij ribosomose.
Palyginti su 23SRNR, 16SrRNR molekul yra ne tokia kompaktika. Joje iskiriami trys dideli ir vienas maas domenas, kurie susilanksto erdvin struktr nepriklausomai. Tuo tarpu
23SrRNR formuoja vien bendr struktr. Tai turi reikms ribosomos subvienet funkcijoms:
maasis subvienetas, kur vyksta informacijos, esanios iRNR, ikodavimas, yra judresnis, o didysis subvienetas, kur vyksta peptidinio ryio susidarymas, yra maiau judrus.
Trys didieji 16SrRNR domenai atitinka molekuls struktrinius elementus: 5domenas sudaro ribosomos maojo subvieneto kn (angl. body, B), centrinis domenas platform (angl.
platform, P), o 3didysis domenas galv (angl. head, H) (7.9 ir 2.31pav.).
Archj ribosomos panaios bakterij, tik jose yra daugiau baltym. Eukariot ribosom
didiojo subvieneto sudtyje yra dar viena 5,8SrRNR molekul, o didij rRNR (18S ir 28S)
molekulse siterpusi nukleotid sek (angl. expansion segments). 5,8S yra kilusi i didiosios
rRNR. Eukariot ribosomos dar turi 2030 papildom baltym. Taigi sudtingesniuose organizmuose ribosomos yra didesns.
Ribosomins RNR yra labai konservatyvios molekuls; remiantis j sekomis, nustatoma ries tapatyb.
368
7.3.3. Ribosominiai baltymai

Ribosomini RNR griauius ribosomoje udengia ribosominiai baltymai. Ne vis organizm ribosominiai baltymai yra visikai vienodi. Pvz., apie tredal archjos H. marismortui 50Ssubvieneto baltym neturi homologik baltym E.coli 50Ssubvienete (7.11pav., a). Daugelio
baltym, ypa didiojo ribosomos subvieneto, struktr sudaro globuls formos domenai, isidst ribosomos paviriuje, ir nestruktrizuotos dalys pirtai, kurie yra siterp rRNR molekules (7.11 pav., b). Daugelis baltym ribosomoje sveikauja su rRNR struktriniais elementais.
Pvz., tredalis 23SrRNR nukleotid sveikauja VanderValso sveika su baltym aminorgi
liekanomis. Ribosominiai baltymai stabilizuoja rRNR tretin struktr, taip pat padeda prijungti
transliacijos veiksnius. Tai, manoma, pagrindins j funkcijos ribosomoje.
7.3.4. Funkciniai centrai ribosomoje

Ribosomos yra sudtingi baltym-RNR kompleksai, kuriuose baltym biosintezs metu laikoma iRNR, dvi aminoacil-tRNR molekuls, transliacijos veiksniai. Kur isidsto visos ios molekuls? Viena tRNR molekul, prie kurios prijungtas sintetinamas polipeptidas peptidil-tRNR,
yra isidsiusi ribosomos Psrityje (angl. peptidyl-P site). Kita tRNR molekul, prie kurios prijungta aminorgtis aminoacil-tRNR, yra isidsiusi ribosomos Asrityje (angl. aminoacyl-A
site) (7.12pav.).
7.11pav. Ribosom baltymai gyvybs domenuose. Veno diagrama, iliustruojanti ribosomos maojo
ir didiojo suvienet baltym pasiskirstym eukariuotuose (E), archjose (A) ir bakterijose (B). Pirmasis
skaitmuo skliausteliuose maojo subvieneto baltym skaiius, antrasis didiojo. Skaitmenys apskritim susikirtimuose ymi bendr baltym skaii (a) (Nucleic Acids Research, v.30, p.5382, 2002); eukariot ribosomos didiojo ir maojo subvienet baltym pavyzdiai (b) (http://en.wikipedia.org/wiki/
Eukaryotic_Small_Ribosomal_Subunit_(40S))
369
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Ribosomos Air Psrityse isidsiusi tRNR molekuli antikodonai sveikauja su iRNR kodonais, esaniais ribosomos 30Ssubvienete (i vieta vadinama ikodavimo centru), o prie tRNR
prijungtos aminorgtys isidsto 50S subvienete. tRNR
molekuli knai isidsto ertmje tarp subvienet
Ribosomose yra trys tRNR suri(7.12pav.). Air Psrityse esanios tRNR molekuls yra pasiimo sritys A,PirE.
sukusios viena kitos atvilgiu, todl prie j prijungtos aminorgtys 50S subvienete suartja. i ribosomos vieta
vadinama peptidiltransferaziniu centru, PTC (angl. peptidyltranferase center). Joje vyksta peptidinio ryio susidarymas. Peptidiltransferazin centr,
galima sakyti, formuoja Air Psritys. Rentgenostruktrine analize nustatyta, kad ir iRNR molekul 30Sribosomos subvienete isidsto plyyje (7.13pav.).
Deacilinta tRNR ieina i ribosomos per E srit (angl. exit-E site). Nustatyta, kad E srityje
tRNR molekuls sveika su iRNR nra tokia stipri kaip Air Psrityse. Silpnesn sveika, greiiausiai, lemia tRNR molekuls disociacij nuo ribosomos.
Susintetintas polipeptidas juda ~100 ilgio ir ~1520 skersmens ijimo tuneliu, esaniu
ribosomos 50S subvieneto upakalinje dalyje (7.12 pav.). Tunelis prasideda ties ta didiojo
subvieneto vieta, kur vyksta peptidinio ryio susidarymas. Tunel sudaro 23SrRNR, taip pat kai
kurie baltymai, pvz., L2 ir L14. Tunelis baigiasi baltym iedais, kurie sveikauja su baltymais
aperonais arba lstels sekrecinio aparato komponentais.
Visuose transliacijos etapuose dalyvauja baltyminiai veiksniai. Energija, kurios reikia transliacijai, gaunama hidrolizuojant didiaenerg jungin GTP. Nors prokariot ir eukariot ribosom struktros labai panaios, tarp j yra daug funkcini transliacijos skirtum, ypa transliacijos iniciacijos etape (eukariotuose jis ymiai sudtingesnis), taip pat elongacijos etape ir
ribosomos sveikoje su antibiotikais.
7.12pav. Ribosomos funkciniai centrai (Science, v.285,

p.2100, 1999)
370
7.4. Baltym biosintez prokariotuose

7.4.1. Transliacijos iniciacija
Dar 1960 m. buvo parodyta, kad baltymai sintetinami pradedant j N galu ir baigiant
Cgalu. Matrica iRNR yra skaitoma 53 kryptimi. Prokariotuose transkripcija ir transliacija
daniausiai vyksta vienu metu, o eukariot lstelse ie procesai yra atskirti erdvje: transkripcija vyksta branduolyje, o transliacija citozolyje.
Iniciacijos procesas vyksta prie susidarant peptidiniam ryiui tarp pirmj dviej aminorgi. Ribosoma prijungia iRNR molekul ir pirmj aminoacil-tRNR. Iniciacijos etapas yra
palyginti ltas ir daniausiai nulemia baltym biosintezs greit. Iniciacijos etapui btini:
zz iRNR, kuri bus transliuojama;
zz 30S ir 50Sribosomos subvienetai;
zz speciali iniciatorin tRNR (ini-tRNR arba formil-Met-tRNRfMet);
zz baltymai iniciacijos veiksniai (IF-1, IF-2, IF-3);
zz GTP.
7.13pav. iRNR molekuls

isidstymas 30Sribosomos subvienete. Viruje
iRNR struktrin schema,
kurioje paymtos iRNR
ir ribosomos sveikos vietos; apaioje ribosomos
30Ssubvieneto kartu su
iRNR pavirius, esantis ribosomos vidinje pusje (Cell,
v.106, p.233, 2001)
371
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Iniciacijos pradia linkstama laikyti moment, kai prie maojo ribosomos subvieneto (30S)
prisijungia transliacijos iniciacijos IF-3 veiksnys. Toliau IF-3 ir 30S kompleksas prijungia iRNR
molekul, iniciatorin aminoacil-tRNR ir transliacijos iniciacijos veiksnius IF-1 ir IF-2. Tada prie
komplekso prisijungia 50Ssubvienetas, ir ribosoma paruoiama elongacijos etapui. Taigi, iniciacijos procese dalyvauja ne visa ribosoma, bet atskiri jos subvienetai.
Iniciacijos etapas reikalingas tam, kad, dar neprasidjus sintezei, bt tiksliai nustatytas iRNR
iniciacijos (START) kodonas. Tai yra labai svarbi ribosomos funkcija, nuo kurios priklauso bsimos
aminorgi seka ir sintezs eiga: perstmus skaitymo rmel nors per vien nukleotid, susinte-
7.14 pav. Baltym biosintezs

pagrindiniai etapai
372
tinto polipeptido aminorgi seka bus visikai kita arba sinProkariotuose iniciacijos kodotez bus stabdoma jame siterpusi terminacijos kodon.
nas nustatomas sveikaujant
Daugelyje iRNR molekuli pirmas transliuojamas kodomaajam ribosomos 30Ssub
nas yra AUG, kuris koduoja aminorgt metionin (Met).
vienetui su iRNR molekule.
Prie kodon yra netransliuojama iRNR sritis. AUG kodon
yra ir skaitymo rmelio viduryje, taiau jie nra iniciacijos kodonai. Lstelje sintetinant baltymus turi egzistuoti bdas
atskirti, kuris i kodon yra iniciacijos kodonas (koduojantis pirm aminorgt sintetinamo baltymo molekulje), o kuris prastas Met aminorgt koduojantis nukleotid trejetas.
Bakterij 30Sribosomos subvienetas atrankiai prisijungia prie iRNR molekuls 5gale esanios savitos A ir G nukleotid turinios srities. i sritis yra ribosom prijungimo sritis, RBS (angl.
ribosome binding site). Ji dar vadinama aino-Dalgarno sritimi, SD (angl. Shine-Dalgarno; pavadinimas kils i atradj pavardi). SD sritis yra labai arti iniciacijos kodono iRNR molekulje
vidutinikai u 7 nukleotid (7.15pav.).
Eukariot iRNR molekuls tokios srities neturi, juose iniciacijos kodonas iRNR nustatomas
kitu bdu.
aino-Dalgarno sritis komplementari daug pirimidino nukleotid turiniam 16S rRNR
(kuri yra 30Sribosomos subvienete) molekuls 3galui. Dl ios sveikos iRNR prisijungia prie
30S subvieneto tokiu bdu, kad iniciacijos kodonas iRNR molekulje idstomas ribosomos
Psrityje (7.13pav.). SDsrities daniausiai iRNR molekulse yra prie iniciacijos kodon, bet ne
prie AUG kodonus skaitymo rmelio viduryje, todl iniciacijos kodonas pirmiausiai ir idstomas ribosomos Psrityje transliacijos iniciacijos metu.
Ne tik AUG kodonas gali bti iniciacijos kodonu. Pvz., E.coli vietoje AUG danai naudojamas ir
kitas GUG kodonas. Jis pasitaiko apie 8% iniciacijos kodon, o archjose yra dar danesnis. Abu
kodonus atpasta ta pati iniciatorin aminoacil-tRNR. domu, kad AUG kodonas koduoja metionin bdamas ir START kodonu, ir vidiniu kodonu skaitymo rmelyje. GUG, bdamas iniciacijos
kodonu, lemia metionino jungim, o bdamas skaitymo rmelio sudtyje valino jungim, kur
ir koduoja (prijungia valil-tRNRVal). Kai kuriais retais atvejais ir kiti kodonai gali bti naudojami kaip
iniciacijos, pvz., AUU. Kodl gi ia neveikia genetinis kodas? Kodono-antikodono sveika ribosomos Psrityje, kur iniciacijos metu prijungiama iniciatorin tRNR, nra lemiama jos prijungimui.
7.15pav. Prokariot iRNR molekuls ainoDalgarno srities sveika su 16S rRNR molekuls komplementaria sritimi 3gale
373
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Svarbesn vaidmen vaidina iniciatorins tRNR molekuls struktra: tRNR molekul sveikauja su
16SrRNR maajame ribosomos subvienete ir todl iniciatorin tRNR prijungiama tik Psrityje.
Bakterijose yra dvi metionil-tRNRMet molekuli rys, kurios atpasta AUG kodon. Viena
tRNR molekuli ris atpasta tik iniciacijos kodonus tai iniciatorin tRNR (ini-tRNR). Kita metionil-tRNRMet ris atpasta tik vidinius AUG kodonus. ios dvi tRNR molekuli rys skiriasi
savo nukleotid seka, bet aminorgt prie j jungia ta pati aminoacil-tRNR-sintetaz.
Kai kuriuose prokariotuose (pvz., E. coli) iniciatorin tRNR yra N-formilmetionil-tRNR,
f-Met-tRNRfMet. Molekul turi struktrini ypatybi, kuriomis skiriasi nuo kit metionil-tRNRMet
molekuli. Viena toki svybi yra formilgrup metionino aminorgtyje. J prie metioniltRNRfMet prijungia formiltransferaz ir taip susidaro N-formilmetionil-tRNRfMet (7.16pav., a).
Tokioje aminoacil-tRNR Met-NH2-COH ryys primena peptidin ry. Taigi prijungta fMet
aminorgtis panai ma peptidin grandin. Transliacijos iniciacijos IF-2veiksnys sveikauja
su ini-tRNR, kuri turi formilgrup metionino liekanoje.
Kaip formiltransferaz atskiria savo substrat iniciatorin metionil-tRNRfMet nuo kitos
ries metionil-tRNRMet? Iniciatorins metionil-tRNR molekuls skiriasi savo nukleotid seka ir
antrine struktra. Joms bdinga:
zz nesuporuoti C1 ir A72 nukleotidai akceptoriniame stiebe (7.16pav., b);
zz A11-U24 nukleotid pora Dstiebe;
zz trys komplementarios G-C nukleotid poros antikodoniniame stiebe.
Pastaroji struktrin ypatyb utikrina formilmetionil-tRNRfMet molekuls prijungim ribosomos Psrityje, kur 16SrRNR A1339 ir G1338 heterociklins bazs sudaro Aminorinius motyvus su tRNR G-C poromis 3040 ir 2941 padtyse.
7.16pav. N-formilmetionil-tRNR sintez (a) ir iniciatorins tRNRfMet struktra (b) (http://genes.atspace.org/6.4.html)
374
Bakterijose ir mitochondrijose metionino formilgrup paalina savitas fermentas deformilaz. Peptidins grandins Ngale lieka prasta NH2 grup. Apie pus susintetint baltym
turi tok Ngal. Kituose baltymuose metionio aminorgt paalina aminopeptidaz. Modifikacija vyksta greitai, ribosomai susintetinus vos 15 aminorgi liekan polipeptid.
Eukariotuose prie iniciatorins tRNR prijungtas metioninas neformilinamas. Tokia tRNR vadinama tRNRiMet.
30Ssubvienetas pats negali inicijuoti transliacijos proceso. Tam reikia baltymini veiksni
iniciacijos veiksni, IF (angl. initiation factors). Prokariotuose yra trys iniciacijos veiksniai: IF-1,
IF-2 ir IF-3.
IF-3veiksnys citozolyje prisijungia prie laisv 30Ssubvienet ir tokiu bdu jiems neleidia
per anksti susijungti su 50Ssubvienetu 70Sribosomas. IF-3 gali prisijungti 30Ssubvieneto
Esrityje. IF-3 veikia ir kaip tikslumo (angl. fidelity) veiksnys destabilizuoja neiniciatorini tRNR
sveik su ribosomos Psritimi. IF-3 dar pasiymi ir tuo, kad lemia deacilint tRNR disociacij i
30Ssubvieneto transliacijos terminacijos metu. Tokiu bdu ilaisvinami 30Ssubvienetai kitam
iniciacijos ciklui.
IF-1veiksnys prisijungia 30Ssubvieneto Asrityje (7.17pav.). Manoma, kad tokiu bdu is
veiksnys neleidia per anksti Asrityje prisijungti aminoacil-tRNR.
IF-2veiksnys (kartu su GTP) utikrina labai svarbi sveik iniciatorins tRNR prijungim
30Ssubvieneto Psrityje (7.17pav.). IF-2 sudaro kompleks su iniciatorine tRNR ir tokiu bdu
neleidia kitoms aminoacil-tRNR dalyvauti iniciacijoje. Tuo tarpu elongacijos etape veikiantis
veiksnys EF-Tu, atvirkiai, nesveikauja su iniciatorine tRNR.
IF-2veiksnys yra nuo ribosomos priklausoma GTPaz. GTP hidroliz vyksta, kai prie 30Ssub
vieneto jungiasi 50Ssubvienetas. Tuo pat metu disocijuoja visi trys iniciacijos veiksniai (7.18pav.).
Susidarius 30Siniciacijos kompleksui, prie jo prisijungia didysis 50Sribosomos subvienetas. Tuo pat metu GTP, prisijungs prie IF-2 veiksnio, hidrolizuojamas iki GDP ir Pi. Hidroliz
vyksta dl IF-2 veiksnio GTPazinio aktyvumo. GDP pakeitus GTP, IF-2 vl gali dalyvauti iniciacijos kompleks susidaryme. vykus hidrolizei visi iniciacijos veiksniai disocijuoja i ribosomos
(7.18pav.). GTP hidroliz sukelia konformacinius pokyius, dl j ribosoma gali vykdyti sintezs
reakcijas, o ribosomos Asritis priimti aminoacilint tRNR.
7.17pav. Prokariot transliacijos

veiksni sveika su ribosomos
mauoju subvienetu. Vietoje IF-2
parodytas eukariot analogas. IF-3-N
ir IF-3-C IF-3 veiksnio N ir C galiniai
domenai (Cell, v.108, p.557, 2002)
375
MOLEKULIN BIOLOGIJA
7.4.2. Transliacijos elongacija

Elongacijos metu vyksta vis peptidini ryi nuo pirmojo iki paskutiniojo sintez. Ribosoma lieka prijungusi iRNR molekul ir transliuoja iRNR nukleotid sek aminorgi sek. ie
vyksmai vadinami elongacijos ciklu.Tik dvi tRNR molekuls sveikauja su iRNR ir ribosomos
kompleksu vienu metu:
zz Asrityje esanti aminoacil-tRNR molekul: maajame ribosomos subvienete jos antikodonas sveikauja su atitinkamu iRNR molekuls kodonu, o didiajame yra aminorgtis;
zz Psrityje esanti peptidil-tRNR su sintetinama polipeptidine grandine (angl. nascent polypeptide chain): elongacijos metu i polipeptidin grandin nuo tRNR Psrityje perkeliama ant aminoacil-tRNR, esanios Asrityje.
Peptidinio ryio susidarymas vyksta kovalentikai prijungus peptidil-karboksigrup prie
aminogrups aminoacil-tRNR molekulje. Baltymo sintezei vykti reikia:
zz iRNR, 70Sribosomos, peptidil-tRNR komplekso;
zz aminoacil-tRNR molekuls;
zz transliacijos elongacijos veiksni;
zz GTP.
7.18pav. Transliacijos iniciacija bakterijose
376
Pasibaigus transliacijos iniciacijos etapui, tolimesnis iRNR molekuls kodonas u iniciacijos

kodono, esanio Psrityje, yra orientuojamas ribosomoje taip, kad galt prijungti kit aminoacil-tRNR, kurios antikodonas sudaro komplementari sveik su kitu iRNR kodonu. i aminoacil-tRNR uima ribosomos Asrit (ioje srityje tinka visos aminoacil-tRNR, iskyrus iniciatorin
tRNR dl jau mintos ypatingos molekuls struktros).
7.4.3. Elongacijos ciklas

Vykstant polipeptido sintezei, kiekviena nauja aminorgtis jungiama per elongacijos cikl. Elongacijos ciklo pagrindiniai ingsniai yra ie:
zz aminoacil-tRNR idstymas ribosomos Asrityje;
zz peptidinio ryio susidarymas;
zz viena aminorgtimi pailgjusios peptidil-tRNR perklimas i Asrities Psrit taip, kad
srityje likt laisva vieta kitai aminoacil-tRNR; is procesas vadinamas perstmimu.
7.19 pav. Transliacijos elongacijos ciklas prokariotuose
377
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Perstmimas (angl. translocation) yra susijs su tRNR ir iRNR molekuli judjimu ribosomos
A,Pir Esrityse. iRNR molekul ribosomos atvilgiu pasistumia per vien jos kodon. Translokacijos metu ir pati ribosoma keiia savo konformacij. Kiekvieno elongacijos ciklo metu polipeptidin grandin Psrityje pailgja viena aminorgtimi.
Vykstant pirmajam elongacijos ciklo ingsniui, ribosomos A srityje idstoma aminoaciltRNR, kurios antikodonas atitinka iRNR molekulje esant kodon (7.19pav.). Bakterijose aminoacil-tRNR jungimui ribosomos Asrityje reikia baltymo elongacijos EF-Tu veiksnio.
Elongacijos veiksniai, EF (angl. elongation factors), vaidina svarb vaidmen polipeptidins grandins sintezje. Bakterijose j yra dideli kiekiai. Pvz., EF-Tu baltymai E.coli sudaro ~5%
viso baltym kiekio. EF-Tu yra monomerin GTPaz. Prijungus GTP, EF-Tu ir GTP kompleksas
prijungia aminoacil-tRNR. Toks trinaris kompleksas tinkamas isidstyti ribosomos A srityje.
Kompleksas prisijungia Asrityje tik tuomet, kai Psrityje yra arba iniciatorin tRNR molekul (tik
vykus iniciacijai), arba tRNR molekul su augania peptidine grandine peptidil-tRNR (peptido sintezs metu). EF-Tu, GTP ir aminoacil-tRNR komplekso susidarymas yra termodinamikai
palankus, todl dauguma aminoacil-tRNR lstelje yra tokiuose kompleksuose. Tik formilmetionil-tRNRfMet nesudaro komplekso dl savo akceptorinio stiebo ypatingos antrins struktros.
Kai formilmetionil-tRNRfMet, EF-Tu ir GTP kompleksas pakliva ribosomos A srit ir susidaro
komplementari sveika tarp kodono ir antikodono, vyksta ribosomos konformacijos pokyi.
ie pokyiai sukelia GTP hidroliz iki GDP pasireikia nuo ribosomos priklausomas EF-Tu
GTPazinis aktyvumas.
Kodl tiksli kodono-antikodono sveika ribosomoje
Sintetinama polipeptidin
sukelia GTP hidroliz, dar nra suprasta. Kad ji vykt, reigrandin yra perkeliama nuo
kia, kad signalas apie komplementari sveik ikodavimo
peptidil-tRNR, kuri yra Psrityje,
vietoje bt perduotas i ribosomos 30S subvieneto 50S
prie aminoacil-tRNR, kuri yra
subvienet, kur yra EF-Tu veiksnio GTPazinio domeno priAsrityje.
sijungimo vieta (7.19 pav.). is signalas turi bti perduodamas ir per tRNR molekul, nes GTP hidroliz vyksta tik
esant intaktinei tRNR.
Tuo metu, kai vyksta GTP hidroliz, EF-Tu veiksnys ribosomos A srityje paleidia aminoacil-tRNR molekuls 3gal su aminorgtimi, ir is sukdamasis (angl. swing out) isidsto ribosomos didiojo subvieneto peptidiltransferaziniame centre. Toliau vyksta peptidinio ryio
susidarymas. Susidarius peptidiniam ryiui, deacilinta (be aminorgties) tRNR lieka ribosomos
Psrityje, o peptidil-tRNR, pailgjusi viena aminorgtimi, Asrityje.
Taigi susidarant peptidiniam ryiui, ne aminorgtis prijungiama prie polipeptidins grandins ir perkeliama nuo aminoacil-tRNR prie peptidil-tRNR, bet atvirkiai peptidin grandin
nuo peptidil-tRNR perkeliama ant aminoacil-tRNR.
EF-Tu disocijuoja i ribosomos EF-Tu ir GDP komplekso sudtyje (7.19pav.). Disocijavs toks
kompleksas negali prijungti kitos aminoacil-tRNR, kol GDP nepakeiiamas GTP. i reakcij katalizuoja dar vienas elongacijos veiksnys EF-Ts. Taigi, kiekvienos aminoacil-tRNR molekuls
prijungimui ribosomos Asrityje yra suskaldoma viena GTP molekul.
378
7.4.4. Ikodavimas
Kaip ribosomoje nustatomos aminoacil-tRNR molekuls (komplekse su EF-Tu ir GTP), kuri
antikodonai yra komplementars iRNR molekuls kodonams? Jeigu aminoacil-tRNR molekuls antikodonas atitinka iRNR kodon, aminoacil-tRNR molekul laikosi ribosomos Asrityje i
dalies dl Votsono-Kriko sveikos tarp komplementari heterociklini bazi. Tai yra pirmin
atranka (angl. initial selection). Taiau skirtumas tarp komplementarios sveikos ir ne visikai
komplementarios sveikos palyginti nedidelis. Jo nepakanka utikrinti didel transliacijos tikslum (viena klaida 103104 jungt aminorgi). Pvz., netipikos bazi poros GU (pirmoje kodono ir antikodono pozicijoje) laisvoji energija panai AU poros, taiau ribosoma atskiria toki
netipik por nuo Votsono-Kriko bazi poros. Taigi, turt egzistuoti kiti didel transliacijos
tikslum utikrinantys bdai.
Dar 1964m. buvo pasilyta, kad ribosoma gali tiksliai nustatyti, ar kodono ir antikodono erdvin geometrija atitinka komplementari kodono ir antikodono sveik ar ne. Vliau paaikjo,
kad tokia ikodavimo funkcija pasiymi maasis ribosomos subvienetas. Komplementari sveika
tarp pirmj dviej kodono ir antikodono heterociklini bazi sukelia konformacini pokyi artimiausioje aplinkoje 30Ssubvienete. Atlikus struktrinius tyrimus parodyta, kad 16SrRNR (E.coli)
G530, A1492 ir A1493 nukleotid konformacija priklauso nuo maojo griovio, kuris susidaro tarp
pirmj dviej iRNR kodono ir aminoacil-tRNR antikodono nukleotid, struktros (7.20pav., ad).
7.20pav. Bakterij ribosomos ikodavimo centro 30Ssubvienete struktra. Centras tuias (a); centre prisijungs paromomicinas (b); centre yra iRNR kodonas ir jam komplementarus tRNR antikodonas
(c); centre yra iRNR kodonas ir jam nekomplementarus tRNR antikodonas bei paromomicinas (PAR) (Science, v.292, p.900, 2001)
379
MOLEKULIN BIOLOGIJA
16S rRNR reikm ikodavimui ir molekulinis mechanizmas paaikjo atlikus ribosomos,

prie kurios prisijungs antibiotikas paromomicinas, rentgenostruktrin analiz. Paromomicinas prisijungia prie 30Ssubvieneto 16SrRNR 44spirals (angl. helix 44) vidins kilpos. Antibiotiko prisijungimas sumaina transliacijos tikslum, t.y. jungiamos ne tos aminorgtys,
kurias koduoja iRNR. Struktriniai tyrimai parod, kad prisijungs paromomicinas sukelia E.coli
16SrRNR konformacijos pokyius 16SrRNR A1492 ir A1493 heterociklins bazs isukamos
(7.20pav., b). Toks pat Aheterociklini bazi isukimas vyksta ikodavimo centre, kai aminoacil-tRNR antikodonas yra komplementarus iRNR kodonui (7.20pav., c). A1492 ir A1493 sudaro
vandenilinius ryius su pirmja bei antrja kodono ir antikodono nukleotid poromis. Su treija pora sveika yra silpnesn. Tai paaikina, kodl ribosomoje toleruojamas nekomplementarumas tarp treiojo iRNR kodono nukleotido ir tRNR antikodono nukleotido. Sudarant ryius
tarp ribosomos 16SrRNR bei kodono ir antikodono dalyvauja ir G530 heterociklin baz. Esant
visikai komplementariai kodono ir antikodono sveikai G530 glikozidinio ryio konfigracija
pasikeiia: i sin virsta anti (7.20pav., c).
Taigi, paromomicinas sukelia konformacinius pokyius ribosomoje, kurie imituoja kodono
atitikimo antikodonui bsen baltym biosintezs metu. Vis anksiau mint 16SrRNR nukleotid mutacijos yra letalios E.coli. Struktrinis kodono ir antikodono sveikos atpainimas
ribosomoje yra labai svarbus sintezs tikslumui.
Ne maiau svarbus iame procese yra ir transliacijos veiksnys EF-Tu. Aminoacil-tRNR ribosom pakliva komplekso su EF-Tu ir GTP sudtyje. Susidarius tiksliai kodono ir antikodono
sveikai, anksiau aptarti struktriniai pokyiai ribosomos 30Ssubvieneto 16SrRNR molekulje sukelia GTP hidroliz ir EF-Tu veiksnio disociacij i ribosomos. GTP hidroliz vyksta ribosomos 50Ssubvienete, kuriame prijungiamas EF-Tu veiksnio GTPazinis domenas. Taigi, signalas i
30Ssubvieneto apie kodono-antikodono sveik turi bti per ribosom perduotas 50Ssub
vienet. Kaip perduodamas signalas dar nra suprasta. Manoma, kad iame procese svarb
vaidmen galt atlikti tRNR molekul.
vykus GTP hidrolizei ir atsipalaidavus EF-Tu, aminoacil-tRNR, esanti Asrityje, pasisuka peptidiltransferazs centro pus ir idstoma (angl. accommodation) arti peptidil-tRNR (7.19pav.).
Didiajame subvienete taip pat vyksta erdviniai pokyiai, dl kuri peptidil-tRNR idstoma
peptidinio ryio sudarymui. tRNR molekuli 5CCA3 galai sudaro Votsono-Kriko poras su
23SrRNR kilp konservatyviais nukleotidais.
7.4.5. Peptidinio ryio susidarymas

Kitas elongacijos ingsnis yra peptidinio ryio susidarymas. Aktyvumas, dl kurio susidaro
peptidinis ryys, yra vadinamas peptidiltransferaziniu aktyvumu. Peptidiltransferaziniu aktyvumu pasiymi didiojo ribosomos subvieneto sritis, kuri sudaro konservatyvs rRNR elementai. Peptidinio ryio susidarymas yra pagrindin chemin reakcija baltym biosintezs metu.
iai reakcijai tiesiogiai nereikia energijos (pvz., ATP).
Aminoacil-tRNR yra idstoma ribosomos Asrityje taip, kad jos aminorgties aminogrup (nukleofilas) gali atakuoti esterio tarp tRNR molekuls ir polipeptidins grandins karbonilgrups Catom (7.21pav.). Vyksta esterinio ryio aminoliz. Svarbu pastebti: kai Asritis
380
nra uimta aminoacil-tRNR, aplinkoje esanios vandens molekuls gali hidrolizuoti esterin
ry tarp tRNR ir peptido (Pcentre). Tyrimais parodyta, kad 23SrRNR struktros komponentai
trukdo prieiti vandens molekulms prie peptidil-tRNR.
Peptidinio ryio susidarymo mechanizmas buvo nustatytas panaudojant kit antibiotik
puromicin. Puromicinas stabdo baltym biosintez. is junginys savo struktra labai panaus
aminorgties, prijungtos prie tRNR molekuls 3gale esanio adenozino, struktr. Skirtumas tik tas, kad puromicino molekulje yra ne deguonies atomas, jungiantis aminorgt su
tRNR, bet azoto atomas (7.22pav.).
7.21 pav. Peptidinio ryio susidarymas ribosomoje
7.22pav. Puromicino (a) ir aminorgties (b), prijungt prie aminoacil-tRNR, struktros
381
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Kai puromicinas pakliva ribosom, Asrityje jis atpastamas kaip aminoacil-tRNR, ir kitame elongacijos ciklo ingsnyje susidaro peptidinis ryys: polipeptidas i ribosomos Psrities
perkeliamas ir jungiamas prie puromicino NH2grups. Susidaro peptidilpuromicinas. Taigi, i
reakcija imituoja pirmojo peptidinio ryio ribosomoje susidarym. Peptidilpuromicinas greitai
disocijuoja i ribosomos, o tolesn sintez stabdoma.
Antibiotikai yra maos (~1000Da molekulins mass) molekuls, kurios veikia bakterijas ir grybus bakteriostatikai (slopina augim) arba bakteriocidikai (sukelia t). Daugelis antibiotik stabdo
bakterij ribosomose vykstani transliacij (7.2lentel). Vieni antibiotikai prisijungia prie ribosomos,
kiti prie transliacijos veiksni ir slopina j funkcijas. Antibiotik taikiniai ribosomose yra funkcikai
svarbs jos centrai: pvz., peptidiltransferazinis centras, G veiksni suriimo centras, peptido ijimo
tunelis didiajame ribosomos subvienete. Pastaraisiais metais struktrine ribosom analize iaikintas
daugelio antibiotik veikimo mechanizmas.
7.2lentel. Kai kurie baltym biosintezs slopikliai
Baltym biosintezs slopiklis
Organizmas
Veikimas
Kasugamicinas
Prokariotai
Stabdo f-Met-tRNRfMet prisijungim
Streptomicinas
Prokariotai
Neleidia susidaryti iniciacijos kompleksui
Iniciacijos etapas
Elongacijos etapas: aminoacil-tRNR prijungimas

Tetraciklinas
Prokariotai
Stabdo aminoacil-tRNR prisijungim ribosomos

Asrityje
Streptomicinas
Prokariotai
Lemia netiksl ikodavim (prijungiama neteisinga aminorgtis)
Elongacijos etapas: peptidinio ryio susidarymas

Sparsomicinas
Prokariotai
Slopina peptidiltransferazin aktyvum
Chloramfenikolas
Prokariotai
Eritromicinas
Prokariotai
Cikloheksimidas
Eukariotai
Slopina peptidil-tRNR perstmim
Fusidin rgtis
Stabdo EF-G ir GDP disociacij i ribosomos
Tiostreptonas
Prokariotai
Stabdo EF-Tu ir EF-G GTPazin aktyvum, kur

stimuliuoja ribosoma
Difterijos toksinas
Eukariotai
Iaktyvina eEF2 veiksn, j ADP-ribozilindamas
Aminoacil-tRNR analogas, kuris stabdo tolesn

peptidins grandins sintez
Elongacijos etapas: perstmimas
Prielaikin terminacija
Puromicinas
7.4.6. Ribosomos peptidiltransferazinis aktyvumas

Gan ilg laik egzistavo hipotez, kad 50Sribosomos subvienete esanti 23SrRNR molekul
gali katalizuoti peptidiltransferazin reakcij. Paalinus Kpeptidaze ir detergentu (natrio dode-
382
7.23pav. Peptidinio ryio susidarymas archjos Haloarcula marismortui ribosomos 50Ssubvienete

(a) ir hipotetinis reakcijos mechanizmas (b) (Molecular Cell, v.26, p.311, 2007)
cilsulfatu) i 50Sribosomos subvieneto beveik visus (80%) baltymus, likusi 23SrRNR molekul
sugebdavo tiesa, labai neveiksmingai katalizuoti peptidinio ryio susidarym tarp substrat, kuri buvo reakcijos miinyje.
Pastarj deimtmet gauta archjos Haloarcula marismortui ir bakterijos Deinococcus radiodurans ribosom 50Ssubvieneto ir kai kuri cheminiu bdu susintetint ribosomos substrat
bei produkt analog kristalai ir atlikta j rentgenostruktrin analiz. Pavyko nustatyti tarpinio reakcijos produkto analogo vadinamojo Jaruso slopiklio1 (angl. Yarus inhibitor), prisijungusio ribosomos didiajame subvienete, erdvin struktr. Jaruso slopiklis yra C-C-dA-fosforoamido puromicinas. Jis prisijungia prie ribosomos Air Psrii ir stabdo baltym biosintez.
Buvo nustatyta, kad toje 50Ssubvieneto vietoje, kur ribosomoje turt vykti peptidinio ryio
susidarymas, aplink reakcijoje dalyvaujanias aminorgtis 18 atstumu nra joki baltym,
vien tik 23SrRNR molekuls atomai.
Tomas Steicas su bendradarbiais, remdamiesi iais duomenimis, pasil ribosomos peptidiltransferazinio centro model (7.23pav., a). Pagal model, substrat tRNR molekuli
3galai 50Ssubvieneto Air Psrityse yra tiksliai idstomi jiems sveikaujant su 23SrRNR konservatyviosiomis Air Pkilpomis. Labai svarbi katalizei yra ir peptidil-tRNR 2OH grup ji dalyvauja greitinant proton judjim (angl. shuttle) reakcijos metu. Manoma, kad 2OH grup
gauna proton i NH2grups, ir vliau atiduoda proton nueinaniosios tRNR molekuls 3OH
grupei (7.23pav., b).
Taigi, remiantis iais eksperimentais, galima manyti, kad nors rRNR galbt tiesiogiai ir nedalyvauja katalizuojant peptidiltransferazin reakcij, taiau ji atlieka nepaprastai svarb struktrin vaidmen, suartindama ir tiksliai idstydama reakcijoje peptidiltransferaziniame centre
dalyvaujanius substratus.
Junginio pavadinimas kils nuo j susintetinusio Maiklo Jaruso (Michael Yarus) pavards.
383
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Peptidiltransferazin reakcija vyksta panaiu greiiu tiek esant 50Sribosomos subvienetui,

tiek pilnos struktros 70Sribosomai. Substrat isidstymas abiem atvejais taip pat yra panaus. Susidarius peptidiniam ryiui ribosomoje vyksta ie procesai:
zz deacilinta tRNR paalinama i ribosomos Psrities;
zz peptidil-tRNR, pailgjusi viena aminorgtimi, perkeliama i Asrities Psrit;
zz iRNR pasistumia tiksliai per vien kodon priek ribosomos atvilgiu, kad kitas kodonas
isidstyt Asrityje.
Susidarius peptidiniam ryiui, ribosomos 30Ssubvienetas pasisuka 50Ssubvieneto atvilgiu,
todl tRNR molekuls isidsto tarp PirE bei AirPsrii atsiduria tarpinse padtyse (angl.
hybrid state). Tokiose padtyse esani tRNR antikodonai atsiduria vienoje ribosomos srityje, o
akceptoriniai stiebai kitoje (7.24pav.). Tai vyksta dar iki prisijungiant transliacijos EF-G veiksniui.
7.4.7. Perstmimas
Deacilinta tRNR iki kito elongacijos ciklo pradios turi bti paalinta i ribosomos, o peptidiltRNR perkelta i Asrities Psrit, kartu persistumiant iRNR molekulei ribosomos atvilgiu tiksliai per vien kodon. is ingsnis yra paskutinis elongacijos cikle ir vadinamas perstmimu.
Perstmime dalyvauja kitas elongacijos veiksnys nuo ribosomos priklausoma EF-G GTPaz.
Kaip ir EF-Tu veiksnys, EF-G veiksnys prijungia GTP. Prisijungus EF-G ir GTP kompleksui prie ribosomos, vyksta GTP hidroliz. Ribosomos didiojo subvieneto tRNR molekuli antikodonai juda 30Ssubvienete: deacilintos tRNR antikodonas Esrit, o peptidil-tRNR antikodonas Psrit (7.24pav.).
7.24pav. Perstmimas ribosomoje dalyvaujant EF-G veiksniui. Peptidinio ryio susidarymas (a); ribosomos 30Ssubvienetas pasisuka, tRNR molekuls uima tarpines padtis (b); EF-G veiksnio prisijungimas ir GTP hidroliz (c); ribosoma grta pirmin padt, EF-G disocijuoja (d, e); 30Ssubvieneto padties
kitimas ribosomoje per elongacijos cikl (f ) (Nature, v.461, p.1234, 2009)
384
30Ssubvienetas pasisuka 50Ssubvieneto atvilgiu apie 6. Tada disocijuoja EF-G. Taigi per elongacijos cikl ribosomos 30Ssuvienetas juda 50Ssubvieneto atvilgiu lyg strekt (angl. ratchet).
Ilgai manyta, kad nuo EF-G priklausomos GTP hidrolizs reikia btent perstmimui. Taiau
pakeitus GTP nehidrolizuojamu jo analogu, ribosomoje vyko vienas perstmimo ingsnis, tiesa,
liau nei prastai. Tai paliudijo, kad perstmimo procesui GTP hidrolizs nereikia. Manoma, kad
GTP hidroliz reikalinga EF-G disociacijai i ribosomos. EF-Tu ir EF-G veiksniai konkuruoja tarpusavyje dl prisijungimo tame paiame ribosomos GTPazs centre. EF-G bei EF-Tu su GTP ir aminoacil-tRNR kompleks erdvins struktros yra labai panaios. EF-G disociacija tuoj po GTP hidrolizs
btina, kad galt prasidti kitas elongacijos ciklas, kurio pirmame ingsnyje reikia EF-Tu.
Kiekvienai polipeptidin grandin jungtai naujai aminorgiai yra hidrolizuojama po dvi
GTP molekules: viena prisijungus aminoacil-tRNR molekulei, o kita perstmimo metu.
Dar du ATP fosfoanhidridiniai ryiai suskaldomi prijungiant aminorgt prie tRNR (aktyvinant tRNR). Tokiu bdu vienam elongacijos ciklui vykti ir prijungti vien aminorgt prie
polipeptidins grandins suskaldomi i viso keturi fosfoanhidridiniai ryiai.
Elongacijos veiksniai EF-G ir EF-Tu yra Gbaltymai, j sveika su ribosoma yra susijusi su GTP prijungimu ir hidrolize. Kaip ir dauguma Gbaltym, ie veiksniai patys pasiymi nedideliu GTPaziniu aktyvumu. EFveiksni GTPazin aktyvum stimuliuoja ribosomos didiojo 50Ssubvieneto sritis vadinamasis
GTPazs centras (angl. GTPase center). ioje srityje GTPazini veiksni aktyvumui stimuliuoti svarbi
sveika tarp ribosomos baltymoL11 ir konservatyvios 23SrRNR nukleotid srities tarp 10511108 nt.
Pastarasis rRNR ir baltymo kompleksas yra vienas geriausiai itirt. kompleks atpasta tiazoliniai
antibiotikai tiostreptonas ir mikrokocinas. Tiostreptonas negrtamai prisijungia prie ios srities ir
stabdo GTP hidroliz, kuri vykdo EF-G. Mikrokocinas prisijungia prie to paties komplekso ir stimuliuoja GTP hidroliz. Dar vienas antibiotikas viomicinas nestabdo GTP hidrolizs, bet stabdo tuoj
po hidrolizs vykstant perstmim. Fusidin rgtis nestabdo GTP hidrolizs ir perstmimo, taiau
neleidia atsipalaiduoti EF-G ir GDP.
Anksiau aptarme polipeptidins grandins sintezs ypatumus bakterijose. Eukariotinje

lstelje esminiai per transliacij vykstantys procesai yra panas, taiau transliacijos veiksni
yra daug daugiau, o transliacijos iniciacijos etapas kur kas sudtingesnis. Reikia pastebti,
kad archjose transliacijos elongacijos etapas iek tiek skiriasi nuo prokariot ir eukariot, nes
deacilintos tRNR atsipalaidavimui i ribosomos Esrities reikia ne GTP, bet ATP hidrolizs, kuri
vykdo aEF3 veiksnys (r. 7.3lentel).
7.4.8. Transliacijos terminacija

Peptido sintez vyksta tol, kol ribosoma nepasiekia terminacijos kodono iRNR molekulje.
Kai susidaro peptidinis ryys, peptidil-tRNR yra perkeliama i ribosomos Asrities Psrit. Kai
Asrityje atsiduria iRNR molekuls STOP kodonas (UGA, UAG arba UAA), j tikrina EF-Tu, GTP
ir aminoacil-tRNR kompleksas, taiau neskmingai, nes trksta aminoacil-RNR, kurios kodonas
bt komplementarus vienam i terminacijos kodon (iskyrus jau aptartas supresorines tRNR
ir selenocisteino tRNR). iuos kodonus atpasta ir prie j prisijungia terminacijos veiksniai, kitaip paleidimo veiksniai, RF (angl. release factors) (7.25pav.).
385
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Prokariot ir eukariot paleidimo veiksniai skirstomi Iir IIklases:

zz Iklass paleidimo veiksniai prisijungia prie STOP kodon iRNR;
zz IIklass paleidimo veiksniai paalina Iklass paleidimo veiksnius.
Bakterijose Iklass paleidimo veiksniai yra du: RF-1 ir RF-2. UAA (ochre) STOP kodon atpasta abu veiksniai, UAG (amber) kodon RF-1veiksnys, UGA (opal) kodon RF-2veiksnys. Eukariotuose vienas paleidimo veiksnys eRF1 atpasta visus iuos STOP kodonus. Prokariot ir eukariot paleidimo veiksni struktra primena aminoacil-tRNR molekuli struktr
(7.26pav.).
RF-1veiksnys turi aminorgi motyv tripeptid PXT (P prolinas, T treoninas, X bet
kuri aminorgtis), o RF-2veiksnys tripeptid SPF (S serinas, F fenilalaninas). Rentgenos-
7.25pav. Transliacijos terminacijos bakterijose schema
386
truktrine analize parodyta, kad RF-2veiksnio SPFmotyvas yra ribosomoje arti STOP kodono
(7.27pav., b). Kita RF-2veiksnio sritis, kurioje yra tripeptidas GGQ, yra arti peptidiltransferazs
centro.
Siloma, kad paleidimo veiksnio motyv, esani arti STOP kodono, aminorgtys sveikauja su pirmaisiais dviem kodono nukleotidais. I klass paleidimo veiksniai keiia A srityje
ikodavimo centre esani 16SrRNR heterociklini bazi G530, A1492 ir A1493 (E.coli) konformacij. Heterociklini bazi pokyiai yra kitokie nei tie, kurie vyksta susidarant komple-
7.26pav. Prokariot ir eukariot kai kuri transliacijos veiksni erdvins struktros. Baltym domenai, pasiymintys panaumu tRNR, parodyti (Cell, v.108, p.557, 2002)
7.27pav. Transliacijos terminacija bakterijose. Peptidiltransferazins ir terminacijos reakcij palyginimas (a); paleidimo RF-2 veiksnio isidstymas ribosomoje. Parodyti baltymo GGQ ir SPF motyvai (b)
(Nature, v.454, p.852, 2008)
387
MOLEKULIN BIOLOGIJA
mentariai kodono ir antikodono sveikai ikodavimo metu. Kai ribosomos A srityje susidaro
70Sribosomos ir RF-1 arba 70Sribosomos ir RF-2 kompleksas, hidrolizuojamas esteris, esantis
peptidil-tRNR molekulje, ir atsipalaiduoja susintetintas polipeptidas. I tikrj vyksta peptidinio ryio sudarymas ne su kita aminorgtimi, bet su vandens molekule (7.27pav., b). Hidrolizei
yra svarbus tripeptidas GGQ, esantis abiej paleidimo veiksni sudtyje (7.26pav., a). Tuoj po
hidrolizs RF-1 arba RF-2 veiksnys atpalaiduojami i ribosomos. Atpalaidavimui reikia RF-3 paleidimo veiksnio, kuris yra GTPaz. RF-3 prisijungia prie ribosomos su GDP. Tada GDP keiiamas
GTP, disocijuoja RF-1 arba RF-2 veiksnys, vyksta GTP hidroliz, ir RF-3 paleidiamas i ribosomos (7.25pav.). Ribosoma lieka komplekse su iRNR ir deacilinta tRNR Psrityje. is kompleksas
iardomas taip: prisijungus paleidimo veiksniui RRF ir EF-G elongacijos veiksniui, atsipalaiduoja
50Sribosomos subvienetas. Tam reikia GTP hidrolizs. IF-3 veiksnio reikia atpalaiduoti deacilint tRNR i Psrities.
Atpaindama STOP kodonus ribosoma daro labai maai klaid. Prielaikini polipeptido hidrolizi ties prasminiais, o ne STOP kodonais, t.y. klaid, pasitaiko ne daniau kaip viena per
100000 vyki. Tok didel tikslum, manoma, lemia labai tiksli RFveiksni ir RNR sveika.
Transliacijos tikslumas yra 105104. Kadangi daugelis baltym sintetinami dideliais kiekiais, tokiu daniu padaromos klaidos neturi takos lstels fenotipui. Ribosomai sintetinant
baltymus vyksta dviej tip klaidos. Pirmojo tipo transliacijos klaidos tai rmelio poslinkis
(angl. frameshift), kai ribosoma peroka iRNR per vien nukleotid. Tokio tipo klaidos vyksta
madaug 105 danumu. Antrojo tipo transliacijos klaidos vyksta, kai ribosomai toleruojant nekomplementari kodono ir antikodono sveik jungiama neteisinga aminorgtis. Tokio tipo
klaidos vyksta madaug 5 x 104 danumu. ito tipo klaid danis priklauso nuo ribosomos
struktros ir greiio.
Nors aminoacil-tRNR ir paleidimo veiksni atranka yra labai tiksli, klaid transliacijos metu vis dlto
pasitaiko. J padaugja, kai trksta maisto mediag, streso slygomis. Ikelta hipotez, kad ribosoma
galt jausti jungt neteising aminorgt, nes, jungus toki aminorgt ir vykus peptidil-tRNR
perstmimui ribosomos Psrit, kits aminoacil-tRNR ir paleidimo veiksnio atrankos tikslumas gana
smarkiai sumaja. Todl ribosoma ima daryti daugiau klaid, greiiau vyksta prielaikin terminacija
pasitelkus RF-1 veiksn, ir susintetinamas pakits polipeptidas. Toks polipeptidas, greiiausiai, suardomas peptidazi, o ribosoma gali dalyvauti naujame transliacijos cikle. Tokioje savitoje terminacijoje
dalyvauja ir RF-3 paleidimo veiksnys.
7.5. Baltym biosintez eukariotuose

Dauguma baltym biosintezs proceso eukariotuose bruo panas baltym biosintezs
prokariotuose, taiau kai kurie vykiai vyksta kitaip. Be to, transliacijoje dalyvauja daugiau baltymini veiksni. Eukariot iRNR molekuls yra monocistroniniai (vieno geno) transkriptai ir
yra gerokai ilgesns, nei j koduojami polipeptidai. Vidutinis eukariot iRNR ilgis sudaro apie
10002000 nukleotid. iRNR molekuls turi kepur 5gale ir poli (A) sek 3gale. Netransliuojam iRNR sek 5gale sudaro ~100 nukleotid, o 3gale net iki 1000 nukleotid.
388
Eukariot iRNR transliacija prasideda iniciacija, kai i 40S ir 60Ssubvienet susimontuoja

80Sribosoma, kurioje iniciatorin tRNR (Met-iRNRiMet) idstoma ribosomos Psrityje ties iRNR
iniciacijos kodonu. Eukariot iRNR molekuls neturi sek, panai prokariot aino-Dalgarno
sritis, kurios padeda tiksliai idstyti iniciacijos kodon ribosomos Psrityje.
Per eukariotini iRNR molekuli transliacij svarb vaidmen nustatant iniciacijos kodon
vaidina per brendim modifikuoti iRNR molekuli galai kepurs struktra 5gale ir poli (A)
struktra 3gale.
Pirmoji struktra, kuri atpasta eukariot transliacijos komponentai, yra kepurs struktra, kuri turi visos eukariot branduolio iRNR ir dauguma eukariot virus iRNR. Isamiau
aptarsime iniciacijos proces eukariotuose.
7.5.1. Transliacijos iniciacija

80Sribosomai susimontuoti transliacijos inciacijos metu, kaip ir prokariotuose, reikia baltym iniciacijos veiksni. Eukariotai turi ymiai daugiau transliacijos iniciacijos veiksni nei
archjos ir prokariotai iuo metu j skaiiuojama daugiau nei deimt (7.3lentel).
7.3lentel. Transliacijos iniciacijos veiksniai prokariotuose, eukariotuose ir archjose
Eukariot
veiksniai
Prokariot
veiksniai
Archj
veiksniai
Funkcijos ir savybs
eIF1
IF-3
a-eIF1
Utikrina AUG kodono atpainimo tikslum
eIF1A
IF-1
a-eIF1A
Stimuliuoja Met-tRNRiMet prijungim prie 40Ssubvieneto
a-eIF2
Prijungia Met-tRNRiMet prie 40Ssubvieneto, GTPaz
eIF2
Reguliuojamas fosforilinimu
Prijungia Met-tRNRiMet
Prijungia GTP, Met-tRNRiMet
eIF2B
eIF2 veiksnio guanino nukleotid pakeitimo veiksnys
Prijungia GTP
Prijungia ATP
Prijungia ATP
eIF3
Lemia Met-tRNRiMet ir iRNR prijungim prie 40Ssubvieneto
eIF4A
a-eIF4A
DEAD dut turinti helikaz
eIF4B
Lemia eIF4A aktyvum
eIF4E
Prie kepurs prisijungiantis baltymas
eIF4F
Prie kepurs prisijungiantis kompleksas, kur sudaro eIF 4A, 4E ir 4G veiksniai
eIF4G
Baltymas tarpininkas, sveikaujantis su daugeliu kit baltym
eIF4H
Veiksnys, panaus eIF4B
eIF5
eIF5B
Dalyvauja atpastant AUG ir lemia eIF2 GTPazin aktyvum

IF-2
a-eIF5B
Subvienet susijungimas, prokariotuose prijungia f-Met-tRNRfMet
389
MOLEKULIN BIOLOGIJA
Iniciatorin tRNR eukariotuose yra tRNRiMet. Ji atskiriama nuo tRNRMet dl tam tam tikr
struktrini skirtum. Pvz., mieli tRNRiMet turi savit tretin struktr ir modifikuojama fosforilinant nukleotido, esanio 64 padtyje, ribozs 2OH grup.
Iniciacijos proces sudaro ie etapai:
zz Pirmajame iniciacijos etape montuojantis iniciacijos kompleksui Met-tRNRiMet molekules
prie maojo 40Sribosomos subvieneto prijungia iniciacijos veiksnys eIF2, kuris yra GTP
prijungiantis baltymas. Susidaro stabilus trinaris eIF2, GTP ir Met-tRNRiMet kompleksas
(7.28pav.). Kompleksas kartu su iniciacijos veiksniu eIF3 prisijungia prie maojo 40Sribosomos subvieneto, sudarydami 43S dydio iniciacijos kompleks. Taigi, kitaip nei
prokariot transliacijos iniciacijos metu, trinario komplekso prisijungimui prie ribosomos 40Ssubvieneto iRNR molekuls nereikia.
7.28pav. Transliacijos iniciacijos vykiai eukariotuose
390
zz Toliau 43Siniciacijos kompleksas prisijungia prie iRNR molekuls 5gale esanios kepurs struktros (m7GpppN). Kad iRNR kepur bt atpainta, reikia, kad prie jos prisijungt transliacijos veiksnys eIF4F. Veiksn sudaro trys baltymai:
prie kepurs prisijungiantis baltymas eIF4E;
pastoli baltymas eIF4G, kurio funkcija yra sujungti kitus komplekso baltymus;
nuo RNR priklausoma helikaz eIF4A (turinti DEAD dut ir iskirianti RNR struktras 5gale).
Nra aiku, ar eIF4F susimontuoja iki prisijungiant iRNR ar baltymai atskirai jungiasi prie
iRNR 5galo. Prie iRNR 5galo dar jungiasi eIF4B veiksnys, kuris stimuliuoja eIF4A helikaz.
Poli (A) struktra, esanti iRNR 3gale, skatina iniciacijos komplekso ties 3galu susidarym.
Tam reikia PABP baltymo, kuris atrankiai prisijungia prie 3galo. PABP sveikauja su eIF4G. iRNR
sudaro udar kilp (7.28pav.). Tokios struktros funkcin reikm dar nra gerai suprasta.
Transliacijos eIF4E veiksnys tiesiogiai prisijungia prie kepurs struktros iRNR molekulje
ir, sveikaudamas su eIF4G veiksnio Ngalu, pritraukia prie iRNR eIF4F kompleks. Komplekso
komponentas veiksnys eIF4A, kartu su veiksniais eIF4B ir eIF4H, kurie gali prisijungti prie RNR,
manoma, veikia kaip helikaz ir iardo antrines struktras, susidaranias netoli iRNR 5 galo.
Veiksnio eIF4E aktyvum stimuliuoja fosforilinimas. eIF4E veiksn fosforilina eIF4F baltym kinaz. Taigi, eIF4E veiksnys yra transliacijos iniciacijos valdymo taikinys. Toks pats taikinys yra ir
eIF4G veiksnys, kuris gali bti suardytas (pvz., virusins infekcijos metu).
Kepur 5gale yra molekulinis ymuo, kur atpasta eukariot transliacijos iniciacijoje dalyvaujantys veiksniai. iRNR, kuriose kepur buvo paalinta, in vitro nra veiksmingai transliuojamos (organeli iRNR transliacijai kepurs nereikia). Virus iRNR molekuls taip pat turi modifikuot 5gal, taiau ne visos.
zz Kitame etape 43Skompleksas juda iilgai iRNR srities, vadinamos netransliuojamja sritimi, UTR (angl. untranslated region), kol suranda ATG kodon (daugelyje iRNR jis
bna pirmasis ATG kodonas u kepurs struktros 43Skomplekso kelyje). Manoma, kad
ribosoma skenuoja iRNR. iam procesui reikia ATP hidrolizs. Procese dalyvauja veiksniai
eIF1 ir eIF1A (7.28pav.).
Suradus kodon, susidaro komplementari sveika tarp iniciatorins tRNR antikodono ir iniciacijos kodono. Taiau vien komplementarios sveikos nepakanka, kad ribosoma sustot ties
iniciacijos kodonu. Svarbi yra iRNR molekuls sritis, esanti aplink iniciacijos kodon, dar vadinama Kozak sritimi2. Trys prie iniciacijos kompleks esantys purino nukleotidai ir G nukleotidas
i karto u jo (NNNPuNNAUGG, kur N bet kuris nukleotidas, Pu purinas) padidina transliacijos veiksmingum ~10 kart.
Kas atsitinka, jeigu ribosoma, skenuodama ilg netransliuojamj iRNR srit (toki pasitaiko
neretai), sutinka AUG kodon, kuris nra iniciacijos kodonas? Yra du galimi veikimo bdai. Pirmu atveju, kadangi nukleotidai, supantys AUG kodon, nra tinkami stabdyti 43Skompleks,
jis juda tolyn. Antru atveju, ribosoma gali pradti transliacij, bet sustoti prijusi tikrj iniciacijos kodon ir pradti sintez i naujo.
Srities pavadinimas kils nuo Merilinos Kozak (Marilyn Kozak) vardo.
391
MOLEKULIN BIOLOGIJA
zz Prijs iniciacijos kodon ir ties juo prisijungs, maasis ribosomos subvienetas kartu su
iniciacijos veiksniais sudaro 48Siniciacijos kompleks. Iniciacijos veiksniai turi bti paalinti prie susimontuojant 40S, iRNR ir Met-tRNRi kompleksui su 60Sribosomos subvienetu. Iniciacijos veiksniams disocijuoti ir 60Sribosomos subvienetui prijungti reikia GTP
hidrolizs. Pakeitus GTP nehidrolizuojamu GTP analogu, iniciacija stabdoma susidarius
48Siniciacijos kompleksui.
GTP, prisijungusio prie eIF2 veiksnio, hidroliz aktyvina eIF5 veiksnys, atrankiai sveikaujantis su eIF2 ir eIF3 veiksniais. eIF5 stipriai prisijungia prie eIF2, taiau indukuoja GTP hidroliz tik
tada, kai eIF2 yra prisijungs prie 40Ssubvieneto. vykus GTP hidrolizei, eIF2-GDP kompleksas
disocijuoja. Manoma, kad GTP hidroliz vyksta tuojau pat, kai 48Spreiniciacijos kompleksas,
skenuodamas iRNR, randa iniciacijos kodon, ir susidaro kodono-antikodono sveika.
Tokiu bdu eukariotuose iniciacijos metu yra hidrolizuojamos dvi GTP molekuls: viena
eIF2 veiksnio, o kita eIF5B. Prokariotuose iniciacijos metu IF-2 veiksnys hidrolizuoja vien GTP
molekul.
Eukariot iRNR 5ir 3gal struktros kepur ir poli
(A) kartu stimuliuoja transliacijos veiksmingum.
Susijungus didiajam ir maaTransliacij eukariotuose valdo daugelis veiksni. Pvz.,
jam ribosomos subvienetams,
hormonai j stimuliuoja, o vairios stresins slygos, pvz.,
iniciacijos veiksnys eIF5B hidrobadavimas, temperatrinis okas, oksidacinis okas, stabdo
lizuoja GTP ir yra paleidiamas
baltym biosintez. Transliacijos iniciacija valdoma, kaip
nuo 80Sribosomos.
minta, ir fosforilinant kai kuriuos transkripcijos veiksnius.
7.5.2. IRES sritys ir j ypatumai

Daugelio eukariot transliacijos iniciacija vyksta transliacijos preiniciacijos kompleksui
(43S) skenuojant iRNR. Taiau egzistuoja ir kitoki transliacijos iniciacijos bd. Jie 1988m. aptikti tiriant pikorna virus iRNR transliacij, vliau nustatyti ir lsteli iRNR. 43Spreiniciacijos
kompleksas i karto jungiasi prie iRNR molekuls srities IRES (angl. internal ribosome entry site),
kuri yra netoli iniciacijos kodono AUG (7.29 pav.). Vykstant transliacijos iniciacijai iuo bdu
nra svarbi iRNR kepurs struktra 5gale ir 3galo struktra.
IRES sritys iRNR sudaro savit antrin struktr, prie kurios jungiasi transliacijos preiniciacijos kompleksas. Mutacijos net vieno nukleotido pakaitos daro didel tak srii akty-
7.29 pav. Nuo IRES priklausoma transliacijos iniciacija
392
vumui smarkiai didina arba maina gebjim inicijuoti transliacij. IRES srii atpainimui ir
jungimuisi prie j reikia savit veiksni ITAF (angl. IRES trans-acting factors) (7.29pav.).
IRES sritys nustatomos tik pagal j funkcionavim numatyti IRES sritis iRNR yra gana sudtinga, jos nepasiymi konservatyvumu (iskyrus gimining virus iRNR).
Pagal tai, kokiu mechanizmu IRES sritys traukia ribosom, iskiriamos kelios j grups. Ypating IRES srit turi hepatito Cviruso iRNR. Ties ja i karto prisijungia 40Sribosomos subvienetas, jungimuisi nereikia joki iniciacijos veiksni. Iniciacija vyksta kitaip nei kit eukariot iRNR.
7.6. Poliribosomos
Daugelio baltym sintez vidutinikai trunka nuo keli sekundi iki keli minui. Bet netgi
iuo labai trumpu tarpsniu ties viena iRNR molekule vyksta daug transliacijos iniciacijos vyki.
Tuoj po to, kai pirmoji ribosoma palieka iniciacijos kodon, ties iRNR 5galu prisijungia kita. Pasitelkus vaizdinimo metodus transliuojamos iRNR molekuls matomos kaip poliribosomos dideli
iRNR ir ribosom kompleksai, kuriuose ribosomos isidsiusios madaug kas 80 iRNR nukleotid
(7.30pav.). Poliribosomose sintetinama ymiai daugiau baltymo molekuli. Tiek eukariotuose,
tiek prokariotuose baltym biosintez vyksta poliribosomose. Bakterijose baltym biosintez
vyksta dar greiiau, nes ribosomos jungiasi ties iRNR 5galu, dar nepasibaigus jo transkripcijai.
Eukariotuose transliacijos veiksmingumo problema sprendiama kitaip: iRNR molekuls
3ir 5galai, kaip minta, yra priartinami vienas prie kito sveikaujant su jais savitiesiems baltymams, tarp kuri yra ir transliacijos veiksniai. Taigi, iRNR transliacij ribosoma baigia arti 5galo,
ir ia gali vykti transliacijos reiniciacija.
7.30pav. Transliacijos eukariot poliribosomose schema (a) ir elektronine mikroskopija gautas

poliribosom vaizdas (b) (B. Alberts, A., Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter. The Molecular
Biology of the Cell, fifth edition, 2007)
393
MOLEKULIN BIOLOGIJA
7.31pav. Nevisaveri baltym sintezs kontrol bakterijose dalyvaujant tmRNR
394
7.7. Transliacijos tikslumo valdymo bdai

Ribosom vykdoma transliacija lstelse yra optimalus procesas atsivelgiant aminorgi jungimo greit ir sintezs tikslum. Klaidos sintetinant madaug 20 aminorgi per
sekund (bakterijose) padaromos vien kart per 10 000 aminorgi jungim. Bakterijos,
kuriose mutacij bdu modifikavus maj ribosomos subvienet padidjo transliacijos tikslumas, nebuvo pranaess u laukinio tipo bakterijas: atvirkiai, baltym sintez iose bakterijose taip sultdavo, kad jos vos igyvendavo.
Klaid taisymas ribosomoje brangiai kainuoja: bakterijose kiekvienai aminorgiai prijungti yra suskaldomi keturi didiaenergiai ryiai, todl kiekvien kart, kai tRNR su neteisingai
prijungta aminorgtimi patenka ribosom, vyksta GTP hidroliz.
Kita kokybs kontrol vyksta ne baltymo lygmenyje, bet iRNR lygmenyje. Prie transliacij
vyksta tikrinimas, ar iRNR molekul yra susintetinta ir subrendusi. Transliuoti degradavusias ar
nesubrendusias iRNR lstelei yra neekonomika, nes bus sintetinami ir nevisaveriai baltymai.
Eukariot iRNR 3gale esani poli (A) struktr ir 5gale esani kepurs struktr atpasta
transliacijos aparato komponentai, ir tik visikai subrendusios iRNR yra transliuojamos.
Bakterijose kokybs kontrol utikrinama kitaip. Bakterij iRNR molekuls neturi savit
sek 3ir 5galuose. Be to, baltym sintez danai prasideda dar nepasibaigus transkripcijai.
Tarkime, ribosomos pradjo transliuoti iRNR, kuri iki galo dl tam tikr prieasi nebuvo susintetinta, arba molekuls 5galas buvo labai greitai suardytas. Ribosomos, prijusios tokios iRNR
gal, sustoja. Tada savita maa lstels RNR, tmRNR (angl. transfer messenger RNA), prisijungia
ribosomos Asrityje (7.31pav.). tmRNR koduoja nedidel 11 aminorgi polipeptid ir STOP
kodon. Ribosoma transliuoja peptid, ilgindama nebaigt sintetinti ankstesn polipeptid.
Kai polipeptidas paleidiamas i ribosomos, jame esantis tmRNR koduojamas peptidas yra signalas lstels peptidazms suardyti nevisavert baltym.
395
MOLEKULIN BIOLOGIJA

1. Schemoje parodyta viruso Ageno DNR. i DNR koduoja trump viruso peptid. Taip pat
yra parodyta subrendusi io geno iRNR.
Viruso Ageno DNR:
5AGCTCATGTGCGAGTCCTGACGCTGACTAGG3
3TCGAGTACACGCTCAGGACTGCGACTGATCC5
Viruso Ageno subrendusi iRNR:
5G*UCAUGUGCGAACGCUGACUAGGAAAAAAAA....3 (G* G kepurs struktra)

a) Uraykite Ageno introno sek.

b) A
geno iRNR yra nukleotid, kurie nekoduojami geno DNR. vardykite procesus, dl
kuri jie atsirado iRNR.
c) Kokia yra Ageno koduojamo peptido aminorgi seka?
2. Genetinis kodas yra isigims. Pasinaudodami genetiniu kodu (7.1pav.) uraykite visas
manomas iRNR sekas, kurios koduoja iuos peptidus:

a) Met-Asn-Ser;
b) Tyr-Glu-Trp.
3. Kodl antibiotikai veikia bakterij ribosomas, bet neveikia eukariot ribosom? Ar visada taip yra?
4. Js kolega yra skeptikas ir netiki, kad ribosoma gali bti ribozimas. Ivardykite eksperimentais pagrstus faktus, paremianius i hipotez.
5. Suskaiiuokite, kiek ATP ir GTP molekuli reiks norint lstelje susintetinti penki aminorgi liekan peptid i laisv aminorgi. Trumpai pagrskite atsakym.
6. Pasinaudodami genetiniu kodu vienaraidiais simboliais uraykite polipeptid (nuo
START kodono iki STOP kodono), kur koduoja iRNR ir kurios seka yra tokia:

396
5CCCUGCGAUGUAUGAACUGGUGAUUAGCCUAAUAGUUGAGAGAGUUGAGAGUUGAUAGGCG3
REKOMENDUOJAMOS LITERATROS SRAAS

AlbertsB., BrayD., HopkinK., JohnsonA.D., JohnsonA. etal. Essential Cell Biology, fourth edition, Garland
Publishing, New York, 2014.
Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. The Molecular Biology of The Cell, fifth edition,
Garland Publishing, New York, 2007.
AllisonL.A. Fundamental Molecular Biology, second edition, John Wiley&Sons, 2012.
BergJ.M., TymoczkoJ.L., StryerL. Biochemistry, seventh edition, W.H.Freeman&Company, 2012.
KarpG. Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments, fifth edition, John Wiley&Sons, 2008.
KarpG. Cell Biology, sixth edition, John Wiley&Sons, 2010.
KrebsJ.E., GoldsteinE.S., KilpatrickS.T. Lewins Genes XI, Jones&Bartlett Learning, 2014.
NelsonD.L., CoxM.C. Lehninger Principles of Biochemistry, sixth edition, W. H. Freeman & Company, 2012.
PollardT.D., EarnshawW.C., Lippincott-SchwartzJ. Cell Biology, second edition, Sounders Elsevier, 2007.
Watson J. D., BakerT. A., Bell S. P., Gann A., Levine M., Losick R. Molecular Biology of the Gene, seventh
edition, Benjamin Cummings, 2013.
WeaverR.F. Molecular iology, fifth edition, McGraw-Hill, 2012.
397
DALYKIN RODYKL
35egzonukleaz, 161
35egzoribonukleaz, 303
3splaisingo sritis, 308
53egzonukleaz, 165
53egzoribonukleaz, 303
amanitinas, 249
spiral, 91
galaktozidaz, 226
juosta, 95
laktas, 95
struktra, 95
replikacija, 212
kampas, 83
kampas, 83
A
A minorinis motyvas, 66, 368
Areplikacijos baltymas, 197
Adenilato ciklaz, 278
Adenilato liekana, 321, 323
Adenovirusas, 216
replikacija, 216
Ago baltymai, 293
Akceptorinis stiebas, 60
Aktyviklis, 268, 272, 273
Alarmonas, 284
Alosterinis valdymas, 277
Alternatyvioji splaisosoma, 334
Alternatyvusis splaisingas, 342
mechanizmai, 343
splaisingo veiksniai, 336
heterologiniai branduolio baltymai,
hnRNP, 336
SR baltymai, 336
Alternatyvusis telomer ilginimas, 227
Amidin grup, 82
Amidinis ryys, 80
Aminoacil-tRNR, 360
398
aminoacil-tRNR sintetaz, 360

Aminogrup, 77
Aminoliz, 381
Aminorgtis, 77
aminorgties aktyvinimas, 360
D-aminorgtis, 77
klasifikacija, 85
kodonai, 355
L-aminorgtis, 77
savybs, 84
struktra, 76
transliacija, 360
AMPA receptorius, 347
Anfinseno dogma, 101
Anhidridinis ryys, 25
Antikodonas, 60, 358
antikodono kilpa, 60
antikodono stiebas, 60
nevienareikmje sveikoje, 359
isidstymas ribosomoje, 368
ikodavime, 365
perkodavime, 357
Antiterminacija, 241
ApolipoproteinasB, 346
Apoptoz, 217
Aptameras
DNR kvadrupleksuose, 45
ribojungiklyje, 71
Archjos, 18
ARS elementas, 205
Ateniuatorius, 279
Atsako elementas, 205
Atsitiktin grandin, 86
Atvirasis skaitymo rmelis, 354
Atvirasis transkripcijos kompleksas, 238
Atvirktin giraz, 53
Atvirktin transkriptaz
DNR polimerazi eim klasifikacijoje, 164
retrovirus DNR sintezje, 14
telomerazje, 222
Augalo lstel, 20
Autogeninis valdymas, 279

Autoradiografija, 151
Autosplaisingas, 319
I grups intron, 321
II grups intron, 323
B
Bakterijos
kaip modelinis organizmas, 17
nukleoidas, 145
replikacija, 165
RNR brendimas, 302
transkripcija, 233
transliacija, 371
Bakteriofagai
bakteriofagas , 271, 283,
bakteriofagas 29, 216
bakteriofagas X174, 29, 46, 209
bakteriofagas T4, 173, 215
bakteriofagas T7, 156, 215
kaip modeliniai organizmai, 18
Baltym struktra
antrin struktra, 91
spiral, 91
protofibril, 93
protofilamentas, 93
superspiral, 93
juosta, struktra, laktas, 95
kilpa, 97
omega () kilpa, 97
linkis, 97
ketvirtin struktra, 104
oligomeras, 104
subvienetai, 104
pirmin struktra, 89
superantrin struktra, 98
motyvai, 98
plauk segtuko, 99
beta-alfa-beta, 99
cinko pirto, 289
EF rankos, 99
klosts, 99
globino klost, 100
Rosmano klost, 100
graik rakto, 99
homeodomeno, 290
leucino utrauktuko, 292
spirals-kilpos-spirals, 98
tretin struktra, 100
domenai, 103
Bazin transkripcija, 260
Bazi pora, 35
Beta galaktozidaz, 226
Biotechnologija, 15
Blokuotasis skaitymo rmelis, 335
Branduollis, 251
branduollio organizavimo sritys, NOR, 250
maos branduollio RNR, snoRNR, 315
Branduolys
branduolio dm, 342
branduolio lamina, 138
branduolio pastoliai, 135
branduolio upildo prisijungimo sritys, 138
Bromodomenas, 129
C
C kiekio paradoksas, 73
CBC baltym kompleksas, 327
C/D dut, 317
Cdc6baltymas, 207
CDK kinazs, 208
Cdt1baltymas, 207
Centromera, 134
histon variantai centromeroje, 118
Chiralikumas, 77
chiralinis atomas, 77
Chromatinas, 109
10nm chromatino silas, 111, 130
30nm chromatino silas, 131
chromatid, 134
chromatino kilpos, 134
chromatino pertvarka, 141
399
chromatosoma, 112
euchromatinas, 109
heterochromatinas
fakultatyvusis chromatinas, 123
konstitutyvusis chromatinas, 123
Chromatin pertvarkantys baltym
kompleksai, 141
Chromatino imunoprecipitacija, 121
Chromatino sekoskaita, 121
Chromodomenas, 129
Ciklinis AMP, cAMP, 277
cis veikianios sekos
replikatoriuje, 193
trankripcijos valdyme, 272
Citrulinas, 125
CRP baltymas, 277
CstFveiksnys, 329
CTD domenas, 266
fosforilinimas, 268
funkcijos RNR brendime, 217
funkcijos transkripcijoje, 269
heptadinis pasikartojimas, 267
struktra, 267
Cviterjonas, 79
argrafo taisykls, 29
D
D-riboz, 23
Daltonas, 81
DAPI daas, 37
Daugiabaltyminis kompleksas, 107
Daugiasubvienetini RNR polimerazi
eima,232
de novo sintez, 156
Deaminazs
adenozino deaminazs, 348
ADAR deaminazs, 348
ADAT deaminazs, 348
400
citidino deaminazs, 346

Denatracija, 101
Deoksiribonukleazs
I deoksiribonukleaz, DNaz I, 238
mikrokok nukleaz, 147
replikacijoje dalyvaujanios (eukariot)
Dna2 endonukleaz, 203
FEN1endonukleaz, 203
Deoksiribonukleorgtis, 24
Deubikvitilaz, 125
DExD/H helikazs, 339
Diastereoizomerai, 77
Dihidrouridinas, 60
Diskerinas, 318, 226
Disulfidinis tiltelis, 89
DNRligaz, 189
funkcijos, 189
katalizuojama reakcija, 190
DNR antrin struktra, 28
Gkvadrupleksas, 44
kryiaus formos DNR, 41
paslinktoji DNR, 43
triguba spiral, 41
DNR grandin
dukterin, 148
motinin, 148
DNR grioviai
didysis griovys, 35
maasis griovys, 35
DNR jungtukas (jungties DNR), 130
DNR paaid perjimas, TLS, 168
DNR polimeraz, 154
aktyvusis centras, 158
bakterij, 165
I polimeraz (DNR Pol I), 165
IIpolimeraz (DNR Pol II), 166
IIIpolimeraz (DNR Pol III), 169
IVpolimeraz (DNR Pol IV), 164
Vpolimeraz (DNR Pol V), 164
DNR EP polimerazs, 168
Klenovo fragmentas, 165
eukariot, 199
polimeraz-praimaz, 196
DNR polimeraz, 200

DNR polimeraz, 200
DNR polimeraz, 199
DNR polimeraz, 199
TLS polimerazs, 200
funkcijos, 154
klaid taisymas, 159
tikslumo lygmenys, 158
struktra, 162
DNR pirmin struktra, 23
DNR replikacija
dvikrypt, 151
eukariotuose, 195
kiti inomi replikacijos bdai, 208
mechanizmo iaikinimas, 148
prokariotuose, 165
pusiaukonservatyvioji, 148
trombono modelis, 177
vienkrypt, 151
DNR spiral, 34
A formos spiral, 37
B formos spiral, 34
Z formos spiral, 40
DNR superspiralizacija, 46
plektonemin, 50
sankibos laipsnis, 48
superspiralikumo laipsnis, 48
ski skaiius, 48
toroidin, 50
DNR topoizomerazs, 52
I tipo topoizomerazs, 53
II tipo topoizomerazs, 54
DNR giraz, 54
DNR tretin struktra, 46
DNR katenanai, 55
DNR mazgai, 55
superspiralizuota DNR, 46
Domenas
baltym, 103
rRNR, 64
E
Editosoma, 346
Egzonas, 307
egzono alinimas, 343
egzon nustatymas, 338
paplitimas, 331
splaising valdanios sekos, 332
egzoninis splaisingo slopiklis, 334
egzoninis splaisingo stipriklis, 334
Egzoribonukleazs
deoksiribonukleazs, 238
ribonukleazs, 303
eksportinas5, 294
eksportinast, 313
Elongacija
replikacijoje, 189
transkripcijoje, 238
transliacijoje, 377
elongacijos ciklas, 377
Enantiomerai, 77
Epigenetinis paveldimumas, 128
Episoma, 167
Esterinio ryio aminoliz, 380
Etidio bromido daas, 50
F
Fibriliniai baltymai, 100
Filogenetin analiz, 63
Fosfodiesterinis ryys, 27
Fosforilgrup, 24
G
G kvadrupleksas, 44
funkcijos, 45
panaudojimas terapijoje, 46
struktra, 44
Galin uridililtransferaz, TUTaz, 349
Gamtin baltymo struktra, 100
401
Gemininas, 208
Genas, 271
kriptogenas, 348
pseudogenas, 74
reguliatoriaus genas, 271
struktrinis genas, 272
Genetinis kodas, 353
iaikinimas, 354
ikodavimas ribosomoje, 379
kodonai, 353, 355
savybs, 355
Genominis nestabilumas, 43, 226
GINS baltym kompleksas, 208
Giraz, 54
Gyvn lstel, 19
Glikozidinis ryys
-N-glikozidinis ryys, 25
konformacijos, 33
anti konformacija, 33
sin konformacija, 33
Gliukokortikoido receptorius, 288
Globino klost, 100
Globuliniai baltymai, 100
Grietasis atsakas, 284
gRNR, 348
Guanililtransferaz, 325
Guanino tetrada, 43
Guanozino kofaktorius, 320
H
H DNR, 41
Haifliko riba, 225
HDV ribozimas, 68
Heptadinis pasikartojimas, 93
Heterochromatinas, 109
Heterociklins bazs, 24
adeninas, 24
citozinas, 24
guaninas, 24
timinas, 24
uracilas, 24
402
Heterociklini bazi sveikos

Hugstyno, 31
Votsono-Kriko, 30
Heterologinis branduolio ribonukleoproteinas,
hnRNP, 336
funkcijos splaisinge, 341
struktra, 336
Histonai, 115
jungties histonas, 112
histon biosintez, 138
histon aperonai, 139
histon klost, 116
histon modifikacijos, 119
acetilinimas, 120
ADP ribozilinimas, 126
biotinilinimas, 127
deimininimas, 125
fosforilinimas, 123
krotonilinimas, 127
metilinimas, 123
prolino izomerizacija, 127
Sumo prijungimas, 125
ubikvitilinimas, 125
histonus modifikuojantys fermentai, 314
acetiltransferaz (HAT), 120
deacetilaz (HDAC), 120
deubikvitilaz, 125
histon demetilaz, 125
metiltransferaz (HMT), 123
mono ADP riboziltransferaz, 126
poli (ADP) polimeraz, 126
histon oktameras, 111
histon variantai, 119
savybs, 115
struktra, 116
erdies histonai, 115
Hoechst daas, 37
Holofermentas
DNR polimerazs, 169
RNR polimerazs, 233
telomerazs, 224
IItopoizomeraz, 196
Iminogrup, 77
Indukcija, 275
Induktorius, 278
Indukuotas atitikimas, 160
Iniciacijos (START) kodonas, 372
Iniciacijos baltymas
besisukanio rato replikacijoje, 208
iniciatorius replikacijoje, 185, 193
Iniciatorin DNR, 197
Iniciatorin tRNR, 371, 374
Iniciatorius
promotoriuose, 259,
replikone, 193
Interkaliacija, 50
Intronai, 331
vairov, 331
kilms teorijos, 332
paplitimas, 331
pre-tRNR intronai, 307
savaime isikerpantys intronai, 319
Igrups, 321
IIgrups, 323
splaisingo cis sekos, 332
egzoninis splaisingo slopiklis, 334
egzoninis splaisingo stipriklis, 334
introninis splaisingo slopiklis, 334
introninis splaisingo stipriklis, 334
akojimosi takas, 333
akojimosi tako seka, 333
polipirimidin ruoas, 333
IRES sritis, 392
iRNR kokybs kontrol, 344
Idstymas, 380
Ikodavimas, 379
ikodavimo centras ribosomoje, 64, 313,
365, 370
Iteronai, 213
Izoakceptorin tRNR, 358
Izoliatorius, 262
Jaruso slopiklis, 383
K
Kajalo kneliai, 319
Kamienins lstels, 20
Karboksigrup, 77
Kampas , 33
Katabolinis slopinimas, 277
Katenanas, 55
Kepur, 325
sintez, 326
struktra, 325
telomer kepurs, 220
vaidmuo brendime, 327
vaidmuo transliacijoje, 389
Kilpa, 59
Kinaz
kinazs CDK, 208
kinaz DDK, 208
Kinetoplastids, 345
Kinetoplasto DNR, 348
koduojami genai, 348
struktrin organizacija, 56
Kintamoji kilpa, 60
Klaid taisymas
DNR polimerazi, 161
aminoacil-tRNR sinteazi, 362
Klenovo fragmentas, 165
karpos transliacijoje, 166
savybs, 165
struktra, 165
Klost, 99
Kodonas, 353
genetiniame kode, 355
START kodonas, 356
STOP kodonas, 385
Kohezinai, 137
Kondensinai, 137
Kongenitin diskeratoz, 226
403
Konjuguotoji sistema, 82
Konkatemeras, 215
Korepresorius, 279
Kozak sritis, 391
Krioelektronin mikroskopija
splaisosomos tyrimuose, 335
ribosomos tyrimuose, 365
Kriptogenas, 348
Krvi dipolis, 83
L
L-pirolizinas, 357
La baltymas, 307
Lamina, 138
Lstelinis senimas, 217
Haifliko riba, 225
M1 faz, 225
krizs faz, 226
Levintalio paradoksas, 101
Linkis (baltym antrin struktra), 97
Lyderin seka
pre-tRNR brendime, 303
trp operono valdyme, 282
Lyginamoji rRNR sek analiz, 303
brendimas, 299
funkcijos, 299
piRNR, 292
brendimas, 299
funkcijos, 299
MCM27 baltymai, 204
funkcijos replikacinje akutje, 207
struktra, 204
Mediatorius, 269
struktra, 270
vaidmuo transkripcijoje, 271
Metiltransferazs
7-metiltransferaz iRNR brendime, 325
histon metilinime, 123
maj RNR brendime, 295
Miels, 19
Mikroprocesoriaus kompleksas, 294
struktra, 295
vaidmuo maj RNR brendime, 295
Molekulin maina, 107, 221
Molekuliniai aperonai, 103, 139, 370
Motinin DNR grandin, 148
MRPribonukleaz, 214, 315
Mutacijos, 362
missens, 363
nonsens, 362
supresorins, 362
M
N
Makrodipolis, 93
MAR-SAR sritys, 138
Masi spektrometrija, 89
MALDI-TOF, 89
Matrica, 148
Maturaz, 324
Maosios RNR, 292
miRNR, 293
brendimas, 294
pre-miRNR, 294
pri-miRNR, 294
funkcijos, 298
siRNR, 292
404
Nekomplementarij nukleotid reparacija, 162

Nekovalentiniai ryiai, 86
elektrostatin sveika, 86
hidrofobin sveika, 86
Van der Valso sveika, 86
vandenilinis ryys, 88
Nelstelin baltym biosintezs sistema, 354
Nepolin aminorgtis, 85
Nesanklotiniai genai, 354
Nekomplementari nukleotid reparacija, 162
Nevienareikm sveika, 359
Nukleoproteinas
chromatinas, 109
ribosoma, 363
splaisosoma, 336
RNaz P, 303
telomaraz, 222
Nukleosoma, 110
baltymai histonai, 115
funkcijos, 115
kovalentins modifikacijos, 119
struktra, 116
erdin nukleosomin dalel, 115
Nukleotidas, 24
savybs, 25
struktra, 25
Nukleozidas, 25
savybs, 25
struktra, 24
Nutrkstamoji iniciacija, 239, 269
O
OB domenas, 185
Okazaki fragmentai, 152
atradimas, 152
bakterijose, 153
brendimas, 189
eukariotuose, 203
brendimas, 203
Oligomeras, 104
Oligopeptidas, 81
Omega () kilpa, 97
Operatorius, 272
Operonas, 273
ara operonas, 284
gal operonas, 283
lac operonas, 273
trp operonas, 279
ORCbaltymai, 205
Organin karboksirgtis, 75
ori sritys, 185
adenoviruso replikacijoje, 216
bakterijose, 186
besisukanio rato replikacijoje, 209

eukariotuose, 206
funkcijos replikacijoje, 193
mitochondrij replikacijoje, 214
Ortogonalioji pora, 358
Ortologas (geno), 146
P
PABPCbaltymas, 329
PABPN1baltymas, 239
Pagrindiniai transkripcijos veiksniai
RNR I polimerazs (RNR PolI), 251
RNR II polimerazs (RNR PolII), 255
RNR III polimerazs (RNR PolIII), 254
Paladio dalels, 363
Paleidimo veiksniai, 385
Palindromas, 41, 275
Pamatin molekulins biologijos dogma, 11
Paromomicinas, 379
PCNAbaltymas, 198
funkcijos, 198
struktra, 198
vaidmuo replikacijoje, 199
Peptidas, 81
Peptidiltransferaz, 380
aktyvusis centras ribosomoje, 363, 370
struktrin analiz, 383
Peptidil-tRNR, 384
Peptidin grup, 83
Peptidinis ryys, 80
dihedriniai kampai, 83
rezonansins struktros, 83
savybs, 84
sintezs reakcija, 81
susidarymas ribosomoje, 364
Perkodavimas, 356
Pernaos RNR, tRNR
aminoacilinimas, 360
aminoacil-tRNR, 360
brendimas, 302
405
deacilinta tRNR, 370

peptidil-tRNR, 376
struktra, 60
antrin, 60
tretin, 61
vaidmuo transliacijoje, 358
Perstmimas
transliacijoje, 365
Pigmentin kseroderma, 201
Piltuvo teorija, 102
Ping pong ciklas, 299
Pirimidinas, 24
Pirofosfataz, 154, 229
PIWI baltymai, 299
Plauk segtuko struktra, 59
Plektonemin superspiralizacija, 50
Poli(A)polimeraz, 329
Poli(A)seka, 328
Poli (ADP) ribozs 1 polimeraz (PARP1), 126
Poliadenilinimo seka, PAS, 328
Policistroninis transkriptas, 273
Polimerazi perjungimas, 197
Polinukleotidin grandin, 23
Polipeptidas, 75
Polipirimidin ruoas, 333
struktra, 333
Poliribosomos, 393
Pradmuo
replikacijoje, 154
eukariotuose, 197
prokariotuose, 180
Praimaz
bakterij, 178
funkcijos, 180, 187
struktra, 180
eukariot, 196
Pre-RCkompleksas, 206
struktra, 207
susidarymas, 207
Pre-RNR, 231
406
Prionai, 14
Procesyvumas, 169
Promotorius, 229
promotoriaus atpainimas, 241
promotoriaus tipins sekos, 242
struktra, 244
bakterij, 244
eukariot, 259
erdinis promotorius (eukariot)
RNR polimerazs I, 250
RNR polimerazs II, 258
Proteoma, 90
masi spektometrija, 89
Prp8 baltymas, 341
Pseudogenas, 74
Pseudouridinas, , 60, 316
Pupsas, 59
Pupso-spirals-pupso struktra, 312
Purinas, 24
Puromicinas, 381
R
Rkilpa
R kilp technika, 331
Racematas, 78
Rad6 veiksnys, 125
Raikos platforma, 71
Ramaandrano diagrama, 83
Redagavimas, 344
editosoma, 346
RNR gidai, gRNR, 348
paplitimas, 345
tipai, 345
nukleotid pakeitimas, 345
nukleotid sek paalinimas ir terpimas, 348
Reguliatoriaus genas, 271
Rekombinantin DNR, 15
Relaksuota DNR, 47
Rmelio poslinkis, 59
Renatracija, 101
Rep iniciacijos baltymas, 210

Replikacija, 148
replikacijos cheminis modelis, 156
replikacijos mechanizmai
adenoviruso replikacija, 215
besisukanio rato replikacija, 208
D kilpos replikacija, 214
dvikrypt replikacija, 151
telomer replikacija, 222
teta replikacija, 212
vienkrypt replikacija, 151
replikacijos tikslumas, 158
tikslumo lygmenys, 158
replikacin akut, 151
replikacins akuts modelis (trombono), trombono, 176
valdymas, 185, 205
replikacijos pradios sritis, 185, 195
eukariotuose ,195
prokariotuose, 185
replikacijos terminacija bakterijose, 190
Replikacijos fabrikas, 194
Replikacijos leidimas, 207
Replikacinis senimas, 217
Replikatyvin DNR polimeraz, 161
Replikatyvin helikaz, 181
Replikaz, 154
Replikonas, 193
Replisoma, 152
bakterijose, 169
funkcijos, 170
struktra, 169
eukariotuose, 195
Represorius, 272
Rezonansin struktra, 82
Rmelio poslinkis, 388
RFCbaltymas, 199
Ribojungiklis, 70
Ribonukleazs
Endoribonukleazs, 303
IIIendoribonukleaz, 314
Eendoribonukleaz, 314
Gendoribonukleaz, 314
Pendoribonukleaz, 303
Zendoribonukleaz, 306, 307
T endoribonukleaz, 314
maj RNR brendime dalyvaujanios
Dicer nukleaz, 294
Drosha nukleaz, 394
Ribonukleorgtis, 23
Ribos takas, 208
Ribosoma, 363
ribosomin RNR, 63
bakterij, 64
eukariot, 314
antrin struktra, 64
brendimas, 314
transkripcija, 249, 252
tretin struktra, 64
ribosominiai baltymai, 369
ribosomos struktra
Asritis, 369
Esritis, 370
GTPazs centras, 385
ikodavimo centras, 370
Psritis, 369
ribosomos tunelis, 370
ribosomos subvienetai
didysis subvienetas, 364
maasis subvienetas, 364
Ribosominis iniciatorius, 250
Riboz, 24
ribozs metilinimas rRNR brendime, 317
ribozs raukl, 32
konformacijos, 32
egzo, 32
endo, 32
struktra, 26
Ribozimas, 67
CoTC ribozimas, 67
glmS ribozimas, 69
HDV ribozimas, 68
plaktuko galvos, 67
plauk segtuko, 67
VS ribozimas, 69
407
RNR, 57
antrin RNR struktra, 57
kilpa, 59
plauk segtukas, 59
pupsas, 59
stiebas, 59
gRNR, 348
iRNR, 324
miRNR, 293
piRNR, 293
rRNR, 314
siRNR, 293
snRNR, 335
snoRNR, 315
tretin RNR struktra, 57
A minorinis motyvas, 66
pseudomazgas, 59
stieb stekingas, 63
tRNR, 60
RNR brendimas, 302
iRNR, 324
maj lstels RNR, 294
rRNR, 314
tRNR, 302
RNR ligaz, 309
pre-tRNR brendime, 309, 313, 349
RNR motyvas, 66
A minorinis motyvas, 66
RNR pirmtakas, 248
RNR polimeraz, 233
bakterij, 233
elongacija, 240
funkcijos, 238
struktra, 233
holofermentas, 239
erdin dalel, 239
BH spiral, 235
TL kilpa, 235
terminacija, 245
transkripcijos ciklas, 238
atsilaisvinimas nuo promotoriaus, 239
iniciacija, 239
nutrkstamoji iniciacija, 239
promotoriaus atpainimas, 241
408
eukariot, 248
Ipolimeraz, 249
IIpolimeraz, 254
erdvin struktra, 255, 256
IIIpolimeraz, 252
RNR pseudomazgas, 59
RNR redagavimas, 344
RNR termometras, 71
RNR vedanioji grandin, 297
ROSE ribojungiklis, 72
Rosmano klost, 100
RPAbaltymas, 197
RRM motyvas, 336
rRNR brendimas, 314
pseudouridinas, 316
ribozi metilinimas, 316
snoRNR, 317
ACA/H dut turinios, 317
C/D dutes turinios, 318
taikini nustatymas, 318
S
S-adenozilhomocisteinas, 124
S-adenozilmetioninas, 124
Sankibos laipsnis, 48
Sarcino-ricino kilpa, 64
Selenobaltymas, 357
Selenocisteinas, 356
sintez, 354
vaidmuo perkodavime, 354
sigma ()veiksnys, 242
alternatyvieji sigma veiksniai, 242
pagrindinis sigma veiksnys, 242
struktra, 241
vaidmuo transkripcijoje, 243
Simplekinas, 329
Sinonimai, 358
siRNR, 293
biogenez, 298
funkcijos, 298
Sklimo ir poliadenilinimo atrankumo veiksnys
CPSF, 329
Slystantysis iedas, 172, 198

jungimas, 173, 199
struktra, 172, 198
vaidmuo replikacijoje, 177
Slopiklis, 261
Smbaltymai, 336
SMC eimos baltymai, 136
snoRNP dalels, 317
funkcijos, 318
Splaisingas, 330
splaisingo slopikliai, 341
splaisingo sritis, 308
splaisingo stiprikliai, 341
splaisingo veiksniai, 334
Splaisosoma, 334
funkcijos, 340
splaisosomos kompleksas, 337
A kompleksas, 338
B kompleksas, 338
C kompleksas, 339
E kompleksas, 337
struktra, 335
U snRNP dalels, 335
Sm baltymai, 336
U snRNP, 335
SRbaltymai, 336
Struktra, 336
vaidmuo splaisinge, 341
SSBbaltymai, 183
funkcijos, 184
struktra, 184
ssosritis, 211
Stekingo sveika, 35
stieb stekingas (RNR), 63
Stereoizomerai, 77
diastereomerai, 77
enantiomerai, 77
Steroidinis receptorius, 288
Stiebo-kilpos struktra, 59
Stipriklis, 141, 261
STOP kodonai, 353
amber kodonas, 386

ochra kodonas, 386
opal kodonas, 386
Struktrinis genas, 272
Substratas, 277
Subvienetas, 104
SUMO baltymas, 125
Superantrin struktra, 98
Superspiralizacija (DNR), 46
DNR superspirls, 47
plektonemin, 50
sankibos laipsnis (Lk), 48
savitasis sankibos skirtumas (Lk), 51
superspiralikumo laipsnis (Wr), 48
superspiralizacijos tankis, 51
ski skaiius (Tw), 48
toroidin, 50
Suprasplaisosoma, 335
Supresija, 362
supresorin tRNR, 362
SV40 virusas, 195
replikacija, 195
Tantigenas, 195
aino-Dalgarno sritis, 373

akojimosi takas, 324
akuts susikirtimo takas, 237
elterino baltym kompleksas, 220
erdin dalel (RNR polimeraz), 233
erdin nukleosomin dalel, 113
onin grup, 77
T
Tantigenas, 195
tkilpa, 221
Tribonukleaz, 314
Tstiebas, 63
TAF veiksniai, 263
409
Tarpgenin sritis, 74
Tarpmolekulin sveika, 95
TATA dut, 259
Tautomerija, 160
TBP baltymas, 259, 266
funkcijos eukariot transkripcijoje, 259
struktra, 266
Teigiamasis reguliavimas, 272
Teigiamoji superspiralizacija, 51
Telomeraz, 217
funkcijos, 223
struktra, 222
telomerazs atvirktin
transkriptaz,224
telomerazs RNR, 222
taikinys prievinje ir antibiotik terapijoje, 227
Telomerazs atvirktin transkriptaz, 224
Telomerazs holofermentas, 224
Telomerinis pasikartojimas, 219
Telomeros, 218
ilginimas, 223
struktra, 219
prie telomer prisijungiantys baltymai,
221
elterino baltym kompleksas, 219
telomerinis pasikartojimas, 220
telomer kepurs, 220
Telomer homeostaz, 227
Terminacija
replikacijoje (bakterij), 190
transliacijoje, 385
Terminacijos baltymas (bakterij), 190
Terminacijos sritys (bakterij), 191
Timinas, 24
Tipins promotorii sekos, 244
bakterijose, 244
eukariotuose, 258
TLSpolimerazs, 200
tmRNR, 395
funkcijos, 394
struktra, 394
Topoizomerazs, 52
410
vairov, 53
savybs, 54
struktra, 55
veikimo mechanizmai
dvej vart, 54
trej vart, 56
Torsin temptis, 47
Torinis kampas, 33, 83
trans esterinimo reakcija, 320
trans splaisingas (tRNR brendime), 312
trans veikiantys gen produktai, 193, 272
Transkripcija, 229
eukariotuose, 247
prokariotuose, 233
RNR polimerazs, 232
transkripcijos burbulas, 230
transkriptas, 231
Transkripcijos kompleksas
bakterij
atvirasis, 238
elongacijos, 239
iniciacijos, 239
udarasis, 238
eukariot
RNR Pol II preiniciacijos, 263
Transkripcijos valdymas
bakterijose, 271
neigiamasis, 272
teigiamasis, 272
eukariotuose, 285
Transkripcijos terminatorius (bakterijose), 245
nuo Rho baltymo priklausomas terminatorius, 246
vidinis terminatorius, 245
Transkripcijos veiksniai, 285
aktyvikliai, 285
koaktyvikliai, 285
pagrindiniai (bazinio aparato), 285
Transkripcijos veiksni domenai, 286
aktyvinanamasis domenas, 286
su DNR sveikaujantis domenas, 286
Transkriptas
monocistroninis, 388
policistroninis, 273
Transliacija, 353
Transliacijos iniciacija
iniciacijos kodonas, 355, 372
iniciacijos kompleksas
bakterij, 376
eukariot, 389
43S, 391
48S, 392
iniciatorin tRNR, 371
Transliacijos elongacija, 376
elongacijos ciklas, 377
Transliacijos terminacija, 385
terminacijos kodonai, 353
Transliacijos veiksniai
eukariot
eIF, 389
prokariot
IF-1, 371
IF-2, 371
IF-3, 371
EF-G, 384
EF-Ts, 378
EF-Tu, 378
RF-1, 386
RF-2, 386
RF-3, 388
RRF, 388
Trifosfataz, 325
Triguba DNR spiral, 41
tRNR, 59
aminoacil-tRNR, 363
antrin struktra, 60
brendimas, 303, 307
deacilinta tRNR, 370
iniciatorin tRNR, 371
N-formilmetionil-tRNRfMet, 374
peptidil-tRNR, 376
transkripcija (eukariotuose), 252
tretin struktra, 60
tRNR nukleotidiltransferaz, 306
tRNR trans splaisingas, 310
Trp represorius, 279
Tvirtinamoji seka, 347
U
U atranki 35 egzoribonukleaz, ExoUaz, 349
U snRNP, 335
struktra, 337
U snRNR, 335
Ubikvitinas, 125
Uracilas, 24
Udarasis transkripcijos kompleksas, 238
V
Van der Valso sveika, 88
Vandeniliniai ryiai, 88
Vluojanioji DNR grandin, 152
Vidins kontrols sritys, 252
Vidinis terminatorius, 245
Vienkrypt DNR replikacija, 151
Viroidas, 67
Virusoidas (satelitin RNR), 68
Voko konformacija, 32
Z
Zribonukleaz, 306, 307
iedin DNR, 3
iedo uklimo kompleksas (UK), 170, 199
mogaus genomo projektas, 15
411
Suiedlien E.
Su-117

Molekulin biologija. Vadovlis. Vilnius: Baltijos kopija, 2014. 412 p.

Bibliogr. 397 p.
ISBN 978-609-417-096-6
Vadovlis Molekulin biologija skirtas auktj mokykl studentams, studijuojantiems molekulins

biologijos pagrindus, taip pat visiems, besidomintiems gyvybs tyrimais molekuli lygmenyje. Knygoje supaindinama su pagrindini lstels biomolekuli nukleorgi ir baltym struktra ir funkcijomis, taip
pat su svarbiausiais molekuliniais vyksmais, kuriuose jos dalyvauja. Septyniuose knygos skyriuose aptariami
pagrindiniai biologins informacijos saugojimo, perdavimo ir raikos vyksmai DNR biosintez, RNR biosintez, RNR brendimas ir baltym biosintez, stengiantis atidiau pavelgti juose dalyvaujani biologini
makromolekuli struktr ir funkcijas, atskleisti molekulini main sudtingum, pristatyti naujausius molekulins biologijos mokslo pasiekimus.
UDK 577.2(075.8)
Molekulin biologija
Vadovlis
Redagavo Giedr Ramon
Maketavo Artras ikus
SL 121. 2014 12 22. 22,7 leidyb. apsk. l.
Tiraas 300 egz. Usakymas 24 046.
Pareng ir spausdino UAB Baltijos kopija,
Kareivi g. 13B, LT-09109 Vilnius
www.kopija.lt
spauda@kopija.lt

Molekulinės Biologijos Vadovėlis

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Molekulinės Biologijos Vadovėlis

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Edita Suiedlien

Vilniaus universiteto Studij komiteto rekomenduota 2014 12 09.

Leidinys finansuotas projekto Biotechnologijos ir biofarmacijos sektoriui reikaling auktos kvalifikacijos

Virelyje naujos DNR II tipo restrikcijos endonukleazs, sumodeliuotos pasitelkus kompiuterin

Edita Suiedlien, 2014

II. NUKLEORGI IR BALTYM MOLEKULIN STRUKTRA......................... 23

2.2. Baltym molekulin struktra................................................................................75

III. CHROMATINO MOLEKULIN STRUKTRA...................................................109

3.2. 10nm ir 30nm chromatino silai........................................................................ 130

3.6. DNR organizacija prokariotuose.......................................................................... 145

IV. DNR BIOSINTEZ (REPLIKACIJA) ...................................................................148

4.3. DNR replikacija prokariotuose............................................................................. 165

4.4. DNR replikacija eukariotuose............................................................................... 195

4.5. Kiti DNR replikacijos bdai................................................................................... 208

V. RNR BIOSINTEZ (TRANSKRIPCIJA)................................................................229

5.4. Transkripcija eukariotuose.................................................................................... 247

5.5. Transkripcijos valdymas prokariotuose............................................................. 271

5.6. Transkripcijos valdymas eukariotuose............................................................... 285

VI. RNR brendimas.................................................................................................302

6.3. Pre-tRNR brendimas eukariotuose...................................................................... 307

6.4. Pre-rRNR brendimas............................................................................................... 314

6.5. Pre-iRNR brendimas eukariotuose...................................................................... 324

6.5.8. Splaisosomos susimontavimas ties pre-iRNR...................................................................337

6.6. RNR redagavimas.................................................................................................... 344

VII. BALTYM BIOSINTEZ (TRANSLIACIJA)......................................................353

7.3. Ribosom struktra ir funkcijos........................................................................... 363

7.4. Baltym biosintez prokariotuose...................................................................... 371

7.5. Baltym biosintez eukariotuose........................................................................ 388

7.6. Poliribosomos.......................................................................................................... 393

Molekulins biologijos gana naujo ir spariai besivystanio mokslo vadovli lietuvi

I. VADAS. Pamatin molekulins biologijos dogma ir molekulins biologijos mokslo raida

Studijuojantiems ar norintiems painti molekulin biologij dabartinis ios mokslo srities

Ankstyvasis molekulins biologijos vystymosi tarpsnis. XXa.pradia1953m.

1.2pav. E.rdingerio knyga Kas yra gyvyb? (1944) (http://www.whatislife.ie/schrodinger.htm)

I. VADAS. Pamatin molekulins biologijos dogma ir molekulins biologijos mokslo raida

lino Makliaudo (Colin MacLeod) ir Maklyno Makkario (Maclyn McCarty) eksperimentus su

Klasikinis molekulins biologijos vystymosi tarpsnis (19532000m.)

1.3pav. Schema, iliustruojanti pamatin molekulins biologijos dogm

I. VADAS. Pamatin molekulins biologijos dogma ir molekulins biologijos mokslo raida

Pogenominis molekulins biologijos vystymosi tarpsnis (nuo 2000 m. iki dabar)

1.1. Modelins biologins sistemos molekulinje

I. VADAS. Pamatin molekulins biologijos dogma ir molekulins biologijos mokslo raida

1.4pav. Escherichia coli bakterijos (http://textbookofbacteriology.net/procaryotes.html)

1.6pav. Archja Methanococcus jannaschii (http://textbookofbacteriology.net/procaryotes.html)

I. VADAS. Pamatin molekulins biologijos dogma ir molekulins biologijos mokslo raida

1.7pav. Miels Saccaromyces cerevisiae (http://rushartsbiology.wikispaces.com/Visuals+-+Unit+5)

1.9pav. Baltaiedis vairenis (Arabidopsis thaliana) (http://en.wikipedia.org/wiki/

Atliko ir apra paveldimumo fenotipinius tyrimus

Atrado nuklein (pliuose ir uv spermoje)

Apra chromosom dalijimsi

Iskyr i nukleino baltymus ir nukleorgtis; sukr termin nukleorgtis

Chemikai apra visas heterociklines bazes

Apra mejoz ir spermatogenez vabzdi organizmuose; sukurta chromosomin paveldimumo teorija

I. VADAS. Pamatin molekulins biologijos dogma ir molekulins biologijos mokslo raida

Atrado chromosom sukibim ir krosingover drozofiloje

Nustat gen padtis chromosomoje

Citochemikai nuda DNR

Naudodamas pneumokokus atrado DNR transformacij

D.Bidlis ir E.Tatumas (G.Beadle & E.Tatum)

Suformulavo teigin vienas genas vienas fermentas

O.Eiveris, M.Makliaudas ir K.Makkartis

rod genetin DNR vaidmen, t. y. kad DNR yra genetin

Ityr DNR nukleotid sudt (argrafo taisykls)