Metode u biološkim istraživanjima

Optičke metode
analize

Prof. Dr Slobodanka Pajević

 Analitičke metode kod kojih se meri interakcija
između energije (najčešće u vidu
elektromagnetskih zraka) i materije (atoma,
molekula ili većih agregata).
Elektromagnetno zračenje – svetlost :
FOTON
talasno - korpuskularne osobine

Proces rasprostiranja
oscilacija kroz elastičnu
sredinu, naziva se talas.

Elektromagnetno zračenje - ne osciluju čestice već

električno i magnetno polje, a amplitudi odgovara maksimum
intenziteta električnog, odnosno magnetnog polja.
 Energiju elektromagnetnih zraka –
fotona - definiše Planck-ov zakon:

Elektromagnetni talasi su transverzalni jer polja

osciluju poprečno na pravac prostiranja.
 Elektromagnetni talas je sinusna oscilacija čija je brzina
prostiranja u vakuumu (c) nezavisna od talasne dužine i iznosi
približno 3.108 m/s. Sinusne (harmonijske) oscilacije su one kod
kojih se udaljenost oscilujuće tačke od ravnotežnog položaja
menja po sinusnom zakonu u zavisnosti od vremena. Za
karakterizaciju elektromagnetnih talasa koristi se i talasni broj
(1/λ), koji predstavlja broj talasnih dužina zračenja po 1 cm.
Energija elektromagnetnog talasa (fotona) iznosi E = hν = hc/λ ,
gde je h - Planckova konstanta (6,6256.10-34 J.s). Energija
elektromagnetnih talasa zavisi direktno od frekvencije zračenja, a
obrnuto je proporcionalna njegovoj talasnoj dužini.
Interakcija elektromagnetnog
zračenja i materije odnosi se na
promene energetskih stanja
protona i elektrona materijalnog
sistema.
 Kada naelektrisana čestica (proton, elektron) usporava
ili na bilo koji drugi način smanjuje ukupni iznos sopstvene
energije, višak se oslobađa u vidu elektromagnetnog talasa.

Pri apsorpciji elektromagnetnog talasa naelektrisana

čestica može da ubrza svoje kretanje ili da poveća iznos
svoje potencijalne energije.

Pri utvrđivanju količine pojedinih atomskih i

molekulskih vrsta u smeši, interakcija
elektromagnetnog zračenja sa elektronima ima
daleko širu primenu, dok interakcija s protonima
pruža informacije koje su neposrednije vezane za
strukturu hemijskih jedinjenja.
Kako svetlost može da deluje na atome i molekule?

Atom
Pojava pri kojoj se elektroni iz spoljne orbitale atoma
podižu na prvi viši energetski nivo apsorbujući zračenje,
a potom se vraćaju u prvobitno stanje emitujući talas iste
talasne dužine, naziva se rezonantna apsorpcija i emisija.

Rezonantna frekvencija apsorbovanog, odnosno

emitovanog zračenja direktno zavisi od atomskog broja i
predstavlja jedinstvenu karakteristiku svakog elementa,
što nalazi značajnu primenu pri analizi (npr. teških
metala) metodom atomske apsorpcione spektrometrije
Kako svetlost može da deluje na atome i molekule?

Molekul

Kada je zračenju, umesto izolovanog atoma,

izložen molekul, gde se zbog međusobnih
odnosa atoma u molekulu pojavljuje niz novih
mogućih energetskih stanja - elektronski
energetski nivoi atoma se cepaju na više
podnivoa, a pojavljuju se i novi (kao posledica
promene kinetičke energije rotacije, uvijanja,
vibracije i oscilovanja pojedinih delova
molekula).
Kako svetlost može da deluje na atome i molekule?
Molekul
Broj različitih energetskih stanja raste
sa stepenom složenosti molekulske
strukture, pa su emisioni i apsorpcioni
spektri jedinjenja mnogo složeniji od
atomskih, teže se tumače, ali i pružaju
mnogo više informacija o strukturi
jedinjenja.
Za pobuđivanje molekula potrebna je manja energija
zračenja, pa se molekulski spektri protežu od
ultraljubičaste, preko vidljive, daleko u infracrvenu
oblast elektromagnetnog zračenja.
Energetske promene u materijalnom sistemu
(uzorku) su ekvivalentne energijama
upotrebljenih elektromagnetnih zraka.
Energija zračenja
pojedinih oblasti je
različita pa će prema
tome biti različite i
promene koje se
odigravaju pri
interakciji zračenja
pojedinih oblasti
spektra sa atomima i
molekulima ispitivane
supstance.
 Efekti zračenja iz pojedinih oblasti spektra
elektromagnetnih talasa
Područje spektra Efekat na:

X-zraci elektrone iz donjih (K i L) orbitala

Daleko ultraljubičasto (UV) zračenje elektrone iz srednjih orbitala

Blisko ultraljubičasto zračenje valentne (spoljne) elektrone

Vidljiva svetlost valentne (spoljne) elektrone

Blisko i srednje infracrveno (IR) zračenje molekulske vibracije

Daleko infracrveno zračenje molekulske rotacije i nisko-

energetske vibracije

Mikrotalasi molekulske rotacije

1. Promene u elektronskom energetskom stanju
atoma i molekula (bliski UV deo spektra 190-370 nm i
VIS deo spektra 370-850 nm):
-Atomska apsorpciona spektrofotometrija (atomi
-UV i VIS spektrofotometrija i fotometrija (molekuli i molekulski
joni)
-Plamena spektrofotometrija i fotometrija
-Spektrografija
-Kvantometrija
-Plazma emeisona spektrometrija
-Atomska fluorescentna spektrofotometrija (atomi i atomski joni)
-Spektrofluorimetrija i fluorimetrija (molekuli ili molekulski joni)
2. Promene u vibracionim (oscilacija) energetskim stanjima
(vibracioni deo IC spektra od 2,5 µm do 50 µm)
-IC spektrofotometrija

3. Promene u energetskim stanjima spina nesparenih

elektrona (deo mikrotalasnog spektra oko 0,01 m)
-elektron spin rezonantna spektrometrija (ESR)
-elektron paramagnetno rezonantna spektrometrija (EPR)
4. Promene u energetskim stanjima spina atomskih
jezgara (deo radiotalsnog spektra oko 5 m)
-nuklearno magnetna rezonanca (NMR)
-nuklearna spin rezonantna spektrometrija (NSR)
 Materijalni sistem (ispitivana supstanca) može kvantirano da
menja svoju energiju skoro diskretno (slobodni atomi i
atomski joni) ili manje više kontinualno (u užem rasponu
energija – molekuli ili u širem rasponu energija – asocijati).

Apsorpcione metode Emisone metode

Interakcijom energije Smanjenje energije
el.mag. zraka i ispitivane ispitivane supstance,
supstance dolazi do otpuštanjem energije u
povećanja energije vidu el.mag. zraka
ispitivane supstance - nakon pobuđivanja -
APSORPCIJA EMISIJA

Metode rasipanja svetlosti

Efekti prelamanja svetlosti
(refraktometrija) i obrtanja ravni
polarizovane svetlosti
(polarometrija)
 Spektar
Zavisnost ukupne energije (E) od kvantirane
energije (ΔE) tj., raspodela apsorbance po
talasnim dužinama
 Spektar
Zavisnost ukupne energije (E) od kvantirane energije
(ΔE) tj., raspodela apsorbance po talasnim dužinama
Apscise
karakt.
tačaka –
npr. maks.
pikova

Definisanje kvantirane energije (talasne dužine ili ekvivalentne veličine)

KVALITATIVNA ANALIZA
 Spektar
Zavisnost ukupne energije (E) od kvantirane energije (ΔE) tj.,
raspodela apsorbance po talasnim dužinama

Smanjenje ukupne energije ili merenje ukupne emitovane energije

– površine zahvaćene pikovima – KVANTITATIVNA ANALIZA
Najjednostavniji spektri dobijaju se
kod elektronskih energetskih
promena atoma i atomskih jona –
prelazi između atomskih orbitala.
Zbog male širine spektra atomski
spektar se označava kao
LINIJSKI SPEKTAR
 Kod energetskih promena molekula i molekulskih jona
dolazi do prelaza elektrona iz jedne u drugu molekulsku
orbitalu. Takođe dolazi do promena u vibracionim i
rotacionim energijama molekula. Spekatar je
komplikovaniji i veće širine pa se označava kao
TRAKASTI SPEKTAR
Spektar može biti:
Prema poreklu - nuklearni, atomski, molekulski, agregacioni

Prema nastanku - apsorpcioni, emisioni

Prema izgledu - neprekidni (kontinualni), diskretni (linijski, trakasti)

Prema opsegu talasnih dužina -

radio-talasni, mikrotalasni, infracrveni,
vidljivi, ultraljubičasti, gama

Prema obliku kretanja iz kojeg nastaje -

rotacioni, vibracioni, rotaciono-
vibracioni, elektronski
Opšti model optičkih
metoda analize
 Boja

Kada zrak bele svetlosti prolazi kroz staklenu posudu

ispunjenu tečnošću (nekom materijom), intenzitet izlazne
svetlosti je manji od intenziteta ulazne. To smanjenje
intenziteta nije podjednako za elektromagnetne talase
svih talasnih dužina: neki talasi apsorbovaće se više od
drugih, tako da se spektri upadnog i propuštenog
zračenja razlikuju, zbog čega tečnost izgleda obojena –
onom bojom koja odgovara spektru izlazne svetlosti.

Boja rastvora u propuštenoj svetlosti uvek je

komplement apsorbovane boje.
 Za kvantitativna određivanja optičkim apsorpcionim
tehnikama služi Lambert – Beer-ov zakon
Intenzitet elektromagnetskog zracenja I0 smanjuje se
prolazom kroz rastvor (ispitivanu supstancu) koja može
apsorbirati zracenje. Smanjenje intenziteta zavisi od
koncentracije supstance (c) koja apsorbuje
elektromagnetno zračenje, debljine sloja (svetlosnom putu
kroz uzorak), molarnom apsorpcionom koeficijentu,
specificnom za svaku supstancu (menja se sa talasnom
dužinom).
Smanjenje intenziteta upadnog zračenja pre i posle prolaza
kroz uzorak definisali su Lambert i Beer
zakonom apsorpcije.

log I0/I = A =  • l • c
 Za kvantitativna određivanja optičkim apsorpcionim
tehnikama služi Lambert – Beer-ov zakon

It

Apsorpcija pri propuštanju monohromatskog zračenja kroz rastvor neke

supstance kvantitativno je iskazana Lambert-Beerovim zakonom:

Relativno smanjenje intenziteta upadnog zračenja (-dI / I) je

proporcionalno (k=const) broju apsorbujućih molekula (n), koje zrak na
svom putu sreće.
I0 označava intenzitet upadnog, a It intenzitet propuštenog zračenja.

Izraz (1), iskazan u tzv. diferencijalnom obliku, integrisanjem i

transformisanjem, dobija oblik:
Lambert – Beerov zakon – osnova za
kvantitativnu analizu

Pod uslovom da ova jednostavna jednačina se transformiše u:

 Kada se prirodni logaritam svede na dekadni preko relacije:

Specifični koeficijent apsorbancije

– veza između apsorbance i koncentracije supstance –

je apsorbancija rastvora debljine 1 cm koji sadrži 1 g supstance u 100
ml, dok je molarani koeficijent to isto sa koncentracijom 1 mol u 1 l
 Greška merenja

Greška je najmanja kada je apsorbanca A=0,4343, a

prihvatljiva u rasponu apsorbance od A=0,2 do A=0,8
 FOTOELEKTRIČNA FOTOMETRIJA
“KOLORIMETRIJA”
Apsorpciona tehnika
Kvantitativna određivanja (primenom Lambert-
Beer-ovog zakona)
Merenje apsorbance uz prethodno
eksperimentalno definisanu funkcionalnu vezu
apsorbance (ili transimisije) i koncentracije
Analiziraju se molekuli koji ulaze u interakciju sa
UV i VIS delom spektra
Optički filteri
 FOTOELEKTRIČNA FOTOMETRIJA

Kolorimetrijskim metodama se određuju

koncentracije obojenih rastvora koji
apsorbuju u vidljivom ili bliskom UV delu
spektra.

Boja koju ima rastvor neke supstance

komplementarna je boji koju ta supstanca
apsorbuje.  
FOTOELEKTRIČNA FOTOMETRIJA
Šema fotoelektričnog fotometra
 Skala galvanometra sa
apsorbancom i
transmisijom

Optički filter

Potenciometar za
podešavanje nule apsorpcije

Optički Mesto za kivetu

filteri

Slot za filter

Fotoelektrični fotometar
FOTOELEKTRIČNA FOTOMETRIJA

Optički filter komplementarne

boje boji rastvora (supstance)
čija se apsorbanca meri

Skala fotometra
Mesto za Optički
kivete filteri
 Dvozračni fotometar

Uzorak
Slepa proba
 UV i V SPEKTROFOTOMETRIJA

Za razliku od fotometrije, u spektrofotometriji

se koristi mnogo uži deo spektra zračenja koji
se od izvora kontinualnog zračenja dobija
pomoću monohromatora (optičke prizme ili
difrakcione rešetke).

Principijelnih razlika u donosu na fotometar gotovo da

nema,
konstrukcione razlike su veoma velike!
 Fotometar Spektrofotometar
Optički filter Monohromatski filter
Mere se veće promene Mere se male promene energije
energije uskog snopa zračenja
Polihromatsko Monohromatsko zračenje –
zračenje – samo mogućnost kvalitativne i
kvantitativna analiza kvantitativne analize
Optički delovi su Umesto sočiva, često ogledala radi
sočiva manjih gubitaka energije
Detektor – Osetljiviji detektori – fotoemisione
fotonaponska ćelija ćelije, fotomultiplikatori
Standardni izvor Stabilizovani izvor napajanja i
napajanja i pojačivač pojačivač signala električnih
signala veličina
Vezivanje izvora zračenja na
stabilan naponski izvor velikog
kapaciteta (akumulator)
Izbegavanje rada na nižim talasnim
dužinama, merenje u crvenom delu
spektra ako je moguće
 Šema spektrofotometra

Spektrofotometar je uređaj za analizu spektra

elektromagnetskog zračenja. Sastoji se od izvora
zračenja, monohromatora i detektora. Monohromator
menja talasnu dužinu zračenja koje propušta.
Registrovanjem intenziteta zračenja koje je uzorak
apsorbovao, propustio ili reflektovao u zavisnosti od
talasne dužine nastaje spektar.
 UV i V SPEKTROFOTOMETRIJA

Da bi se postigla moguća tačnost i osetljivost, bitan

je izbor talasne dužine merenja

Spektrofotometrija mora da ispuni sledeće uslove:

 
-da se merenjem postiže maksimalna osetljivost

-da male promene talasne dužine ne utiču na

reproduktivnost (najčešće se meri na talasnoj dužini
maksimuma apsorpcije)

-da važi Lambert – Beer-ov zakon

 Preklapanje pikova

Ahl a +
A hl b

Pravilo aditivnosti apsorbance