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PACES 2013-2014
UE1
Introduction.
Chapitre 1. Stratgies pour l!tude des protines
Chapitre 2. Structure des protines: de lacide amin la macromolcule
Chapitre 3. L!exemple du transport de loxygne : myoglobine et hmoglobine
Chapitre 4. L!exemple des protines motrices : actine, myosine et les autres...
Chapitre 5. Lexemple dune protine membranaire, le rcepteur de lactylcholine
Introduction.
Les protines : premires actrices du monde vivant
! !protine! vient de !"#$%&#' (proteion) = qui occupe le premier rang.
! Il n!existe pratiquement pas de processus biologique non rgi par une/des protine(s).
! Comprendre le fonctionnement d!une protine, cest donc comprendre in fine
!la logique du vivant!
Les protines assurent l'ensemble des fonctions du vivant
Crer et maintenir une structure
Les protines du cytosquelette
Transformer
Les enzymes catalysent
lessentiel des
ractions chimiques du vivant
Bouger-se dplacer
Les protines fonction motrice
Les protines des mouvements
intracellulaires
Reconnatre et se dfendre
Les immunoglobulines
Transporter
Les transporteurs de petites
molcules dont loxygne
Informer-signaler
Les transporteurs
trans-membranaires
Homognat
cellulaire
Centrifugation
moyenne vitesse
(20 000xg, 20 min)
Le culot contient
cellules entires
noyau
cytosquelette
Centrifugation
haute vitesse
(80 000xg, 1h)
Le culot contient
mitochondries
lysosomes
peroxysomes
Centrifugation
trs haute vitesse
(150 000xg, 3h)
Le culot contient
microsomes
petites vsicules
RER
Le culot contient
ribosomes
virus
macromolcules
de grande taille
Le surnageant
contient le cytosol
Tampon dlution
(phase mobile)
chantillon
Billes fonctionnalises
(Phase fixe)
Colonne de chromatographie
6 5 4 3 2 1
Chromatographie d!affinit
10
lectrophorse (SDS-PAGE)
lectrophorse mono-dimensionnelle
Protine avec 2
Protine simple (C)
sous-units (A et B)
lectrophorse mono-dimensionnelle
Cathode
100 kDa
1 : homognat cellulaire
40 kDa
2 : aprs ultracentrifugation
3 : aprs chromatographie changeuse dions
4 : aprs chromatographie par filtration sur gel
5 : aprs chromatographie d!affinit
Anode
15 kDa
1
14
Protine
purifie
Cristal de
protine
Reconstruction
informatique
des donnes
Production
du modle
) =1,54 A
Source
rayons X
Profil de
diffraction
Rsolution 5A
Cartes de
densit lectronique
Rsolution 1,5A
15
16
17
Naccepteur
2,88 A
-N-H
donneur
Oaccepteur
3,04 A
2 types dans
les protines
! Les liaisons hydrophobes sont principalement dues la forte affinit de leau pour
elle-mme
Les molcules apolaires interagissent entre elles pour laisser le plus de liaisons
hydrogne possible entre les molcules deau (penser deux gouttes dhuile dans de
leau). Dans un environnement biologique, les protines exposent leurs rsidus
hydrophiles lextrieur et les rsidus hydrophobes lintrieur.
Cette rgle est pratiquement gnrale, lexception notable des protines
transmembranaires, et constitue lune des bases principales pour la mise en place de la
structure tri-dimensionnelle des protines
18
Dfinition du pH et du pK
Equilibre acide-base
On dfinit le pH = -log [H+] = log1/[H+]
Dans les milieux biologiques, il n!y a pas d!acide fort ou de base forte
mais des acides et des bases faibles, c!est dire qu!ils ne sont que partiellement ioniss
dans la gamme des pH biologiques
Un acide est un donneur de proton, une base est un accepteur de proton
HA
acide
H+ + A proton Base
conjugue
Ka=
(H+)(A-)
HA
quation de Henderson-Hasselbalch
pH = pKa + log
[A-]
[HA]
19
Carbone *+
COOH
NH2- C - H
R
COOH
H - C - NH2
R
Il existe des codes trois ou une lettre extrmement utiliss pour les squences protiques
glycine,
Gly,
mthionine,
Met, M
Cystine,
Cys, C
phnylalanine, Phe, F
alanine,
Ala,
Proline
Pro, P
glutamine,
Gln Q
Tryptophane, Trp, W
valine,
Val,
srine,
Ser, S
Asparagine,
Asn, N
histidine,
His, H
leucine,
Leu,
thronine,
Thr, T
lysine,
Lys, K
Tyrosine,
Tyr, Y
Arginine,
isoleucine, Ileu, I
glycine
alanine
valine
Arg, R
21
leucine
isoleucine
mthionine
Pas de
carbone
asymtrique
proline
22
phenylalanine
tryptophane
srine
thronine
tyrosine
cystine
23
phenylalanine
tyrosine
Cycle phnyl
tryptophane
Groupe indol
24
srine
thronine
tyrosine
Rduction: (-mercaptothanol
Pont disulfure
oxydation
cystine
26
OSE
asparagine
glutamine
acide aspartique
acide glutamique
27
+
H
pH 5,0
Fonction guanidinium
histidine
pKa (R) = 6,0
lysine
arginine
pKa (R) = 12,5
La liaison peptidique est une liaison covalente qui se forme par condensation du groupe
*-carboxyle (acide) dun acide amin avec le groupe *-amin dun autre acide amin
et limination d!eau
H *-carboxyle H
NH2 - C - COOH
NH2 - C - C
N - C - COOH
H
R1
N- C - COOH
H
R1
R2
*-amine
H2 O
R2
liaison peptidique
(liaison amide particulire)
29
Forme hybride
Les lectrons sont partags
entre les atomes O, C et N
et sont distribus sur une
orbitale molculaire !
qui recouvre les 3 atomes
30
1,0 A
C*+
C*+
1,33 A
1,52 A
119,5
-+
,+
1,45 A
C*+
118,2
115,6
121,1
1,23 A
.+
121,9
C*+
123,2
carbone
oxygne
azote
hydrogne
Chane latrale
31
2.3.2. La liaison peptidique et la nature des rsidus amino-acides imposent des structures
spatiales trs particulires aux chanes polypeptidiques
On dfinit ,, angle de torsion autour de la liaison C-N. Cet angle ne peut prendre que 2 valeurs
Vers le
C-terminal
Vers le
N-terminal
Vers le
N-terminal
Vers le
C-terminal
, = 0
CIS
, = 180
TRANS
La liaison peptidique prend presque toujours une configuration trans, plus stable
32
C*+
La libert de rotation de l!angle . (phi) autour de la liaison entre le C* et l!azote amidique
33
2.3.3. Les chanes polypeptidiques sont constitues dun nombre variable de rsidus
amino-acides et possdent une structure spatiale spcifique
N-terminal
C-terminal
Par dfinition une chane polypeptidique commence par l!acide amin qui a sa fonction amine
libre (extrmit N-terminale, que l!on place gauche) et se termine par l!acide amin
qui a sa fonction acide carboxylique libre (extrmit C-terminale, que l!on place droite.)
NB : Par dfinition on appelle un oligopeptide un enchanement de quelques acides amins
(de 2 une dizaine).
!Polypeptide! et !protine! sont pratiquement quivalents. Cependant on rserve
gnralement le terme polypeptide des structures de moins de 10 kDa.
34
lys
asp
NH
CH
CO
NH
CH
NH
CO
CH
CO
NH
CH
CH2
CH2
CH2
CH2
COOH
CH2
COO-
CH2
CH2
CH2
pH 1
CO
CH2
CH2
pH 7
+NH3
NH
CH
+NH3
CO
NH
CH
CH2
CH2
COO-
CH2
CO
CH2
pH 12
CH2
NH2
35
chymotrypsine
NH2-ala-ser-phe-pro-lys-gly-gly-arg-trp-asp-glu-lys-cys-COOH
trypsine
Clivage chimique
- =-47
. =-57
C-O pointent
vers le haut
C-term.
hlice hlice
gauche droite
C-term.
N-H pointent
vers le bas
Liaison
hydrogne
1 tour =
3,6 rsidus
5,41 A
Liaison R4
Hydrogne
R1!R5
N-term.
R1
R2
N-term.
- =+135
Vue de
dessus
37
. =-139
3,4 A
- =+113
. =-119
C"N
(brin 1)
C"N
(brin 1)
N!C
(brin 2)
C"N
(brin 2)
C"N
(brin 3)
C"N
(brin 3)
feuillet bta parallle
vu de dessus
38
39
Prdiction de structure 3D
1 - //*((**/(****/****/*+
21-*///*//*/**/***/(/*/+
41-*****/(*//******(*+
COOH
Hlice 3
Hlice 1
NH2
structure primaire
structure tridimensionnelle
Liaisons
hydrognes
Rsidus
hydrophobe
s
Rsidus
hydrophiles
Cur
hydrophobe
extrieur
hydrophile
42
On appelle
Structure secondaire
Structure tertiaire
Hlice alpha
coude
Feuillet bta
lorganisation complexe
dune protine multimrique
(au moins dimrique) :
43
Conversion
Auto-propageable
44
45
46
3.2. La myoglobine
3.2.1. La myoglobine a une structure compacte et riche en hlice alpha
Schma simplifi
Modle en cylindre
47
3.2.2. Loxygne est fix sur la myoglobine grce lhme, un groupement prosthtique
Unit de base
groupement prosthtique =
molcule non peptidique
ncessaire la fonction
apoprotine = protine
dpourvue de groupement
prosthtique
C
C
O2
50
Saturation (Y)
P50 = 3-5
0,5
0,0
0
20
40
60
80
100
Pression partielle en oxygne, pO2 (en torr)
1 torr = 1mm Hg 1 torr = 0,13 kPa
51
3.3. Hmoglobine
3.3.1. Lhmoglobine est compose de 4 sous-units de structure proche de celle de la
myoglobine
52
3.3.2. Lhmoglobine adulte contient 2 chanes alpha et deux chanes bta, identiques deux
deux. Cette structure confre la molcule des caractristiques de protine allostrique
protine allostrique = protine,
comportant gnralement plusieurs
sous-units, possdant plusieurs sites
de liaisons pour un/des ligands et telle
que la liaison dun ligand sur un site
modifie la liaison des autres ligands
Saturation (Y)
1,0
poumons
P50 = 3-5
0,5
La courbe sigmode traduit
un effet coopratif.
P50 = 26
0,0
0
20
40
60
80
100
Effet BOHR
100%
66% capacit libre
77% capacit libre
90% capacit libre
55
avec DPG
P50=20
P50=26
56
En l!absence d!O2
Aprs fixation de O2
57
Les dplacements gnrs sur une sous-unit sont transmis une sous-unit associe
*1+
*2+
Contact *1 (1+
(2+
Contact *2 (1+
(1+
58
Les dplacements gnrs sur une sous-unit sont transmis une sous-unit associe
La rsultante globale est un mouvement du dimre *1(1 par rapport *2(2
59
Desoxy
2,3 DPG
Etat tendu T
Etat relach R
T T
R R
T T
R R
O2 R
O2 O2
O2 O2
O2 O2
O2 O2
O2 O2
O2 O2
R R
R R
O2 R
O2 O2
O2 O2
Modle squentiel
T T
T T
T O2
T T
T T
O2 T
61
O2 O2
O2 O2
O2 O2
O2 O2
sans DPG
avec DPG
O2 O2
T T
R R
T T
R R
T T
62
Hmoglobine S:
Mutation dun acide amin
sur la sous-unit (
*+
Passage dans la microcirculation.
Oxy HbS libre son oxygne et se
transforme en desoxyHbS. Cette
transformation est associe un
changement conformationnel qui
favorise la formation dune poche
hydrophobe
Oxy HbS
O2
Hmatie normale
desoxy HbS
Polymre de
desoxy HbS
Hmatie falciforme
63
4.3. Etudier un exemple de rgulation de lactivit des protines par leur environnement
64
65
Bande A
Ligne Z
Zone H
Bande I
Ligne Z
1m
fins
fins + pais
pais
fins + pais
fins
Myofibrille contracte
66
67
68
coudes et boucles
Chaque monomre contient une
molcule d!ATP et un ion Ca2+.
69
4.2.2. La myosine musculaire est une protine complexe de trs grande taille
La myosine (520 kDa) est une protine
polymrique compose de deux chanes
lourdes (220 kDa) et de deux paires
de chanes lgres (20 kDa chacune)
2 hlices * +
Super-enroules
N-terminal
chanes
lgres
Fragment S1
tte
C-terminal
queue
La digestion enzymatique de la
myosine gnre des fragments qui
permettent ltude de sa structure
et de ses fonctions
70
ADP + Pi + H+
ATP
ADP
Pi
L!hydrolyse de l!ATP entrane un
changement conformationnel
(bras de levier)
10 nm
Chanes
lgres
71
tte de la myosine
filament d!actine
72
ADP
ATP
2
Hydrolyse
de l!ATP
Pi
73
4.3. Etudier un exemple de rgulation de lactivit des protines par leur environnement
Comment contrler la contraction musculaire ?
Il existe un complexe de protines rgulatrices : la troponine et la tropomyosine
fix sur les filaments d!actine : notion d'difice macromolculaire
la troponine est une protine sensible aux ions Ca2+ . Elle change de conformation en prsence
de Ca2+. Cela induit le dplacement de la tropomyosine, ce qui dmasque le site de fixation de
la myosine sur lactine.
Troponine
C
Actine
Tropomyosine
I = inhibitory
74
Terminaison nerveuse
Scrtion dactylcholine
Membrane plasmique
Tubule T
+
+
+
+
+
+
+
+
+++++
+++++
---Z
-
-----
REL
Na+
Rcepteur de lactylcholine
Na+
Z
actine
myosine
Protines
rgulatrices
Ca++
Ca++
Myocyte
75
76
Extracellulaire
Double
couche
de lipides
Intracellulaire
La protine
77
Pore
Site de liaison
de lactylcholine
80
3. Somme de liaisons
de faible nergie:
interaction rversible
SITE RECEPTEUR
La fixation de 2 molcules
dactylcholine sur les 2 sites de
liaison induit un changement
conformationnel de la protine qui se
traduit par une ouverture du pore
la fois au niveau de la rgion
transmembranaire et au niveau du
domaine cytoplasmique (sortie du
pore).
82
Chacune de ces fonctions est contrle par des rgions prcises et limites au sein du
rcepteur-canal.
Les mcanismes lmentaires responsables de ces trois fonctions se retrouvent dans de
trs nombreuses autres protines membranaires.
83
actylcholine
Rcepteurs
nicotiniques
motoneurone
Auto-anticorps
cellule musculaire
Rcepteurs nicotiniques
internaliss et dgrads
84