LAPORAN PRAKTIKUM "MIKROBIOLOGI PEWARNAAN GRAM DAN

PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI"

A. Judul Praktikum
PEWARNAAN GRAM DAN PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI
B. Tujuan Praktikum
Mengetahui dan memahami prosedur pewarnaan gram dan mengelompokkan
bakteri gram positif atau bakteri gram negatif serta menentukan morfologinya.
C. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri merupakan
mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak
berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri
dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu
teknik pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi bakteri.
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati
morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah
dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling
banyak digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui
morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau
metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua
kelompok besar, Gram positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel
mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian
gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena
menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan pewarnaan diferensial karena pewarnaan
ini mampu mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan
menjadi dua yaitu Gram negatif dan Gram positif.
Selain dengan pewarnaan atau pengecatan, identifikasi bakteri dapat berupa melihat
morfologi koloni dan uji biokimia bakteri. Morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur,
warna koloni,dll. Semantara uji biokimia dilakukan untuk memastikan jenis/spesies
bakterinya. Oleh karena itu, dilakukan praktikum ini untuk mengetahui teknik pewarnaan
bakteri, morfologi koloni, dan uji biokimia sehingga dapat mempernudah untuk isdentifikasi
bakteri.
2. Tinjauan Teori

Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak
bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2007) . Salah satu cara untuk mengamati
bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau
pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu
mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan baik secara langsung
(bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari
pewarnaan tersebut ialah untuk :
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik
dan kimia yang ada akan dapat diketahui (Suriawiria, 1999).
Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple stain),
pewarnaan diferensial (differential strain), dan pewarnaan khusus (special strain) (Pratiwi,
2008). Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Prosedur Pewarnaan
sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk
ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat
(coccus), batang (basil), dan spiral (Lay, 1994).
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan
gram dan pewarnaan tahan asam. Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan
diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri. Bakteri yang
diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi dua kelompok, salah satu diantaranya
bakteri gram positif dan bakteri gram negatif (Pelczar & Chan, 1986).
Pada pewarnaan gram, bakteri yang telah difiksasi dengan panas sehingga
membentuk noda pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu crystal violet. Karena
warna ungu mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini disebut pewarna primer. Selanjutnya
noda dicuci dan pada noda spesimen ditetesi iodin yang merupakan mordant. Setelah iodin
dicuci, baik bakteri Gram Positif maupun Gram Negatif tampak berwarna ungu. Selanjutnya
noda spesimen dicuci dengan alkohol yang merupakan decolorizing agent (senyawa peluntur
warna) yang pada spesies bakteri tertentu dapat menghilangkan warna ungu dari sel. Setelah
alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai kembali dengan safranin yang merupakan pewarna
basa berwarna merah. Bakteri yang tetap berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram Positif,
sedangkan bakteri yang berwarna merahdigoongkan ke dalam Gram Negatif (Suriawiria,
1999).

Perbedaan warna antara bakteri Gram Negatif dan bakteri Gram Positif disebabkan
oleh adanya perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding Gram Positif mengandung
banyak peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri Gram Negatif banyak mengandung
lipopolisakarida(Suriawiria, 1999).
Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai
gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D. Bakteri tahan asam
merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai
dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok
bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna
pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat
patogen pada manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis (Pelczar & Chan, 1986)
Pengamatan morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, dan warna koloni.
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi
menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya
dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Hadioetomo, 1993).
D. Tinjauan Pustaka
Mikrobioligi adalah ilmu yang mempelajari makhluk-makhluk hidup yang kecil, yang
hanya dapat dilihat dengan mikroskop (mikros= kecil, bios= hidup, dan logos= ilmu).
Makhluk hidup yang kecil ini disebut mikroba atau mikro-organisme. Bakteri berasal dari
kata latin bacterium (jamak, bacteria) , adalah kelompok raksasa dari organisme hidup.
Mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniseluler (bersel tunggal), dengan
struktur sel yang relatif sederhana tanpa nucleus (inti sel, cytoskeleton, dan organel lain
seperti mitoondria dan kloroplas. Istilah bakteria telah diterapkan untuk semua prokariota
atau kelompok besar mereka, tergantung pada gagasan mengenai hubungan mereka. Bakteri
adalah yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Mereka tersebar (tersebar dimanamana) di tanah, air, dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak pathogen merupakan
bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya hanya berukuran 0,5

, meski ada jenis

yang dapat mencapai 0,3mm. Meski umumnya memiliki dinding, seperti sel tumbuhan dan
jamur, tertapi dengan komposisi yang sanngat berbeda (peptidoglikan). Banyak yang
bergerak menggunakan flagella, yang berbeda dalam strukturnya dari flagella kelompok lain.
Bakteri pertama ditemukan oleh Anthony van Leewenhoek pada tahun 1674. Mikroorganisme
yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula

dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana elsel bakteri tersebut di suspensikan,. salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri
sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah degan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal
tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangakaian pengecatan (Entjang, 2003).
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat
kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan
pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang yang beragam,
sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain.
Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 m. Bentuk bakteri
bermacam macam yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam
olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan
jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel
individu bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks)
(Pelczar & Chan, 2007).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam
bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas
daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan
sekitarnya. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu
pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna
pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna
pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana.
Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagianbagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007). Teknik
pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan
sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri
atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan
tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur
pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel
mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007).
Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan Gram terbagi dua golongan, yaitu:
Gram positif , bila warna zat pewarna pertama (karbol gentian violet) tetap bertahan, dengan
demikian warna se bakteri tampak ungu tua; dan Gram negatif, bila warna zat pewarna

pertama tidak bertahan (luntur) kemudian tercat oleh zat pewarna tandingannya, misal: air
fuchsin, safranin, dan oleh zat pewarna tandingan lainnya. (Razali, 1987)
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif ialah
setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan komposisi
dinding sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang
penting; dinding sel bakteri Gram negatif pada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki
bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada
Gram positif. Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan
dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas didding
sel meningkat. Denagn demikian, kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat disari
keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan. Keterangan lain yang hampir sama juga
mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu pada
bakteri Gram negatif kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan
jalinannya jauh lebih sedikit daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan
bakteri Gram negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol
gentian violet dan lugol. Selautnya, bila sel-sel Gram psitif diperlakukan dngan lisozim untuk
menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding
akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah
dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri
Gram positif itu yag menjadi tempat tertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol gentian
violet. (Razali, 1987).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya
berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawasenyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel
bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar
pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa.
Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika
warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah
methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah
Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat
bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah
bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor
seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna
penutup (Sutedjo, 1991).

Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat
tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan
pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan
diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan
metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).
Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, salah satu di
antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna terdapat pada ion positif (zat
pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam, warna akan terdapat pada ion negatif (zat pewarna Na+). Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama
oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu
diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat
pewarna basa, Kristal violet, safranin dan metilin blue adalah beberapa zat pewarna basa
yang biasa digunakan. Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri
menyeluruh. Jadi, mewarnai bakteri dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya
pewarnaan pada daerah latar belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar
belakang yang berwarna (Volk & Wheeler, 1993).
Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan
Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut merupakan
pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua kelompok fisiologi, yang
akan memudahkan untuk identifikasi. Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah
memberi pewarna kristal violet, setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan
pewarna yodium, setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95%
selama 30 detik, kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta
warna merah) selama 1 menit. Zat pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk
senyawa yang kompleks. Beberapa bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah
apabila dicuci dan beberapa bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci
dengan alkohol 95%. Bakteri gram positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri
gram negatif akan terwarna merah (safranin) (Umsl, 2008).
Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan
ZiehlNelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik
bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram
dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua
bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk

kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram
positif akan berwarna ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus,
Stapilococcus, Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll.
Sedangkan bakteri Gram negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin
akan memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram negative
adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dll (Cappuccino
& Sherman, 1983).
Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua
kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut
warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen
kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar
tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna,
maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat
warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna
tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna
dasar. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol dan safranin
(Tracy, 2005).
Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel
bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol, maka poripori
akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak
berwarna. Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian
alcohol. Hal ini akan mengecilkan poripori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium.
Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30
lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram
negatif hanya memiliki 12 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding
sel yang lebih besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet, Aalkohol,
Ammonium oksalat, Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide, Aquades), Gram C
(Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades) (Madigan, 2003).
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut:
pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam),
pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora,
pewarnaan kapsul, pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan
Neisser (granula volutin), pewarnaan yodium (granula glikogen) dan pewarnaan negatif
(Gozali, 2009).

Memurut Pelezar and Chan, 2007 secra morfologi sel bakteri memnyai bagian-bagian
sebagai berikut:
1. Kapsul : lapisan tebal dari lendir yang membungkus sel. Fungsi kapsul adalah melindungi sel
dari kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan sebagai sarana pengikat antar sel satu
dengan yang lainnya. Kapsul berhubungan dengan sifat patogenitas dimana bakteri yang
berkapsul biasanya bersifat patogen akan hilang/ berkurang. Hal ini terjadi karena kapsul
melindungi bakteri dari dari sistem imun tubuh, sehingga ketika bakteri masuk ke tubuh
2.

hospes, sistem imun tubuh tidak mampu lelawan bakteri.

Dinding sel : bagian sel yang membungkus isi sel, terletak antara kapsul dan membran
sitoplasma dengan struktur sangat kaku. Tebal sel 10-35mm. Fungsi dindiing sel adalah
pelindung sel dari tekanan osmosis, memberi bentuk pada sel, dan berperann dalam

3.

reproduksi.
Membran sel/sitoplasma : lapisan tipis yang bersifat permiabel, fungsinya untuk mengatur

zat-zat masuk dan keluar sel.

4. Pili : benang-benag halus yang keluar dari dinding sel (seperti filamen tetapi bukan
flagela).Jumlah pili lebih banyak, lebih pendek, dan lebih kecil dari flagela.
5. Flagela : alat gerak dari bakteri terdiri dari rambut tipis yang mencuat menembus dinding sel
dan bermula dari dasar tubuh, merupakan suatu struktur granular yang tepat dibawah
membran sel dalam sitoplasma. Flagela terdiri dari tiga bagian yaitu tubuh dasar, struktur
seperti kait dan sehellai filamen panjang di luar dinding sel. Panjang flagel: beberapa kali
panjang sel, namun diameternya lebih kecil daripada diameter ssel (10-20).
6. Kromoson : merupakan pembawa sifat yang diturunkan pada sel anakan.
7. Krommosom : bakteri tidak terbentuk membran (DNA telanjang), biasanya terdiri dari satu
8.
9.
E.
1.
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
j.
2.
1.
a.
b.

sel DNA yang sirkuler

Plasmit : bahan genetk tambahan yang bersifat otonom.
Ribosom : tempat sintesis protein.
Alat dan Bahan
Alat:
Pipet tetes
Kawat ose
Lampu bunsen
Mikroskop
Botol semprot
Cover Glass
Korek api
Object Glass
Kapas
Hair drier
Bahan:
Pewarna gram
Biakan murni
Garm A: Methylene blue

c.
d.
e.
f.
g.
F.

Gram B: Iodium
Gram C: Alkohol
Gram D: Safranin
Air
Minyak imersi
CARA KERJA
obyek glass difiksasi/diaseptiskan

satu ose biakan kuman murni (bacilus sp.) diletakkan di atas obyek glass

diratakan biakan kuman murni dengan jarum ose

difiksasi dengan melidah apikan bagian yang tidak ada kumannya di atas bunsen 2-3

kali dengan cepat

dituangkan pewarna carbol gentian violet, biarkan selama 1 menit

dibuang sisa carbol gentian violet, dicuci preparat dengan air mengalir

dikeringkan preparat dengan membiarkan di udara terbuka/ dihair drier

dituangkan pewarna iodium, biarkan selama 2 menit

dibuang sisa iodium

dicuci preparat dengan air mengalir

dikeringkan preparat diudara terbuka/ dihair drier

dipucatkan dengan alkohol 95% dengan cara meneteskan perlahan sampai warna

ungu hilang
dibilas dengan air mengalir

dituangkan pewarna safranin sebagai pewarna penutup/ pembanding biarkan selama

30 detik
dibuang kelebihan safranin

dicuci preparat dengan air mengalir

dikeringkan preparat dengan meletakkan diantara 2 buah kertas isap

ditambahkan minyak imersi pada preparat dan amati preparat dibawah mikroskop dengan
perbesaran lemah (10 X) kemudian perbesaran kuat (100)
G. Data dan Hasil
KELOMPO

NAMA

BAKTERI
Bacillus sp.

TERMASUK WARNA
GRAM (+)
GRAM (-)

GAMBAR

Ungu
Berbentuk
batang (basil)

H. Pembahasan

Laporan praktikum mikrobiologi kali ini adalah pewarnaan dan pengamatan

morfologi pada bakteri. Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang
dikerjakan

di

laboratorium

mikrobiologi

untuk

kepentingan

identifikasi

mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang

khas terhadap pewarnaan tertentu (pewarnaan gram) dapat digunakan untuk identifikasi
awal. Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negative,
tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet.
Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri
sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik. Alkohol 70% yang
disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus
dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh
mikroorganisme yang tak diinginkan agar mendapatkan pengukuran yang akurat.
Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini
dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan
alkohol. Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek.
Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri
tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila
kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan
mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.
Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api.
Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga

olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan
dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala
api.
Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram A (methylene blue)
sebanyak 1-2 tetes dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan
dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan menggunakan tissue untuk
mengeringkan bagian bawah ojek gelas. Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi
kelebihan zat warna dari methylen blue.
Kemudian ditambahkan larutan gram B yang merupakan iodium.

Gram B

merupakan larutan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh
bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat
warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram, penambahan larutan
mordan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks. Tanpa penambahan larutan
mordan, zat warna methylene blueakan larut saat penambahan larutan alkohol. Lalu dibiarkan
selama 1 menit untuk dibilas kembali dengan aquades. Akibat pemberian cat Gram B, maka
pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).
Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan
penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan biru dari komplek methylen blue
dan KI pada gram negatif, karena mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap
mempertahankan warna biru karena mengandung peptidoglikan. Larutan ini juga
berfungsiuntuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negatif yang akan
menyebabkan

pori-pori

sel

membesar

sehingga

meningkatkan

daya

larut

persenyawaan methylene blue.Perlakuan ini dilakukan tidak membutuhkan waktu yang lama
atau secepat mungkin untuk melakukan pembilasan dengan aquades. Kemudian dilakukan
pengeringan.
Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin (gram D) sebanyak 2 tetes dan
diamkan selama 30 detik. Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna
pada bakteri positif karena persenyawaan kompleksmethylene blue tetap terikat pada dinding
sel. Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri
berubah menjadi merah karena warna biru yang dihasilkan oleh methylene blue telah luntur
dengan lisisnya membran sel sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau zat
pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay,
1994). Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan, Cat ini berwarna merah.
Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna

mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat
primer. Kemudian preparat dikeringkan dengan cara diangin-anginkan lalu dilakukan
pengamatan di bawah mikroskop.
Pemberian methylen blue pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna biru.
Perbedaan respon terhadap mekanis pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada
struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan
gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.
Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi
lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam
sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada
bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori
mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak
dapat masuk sehingga sel berwarna biru.
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen
dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma
organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram
negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif
memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan
bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna ,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang
sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna
terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri
seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu
spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Berdasarkan hasil pengamatan di bawah mikroskop, diidentifikasi bakteri jenis
Bacillus sp. merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram
positif.
I.

Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut :

1.

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat digunakan untuk

membedakan antara bakteri gram negatif dan gram positif. Pewarnaan ini sering digunakan

untuk identifikasi dan klasifikasi bakteri. Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda
dengan bakteri gram negatif sehingga hasil pewarnaan gram akan berbeda.
2.

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna methylene blue sewaktu
proses pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal.

3.

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan warna methylene blue
sewaktu prose pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis.

4.

Berdasarkan hasil pengamatan dapat diidentifikasi bahwa bakteri Bacillus sp. merupakan
bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram positif .
J. Daftar Pustaka
Cappuccino, J., G., & Natalie., S, 1983, Microbiology A Laboratory Manual, AddisonWesley Publishing Company : New York.
Dwidjoseputro. 1994. Mikrobiologi untuk Universitas. Ganesha Expect. Bandung.
Gozali, Amir, 2009, Pewarnaan Gram, http://www.gozali.blogspot.com/ gram/pewarnaan
gram-prinsip.html . Diakses pada tanggal 14 April 2012.
Lay, B.W, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada : Jakarta.
Madigan, M.T, 2003, Brock Biology of Microorganism, Pearson Education : inc. United
State of America.
Pelczar, M. J., Chan, E.C.S, 2007, Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book
Company: New York.
Razali, U., 1987, Mikrobiologi Dasar, Jatinangor: FMIPA UNPAD.
Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka.
Sutedjo, M., 1991, Mikrobiologi Tanah, Rineka Cipta. Jakarta.
Tracy,2005, GramStaining, www.tracy.k12.ca.us/ thsadvbio/ pdfs/ gram%20stain.pdf,
Diakses pada tanggal 18 April 2014.
Umsl, 2008, StainingBacteria, www.umsl.edu /~microbes/pdf/ stainingbacteria.pdf,
Diakses pada tanggal 18 April 2014.
Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : Jakarta
Waluyo. 2004. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : CV Rajawali.
Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.

Laporan Mikrobiologi Pewarnaan

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri
yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi
menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya
dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Dwidjoseputro.1998).
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri
itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka
dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling

utama

dalam

penelitian-penelitian

mikrobiologi

(Dwidjoseputro.1998).

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler
dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan.
Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan
bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994)
Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik
pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian bakteri.
1.2 Tujuan

Untuk mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri

Untuk mengetahui perbedaan gram positif dan gram negatif

Untuk mengetahui jenis-jenis pewarnaan bakteri

Untuk mengetahui larutan pewarna yang digunakan pada percobaan pewarnaan

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat
yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras
dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati
bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau

pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu
mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi
ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan
membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan.
Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan
infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk
melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang
digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang
memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial
lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompokkelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998).
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan
pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Hadiutomo. 1990). Pada
umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang
tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk
mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur
dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan
sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo. 1990).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.
Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan
bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.
Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga
pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding
sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004).
Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan
umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna
yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan
negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua,
yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion
positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna
adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna
basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki
muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat
warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan
negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasmasewaktu proses
pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam
sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro.1998).
Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai mikroorganisme, namun
biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam
yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada
struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang
bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap
struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan
(Dwidjoseputro.1998).
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut
pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang
bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada
pewarnaan negatif latar belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan
kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan
mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro.1998)
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini
kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak
sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali
dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi
tersebut berasal adari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu
encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya
(Sutedjo.1991).
Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali
setelah pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat
dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol.
Fiksasi digunakan untuk :
1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai
2. Melekatkan bakteri pada glass objek

3. Mematikan bakteri
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan
ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin
basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan
sederhana : zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo
(Lay.1994).
Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering
digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada
bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan
sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti
rantai (stertococcus), buah anggur ( stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus
yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay.1994).
Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah
dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau
nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri,
akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat
tidak berwarna dengan latar belakang hitam (Lay.1994).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bioteknologi dari
Denmark yang bernama Christian Gram pada tahun 1884. Menemukan metode pewarnaan
secara tidak sengaja. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu,
bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri
terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding
selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan
diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium
mikrobiologi. Pewarnaan itu merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi
bakteri (Lay,1994)
Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang
berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil
pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding
selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci
dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak

tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif
(Lay,1994)
Cirri-ciri gram negative:

Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer
Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat dalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung

asam laktat.
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik
Ciri-ciri bakteri gram positif:

Struktur dindingnya tebal

Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal
Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu
a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu
b. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan
c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur
pewarnaan gram untuk :

Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar

Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme
Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa

BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN
3.1.Waktu dan Tempat
Praktikum mikrobiologi mengenai pewarnaan dan cara-cara pewarnaan yang
dilaksanakan hari Rabu, 6 April 2011 pukul 10.00-12.00 WITA. Bertempat di Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Mulawarman
Samarinda.
3.2. Alat dan Bahan
3.2.1. Alat-alat

Mikroskop

Jarum ose

Cawan petri

Bunsen

Kapas

Pipet tetes

Botol

Beaker gelas

Gelas piala

Cover glass

Kertas saring

Pinset

Objek glass

Gunting
3.2.2. Bahan-bahan

Alkohol 95%

Aquades

Carbol Fuchsin

Crystal Violet

Nigrosin

Tinta cina

Malachite green

Lugols iodida

Safranin

Tisu

Alkohol 70%

Biakan murni bakteri

3.3. Cara Kerja
3.3.1. Pewarnaan Sederhana

1. Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen
2. Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades pada
preparat glass menggunakan jarum ose
3.

Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat
glass

4. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya

5. Diteteskan larutan zat warna crystal violet sebanyak 1 atau 2 tetes
6. Dikeringkan dan dianginkan selama 1 menit
7. Dicuci dengan air mengalir
8. Dikeringkan preparat dengan dianginkan, dan
9. Diamati dibawah mikroskop karakteristik dan bentuk bakteri
3.3.2 Pewarnaan Negatif
1. Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen
2. Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades pada
preparat glass menggunakan jarum ose
3.

Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat
glass

4. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya

5. Diteteskan larutan zat warna tinta cina 1 tetes
6. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
7. Dicuci dengan air mengalir

8. Dikeringkan preparat dengan dianginkan, dan

9. Diamati dibawah mikroskop
3.3.3 Pewarnaan Gram
1. Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen
2. Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades pada
preparat glass menggunakan jarum ose
3.

Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat
glass

4. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya

5. Diteteskan larutan zat warna crystal violet 2-3 tetes dan didiamkan selama 1 menit
6. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
7. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan
8.

Diteteskan dengan larutan Lugol dan dibiarkan selama 1 menit lalu dicuci dengan air
mengalir dan diangin keringkan

9.

Kemudian dicuci dengan dengan alkohol 95% selama 30 detik, lalu dicuci dengan air
mengalir dan dikering anginkan

10. Diberi larutan basic fuchsin atau safranin selama 2 menit

11. Dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan
12. Diamati dibawah mikroskop
3.3.4 Pewarnaan Spora
1. Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen
2. Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades pada
preparat glass menggunakan jarum ose
3.

Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat
glass

4. Ditutup dengan kertas saring

5. Diteteskan malachite green kemudian difiksasi
6. Didiamkan selama 5 menit dan dibuang kertas saring
7. Dibilas dengan air mengalir dan kemudian dianginkan
8. Diteteskan safranin dan dikeringkan tanpa fiksasi
9. Diamati dibawah mikroskop

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan
4.1.1. Tabel hasil pengamatan pewarnaan
No
.
1.

2.

3.

4.

Teknik Pewarnaan

Pengamatan

Pewarnaan Sederhana

Keterangan :

Perbesaran 400
Berwarna Ungu
Berbentuk basil
Keterangan :

Perbesaran 400
Berwarna Kuning
Berbentuk coccus
Keterangan :

Perbesaran 400
Berwarna Merah
Berbentuk basil
Gram negatif
Keterangan :

Perbesaran 400
Berwarna Merah
Berbentuk coccus

Pewarnaan Negatif

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Spora

4.2 Pembahasan
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat warna
dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan
susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara
lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin(lay ,1994).
Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit
diwarnai, dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya, metode pewarnaan
negatif merupakan suatu metode perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat warna
yang tidak meresap ke dalam sel-sel bakteri melainkan melatar belakangi sehingga kelihatan
atau nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak berwarna(negatif) (Lay.1994).

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan

bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna
crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram
negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu
diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna
ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang
digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine
(Lay.1994).
Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malachite green dan
safranin, yang dalam hasil pewarnaannya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta
warna merah pada sel vegetatifnya yaitu pada Bacillus subtitulis (Lay.1994).
Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya terdiri
dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara yang cepat
untuk melihat morfologi bakteri secara umum(Dwidjoseputro.1998).
Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung dimana
digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteru melainkan ke dalam
latar belakangnya (Lay.1994)
Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ;
sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan
larutan pencuci (Dwidjoseputro.1998).
Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang menggunakan malachite
green dan safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan muncul warna hijau pada sporanya
dan warna merah pada sel vegetatifnya (Lay.1994)
Fuchsin carbon, merupakan campuaran fuchsin fenol dan dasar yang digunakan dalam
prosedur pewarnaan bakteri. Hal ini umumnya digunakan dalam pewarnaan mikrobkateria
karena memiliki ketertarikan untuk asam mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba,
carbol fuchsin juga digunakan sebagai antiseptik tropikal (Lay,1994)
Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini
digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet
memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai
antiseptik topikal (Sutedjo,1991).
Nigrosin adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan
memanaskan campuran nirobenzena, anilin, dan hidroklorida. Industri utamanya adalah
sebagai pewarna untuk lak, pernis, dan tinta penanda pena. Didalam biologi, nigrosin

digunakan untuk pewarnaan negatif bakteri. Bentuk dan organisme yang terlihat sebagai
warna bebas menguraikan terhadap latar belakang gelap. Keuntungan dari menggunakan
metode ini daripada noda positif biasa seperti fuchsin, metilen blue, atau carbol, ialah bahwa
fiksasi sebelumnya oleh panas atau alkohol

tidak diperlukan sehingga organisme

terlihat. Selain itu pewarnaan negatif dengan nigrosin dapat mengungkapkan beberapa
mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai dengan metode biasa.
Lugols yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan
iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan, dan
untuk desinfikasi darurat air minum, dan sebagai reagen untuk deteksi pasti di dalam
laboratorium, pewarnaan dan tes medis (Dwidjoseputro.1998).
Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin
digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruhinti sel
darah merah. Ini adalah counterstain klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan
untuk deteksi tulang rawan, musin dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur
kimia. Ada juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dan aplikasi
pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan diantara keduanya.
Persiapan safranin komersial sering mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga
digunakan sebagai indikator redok dalam kimia analitik (Sutedjo,1991)
Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak
realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi bertujuan
untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur
selnya (Lay,1994).
Menurut hasil pengamatan, pada pewarnaan sederhana dikemukakan bakteri dengan
bentuk basil dan berwarna ungu dalam pembesaran 400. Pada pewarnaan negatif, tidak
ditemukan terlalu banyak bakteri, ditemukan bakteri dengan bentuk coccus dan pewarnaan
negatif mewarnai belakangnya berwarna biru gelap dan bakteri berwarna kuning. Pada
pewarnaan gram ditemukan bakteri jenis gram negatif dengan warna merah dan memiliki
bentuk basil pada perbesaran mikroskop hingga 400. Sedangkan, pada perwarnaan spora
yang menggunakan malachite green dan safranin, spora seharusnya berwarna hijau, tetapi
pada hasil pengamatan yang terlihat hanya warna merah dari safranin, yaitu sel vegetatifnya
dengan bentuk coccus pada perbesaran 400 di mikroskop.
Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat warna yang
berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang maksimalnya dalam proses fiksasi
sehingga masih ada bakteri yang belum mati, dan faktor yang lain adalah pada proses

pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air sehingga dapat menyebabkan
bakteri larut terbawa air

BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Dari percobaan pewarnaan yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan :

Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna, substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup

Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif
berwarna ungu kareana dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta perbadaan
terjadi pada dinding selnya

Macam-macam

pewarnaan

anatara

lain

differensial,pewarnaan spora dan perwarnaan kapsul

pewarnaan

sederhana,pewarnaan

Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain : alkohol, carbol
fuchsin, crystal violet, nigrosin, malachite green, lugols iodida, dan safranin.
5.2 Saran
Sebaiknya pada praktikum dilakukan percobaab yang lain seperti pewarnaan kapsul,
basil tahan asam, dan perwarnaan fulton, diharapkan dengan mempelajari berbagai macam
metode pewarnaan lebih banyak mengenai tentang proses dan metode pewarnaan.

DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro,
Hadiutomo.
Lay,
Sutedjo,

D.1998.Dasar-Dasar
1990.

Mikrobiologi

Bibiana.W.1994.Analisis
Mul

Mikrobiologi,
Dasar

Mikroba

Mulyani.1991.Mikrobiologi

di

Malang

Jilid

I.

Jakarta:

Laboratorium.Jakarta
Tanah.Jakarta

Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum.Malang : UMM Press

Djambatan

Erlangga
:

Rineka

Rajawali
Cipta

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat
yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras
dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati
bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau
pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya, yaitu
mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Hastowo, 2002).
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi
ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan
membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan.
Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan
infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk
melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang
digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang
memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial
lainnya ialah pewarnaan Ziehl Neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompokkelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro, 1994).

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling
penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan
bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut: zat pewarna kristal violet,
larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat
warna safranin atau air fuchsin (Hastowo, 2002).
1.2 Tujuan
Adapun tujuan dilaksanakannya praktikum Pengecatan/Pewarnaan Bakteri ini adalah
untuk mengamati morfologi bakteri, untuk mengamati dan membedakan struktur yang
terdapat dalam sel dan juga untuk membedakan kelompok bakteri berdasarkan reaksinya
terhadap warna yang sekaligus menunjukkan sifat bakteri tersebut, serta untuk mempelajari
pewarnaan spora bakteri.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian Pewarnaan Bakteri
Pengenalan bentuk mikroba, kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih
dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah
pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jasad, mengamati struktur dalam dan luar
sel bakteri, dan melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau
kimia jasad dapat diketahui (Hadioetomo, 1991).
Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak
bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Hastowo, 2002).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.
Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan
bakteri gram negatif, yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.
Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga
pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding
sel seperti Mycoplasma sp (Hadioetomo, 1991).
Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan
umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna
yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan
negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna (Hadioetomo. 1991).

2.2 Macam-Macam Pewarnaan Bakteri

Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
1. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan.
Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai
organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan
sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan
sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa
digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuchsin
yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan
(Dwidjoseputro, 1994).
a.

Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya

untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah
metilen biru dan air fuchsin (Dwidjoseputro, 1994).
b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri
tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme
kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Metode ini menggunakan tinta cina (Dwidjoseputro, 1994).
2. Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan
teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumoniae. Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat
warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak.
Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil
ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.

Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka (Hastowo, 2002).
Menurut (Hadioetomo, 1991), dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu:
a.
b.

Zat warna utama (violet kristal)

Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
Pencuci/peluntur zat warna (alkohol/aseton) yaitu solven organic yang digunakan untuk

c.

melunturkan zat warna utama.

Zat warna kedua/cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang
telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alkohol.
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan
safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa
peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel
menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru
(Hadioetomo, 1991).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu
lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu
pendek (Hadioetomo, 1991).
Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan karbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh
permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak
sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7
menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan.
Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan
dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan
dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan,
dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Zaraswati, 2004).
3. Pewarnaan Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau
tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus:
Pewarnaan Endospora anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus
adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan
bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu
bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan

kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel
vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah
mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan. Namun jika
dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Hastowo,
2002).
a. Pewarnaan Kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat
sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan
dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang
yang berwana biru gelap (Hastowo, 2002).
b. Pewarnaan Spora
Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bisa menembusnya dengan
cara memanaskan preparat (Hastowo, 2002).
c. Pewarnaan Flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil,
sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel (Hastowo, 2002).
d. Pewarnaan Nukleoid
Pewarnaan nukleoid menggunakan pewarna fuchsin yang khusus untuk DNA
(Hastowo, 2002).
BAB III
METODOLOGI PRAKTIKUM
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum Mikrobiologi dengan judul Pengecatan/Pewarnaan Bakteri dilaksanakan
pada hari Senin, tanggal 9 Desember 2013 pada pukul 13.20 WIB hingga selesai. Praktikum
ini bertempat di Laboratorium Biologi Institut Agama Islam Negeri (IAIN) Raden Fatah
Palembang.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Alat yang digunakan yaitu:
1.

Object Glass

2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Tisu
Jarum Ose
Mikroskop
Bunsen
Nampan
Rak dari Kawat
Penaras Air
3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan yaitu:

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Akuades
Metilen Blue
Gentian Violet
Larutan Iodium
Alkohol 96%
Larutan Safranin
Bakteri yang akan diuji
3.3. Cara Kerja

3.3.1
a.
1)
2)
3)

Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana positif
Bersihkan object glass dengan kapas.
Jika perlu tuliskan kode atau nama bakteri pada sudut object glass.
Bila menggunakan biakan cair pindahkan setetes biakan dengan pipet tetes atau dapat juga
dipindahkan dengan jarum inokulum. Jangan lupa biakan dikocok terlebih dahulu. Jika
digunakan biakan padat, maka biakan dipindahkan dengan jarum inokulum, satu ulasan saja

kemudian diberi aquades dan disebarkan supaya sel merata.

4) Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen (lewatkan pada api 2-3
5)

kali).
Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna (dapat

digunakan methylen blue, safranin, crystal violet) dan tunggu kurang lebih 30 detik.
6) Cuci dengan aquades kemudian keringkan dengan kertas tisu.
7) Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10).
b. Pewarnaan sederhana negatif
1) Ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina diujung kanan salah satu object
glass.
2) Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nitrogen tadi, lalu dicampurkan.
3) Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan kesamping kiri.
4) Biarkan preparat mengering diudara, jangan difiksasi atau dipanaskan diatas api.
3.3.2

Pewarnaan gram
Cara kerja
Hasil atau dampak
Buat preparat ulas (smear) yang Sel bakteri tertempel pada

telah difiksasi dari bakteri gram permukaan kaca (object glass).

positif misal Bacillus subtilis
dan

gram

negatif

misal

Escherichia coli.
Teteskan kristal violet sebagai Kristal ungu akan mewarnai
pewarna

utama

pada

kedua seluruh

permukaan

bakteri

preparat, usahakan semua ulasan gram positif dan gram negatif.

terwarnai dan tunggu selama
lebih kurang 1 menit.
Cuci dengan aquades mengalir.
Teteskan mordan (lugols iodin)

Adanya

lugols

iodin

lalu tunggu kurang lebih 1 menyebabkan adanya ikatan

menit.

CV dengan iodin

yang akan

meningkatkan

afinitas

pengikatan zat warna oleh

bakteri.
dapat

Pada

gram

terbentuk

CV

positif
iodin

ribonukleat pada dinding sel.

Cuci dengan aquades mengalir.
Beri larutan pemucat (alkohol Penetesan
etanol
absolut
96%/aseton) setetes demi setetes menyebabkan
sehingga

etanol

yang

terbentuknya

jatuh pori-pori pada gram negatif

berwarna jernih. Jangan sampai yang memiliki banyak lapisan

terlalu banyak (overdecolorize)

lemak

(lipid

larut

dalam

etanol), sehingga CV-iodine

akan lepas dari permukaan sel
gram negatif, sedangkan pada
gram positif CV-iodin tetap
menempel pada dinding sel, sel
gram negatif menjadi bening.
Cuci dengan aquades mengalir.
Teteskan counterstain (safranin) Safranin akan mewarnai sel
dan tunggu selama kurang lebih gram negatif menjadi berwarna
45 detik.

merah, sedangkan gram positif

tidak

terpengaruh.

Counterstain hanya berfungsi

sebagai pengontras saja.

Cuci dengan aquades mengalir.
Keringkan preparat dengan
kertas tisu yang ditempelkan
disisi ulasan (jangan sampai
merusak ulasan) lalu biarkan
mengering diudara.
3.3.3
a.
b.
c.

Pewarnaan Spora
Sediakan object glass yang bersih, lalu fiksasi.
Teteskan setetes aquades steril diatas kaca object glass tersebut.
Ambil bakteri yang akan diuji dengan menggunakan jarum ose (inokulasi), lalu letakkan

d.

diatas tetesan aquades itu, ratakan pelan-pelan.

Ambil object glass yang lainnya yang bersih, lalu letakkan diatas object glass sediaan

e.
f.
g.

tersebut sehingga membentuk sudut 450.

Geser object glass, sehingga sediaan menjadi tipis dan merata, biarkan hingga kering
Fiksasi dengan cara melewatkan sediaan diatas nyala api bunsen dengan cepat.
Teteskan larutan hijau metalik diatas apusan bakteri tersebut, lalu panskan diatas uap air
mendidih selama 5 menit. Jagalah jangan sampai apusan mengering, jika mengering

h.
i.

tambahkan kembali larutan hijau metalik.

Cuci dengan air mengalir.
Teteskan dengan larutan safranin pada apusan sehingga seluruh apusan tertutup biarkan

j.
k.

selama 1-2 menit.

Cuci dengan air mengalir, lalu keringkan dengan menggunakan kertas hisap atau tisu.
Amati dengan menggunakan mikroskop dengan minyak imersi. Sel vegetatif akan berwarna

l.

merah muda dan spora akan berwarna hijau.

Gambar sel dengan sporanya.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
Bentuk

Warna

Gambar

Batang/Basil

Ungu

Bacillus subtilis
(Gram Positif)

Bulat

Merah Muda

Serratia marcescens
(Gram Negatif)
4.2 Pembahasan
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri
gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna kristal
violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif
akan kehilangan zat warna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat
pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini
disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang digunakan
dalam pewarnaan gram antara lain: kristal violet, alkohol, safranin, dan iodin (Lay, 1994).
Fuchsin carbon, merupakan campuran fuchsin fenol dan dasar yang digunakan dalam
prosedur pewarnaan bakteri. Hal ini umumnya digunakan dalam pewarnaan mikrobateria
karena memiliki ketertarikan untuk asam mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba,
carbol fuchsin juga digunakan sebagai antiseptik tropikal (Lay, 1994).
Crystal violet atau ungu gentian digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram
klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan
sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal (Pelczar, 1986).

Nigrosin adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan
memanaskan campuran nitrobenzena, anilin, dan hidroklorida. Industri utamanya adalah
sebagai pewarna untuk lak, pernis, dan tinta penanda pena. Didalam biologi, nigrosin
digunakan untuk pewarnaan negatif bakteri. Bentuk dan organisme yang terlihat sebagai
warna bebas menguraikan terhadap latar belakang gelap. Keuntungan dari menggunakan
metode ini daripada noda positif biasa seperti fuchsin, metilen blue, atau carbol, ialah bahwa
fiksasi sebelumnya oleh panas atau alkohol tidak diperlukan sehingga organisme terlihat.
Selain

itu

pewarnaan

negatif

dengan

nigrosin

dapat

mengungkapkan

beberapa

mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai dengan metode biasa (Lay, 1994).
Lugols yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan
iodida dalam air. Larutan iodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan, dan
untuk desinfikasi darurat air minum, dan sebagai reagen untuk deteksi pasti di dalam
laboratorium, pewarnaan dan tes medis (Dwidjoseputro, 1994).
Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin
digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Persiapan safranin
komersial sering mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai
indikator redok dalam kimia analitik (Dwidjoseputro, 1994).
Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak
realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pembakaran. Fiksasi bertujuan
untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur
selnya (Lay, 1994).
Pada praktikum kali ini para praktikan menggunakan larutan pewarnaan yang telah jadi,
namun tetap harus diketahui bagaimana cara pembuatan larutan pewarnaan secara manual.
Untuk larutan kristal violet sebanyak 100 gram, dibutuhkan alkohol

sebanyak 20 ml,

amonium oksalat 0,8 gram, dan aquades 80 ml yang kemudian harus di homogenkan
menggunakan hot plate. Lalu untuk larutan lugol komposisinya yaitu iodium sebanyak 3
gram, kalium iodin 0,6 gram, dan aquades 100 ml, yang kemudian juga dihomogenkan
terlebih dahulu mnggunakan hot plate. Larutan ketiga yaitu aseton alkohol yang merupakan
campuran dari aseton sebanyak 30% dan alkohol sebanyak 70%, campuran larutan ini tidak
perlu di homogen kan menggunakan hot plate, karena mereka sudah sama-sama homogen.
Larutan yang terakhir yaitu safranin, untuk larutan ini digunakan safranin serbuk sebanyak
0,5 gram, etanol 10 ml, dan aquades 100 ml, yang selanjutnya di homogenkan menggunakan
hot plate.

Pada praktkum di dapati hasil bahwa pada pewarnaan bakteri Bacillus subtilis dengan
pengamatan mikroskop pada perbesaran 4x10 bentuk bakterinya basil/batang, lalu warna
yang tetap menempel adalah warna ungu, sehingga diketahui bahwa Bacillus subtilis
merupakan gram positif. Sedangkan pada bakteri Serratia marcescens yang diamati dengan
mikroskop pada perbesaran 4x10 juga, bakteri berbentuk bulat/kokus dan tetap
mempertahankan warna merah muda, yang berarti Serratia marcescens merupakan gram
negatif.
Hal ini diperkuat oleh (Pelczar, 1986). Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai
antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif yaitu bakteri gram-positif adalah bakteri
yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis
ini akan berwarna biru atau ungu dibawah mikroskop, sedangkan bakteri gram-negatif akan
berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini
terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri.
Menurut (Lay, 1994). Bakteri gram-negatif tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu
gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji
pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Pada praktkum kali ini di dapati hasil bahwa pada pewarnaan bakteri Bacillus subtilis
dengan pengamatan mikroskop bentuk bakterinya basil/batang, lalu warna yang tetap
menempel adalah warna ungu, sehingga diketahui bahwa Bacillus subtilis merupakan gram
positif. Sedangkan pada bakteri Serratia marcescens yang diamati dengan mikroskop, bakteri
berbentuk bulat/kokus dan tetap mempertahankan warna merah muda, yang berarti Serratia
marcescens merupakan gram negatif.
5.2 Saran
Dalam melaksanakan praktikum mengenai pengecatan/pewarnaan bakteri, diharapkan
ketika dalam pemberian larutan warna dilakukan secara hati-hati dan teliti, dan harus sesuai
dengan prosedur yang telah ditentukan.

Diposkan oleh Deby Noviyanti di 6/17/2015 01:06:00 AM

Kirimkan Ini lewat EmailBlogThis!Berbagi ke TwitterBerbagi ke FacebookBagikan ke
Pinterest
Label: Laporan Praktikum Mikrobiologi

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil Pengamatan Terlampir

3.2 Pembahasan
Pada percobaan pertama yaitu pewarnaan basa menggunakan metiline
blue. Setelah dimati di bawah mikroskop, dapat diketahui bahwa sel bakteri
Staphylococcus aereus, Bacillus sp. dan E. Coli, berwarna biru. Pada isolat bakteri
jantung ayam dan daging ayam, selnya juga berwarna biru disebabkan oleh
dinding sel bakteri yang memiliki muatan negatif bersatu dengan ion yang
bermuatan positif dari metiline blue dan menyebabkan sel bakteri tersebut
terwarnai (Ramona dkk, 2007). Sedangkan pada isolat bakteri hati ayam selnya
tidak berwarna, hal tersebut diakibatkan pada saat pencucian dengan air mengalir
yang terlalu lama, dan pada saat pengeringan tersentuh oleh praktikan, sehingga
warna metiline blue luntur.
Pada percobaan kedua yaitu pewarnaan negatif, menggunakan cairan
nigrosin (tinta cina). Hasil yang didapat setelah diamati dibawah mikroskop
adalah semua isolat bakteri selnya berwarna bening, tetapi pada lingkungan di
sekitar sel tampak berwarna hitam. Hal tersebut terjadi karena pewarna ini tidak
menembus atau berikatan dengan dinding sel bakteri akibat adanya daya tolak
menolak antara muatan negatif pewarna dan muatan negatif dinding sel bakteri.
Pewarna akan membentuk deposit di sekitar bakteri atau menghasilkan latar

PEWARNAAN GRAM DAN PENGAMATAN MORFOLOGI BAKTERI

Diposkan oleh ina sholihah di 07.17 1 komentar

I.

Tujuan
Mengetahui

dan

memahami

prosedur

pewarnaan

gram

dan

mengelompokkan bakteri ke dalam kelompok bakteri gram positif atau

II.

bakteri gram negatif serta menentukan morfologinya.

Pendahuluan
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur
dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri adalah
domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki membran
inti (prokariota).
coccus,

basil,

Bakteri memiliki beragam variasi

dan

spiral,

serta

dapat

hidup

bentuk,seperti

soliter

maupun

berkoloni.Habitat bakteri sangat bervariasi dari air, tanah, udara,

hingga dalam tubuh hewan. Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen
sehingga tidak berwarna dan hampir tidak kelihatan karena tidak
kontras dengan medium dimana mereka hidup. Oleh karena itu, perlu
dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan
mikroskop (Dwidjoseputro, 2005).
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mulamula diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau
pewarnaa, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaan
gram merupakan salah satu teknik pewarnaan atau pengecatan yang
dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi
bakteri. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan
sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan gram)
dapat digunakan untuk identifikasi awal. Dengan metode pengecatan
gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram
positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap
cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh
komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan gram tidak bisa
dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel.
Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutanlarutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan iodium, larutan

alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa

safranin.
Bakteri garam positif adalah bakteri yang mempertahanka zat warna
metil ungu atau Kristal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri
jenis tersebut akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda atau
merah. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri tersebut
terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
(Karmana, 2008).Berdasarkan hal tersebut maka dilakukanlah agar
praktikan dapat memahami dan melakukan pewarnaan gram terhadap
suatu jenis bakteri; mengidentifikasi suatu jenis bakteri gram positif
atau gram negatif; dan mengamati bentuk bakteri.
III.
Tinjauan Pustaka
A. Pewarnaan Gram
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri
sangat

kecil,

bentuk

tubuh

bakteri

baru

dapat

dilihat

dengan

menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih

(Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel
beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel
spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran
antara 0,1 sampai 0,3 m. (Pelczar dan Chan, 2007).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri
dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk
melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan
vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada
bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme
dengan sekitarnya. (Pelczar & Chan, 2007).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah
satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion
bermuatan

negatif.

Senyawa-senyawa

kimia

ini

berguna

untuk

membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan

memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai
dasar pewarnaan bakteri. (Pelczar & Chan, 2007).

Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara

komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang
disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan
listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna.(Volk dan
Wheeler, 1993)
Macam-Macam Pewarnaan
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan
sebagai berikut :
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana adalah pewrnaan yang menggunakan zat
warna yang tunggal bertujuan untuk mengindentifikasi morfologi sel
bakteri. Pada pewarnaan ini zat warna yang kami gunakan adalah
gentiana violet.Biasanya bakteri maupuin sekitarnya akan mempunyai
warna yang sama, tetapi dengan intensitas yang berbeda. Pewarna
sederhana yaitu tipe pewarna yang paling sederhana, caranya hanya
dengan menambahkan pada olesan yang telah difiksasi salah satu
diantaranya

zat

warna

berikut

Lembayung

gentian,

lembayung

safranin, biru metilen, furchin bara dan zat warna anilin bara yang
lainnya. (Pelczar & Chan, 2007)
a. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna
dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang
dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.
(Pelczar & Chan, 2007)
b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk
mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam
gelap.

Pada

pewarnaan

ini

mikroorganisme

kelihatan

transparan

(tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan

ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
(Pelczar & Chan, 2007)
Kebanyakan

bakteri

mudah

bereaksi

dengan

pewarna-pewarna

sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa)

sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana

umumnya

bersifat

alkalin

(komponen

kromoforiknya

bermuatan

positif).Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang
dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu
cara

yang

cepat

untuk

melihat

morfologi

bakteri

secara

umum.

Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen
(30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).
(Pelczar & Chan, 2007)
2. Pewarnaan differensial
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna
seperti pewarnaan gram. Pewarnaan gram atau metode gram adalah
salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas di gunakan
untuk mengidentifikasi bakteri. Metode ini di beri nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938) yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk

membedakan

antara pneumokokus dan bakteri Klebsiela, pneumonia. Bakteri yang

telah diwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu,
bakteri gram positf dan bakteri gram negatif. Bakteri garam positif
akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan
tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram
negatif akan kehilangan zat pewarna Kristal violet setelah dicuci
dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingnya yaitu
dengan zat pewarn air fucshin atau safranin akan tampak berwarna
merah. Perbedaan warna ini di sebabkan oleh perbedaan dalam
struktur kimiawi dinding selnya (Pelczar dan Chan, 2007).
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
a. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau
b.

multilayer.
Dinding

selnya

mengandung

lemak

lebih

banyak

(11-22%),

peptidoglikan terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan

jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.
c. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
d. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya
kristal violet.
e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
f. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
(Pelczar dan Chan, 2007)

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

a. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau
b.

monolayer.
Dinding selnya

mengandung

lipid

yang

lebih

normal

(1-4%),

peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama

merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
c. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
d. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu
kristal.
e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
f. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
(Pelczar dan Chan, 2007)
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
a.
b.

Zat warna utama (violet kristal)

Mordan (larutan Iodin) yaitu

senyawa

yang

digunakan

untuk

mengintensifkan warna utama.

c.
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic
yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
d. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan
dengan alcohol. (Pelczar dan Chan, 2007)
Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan
Gram negatif ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini,
berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding sel. Perbedaan
ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang
penting; dinding sel bakteri Gram negatif pada umumnnya lebih tipis
dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid
bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya
dalam eksperimen pengecatan menunjukkan bahwa perlakuan dengan
alkohol

mengeskstrak

lipid,

yang

menyebabkan

poisitas

atau

permeabilitas dinding sel meningkat. Dengan demikian, kompleks

karbol gentian violet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram
negatif

terwarnakan.

Keterangan

lain

yang

hampir

sama

juga

mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua golongan

bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif kandungan peptidoglikan
jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit
daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram

negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks
karbol gentian violet dan lugol. Selanjutnya, bila sel-sel Gram psitif
diperlakukan dengan lisozim untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa
strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan
tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel
ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa
struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yang menjadi tempat
pertahannya

zat

pewarna

pertama

yaitu

karbol

gentian

violet.

(Karmana, 2008)
Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi
pada dinding sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan
dalam pemberian alcohol, maka poripori akan membesar dan tidak
mengikat

pewarna.

Hal

ini

menyebabkan

bakteri

menjadi

tidak

berwarna. Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi

selama pemberian alcohol. Hal ini akan mengecilkan poripori sehingga
menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki
dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan
sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan
bakteri Gram negatif hanya memiliki 12 lapisan peptidoglikan sehingga
memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar. Pewarnaan Gram
terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet, alkohol, Ammonium oksalat,
Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide, Aquades), Gram C
(Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades) (Pelczar
& Chan, 2007).
Perbandingan Karakteristik Gram positif dan Gram negatif
1. Dinding sel
a. Gram positif : Homogen dan tebal (20-80 nm) serta sebagian besar
tersusun dari peptidoglikan. Polisakarida lain dan asam teikoat dapat
ikut menyusun dinding sel.
b. Gram negatif : Peptidoglikan (2-7 nm) di antara membran dam dan
luar, serta adanya membran luar (7-8 nm tebalnya) yang terdii dari
lipid, protein, dan lipopolisakarida
2. Bentuk sel
a. Gram positif : Bulat, batang atau filamen
b. Gram negatif : Bulat, oval, batang lurus atau melingkar seprti tand
koma, heliks atau filamen; beberapa mempunyai selubung atau kapsul
3. Reproduksi

a.
b.
4.
a.
b.
5.
a.

Gram positif : Pembelahan biner

Gram negatif : Pembelahan biner, kadang-kadang pertunasan
Metabolisme
Gram positif : kemoorganoheterotrof
Gram negatif : Fototrof, kemolitoautotrof, atau kemoorganoheterotrof
Motilitas
Gram positif : Kebanyakan nonmotil, bila motil tipe flagelanya adalah

b.

petritrikus (petritrichous)
Gram negatif : Motil atau nonmotil. Bentuk flagela dapat bervariasi-

6.
a.
b.
7.
a.
b.

polar,lopotrikus (lophtrichous), petritrikus (petritrichous).

Anggota tubuh (apendase)
Gram positif : Biasanya tidak memiliki apendase
Gram negatif : Dapat memiliki pili, fimbriae, tangkai
Endospora
Gram positif : Beberapa grup dapat membentuk endspora
Gram negatif : Tidak dapat membentuk endospora
(Tracy, 2005)
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat

Bakteri garam (+)

Bakteri

gram

negatif(-)
Komposisi dinding

Kandungan lipid rendah

Kandungan lipid

sel

(1-4%)

tinggi

Ketahanan

Lebih sensitif

Lebih tahan

Lebih dihambat

Kurang dihambat

Kebanyakan spesies

Relatif sederhana

terhadap penisilin
Penghambatan
oleh pewarna
basa (VK)
Kebutuhan nutrisi

relatif kompleks
Ketahanaa

Lebih tahan

Kurang tahan

terhadap
perlakuan fisik
(Tracy, 2005)
3. Pewarnaan tahan asam
Pewarnaan ini menggunakan pewarna utama karbol fuksin. Yang
memungkinkan bakteri tahan asam terlihat berwarna merah, sementara

jenis lain akan tampak sesuai pewarna pembanding. Pewarnaan ZiehlNeelsen menggunakan 3 jenis larutan, yaitu ZN A, ZN B, dan ZN C.
Larutan

ZN

merupakan

cat

utama

yang

berupa

karbolfuksin,

memberikan warna merah kepada sel bakteri. Larutan ZN B adalah

peluntur yang berupa etanol, yang melunturkan warna merah pada
bakteri tidak tahan asam, sementara warna merah pada bakteri tahan
asam tidak luntur. Larutan ZN B merupakan pewarna pembanding
berupa methylen blue, sehingga bakteri tidak tahan asam yang tadi
warnanya luntur memiliki kekontrasan dengan bakteri tahan asam.
Hasil akhirnya adalah bakteri tahan asam tampak berwarna merah,
sementara bakteri tidak tahan asam berwarna biru. (Pelczar & Chan,
2007).
4. Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel,
pewarnaan spora, pewarnaan kapsul dan pewarnaan nucleoid
a. Pewarnaan Spora
Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha
mengamankan diri

terhadap pengaruh buruk dari luar.spora bakteri

mempunyai fungsi yang sama seperti kristal amoeba, sebab bakteri

dalam bentuk spora dan amoeba dalam bentuk Kristal merupakan suatu
fase

di

mana

kedua

mikroorganisme

itu

berubah

bentuk

untuk

melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak menguntungnkan.

Endospora hanya terdapat pada bakteri merupakan tubuh dinding yang
tebal yang sangat refraktif, dan sangat resisten. Dihasilkan oleh semua
spesies basillus, clostidum, dan sporosarcina. Bakteri yang mampu
membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak
generasi sehingga sel vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di
dalam

pertumbuhanya,

terjadi

sintesis

protoplasma

baru

dalam

sitoplasma vegetatifnya yang di maksudkan untuk menjadi spora

(Pelczar dan Chan, 2007).
Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang bulat panjang. Hal ini
tergantung oleh spesisesnya endospora ada yang lebih kecil ada pula
yang lebih besar dari pada diameter sel induk. Letak sel di dalam sel
serta ukurannya dalam pembentukanya

tidaklah sama bagai semua

spesies. Sebagai contoh beberapa spora adalah sental yang dibentuk

ditengah-tengah

sel,

yang

kedua

adalah

terminal

yang

dibentuk

diujung, ketiga yaitu subterminal yang dibentuk di dekat ujung. Pada

umumnya sporulasi itu mudah terjadi jika keadaan medium memburuk

dan zat-zat yang timbul sebagai zat-zat pertukaran zat bertimbuntimbun dan faktor-faktor luar lainya merugikan tetapi pada beberapa
spesies mampu membentuk spora meskipun tidak terganggu oleh
faktor luar. Sporulasi dapat di cegah, jika selalu diadakan pemindahan
piaraan

ke

medium

yang

baru,

beberapa

spesies

bakteri

dapat

kehilangan kemampuanya untuk membentuk spora-spora dapat tumbuh

lagi menjadi bakteri apabila keadaan di luar menguntungkan. Mulamula air meresap ke dalam spora, kemudian spora mengembang dan
kulit spora menjadi retak karenanya keretakan ini dapat terjadi pada
salah satu ujung. Tetapi juga dapat terjadi di tengah-tengah spora. Hal
ini merupakan cirri khas bagi beberapa spesies bacillus, jika kulit spora
pecah di tengah-tengah maka masing-masing pecahan akan merupakan
suatu tutup pada kedua ujung bakteri (Pelczar dan Chan, 2007).
b. Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat
yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel
dan flagel. (Tracy, 2005).
c. Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan
tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat
pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan
kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang
berwana biru gelap. (Pelczar dan Chan, 2007).
d. Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk
DNA (Hamid, 2010).
5. Pewarnaan negatif
Pewarnaan negatif yaitu dengan pewarnaan latar belakang sel
dengan zat warna asam, sehingga sel sel tersebut secar kontras tidak
berwarna. Yang biasanya dipakai adalah zat warna hitam nigrosin.
Metode ini digunakan untuk sel sel dan struktur struktur yang sukar
diwarnai secara langsung. (Hamid, 2010).
Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri sebagai
berikut:

1. Fiksasi
Fiksasi perlu dilakukan sebelum pewarnaan bakteri karena berguna
merekatkan

sel

bakteri

pada

gelas

objek,

membunuh

bakteri,

melepaskan granula (butiran) protein menjadi gugusan reaktif (NH 3+)

membuat

sel-sel

lebih

kuat,

mencegah

terjadinya

otolisis

sel,

mengubah avinitas, fiksasi dapat dilakukan secara fisik atau dengan

bahan kimia.
2. Peluntur zat warna
Peluntur zat warna berguna untuk menghasilkan kontras yang lebih
baik pada bayangan mikroskop. Pada umumnya, sel-sel yang mudah
diwarnai akan lebih mudah pula dilunturkan warnanya. Sedangkan selsel yang sukar diwarnai akan lebih sukar dilunturkan warnanya.
3. Substrata
Merupakan zat warna asam atau basa dapat bereaksi dengan
senyawa-senyawa tertentu. Oleh karena itu, senyawa-senyawa organik
seperti

protein,

karbohidrat,

lemak

dan

asam

nukleat

akan

mempengaruhi pewarnaan. Berdasarkan jenis zat warna yang diserap

oleh sel, maka dapat dibedakan tiga macam sel yaitu: sel-sel asidofil,
basodill dan sudanofil.
4. Intensifikasi warna
Zat

warna

dapat

diintensifikasikan

dengan

cara

menambahkan

mordan, yaitu zat kimia yang dapat menyebabkan sel-sel bakteri dapat
diwarnai lebih intensif karena zat warna terikat lebih kuat daripada
jaringan sel. Mordan dibagi atas dua macam, yaitu mordan asam dan
mordan basa. Mordan asam adalah mordan yang bereaksi dengan zatzat warna basa. Sedangkan mordan basa adalah mordan yang bereaksi
dengan anion zat warna asam.
5. Zat warna penutup atau zat warna lawan
Zat warna lawan adalah suatu zat warna basa yang berbeda
warnanya dengan zat warna mula-mula yang digunakan. Gunanya
adalah untuk memberikan warna pada sel-sel yang berbeda warnanya

dengan zat warna mula-mula. Zat warna penutup diberikan pada akhir
pewarnaan dengan tujuan untuk memberikan kontras pada sel-sel yang
tidak menyerap zat warna utama.
(Pelczar & Chan, 2007).
B. Morfologi Bakteri
Bakteri merupakan mikrobia prokariotik uniselular, termasuk klas
Schizomycetes, berkembang biak secara aseksual dengan pembelahan
sel.

Bakteri

tidak

berklorofil

kecuali

beberapa

yang

bersifat

fotosintetik. Cara hidup bakteri ada yang dapat hidup bebas, parasitik,
saprofitik, patogen pada manusia, hewan dan tumbuhan. Habitatnya
tersebar luas di alam, dalam tanah, atmosfer (sampai 10 km diatas
bumi), di dalam lumpur, dan di laut. Bakteri mempunyai bentuk dasar
bulat, batang, dan lengkung. Umumnya bakteri berukuran 0,5-10 m.
(Volk dan Wheeler, 1993)
a. Bakteri bentuk bulat
Bakteri berbentuk bulat dikenal sebagai basil. Kata basil berasal dari
bacillus yang berarti batang. Bentuk basil dapat pula dibedakan atas:
1. Basil tunggal yaitu bakteri yang hanya berbentuk satu batang tunggal,
misalnya Salmonella typhi, penyebab penyakit tipus.
2. Diplobasil yaitu bakteri berbentuk batang yag bergandengan dua-dua.
3. Streptobasil yaitu bakteri berbentuk batang yang bergandengan
memanjang membentuk rantai misalnya Bacillus anthracis penyebab
penyakit antraks.
b. Bakteri bentuk bola
Bakteri berbentuk bola dikenal sebagai coccus, bakteri ini juga dapat
dibedakan atas:
1. Monokokus, yaitu bakteri berbentuk bola tunggal, misalnya Neisseria
gonorrhoeae, penyebab penyakit kencing nanah.
2. Diplokokus, yaitu bakeri berbentuk bola yang bergandengan dua-dua,
misalnya Diplococcus pneumonia penyebab penyakit pneumonia atau
radang paru-paru.

3. Sarkina, yaitu bakteri berbentuk bola yang berkelompok empat-empat

sehngga bentuknya mirip kubus.
4. Streptokokus, yaitu bakteri bentuk bola yang berkelompok memanjang
membentuk rantai.
5. Stafilokokus, yaitu bakteri berbentuk bola yang berkoloni membentuk
sekelompok sel tidak teratur sehingga bentuknya mirip dompolan buah
anggur.
c. Bakteri bentuk spiral
adalah bakteri yang bengkok atau tidak lurus atau berbentuk silinder.
Bakteri yang berbentuk spiral itu tidak banyak terdapat. Spiral terbagi
menjadi tiga bentuk diantaranya :
1.

Vibrio atau bakteri koma

Batang melengkung seperti koma dan kadang membelit seperti huruf S.

2.

Mempunyai spiral yang pendek.

Spiril
Bentuknya seperti spiral atau seperti lilitan. Individu-individu sel yang

3.

tidak saling melekat.

Spirocheta
Bentuknya seperti spiral tetapi pergerakannya sangat aktif yang
dimungkinkan karena adanya flagela yang membelit diketahui bentuk
aslinya (Hamid, 2010).

Ada tiga mcam bentuk spiral:

1. Spiral, yaitu golongan bakteri yang bentuknya seperti spiral misalnya
Spirillum.
2. Vibrio, ini dianggap sebagai bentuk spiral tak sempurna, misalnya
Vibrio cholera penyebab penyakit kolera.
3. Spiroseta yaitu golongan bakteri berbentuk spiral yang besifat lentur.
Pada saat bergerak, tubuhnya dapa memanjang dan mengerut.
(Istamar, 2004)
Anatomi bakteri

Bakteri tersusun atas dinding sel dan isi sel. Disebelah luar dinding
sel terdapat selubung atau kapsul. Di dalam sel bakteri tidak terdapat
membrane dalam (endomembran) dan organel bermembran seperti
kloroplas dan mitkondria. Struktur tubuh bakteri dari lapisan luar
hingga bagian dalam sel yaitu flagela, dinding sel, membrane sel,
mesosom, lembaran fotosintetik, sitoplasma, DNA, plasmid, ribosom,
dan endospora. (Istamar, 2004)
a. Flagela
Flagela terdapat salah satu ujung, pada kedua ujung atau pada
perukaan sel. Fungsinya untuk bergerak. Berdasar letak dan jumlahnya,
tipe flagella dapat dibedakan menjadi montrik, amfitrik, lofotrik, dan
peritrik.Flagela terbuat dari protein yang disebut flagelin. Flagella
berbetuk seperti pembuka sumbat botol. Fungsinya adalah untuk
bergerak. Flagella berputar seperti baling-baling untuk menggerakkan
bakteri. Flagela melekat pada membrane sel. (Istamar, 2004)
b. Dinding sel
Dinding sel tersusun atas peptidoglikan yakni polisakarida yang
berikatan dengan protein. Dengan adanya dinding sel ini, tubuh bakteri
memiliki bentuk yang tetap. Fungsi dinding sel adalah untuk melindungi
sel. (Istamar, 2004)
Di sebelah luar dinding sel terdapat kapsul. Tidak semua sel bakteri
memiliki

kapsul.

Hanya

bakteri

patogen

yang

berkapsul.

Kapsul

berfungsi untuk mempertahankan diri dari antibodi yang dihasilkan

selinang. Kapsul juga berfungdi untuk melindungi sel dari kekeringan.
Kapsul bakteri tersusun atas persenyawaan antara protein dan glikogen
yaitu glikoprotein. (Istamar, 2004)
c. Membrane sel
Membrane sel tersusun atas molekul lemak dan protein, seperti
halnya membran sel organisme yang lain. Membrane sel bersifat
semipermiable dan berfungsi mengatur keluar masuknya zat keluar
atau ke dalam sel. (Istamar, 2004)
d. Mesosom

Pada tempat tertentu terjadi penonjolan membran sel kearah dalam

atau ke sitoplasma. Tonjolan membrane ini berguna untuk menyediakan
energi atau pabrik energi bakteri. Organ sel (organel) ini disebut
mesosom.

Selain

itu

mesosom

berfungsi

juga

sebagai

pusat

pembentukan dinding sel baru diantara kedua sel anak pada proses
pembelahan. (Istamar, 2004)
e. Lembar fotosintetik
Khusus pada bakteri berfotosintesis, terdapat pelipatan membrane
sel kearah sitoplasma. Membrn yang berlipat-lipat tersebut berisi
klorofil,dikenal

sebagai

lembar

fotosintetik

(tilakoid).

Lembar

fotosintetik berfungsi untuk fotosintesis contohnya pada bakteri ungu.

Bakteri lain yang tidak berfotosintesis tidak memiliki lipatan demikian.
(Istamar, 2004)
f. Sitoplasma
Sitoplasma adalah

cairan yang berada di dalam sel (cytos = sel,

plasma= cairan). Sitoplasma tersusun atas koloid yang mengandung

berbagai molekul organik seperti karbohidrat, lemak, protein, mineral,
ribosom,

DNA,

dan

enzim-enzim.

Sitoplasma

merupakan

tempat

berlangsungya reaksi-reaksi metabolism. (Istamar, 2004)

g. DNA
Asam deoksiribonukleat (deoxyribonucleic acid, disingkat DNA) atau
asam inti, merupakan materi genetic bakteri yang terdapat di dalam
sitoplasma. Bentuk DNA bakteri seperti kalung yang tidak berujung
pangkal. Bentuk demikian dikenal sebagai DNA sirkuler. DNA tersusun
atas dua utas polinukleotida berpilin. DNA merupakan zat pengontrol
sintesis protein bakteri, dan merupakanzat pembawa sifat atau gen.
DNA ini dikenal pula sebagai kromosom bakteri. DNA bakteri tidak
tersebar di dalam sitoplasma, melainkan terdapat pada daerah tertentu
yang disebut daerah inti. Materi genetik inilah yang dikenal sebagai inti
bakteri. (Istamar, 2004)
h. Plasmid

Selain

memiliki

DNA

kromosom,

bakteri

juga

memiliki

DNA

nonkromosom. DNA nokromosom bentuknya juga sirkuler dan terletak

di luar DNA kromosom. DNA nonkromosom sirkuler ini dikenal sebagai
plasmid. Ukuran plasmid sekitar 1/1000 kali DNA kromosom. Plasmid
mengandung gen-gen tertentu misalnya gen kebal antibiotik, gen
patogen. Seperti halnya DNA yang lain, plasmid mampu melakukan
replikasi dan membentuk kopi dirinya dalam jumlah banyak. Dalam sel
bakteri dapat terbentuk 10-20 plasmid. (Istamar, 2004)
i.

Ribosom
Ribosom merupakan organel yang berfungsi dalam sintesis protein

atau sebagai pabrik protein. Bentuknya berupa butir-butir kecil dan

tidak diselubungi membran. Ribosom tersusun atas protein dan RNA. Di
dalam sel bakteri Escherichia coli terkandung 15.000 ribosom, atau
kira-kira masa sel bakteri tersebut. Ini menunjukkan bahwa ribosom
memiliki fungsi yang penting bagi bakteri. (Istamar, 2004)
j.

Endospora
Bakteri

ada

yang

dapat

membentuk

endospora,

pembentukan

endospora merupakan cara bakteri mengatasi kondisi lingkungan yang

tidak menguntungkan. Endospora tahan terhadap panas sehingga tidak
mati oleh proses memasak biasa. Spora mati di atas suhu 120 C. jika
kondisi telah membaik, endospora dapat tumbuh menjadi bakteri
seperti sedia kala.( Istamar, 2004)
IV.
4.1
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
j.
4.2
a.
b.
c.
d.

Metode
Alat
Obyek glass
Cover glass
Mikroskop Cahaya Listrik
Jarum inokulasi
Bunsen
Rak tabung
Tabung reaksi
Beaker glass
Pipet tetes
Hair dryer
Bahan
Biakan kuman Staptyloeoccus aereus
Gram A : Carbol gentian violet
Gram B : Iodium
Gram C : Alkohol 95%

e.
f.
g.
h.
4.3
a.
b.

Gram D : Safranin
Air
Kapas
Minyak imersi
Cara kerja
Membersihkan tangan dan meja dengan alkohol.
Diambil obyek glass dan fiksasi dengan melidah apikan di atas Bunsen

c.

sebanyak 2 3 kali secara cepat.

Diambil antara 1 2 ose biakan kuman Staptyloeoccus aereus dan

diletakkan di atas obyek glass.

d. Diratakan biakan murni Staptyloeoccus aereus dengan jarum ose.
e. Difiksasi dengan melidah apikan bagian yang tidak ada kumannya di
atas bunsen 2 3 kali dengan cepat.
f. Dituangkan pewarna Carbol gentian violet, biarkan 1 menit.
g. Dibuang sisa Carbol gentian violet.
h. Dicuci preparat dengan air mengalir.
i. Dikering preparat dengan menggunakan hair dryer.
j. Dituangkan pewarna Iodium, biarkan selama 2 menit.
k. Dibuang sisa Iodium.
l. Dicuci preparat dengan air mengalir.
m. Dikeringkan preparat menggunakan hair dryer.
n. Dipucatkan dengan alkohol 95% dengan cara meneteskan perlahan
sampai warna ungu hilang.
o. Dibilas dengan air mengalir.
p.
Dituangkan pewarna Safranin
q.
r.
s.
t.
u.

sebagai

warna

penutup

atau

pembanding biarkan selama 30 detik.

Dibuang kelebihan Safranin.
Dicuci preparat dengan air mengalir.
Dikeringkan preparat dengan meletakkan diantara 2 buah kertas isap.
Ditambahkan minyak imersi pada preparat.
Mengamati preparat di bawah mikroskop dengan pembesaran lemah

kemudian pembesaran kuat (100X).

v. Diamati jenis dan bentuk morfologi bakteri.
V.
Hasil Praktikum
No

Nama

Gambar

Keterangan

Staphylococ

cus aureus

positif
Berwarna

Jenis bakteri gram

merah

muda dan ada yang

-

sedikit biru tua

Bentuk : bulat
morfologinya
stafilokokus

VI.

Pembahasan

Pada praktikum kali ini, dilakukan perwarnaan gram pada bakteri.

Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk
membedakan

bakteri

apakah

gram

positif

atau

gram

negatif.

Pewarnaan gram menggunakan lebih dari satu pewarna dan memiliki

reaksi yang berbeda untuk setiap bakteri sehingga dapat digunakan
untuk membedakan bakteri. Pewarnaan gram ini mampu membedakan
dua kelompok besar bakteri, yaitu gram positif dan gram negatif.
Pada

pewarnaan

Gram,

bakteri

yang

digunakan

yaitu

Staphyloecoccus aureus. Umur bakteri pada pewarnaan gram harus

berumur

24

jam

atau

hari.

Dari hasil pewarnaan Gram dan setelah diamati dengan bantuan

mikroskop cahaya listrik bahwa Staphylococcus aureus merupakan
bakteri gram positif karena berwarna merah muda dan ada yang sedikit
biru tua , morfologinya stafilokokus, dan berbentuk bulat. Bakteri ini
umumnya tumbuh bergorombol sehingga tampak seperti anggur.
Bakteri garam positif

ialah bakteri yang mengikat warna utama

(crystal violet) dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh

peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh zat warna lawan (safranin) pada
mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna ungu.Bakteri Gram positif
terlihat berwarna ungu karena dinding selnya mengikat Kristal violet
lebih kuat. Namun selama praktek, hasil warna bakteri yang kami amati
berwarna merah muda dan ada yang sedikit biru tua. Perbedaan warna
ini disebabkan oleh kesalahan pada proses pewarnaan dalam tahap
pengeringan preparat yang terlalu panas sehingga menghasilkan warna
merah muda dan bakteri yang seharusnya gram positif berubah menjadi
bakteri gram negatif.
Staphylococcus
menggunakan

termasuk ke dalam bakteri gram positif. Karena

teknik

pewarnaan

gram,

bakteri

ini

memiliki

peptidoglikan yang tebal, sehingga dapat mengikat cat gram dengan

kuat,sehingga

disebut

gram

positif.

karena

dia

termasuk

dalam

kelompok bakteri gram positif, maka warna dari Staphylococcus adalah

ungu dengan warna dasar merah. Hal tersebut dikarenakan kandungan
lipid dari bakteri gram positif lebih rendah dan banyak mengandung
peptidoglikan.Karena kandungan lipidnya yang lebih rendah ,dinding
sel bakteri gram positif menjadi terdehidrasi selama perlakuan dengan

etanol sehingga bakteri gram positif mempertahankan zat pewarna

ungu Kristalnya.
Langkah langkah yang dilakukan selama pewarnaan gram adalah
proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun
mengakhiri dalam praktek. Alkohol yang disemprotkan pada tangan,
kaca preparat dan meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci
dengan

sabun

terlebih

dahulu.

Hal

tersebut

berfungsi

untuk

menyeterilkan atau membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan

agar mendapatkan hasil yang akurat.
Sample biakan bakteri Staptyloeoccus aereus diambil sekitar 1 2
ose, diletakkan di atas obyek glass serta diratakan dengan jarum ose.
Kemudian

difiksasi

untuk

menguapkan

air

sehingga

hanya

akan

didapatkan bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri

benar-benar melekat pada obyek glass sehingga olesan bakteri berupa
tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian.
Proses fiksasi dengan pemanasan biasanya di atas bunsen pada
pewarnaan gram dapat menyebabkan bakteri tersuspensi mati atau
tidak produktif apabila suhu terlalu tinggi, walaupun dapat melekatkan
bakteri pada kaca preparat. Setelah itu biakan bakteri dituangi
pewarna carbol gentian vioet yang berfungsi memberikan pewarnaan
pada bakteri tersebut. Bakteri akan berwarna ungu. Penuangan carbol
gentian vioet harus merata pada seluruh area biakan bakteri pada kaca
preparat agar bakteri dapat terwarnai dengan sempurna. Bakteri yang
telah diwarnai dibiarkan selama 1 menit agar pengikatan warna oleh
bakteri menjadi semakin kuat. Kemudian sisa carbol gentian vioet dan
dicuci dengan air mengalir dan dikering preparat dengan hair drier.
Langkah selanjutnya, penuangan iodium kemudian didiamkan selama
2 menit. Iodium merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang
berfungsi mengfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme
target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian iodium bertujuan
untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat iodin
terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme
gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel
organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan
hilang dari sel. Iodium yang diteteskan didiamkan selama 2 menit

bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih

kuat. Setelah itu, kaca preparat dibilas dengan aquades hingga
warnanya hilang dan dikeringkan dengan menggunakan hair drier.
Langkah selanjutnya adalah meneteskan alkohol

95 % dengan

perlahan sampai warna ungu hilang. Penetesan alkohol 95 % pada

biakan bakteri untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan
melunturkan pewarnaan ungu dari komplek Kristal ungu dan iodium.
Pada gram positif akan tetap mempertahankan warna ungu karena
mengandung peptidoglikan. Bakteri gram positif akan mengalami
dehidrasi pada dinding selnya dan pori-porinya menciut karena daya
rembes dinding sel dan membrane menurun sehingga komplek Kristal
ungu dan iodium tidak dapat keluar dari sel dan tetap berwarna ungu.
Setelah itu dibilas dengan air mengalir bertujuan agar warna dapat
luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa di obyek glass.
Kemudian ditambahkan safranin dengan menuangkannya dan dibiarkan
selama 30 detik. Pewarna safranin merupakan pewarna sekunder atau
kontras berfungsi untuk mewarnai kembali sel sel yang telah
kehilangan pewarna utama setelah perlakuan alkohol. Pewarnaan
safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna
merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif
dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori
mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga
pewarna

safranin

tidak

dapat

masuk

sehingga

sel

berwarna

ungu.Kemudian dibuang kelebihan safranin, dicuci dengan air mengalir,

dan dikeringkan dengan hair drier.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke
pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena
zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel
bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian
zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses
identifikasi

bakteri

berlangsung

cepat

(efisiensi

waktu).(Karmana,

2008)
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan
pembilasan terhadap preparat dengan menggunakan air mengalir.
Pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna

yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing

reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dengan menggunakan
hair drier, agar air tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru
yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, preparat dikeringkan
dan ditambahkan minyak imersi pada preparat dan diamati di bawah
mikroskop

dengan

pembesaran

lemah

baru

kemudian

dibesarkan

dengan pembesaran kuat ( 100X ). Jika terbentuk warna ungu maka

termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna
merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram
negatif.Hasil akhirnya, Staptyloeoccus aereus merupakan bakteri gram
positif yang seharusnya berwarna ungu.
Pengamatan

bentuk

dan

jenis

bakteri

akan

tampak

jelas

jika

dilakukan pewarnaan terhadap sel. Kebanyakan sel-sel bakteri tidak

berwarna,

sehingga

memperlihatkan

jika

warna

di

lihat

di

kontras.Warna

bawah
yang

mikroskop

membedakan

tidak
antara

bakteri Gram positif dengan bakteri Gram negatif yaitu warna ungu dan
merah, bakteri tersebut akan menyerap warna ungu dikatakan sebagai
Gram positif dan menyerap dominan warna merah berarti Gram negatif.
Hal itu disebabkan karena perbedaan struktur dinding sel diantara
keduanya. Pengamatan Staphylococcus aureus dengan perbesaran 100x
bentuknya adalah kokus atau bulat termasuk dalam bakteri Gram
positif

karena

bakteri

ini

menyerap

warna

ungu

dan

dapat

mempertahankannya selama proses pewarnaan tersebut. Pewarnaan

bakteri ini dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi, peluntur
warna, substrat, intensifikasi pewarnaan, dan penggunaan zat warna
penutup.
VII.

1.

Kesimpulan
Dari hasil praktikum dan pengamatan pewarnaan gram dan morgologi
bakteri dapat disimpulkan bahwa :
Staphylococcus aureus merupakan

bakteri

gram

positif

karena

berwarna merah muda dan ada yang sedikit biru tua , morfologinya
stafilokokus,

dan

berbentuk

bulat.

Bakteri

ini

umumnya

tumbuh

bergorombol sehingga tampak seperti anggur.

2. Terjadi penyimpangan warna, Staphylococcus aureus yang seharusnya
berwarna ungu atau biru tua tapi berubah menjadi merah yang

disebabkan proses pengeringan yang terlalu lama sehingga menjadi

panas.