MANIPULASI EKSPRESI GEN

A. ANITA ARTARINI

PUSTAKA
1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, Molecular
Biotechnology: Principles and Applications of
Recombinant DNA, ASM Press, Washington DC,
halaman 121-159 and 163-187
2. Brown TA, 2006, Gene Cloning & DNA analysis,
Blackwell Publ. Oxford, halaman 277 - 300

Target Kuliah
Penggunaan vektor ekspresi
Strategi overproduksi (manipulasi ekspresi gen pada
vektor)
Pemilihan vektor
Pemilihan sel inang

Ekspresi Gen

ORGANISASI GEN PROKARIOT

kerangka baca terbuka (open
reading frame = ORF) /
coding sequence = CDS

5
3

operator

promotor

situs aktivator

RBS

kodon start
Inisiasi transkripsi

kodon stop
terminator

Komponen transkripsi: promotor, terminator, situs inisiasi transkripsi,

situs aktivator, operator
Komponen translasi: RBS, kodon start, kodon stop

TRANSKRIPSI

TRANSLASI

VEKTOR (Plasmid)
VEKTOR KLONING
HANYA UNTUK MENDAPATKAN DNA (copy number tinggi)
komponen untuk replikasi (harus sesuai dengan inang baru)

VEKTOR EKSPRESI
UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN
( komponen untuk transkripsi & translasi (harus sesuai dengan inang baru),
tambahan komponen untuk mempermudah proses
downstream/pemurnian)

TRANSKRIPSI DAN BIOTEKNOLOGI

PROMOTOR DAN TERMINATOR KUAT

PROMOTOR DAN TERMINATOR DIKENALI OLEH RNA
POLIMERASE INANG

REGULASI EKSPRESI DNA SISIPAN PADA VEKTOR EKSPRESI

PENGGUNAAN PROMOTOR KUAT
PROTEIN REKOMBINAN YANG DIHASILKAN DAPAT
TOKSIK TERHADAP SEL
BAGAIMANA CARANYA:
EKSPRESI GEN PERLU DIREGULASI
PENGGUNAAN PROMOTOR YANG DIREGULASI

11

Sistem/Kaset Ekspresi
promotor operator

RBS

ATG

MCS

Kaset ekspresi

STOP codon

terminator

Regulasi ekspresi DNA sisipan

Regulasi ekspresi DNA sisipan

VEKTOR (Plasmid)
VEKTOR KLONING
HANYA UNTUK MENDAPATKAN DNA (copy number tinggi)
komponen untuk replikasi (harus sesuai dengan inang baru)

VEKTOR EKSPRESI
UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN
( komponen untuk transkripsi & translasi (harus sesuai dengan inang baru),
tambahan komponen untuk mempermudah proses
downstream/pemurnian)

TUJUAN PROTEIN FUSI

Banyak tujuan, diantaranya :
Mempermudah proses pemurnian
Direkayasa pada tingkat DNA
Hasil transkripsi dan translasi adalah protein fusi yang
dapat dimurnikan dengan kromatografi afinitas

Lokalisasi protein
Penambahan peptida sinyal menentukan lokasi protein
yang diekspresikan
Lokasi protein : sitoplasma (tidak perlu peptida sinyal),
ekstrasel atau periplasma (khusus bakteri Gram negatif)
17

Kaset Ekspresi (FUSI PROTEIN untuk pemurnian)

Kaset ekspresi:
Komponen transkripsi:
Promotor
Terminator
Komponen translasi:
Operator (lacO)
RBS
Kodon start
Kodon stop
6xHis:
Untuk mempermudah
Pemurnian protein
MCS (multiple cloning site):
untuk penyisipan DNA
yang akan diekspresikan

PROTEIN FUSI
Protein fusi

Met
His-His-His-His-His-His
Sisi pengenal enterokinase
Protein rekombinan

Vektor Ekspresi dan Protein Fusi

N- Signal peptida Luciferase His-tag Protein target -C

N- Signal peptida Luciferase Protein target

His-tag -C

Signal peptida (pelB) : lokalisasi

protein ke periplasma
Luciferase (Rluc8) : protein
reporter (tingkat ekspresi)

ENZIM PEMBENTUK IKATAN

DISULFIDA (PERIPLASMA)
SUASANA HARUS OKSIDASI

LOKASI PROTEIN
PROTEIN EKSTRASEL

CONTOH HASIL OVERPRODUKSI DAN PURIFIKASI

94 kDa
67
43
30
20

1 = PROTEIN MARKER
2 DAN 6 = PROTEIN TOTAL (TIDAK DIINDUKSI)
3,4,5 = PROTEIN TOTAL (DIINDUKSI IPTG)
7, 8 = PROTEIN HASIL PEMURNIAN

SEL INANG UNTUK TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

PEMILIHAN TERGANTUNG PADA:
JENIS DAN JUMLAH PROTEIN YANG AKAN DIHASILKAN
MODIFIKASI STRUKTUR PROTEIN (GLIKOSILASI)
BIAYA PRODUKSI

FAKTOR-FAKTOR YANG HARUS DIPERHATIKAN:

POLA PERTUMBUHAN (CEPAT VS LAMBAT)

BIAYA PERTUMBUHAN
TINGKAT EKSPRESI
SEKRESI PRODUK (MEMUDAHKAN PEMURNIAN)
KETERSEDIAAN VEKTOR DAN VEKTOR SHUTTLE

Eukariot vs Prokariot

SISTEM EKSPRESI EUKARIOT

SEL INANG YANG DAPAT DIGUNAKAN:
Saccharomyces cerevisiae
Pichia pastoris
Baculovirus-serangga
Sel mamalia

VEKTOR SHUTTLE & EKSPRESI

KONSTRUKSI VEKTOR DI E. coli
EKSPRESI GEN (PRODUKSI PROTEIN) DI INANG KE-2
KOMPONEN REPLIKASI DIKENALI E. coli DAN INANG KE-2
ADA 2 ORI ( 1 UNTUK E. coli DAN 1 UNTUK INANG KE-2)
KOMPONEN EKSPRESI DIKENALI INANG KE-2
SISTEM SELEKSI VEKTOR (HARUS ADA UNTUK E. coli DAN
INANG KE-2)

SUICIDE VEKTOR & EKSPRESI

KONSTRUKSI VEKTOR DI E. coli
EKSPRESI GEN (PRODUKSI PROTEIN) DI INANG KE-2
KOMPONEN REPLIKASI DIKENALI HANYA E. coli (VEKTOR
TERINTEGRASI KE KROMOSOM INANG KE-2)
HANYA ADA 1 ORI YANG DIKENALI E. coli
KOMPONEN EKSPRESI DIKENALI INANG KE-2
SISTEM SELEKSI VEKTOR (HARUS ADA UNTUK E. coli DAN
INANG KE-2)

VEKTOR SHUTTLE
VEKTOR YANG DAPAT REPLIKASI DALAM DUA INANG
BERBEDA
MEMPUNYAI DUA ori

Prosedur standard kloning pada ragi

Menggunakan vektor shuttle

Kloning awal dilakukan di
Escherichia coli:
Penyiapan DNA sisipan dan
DNA plasmid
Ligasi dan transformasi
Konfirmasi kebenaran klon
Purifikasi plasmid rekombinan
Transformasi ke dalam sel ragi
Konfirmasi kebenaran klon

PROSES KLONING PADA RAGI

KLONING 2 TAHAP:
KLONING PADA E. coli
KLONING PADA RAGI

SISTEM RAGI
GLIKOSILASI
SACCHAROMYCES CEREVISIAE: OVERGLIKOSILASI (?)
PICHIA PASTORIS: POLA GLIKOSILASI LEBIH MIRIP POLA PADA
SEL MAMALIA

SISTEM PROKARIOT VS EUKARIOT

PROKARIOT

JUMLAH PROTEIN
MEDIUM SEDERHANA
PERTUMBUHAN
MODIFIKASI PASKA TRANSLASI
TIDAK ADA
UKURAN PROTEIN
KONFORMASI PROTEIN
SEDERHANA
KECENDERUNGAN
PEMBENTUKAN BADAN INKLUSI
TIDAK MAMPU
MENGHILANGKAN INTRON

EUKARIOT

JUMLAH PROTEIN
MEDIUM KOMPLEKS
PERTUMBUHAN
MODIFIKASI PASKA TRANSLASI
ADA
UKURAN PROTEIN
KONFORMASI PROTEIN
KOMPLEKS
TIDAK KECENDERUNGAN
PEMBENTUKAN BADAN INKLUSI
MAMPU MENGHILANGKAN
INTRON

33

PERBANDINGAN SIFAT VEKTOR EKSPRESI

PARAMETER

PROKARIOT

EUKARIOT

MARKA SELEKSI

ampR, kanR, tetR

leu2, ura3, trp1,

NEOR, Dihidrofolat
reduktase

PROMOTOR

lac, trp; t7; nirB

Gal; AOX;
-actin; CMV IE; SV40
early

REGULASI EKSPRESI GEN PADA

SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Upstream activating sequences

Promotor GAL

Induksi oleh galaktosa

Represi oleh glukosa

MARKA SELEKSI PADA RAGI

Gen resistensi terhadap inhibitor:
methotrexat dan tembaga
Gen pengkode biosintesis asam amino / basa
nukleotida: (SELEKSI AUKSOTROP)
Gen LEU2: mengkode -isopropil-malat dehidrogenase
yang mengkatalisis perubahan asam piruvat menjadi leusin
Gen TRP1: mengkode N-(5'-phosphoribosyl)- anthranilate
isomerase, terlibat dalam biosintesis triptofan
Gen URA3: mengkode orotidin-5-fisfat dekarboksilase
(enzim yang mengkatalisis 1 tahap biosintesis nukleotida
pirimidin)

SISTEM EKSPRESI Pichia pastoris

Ragi metilotropik
Promotor: AOXI (diinduksi
oleh metanol)
Marka seleksi: gen resistensi
terhadap zeocin

37

PRODUK YANG DISETUJUI OLEH FDA

JAN 1996 NOVEMBER 2000:
21 / 33 SISTEM SEL MAMALIA
Tiga lini sel mamalia utama (11 dari 21):
Sel Chinese Hamster ovary (CHO)
Murine myeloma lines SP/20
NS0

Sel CHO