4. Dibujo esque- ‘gue muestra un ‘6ptico co- (Didsjo cecido por Fa. Carl PiTULO 2 Métodos histolégicos “El arte y Ia ciencia tienen su punto de encuentro en el método.” La totalidad del conocimiento actual re- feridova la estructura y la fiincién de los or- ganismos bioldgicos tiene su fundamento fen los métodos necesarios para la investi- gacién de las eélulas y los tojidos. En alg nos casos, los grandes avances prensi6n y el conocimiento fueron conse- cuencia directa del desarrollo de una nue- va técnica. La creacién de la microscopia electrénica, los métodos de fracciona- miento celular, la inmunohistoquimica y la tecnologia del DNA son ejemplos claros. Es necesario contar con ciertos cono mientos respecto de los principios funda- mentales de los métodos aplicados con mayor frecuencia, para que el estudio de la histologia no sea tan sdlo un aprendizaje de detorminados hechos; sino que ademas permita adoptar una postura critica frente a ellos. En consecuencia, se comenzaré ol estudio de la histologia con un breve and- lisis de las goneralidades de los métodos histolégico na menudo ser de gran tilidad revisar algunos de estos métodos, je. Ocular Tubo Prisma Estativo, Tornillo macrometrica Tornillo rmicrométrico Lampara Colector Bulwer relacionados con el estudio especifico de las eélulas y los tejidos. general, los métodos histolégicos se ssifican en dos grupos: los que se basan en la observacién directa de células y teji- dos vives, y los que analizan material muerto o inanimado. En un lugar interme- dio se ubican las técnicas de aislamiento de los componentes de células vivas me- diante métodos de centrifugaci6n. En to- dos los casos se comienza con el andlisis microseépico, de importancia fundamen- tal para todos los métodos histolégicos. Anilisis microsc6pico El microscopio os el instramento mas importante en la histologia, debido al pe- quefto tamafo de las estructuras analiza- das. Cabe destacar que cuando en este texto se alude al término “microscopio” siempre se refiere al microscopio dptico, a menos quo se especifique otra cosa. Revélver Objetivo Platina ‘Condensador Tornillo de centrado Filtro de luz diurnal Brazo del condensador Diatragma Espejo METODOS HISTOLOGICOS 19Cuando la luz atraviesa un material bio- mucho mas importante el poder de reso Togico, por elempla i eg panei Ghats ao ee gico, cambian sus caracteristicas, y estas modificaciones se hacen te los sistemas de lentes. El ojo puede di- ferenciar variaciones de intensidad de la luz (contraste entre luz y sombras) y de color (distintas longitudes de onda). En consecuencia, es necesario modificar la luz, para que el preparado se observe co- mo formado por elementos més oscuros y més claros.o de distintos colores. Las Iulas y los tojidos no coloreados se suelen captar con el microscopio como carentes de color y transparentes, porque no pre- sentan suficiente contraste. Gon la ayuda de tinciones histoldgicas se logra una ab- sorcién diferencial de la luz, de modo que se visualizan las distintas estracturas. Poder de resolucién y aumento. Estos dos conceptos se emplean para determi- nar la utilidad de un microscopio y se de- ben diferenciar con claridad entre sf. Es Apertura numérica y poder de resolucién La capacidad de refracci6n o:indice de refraccién de un medio se define como sibles median- Heterocarion v Célula hibrida (Gincarion) Fig. 2-11. Dibujo esquematico de hibridacién celular. Se induce la fusion celular por agrega- do de virus Sendai, que favorece la formacién de un heterocarion y de células hibridas cuando ste se divide. ne a acciones cancerigenas como irradia~ ciones, agentes quimicos 0 infecciones por virus cancerigenos. Se obtene una Iiea celular establecida de este tipo de células transformadas a partir de un tojido tumo- ral o de un cultivo primario, después que este Ultimo ha sido expuesto a una accién ‘cancerigena. Se puede entonces establecer un cultivo homogéneo de Ifnea pura por Glonacién del cultivo primario. Las Ifneas celulares transformadas de crecimiento ré- pido y supervivencia ilimitada (ing. im- ‘mortal cell lines) representan un material especialmente importante para las investi- gaciones exporimentales. Por tiltimo se veré el fonémeno de hibri- dacién celular, de gran importancia en la investigaci6n de células cultivadas. Las cé- lulas hibridas se forman por fusién celular, es decir, la unién de dos o mas células. La fusion celular se puede producir en forma espontdnea, por ejemplo en la fecundacién, cuando se unen las células sexuales mascu- Tinas y femeninas, pero también se demos- 6, alrededor del afio 1960, que ocurre en Ia formacién de células hibridas en cultivos celulares. Sin embargo, recién cuando poco después se descubrid que era posible indu- cir la fusion celular en los cultivos celula- res, mediante el agregado de ciertos virus (el més usado es el denominado virus Sen- dai, que incrementa la tendencia a la fusi6n de las membranas celulares), cobré real im- portancia la técnica de la hibridacién. Me- diante la fusién de dos células diferentes desde el punto de vista genético, la célula formada contiene dos nticleos con distinto contenido genético, lo que se denomina he- terocarion (fig. 2-11). Algunas de las oétu- las formadas tendrén capacidad para divi- dirse y los dos micleos comienzan la divi- sidn al mismo tiempo. A su vez, esto a ve- es también da lugar a la formaci6n de dos células, cada una de las cuales contiene un niicleo. Este micleo (en cada una de las dos células hibridas neoformadas) contione una copia de los cromosomas de ambas oélulas: este tipo celular se denomina sincarion. Entre otras aplicaciones, la hibridacién celular ha contribuido a las investigacio- nes sobre el crecimiento de células tumo- rales, donde se han fusionado células nor- males con células eancerosas. La técnica también se ha utilizado para demostrar que las protefnas de las membranas celu- lares tienen capacidad para desplazarse dentro de estas tiltimas, como se verd con mayor detalle en el capitulo 3, Una aplica- jén muy especial es el desarrollo de an- ticuerpos monoclonales, cuya utilizacion tione gran importancia en las investiga- ciones inmunohistoquimicas (véase més adelante en este capitulo). Para terminar con el tema de cultivo de tojido se puede decir que, si bien no es una alternativa, representa una_posibili- dad para realizar trabajos experimentales sobre tejidos humanos sin chocar con pro- blemas éticos. Manipulacién experimental de células vivas Adem de las posibilidades experimen- tales de actuar sobre células y tejidos a tra- -vés de las modificaciones del medio circun- I ESR AL RE ESET METODOS HISTOLOGICOS 29Macrétagos que contienen carmin de tio eit gy | CRM a, eee o~, oO ty ' = . a 8 aes o.. "ee A ¢ - aad * $4 > a 4 * E Aug: abe ‘ Fig. 2-12. Tincién supravital de macrofagos de tejido conectivo, por agregado de carmin de litio a un preparado de tejido vivo. Las part Cculas rojas de carmin de ltio han sido fagocita- das por los macréfagos. 440, dante relacionadas con el cultivo de tejido, txisten varios métodos para la manipula: Gién mas o monos directa de células vivas Tinciones vital y supravital, Algunos colorantes relativamente inocuos son cap- tados on forma selectiva por determinadas células vivas. En consecuencia, la locali- zacién del colorante se puede utilizar pa- fa dotectar ostas células 0 determinadas Organelas, a las que se une el colorante después de ser captado, De esta manaera también se pueden identificar algunas sustancias intercehulares Para la tincién vital so inyecta el colo- rante eft el animal vivo, Para la-tincién su: pravital'se agrega el colorante a Tas cél fog o-eb te)ido-vtva-ctespurés de. su 9RUrAG= cion del organismo, EL azul tripdn y el carmim de litio se componen de particulas finas y han teni- do importancia definitiva para el estudio. do la fagocitosis, es decir, la forma en que doterminadas células captan_particulas del medio (fig. 2-12). El rojo neutro y el verde Jano,se utilizan pirerel-oorndto do Ine plobelog hlaneng) El Verde Janoytife selactivamente lasmitecon drias7y-e¥irojo outro para-identificar_los distintos subtipos de leucocitos.1 La alizarina se une a la matriz 6sea neo- formada y lo confiere coloracién roja, La tincién vital con alizarina ha sido muy 30 METODOS HISTOLOGICOS importante en los trabajos sobre el meca- nismo de crecimiento 6seo. Micromanipulacién mecénica. Nume- rosas técnii bajo'la denomi: nacién micromanipulacién 0 microc gia, se han dosarrollado sobre la base del micromanipulador. Este instrumento se compone de un microscopio, en el que el preparado a estudiar se encuentra en una cémara hnimeda de operacion, sobre la platina. En el micromanipulader se mon- tan agujas finas, ganchos o pipetas de vi- drio, cuyos extremos aparecen en el cam- po visual y que se pueden desplazar con tanta precisidn, que se pueden disecar las células individuales con gran aumento. te método de disecci6n ha increment do el conocimiento de la naturaleza fisica de las células. Se ha demostrado que el pro- toplasma es viscoso y se han desplazado las ntzo de la células. También se puede empujar ol micleo celular dentro del citoplasma y ha demostrado ser una vesicu- la deformable Lena de liquido. Asi, se pu den hacer muescas en él al presionar con tuna aguja. Con la microdiseccién también se demostré muy pronto la existencia de una membrana celular (fig. 2-13), Fig. 2-13. Fotomicrografas (a campo oscuro) de células huevo de rana vivas, que demuestran como se procede en a micromanipulacién ‘mecéinica. En a se observan dos invaginacio- res en la membrana celular producidas por pre sién con dos microelectrodes. En b se visuali- an los microelectrados después de atravesar la membrana celular hacia el interior del citoplas- ma. La medida incluida representa 100 um. (Se: gin Kanno y Loewenstein.) CAPITULO 2Fig. 2-14. Fotomicrogra- fade una neurona de la fetina captada con mi roscopio de fluorescen. a. Medianto un microin- ector se inyect6 el colo- ante fluorescente amari- Ho Lucifer directamente ie la neurona viva. Luego Ke sactific el animal y se {efectud un preparado his: Bet6gico de la retina. (Ce ISa por J. Zimmer.) aritu.o Los microelectrodes son pipetas muy finas que contienen soluciones salinas concentradas. Mediante la micromanipu- laci6n se inyectan éstas en las células, y después se puede medir la diferencia de Fig. 2-15 Fotomicrografia de una oélula viva cap: ‘ada con microscopio de contraste de fase. La cé- lula se encuentra en la etapa denominada metata: 9 do una division celular, por lo que se observan ‘laramente los cromosomas, La linea ciara an- ‘gosta entre las dos flechas se forma por itradia- ion con un haz de luz ultravioleta de 3 1m de ancho, que parece haber “desplazado" un corto segmento de una hilera de cromosomas parale los. Esto se confirma al demostrar que los seg- ‘mentos claros de cromosomas ya no contienen DNA (mediante investigacion histoquimica, segun ‘| método de Feulgen). «900. (Segun Bloom y Ozarslan.) potencial eléctrico entre el interior de la medio (fig, 2-13). De esta mane- ra es posible investigar los potenciales de membrana variables de los tejidos nervio- soy muscular. Los microinyectores son una variai especial de microelectrodos y se pueden emplear para la inyeccion de cantidades microsc6picas (picolitros) de sustancias dentro de las céhulas. Una aplicacion es- pecial es la inyeccién de un colorante qu difunde en las distintas partes del cito- plasma y que se hace fluorescente con el microscopio éptico. Gon esta técnica es posible dibujar el contorno de cada célula individual en tejidos con estructuras muy complicadas, por ejemplo, del sistema nervioso central (fig. 2-14). Utilizacién de haces de rayos angostos y de alta energia. Mediante aparatos es- peciales es posible concentrar protones n un haz de rayos con un didmetro d 2,5 um, y con irradiaci6n ultravioleta se pueden lograr diémetros de alrededor de 1 un, Este microrrayo es tan angosto qu puede incidir y, en consecuencia, destruir los componentes individuales del micleo celular, por ejemplo, parte de un cromoso- ma (fig. 2-15), En el iltimo tiempo se han utilizado especialmente los rayos laser con este proposito. Microcinematografia. Si bien esta a no implica en s{ misma una manip directa de células vivas, reprosenta un método importante para su. observa cidn, La microcinematografia (gr. kinema, movimiento) es una técnica que registra en una pelicula (como imagenes vivas) lo que se observa a través del objetivo de un microscopio, mediante una cimara de v deo, Tiene especial importancia para el andlisis de movimientos cuando son de- jasiado rapidos o lentos para pode: considerados directamente. Por ejer con una aceleracién de cien ve ble observar la division celular y, ademé se puede observar cémo se desplazan. las mitocondrias dentro de la célula viva Por el proceso inverso (frenando los imientos muy rdpidos) es. posible , por ejemplo, los movimientos de Métodos de fraccionamiento celular Mediante los métodos de fracciona- miento celular es posible separar los dis- tintos componentes celulares y mantener al mismo tiempo, sus funciones. Por lo tanto, los métodos de fraccionamiento ce- lular han jugado un importante papel en la resolucion de la organizacién funcional de la célula, METODOS HISTOLOGICOS 31Centrifugaci6n diferencial (centrifuga cién dinémica). Este es el método més uti- lizado para la separacién do organelas co- Iulares. Antes de la centrifugacién se efec-~ ia una homogenizacién. Se colocan pe- quefios trozos de tojido en una solucién adecuada (p. e)., de sacarosa) que contri- buye a mantener intactas las organelas y se opone a su tendencia a agruparse. Des- pués se coloca la solucién con los trozos de tejido en un homogenizador, que pue- de tener la forma de un cilindro de vidri en el cual rota a gran velocidad una vari Ia de teflén (fig. 2-16). Los trozos de teji- do son aplastados por la friccién de la va- rilla contra las paredes del cilindro. Asi se rompen las membranas celulares y que- dan libres en la solucion las organelas y las inclusiones. Se pueden utilizar otros métodos para la homogenizacién de las eélulas y los tejidos, por ejemplo ultraso- nido. Después de unos minutos de reposo se centrifuga el sobrenadante (lat. super- natant, flotante) con velocidad moderada y temperatura apenas superior a 0°C, Des- pués do la sodimentacién de las particulas més pesadas se puede hacer sedimentar las particulas con masa menor, mediante centrifugaciones con velocidades crecien- tes. La identificacion de una fraccién y la evaluacién de su grado de pureza, on ol caso de los nticléos celulares, se puede efectuar por microscopia de contraste de fase. Las particulas mas pequoiias (es de- cir, la mayorfa) deben ser identificadas mediante microscopia electronica de los cortes ultrafinos del sedimento s6lido ob- mnido por centrifugacién, el denominado “pellet”. De esta manera se tiene la seguri- dad de que las fracciones no contienen mezclas de distintos tipos de organelas. Centrifugacién por gradientes de den- sidad (centrifugacién equilibrada). Con este método es posible obtener mayor cantidad de fracciones mds limpias que con la centrifugaciOn diferencial. Se ob- tiene el homogenizado como en el caso anterior y se agrega una solucién de, por jemplo, sacarosa, que contiene concen- thaciones crecientes de sacarosa a medida que se acerca al fondo, es decir, con den- sidad creciente. La centrifugacién prolon- gada a gran velocidad hace que las parti- Culas sedimenten en el sitio que les per- mite su densidad (se detienen cuando al- canzan una “profundidad” equivalente a su propia densidad). De esta manera se logra obtener fraccio- nes casi puras de micleos, elementos nu- cleares, mitocondrias, lisosomas, riboso- mas, retfculo endoplasmatico y grénulos de secrecién, Estos homogenados cehila- res fraccionados, en los cuales los compo- nentes mantienen su funcién biolégica, se denominan sistemas libres de células. El 32 METODOS HISTOLOGICOS estudio de estos sistemas libres de células ha contribuido con gran parte del conoci- miento actual sobre la biologfa molecular de la célula, por ejemplo respecto a la re- plicaci6n y la transcripcién del DNA y a la sintesis de proteinas. En afios recientes, los métodos de frac- cionamiento celular han sido suplementa~ dos con varias técnicas para la investiga- cién de macromoléculas, entre ellas dis- tintas formas de cromatografia y de elec- troforesis. Sin embargo, estas técnicas pertenecen més a la parte bioquimica de la biologfa celular y no se las incluiré en esta presentacién general (se refiere al le tor a textos de biologia molecular y bio- quimica), si bien es obvio que se hard re- ferencia a ellas en relaciones relevantes de los préximos capitulos. Preparacién e investigacién de tojidos muertos El estudio directo de células y tejidos vivos sélo tiene aplicaciones limitadas. Es dificil diferenciar los distintos componen- tes entre sf con la microscopia de transmi sion, dado que tienen igual grado de re- faccién de la luz. Ademas, por lo general ol tejido presenta un espesor tal que la pe- netracién de la luz es demasiado escasa. En consecuencia, se utiliza con mucha mayor frecuencia el tejido muerto, que se mantiene mediante acciones quimicas i mediatamente después de extraido y en- tonces se corta en secciones muy delga- das, denominadas cortes histolégicos. Después de la tincién con distintos col rantes se observan los cortes con el. mi croscopio 6ptico, dado que el mayor con- traste entre los componentes tisulares per- mite diferenciarlos. Es obvio que al prepa- rar los cortes histolégicos se debe procu- rar mantener, en lo posible, el aspecto de las estructuras en el organismo vivo. Proparacién de tejidos para microscopia 6ptica Fijacién, Las se matan con la fi- jacion, para detener los procesos celulares dindmicos.con Ta jidez posible y mi ‘con Jas minimas iodificaciones posibles. Esto se logra con Ja insolubilizacion de los componentes estructurales de la célula y la formacién: de enlaces eruzados, por la aceién de di tintos agontes quimicos, los fijadores. En el proceso de fijacién ise estabilizan las _proteinas, porque los fijadores favorecen la formacién de enlaces cruzados entre las moléculas proteicas. De esta manera se amantienen todas las relaciones-entre las mo en la célula viva. Li CAPITULO 2Fig. 2-16. Dibujo esque- ‘matico del procedimiento de fraccionamiento ce- lular (véase el texto para Jos detalles) = Q Homogeneizacién Restos de tejido ceonectivo Centritugacion 1,000 9, 10 min Sobrenadante proteinas solubles se unen a las estructu- tales y se transforman as{ en insolubles. Al mismo tiempo se alcanza cierta fuerza mecénica, que posibilita los pasos si- guientes del proceso de preparacién. Al- _gunos fijadores como, por e] “maldehfdo y, en especial, a il nS an ‘Sobrenadante jemplo, el for-— | glutaraldehi- Célula intacta Reposo } Nacleos colulares © ‘Centriftugacion 40.000 9, 20 min : wwococaae & GF WD Sobrenadante a wm 6% ~~ Conteitugacion 100.000 9, * hora, -wigosonas @ gO = ‘Sobrenadante 3 ‘Comploja'ce Goleta Yo eq @ ee = Cenirtugacion 200.000 g, 7 hora } Ribosomas do son especialmente efectivos en lo refe- ido a la formacién de enlaces transversa- les. Estos dos fijadores, junto con el. tetr6- xido de osmio, que también forma enlaces transvorsales, son algunos de los agentes mas efectivos. Mantionen el aspecto de la célula en condiciones muy similares a las METODOS HISTOLOGICOS 33i que se observan con el microscopio de contraste de fase, como control de la es- tructura de las células vivas. digestion o autdlisis y conducirian a la degeneracién post mortem (lat muerte). Ademas, se eliminan bac muchos otros microorganismos, que po- drian destruir el tejido. En la prictica, la fijacién se lleva a ca- bo por inmersién de un pequeno trozo de tojido en ol fijador, apenas se haya to- mado la muestra. Es conveniente reali- zar la extraccidn del tejido mediante pinzas y una cuchilla afilada, y procurar no dafiar el tejido. Para los tejidos huma- nos, esto se puede efectuar durante pro- cedimientos quirirgicos 0 por biopsia (gr. bios, vida; opsis, sin), es decir, una muestra de tejido extraida del organismo vivo. De los tejidos accesibles directos, como la piel, se puede tomar la muestra por corte con cuchillo, pero también es posible tomar muestras de érganos inter- hos como, por ejemplo, el higado o el ri- Aén, mediante cénulas especiales. Las biopsias también se pueden extraer du- rante procedimientos como endoscopias (gr. endon, dentro; skopein, ver), es decir estudios internos de cavidades mediante un instrumento munido de una fuente luminosa, el endoscopio. Después de la extraccidn del tejido se lo sumerge one! fijador, en la fijacién por inmersion, a diferencia de la fijacién_por perfusién, que se puede aplicar a animales do expe~ rimentacién, En este caso se inyecta el Bjador en el torrente sanguineo del ani mal vivo anestesiado y el fijador Hoga por via hematégena.répidamente a todo el tejido. De esta manera se logra matar todas las células de un drgano completo en forma casi instanténea después de in- terrumpir la administracin de oxigeno. y se obtiene una fijacién mas répida y uniforme. E] método se aplica en traba~ jos muy exigentes, por ejemplo prepara- dos para microscopia electronica, en los que se destacan con nitidez incluso las pequeflas modificaciones estructurales post mortem. Inclusién y corte-El tojido fijado se cor- ta.en secciones-delgadas, que permiton-cl paso de la luz.!La mayorfa de los prepara- dos para microscopia éptica tienen un e: pesor de alrededor.do-5-t0-jum para lo que se requiere un micrétomo, instrumen- to similar, en principio, a una cortadora de fetas. Para obtener la consistencia ne- cesaria_para_poder_cortar secciones ta delgadas es necesario.incluir antes el tej do en un material que, al secarse, le con- fiera suficiente dureza. Las sustancias 34 METODOS HISTOLOGICOS Fig. 2-17. La ilustracion muestra el corte de telidos incluides en un micrétomo de parati- na. Tras @l corte se retinen los trozos en serie ‘sobre una pequefia “cinta transportadora” y se colocan en el bafio de agua caliente de la dere. ‘cha para que se estiren. A continuacién se montan sobre portaobjetos y se procesan. So- bre la mesa se ven 7 bloques de parafina, en los que se distinguen los trozos de tejido inclu dos. Cada bloque esta fijado a un pequeio cu- bo de madera que se ajusta al micrétomo du- rante el corte det blogue. adecuadas para este fin, los medios de in- ¢lusi6n, son tipos de cera insolubles en agua, por lo general_parafina. En conse- chencia, antes de la inclusion, es necesa- rio deshidratar el tejido. Para ello se-pasa el tejido por una serie de soluciones.acuo- sas de efanol en concentracioes crecien- tes, hasta llegar alanhidro. El tejido se su- merge entonces en-un-liquido miscible en otanol y parafina, por ejemplo\xileno, pro- See eee pués del aclaramiento se coloca el tejido en parafina liquida, que disuelve el xileno “y_penetra asf en el tejido. Al enfriar, se so- lidifica la-parafina-y forma, junto con el tejido incluido, un Bloque sdlido 0 “taco”, que es lo que se secciona (fig. 2-17). ‘A pesar de los cuidados, se producen ciertas modificaciones al procesar el taco. El alcohol y el xileno extraen grasas y el calentamiento de la inclusién inactiva muchas enzimas; ademas, a menudo el te- jido se contrae de modo perceptible. Pe evitar estos problemas, a veces se efectia un corte por congelamiento de tejido fija- do 0 no. Un taco de tejido congelado tiene consistencié*suficiente para ser cortado en un eridstato (véase fig. 2-33, pag. 43). La técnica de congelacién es tan ripida que se pueden obtener secciones en pocos minutos. Se utiliza, por ejemplo, para de- terminar si el material de una biopsia ex- traida en un acto quirtirgico es benigno 0 maligno. El resultado de la biopsia se ob- tiene mientras el paciente permanece CAPITULO @Acino: Islote de Langerhans. anestesiado, por lo que el cirujano puede decidir en el momento el alcance del pro- cedimiento quirirgico. Método de congelacién-desecacién. Con este método se intenta lograr que la variacion estructural y la extracei6n qui- mica sean las minimas posibles, para conservar la actividad enzimética. Se congela rapidamente el trozo de tejido y se lo coloca en una camara de vacio a ba- ja temperatura, después se seca (se deshi- drata) por evaporacin lenta (sublima- cién) del agua. En la congelacién-sustitucién se efec- hia primero una fijacién moderada y un tratamiento con sacarosa, después una congelacién répida del tejido y a conti- nuacién una deshidratacion a ~85°C en metanol puro. Una vez eliminada el agua se transfiere ei tejido a un medio de inclu- sin plastico adecuado, que se infiltra mientras se incrementa gradualmento la temperatura hasta alrededor de -20°C, Por uiltimo se polimeriza por irradiacién con luz ultravioleta el medio de inclusién, que se seca, y ya se puede cortar el taco terminado. Fig. 2-18. Fotomicrografia que muestra las ga- mas de color del método de tincién histologica de uso mas frecuente, la coloracién con he- ‘matoxilina-eosina (HE). El corte de tojido os de pancreas, por lo que se distingue un isiote de Langerhans, con células cuyo citoplasma se tine de color rosa claro con la eosina, y nume- ros0s Acinos, con células cuyo citoplasma se fhe de azul llaceo con la hematoxilina en la 20- nna basal y de rosa con la eosina, en la porcion apical. «650 E] miétodo es muy poco agresivo con el tejido y es apropiado para muchos proce- dimientos inmunohistoquimicos (véase més adelante). Coloracién. 1.08 cortes de tejido se sue- len montar sobre portaobjetos y se colo- rean. La mayorfa de los colorantes histolé- gicos se utilizan en solucién acuosa, por To que los cortes incluidos en parafina de- n_ser “desparafinados”. mediante un tratamiento con xileno, y rehidratados por Pasajes por concentraciones decrecientes do alcohol en agua, antes de ser tenidos. ‘Los cortes por congelacién se pueden tra- tar con las soluciones acuosas inmediata- mente después de seccionados. La mayor parte de los métodos de tin- ci6n histolgicos se desarrollaron en fun- cién de su capacidad para tefiir selectiva- mente los distintos componentes tisula- res. Bl método de tincién mds u la combinacién de hemato: (HE), quo-tinie los componentes nucteares de azul violéceo, miantras-que-tasl torles ‘Tas estructuras titoplasmaticas adquieren une tonalidad rosada \fig. 2-18). En con- secuencia, la tincién con HE muestra con nitidez la forma y la estructura del ni- cleo, ademds de la forma y la extension de la célula. Gabe destacar, sin embargo, que la tincién histoldgica es un procedi- miento quimico y que se ha producido tun gran desarrollo on los métodos que in- forman sobre la composicién quimica de las células y los tejidos. Esto se vera con mayor detalle en la soccton sobre histo- quimica, Después de la tincidn, por lo general se deshidrata y se aclara nuevamente la muestra de fejido y entonces se monta, es docir, se cubre con una gota de medio de ‘montaje transparente (Dopex, Bukitt). Por uiltimo se coloca un cubreobjeto para pro- teger el preparado. Algunos modios de montaje son miscibles en agua, por lo que se puede montar inmediatamente, sin ne- cesidad de deshidratacion y aclaramiento. Preparacién de tejidos para microscopia electronica Dobido al poder de resolucién mucho mayor del microscopio electrénico, en es- te caso se agudizan las exigencias de man- tener las estructuras originales del tejido. Para la fijacién se suele utilizar glutaral- dehido. También se puede emplear tetrd- xido de osmio que, ademas de fijar el teji- do, se une con las membranas lipaprotei- cas y asf logra mayor contraste en Ia ima- gen del microscopio electrénico. Esto se debe al aumento de la dispersién de elec trones por la membrana, a causa del eleva- do mimero atémico del osmio. En conse- cuencia, se habla de “tincién” o contras- METODOS HISTOLOGICOS 35tado. El contrastado con osmio se emplea ‘a menudo después de la fijacién con glu- taraldebido, que por s{ misma no aumen- ta ol contraste. Después de la jacion se deshidrata y se incluye el tejido. Para la inclusién se suelen utilizar resinas epoxi y distintos materiales pldsticos, que adquieren gran dureza después del secado y permiten la secci6n de cortes ultrafinos. 36 METODOS HISTOLOGICOS El haz de electrones se detiene con faci- lidad, por lo que los cortes de tejido utili- zados no deben exceder de 20-100 nm. Desde el punto de vista técnico, el corte de estas secciones ultrafinas es muy di- ficil y se necesita un ultramicrétomo, con una cuchilla de vidrio o de diaman- te. El corte se controla con un microsco- pio y se aumenta el contraste mediante el pasaje rapido de las secciones por una Fig. 2-19. Imagen de un corte ultratino captada ‘con microscopio elec- tronico, aumentada 19.000 veces. La imagen muestra la pared de un tdbulo renal, y se observa ‘con claridad una célula el tabulo completa, ro- deada de partes de dos células vecinas. Notese la gran riqueza de detalles {ue facitan la identifica cién de organelas e inclu- siones, por ejemplo, mito- condrias (M). (Cedida por ‘AB. Maunsbach.) CAPITULO 2Fig. 2-20. Fotomicrografia de un corte semiti- no de telido de rinn. Tras la fiiacion se incluy6 el tejido en pldstico y se cort6 en secciones de 11 um de espesor, que se colorearon con azul de toluidina. 630. solucién de acetato de uranilo. Por lo general no es necesario eliminar el plas- tico de inclusin, dado que es homogé- neo y transparenie, y ademés estabiliza el preparado durante el andlisis con el ‘oscopio. Los cortes ultrafinos se montan después de la seccién sobre un pequento reticulado de cobre, denomina- do “grilla”, que suele estar cubierto por una pelicula plastica de sostén muy del- gada. En la observacién microscopica (fig. 2-19), el haz de electrones atraviesa el corte por los orificios de la grilla. La gran calidad técnica que se obtiene con la preparacién de tejidos para la mi- croscopia electronica también se aplica para la microscopia déptica, con los cor- tes semifinos, de alrededor de 1 um de espesor, y la posterior tincién con, por ejemplo, azul de toluidina (fig. 2-20). Se usa azul de toluidina por su capacidad para penetrar en los medios de inclu- sidn de resinas epoxi, lo cual no ocurro con los colorantes histolégicos comu- nes. Los cortes semifinos también se pueden seccionar después de ser inclui- dos en resinas acrilicas (on lugar de re- sinas epoxi), que dan resultados de cali- dad muy similar y permiten la tincién, por ejemplo, con hematoxilina y eosina (fig, 2-21) Congelacién y fractura (ing. freeze- cleaving o freeze-fracture). Es una técni- Fig. 2-21. Fotomicrogratia de la comea. Es un corte semifino de tejido incluido en resina ‘acrilica y tefido con hematoxilina-eosina. x40. ca nueva que se aplica a la investigacién de tojidos por microscopia electronica. Consiste en congelar rapidamente el te- jido en nitrégeno liquide y Inego-colo~ carl6 en vacfo, para después fracturarlo con un cuchillo.o navaja (de modo simi- Jar a como se parte un ladrillo). Se colo- ca entonces vapor de platino sobre la su: porficie de Fractura-en. éngulo incline fo, lo que forma una delgada plantilla platino de esa superficie, o réplica,. 10 acentiia las formas dol relieve. Se Sireeeentatene lacreniicattee pation mediante la aplicacién de particulas de €arb6n. A continuacién se elimina ol te- Jjido con un écido fuerte y se monta la ré- ‘plica de platino sobre una grilla, para la observacién con el microscopio electré- nico de transmisién, dado quo el haz de electrones es capaz de atravesar la répli- ca delgada. Las ventajas del método son evitar las aéciones de los fijadores quimicos y de los inedios de-deshidratacion y de inclusion, por lo que se han podido compararlas ¢s- tructuras do los tojidos fijados y no fijados con el microscopio electrénico (fig. 2-22) El método tiene aplicaci6n especialmente importante en la investigacién do las os- tructuras internas de las membranas (véa- se con més detalle en el cap. 3). El poder de resolucién es de alrededor METODOS HISTOLOGICOS 37t ' Métodos histoquimicos Elelemento fundamental de los méto- dos histolégicos es la utilizacién de a ciones fisicas y quimicas sobre prepara- dos histolégicos, para determinar la 1o- calizacion de sustancias quimicas en las células y los tejidos. Para la histoquimica es esoncial la localizacion, dado que el empleo de cores de tejido pued formacién sobre la localizacion, imposi- ble de obtener por determinaciones bio- quimicas obtenidas de homogenados de tejidos. ‘Antes de la reaccién histoquimica en sf es necesario efectuar una fijacién y una preparacion adecuadas, que consorven la sustancia quimica estudiada y las estruc- ruras celular y tisular. Los lipidos son so- lubles en solventes orgdnicos como el xi- 1, por lo que so deben evitar cuando se rudian esos compuestos. Debido a la ac- én desnaturalizante de los agentes fija- dores sobre las proteinas, la mayoria de las enzimas se inactivan’con la fijac pero, por otra parte, algunas enzimas son 38 METODOS HISTOLOGICOS solubles y se pierden si no se Heva a cabo una fijaci6n previa a la determina i toquimica, La reaccién histoquimica debe inducir la formacién de un producto insoluble visible. En consecuencia, debe ser colo- reado 0 poder transformarse en fluores- Cente. Para la microscopia electronica es necesario que posea clectrondensidad suficiente, Se debe considerar la sensibilidad dela reaceién histoquimica, dado que los re- sultados negativos no se pueden interpre- tar de inmediato como ausencia de la pro- piedad buscada. Es posible que la canti- dad presente sea demasiado pequena para ser detectada, o que la sustancia se haya perdido 0 modificado durante la prepar cion previa, Se pasa gradualmente de los métodos de tincién morfolégicos a los procedi- mientos histoquimicos mas_especificos. Por lo tanto, se verén primero algunas reacciones més generales antes de anali- za los principales métodos histoqut Fig. 2-22. Imagen de la réplica de un preparado realizado por congela- clon y fractura, captada con microscopio elec trénico. La imagen muestra una célula epite- lial (del plexo coroideo ce- rebral) y se observan con Glaridad el nucleoioma y ‘sus poros. «22.400. (Ce- dida por B. Van Deurs.) CAPITULO 22:23. Fotomicrogra- de un corte de la mé- ‘espinal tefido con los Acidofilia y basofilia Para obtener suficiente contraste de co- lor en los cortes histolégicos comunes, por lo general se emplean combinaciones de colorantes écidos y basicos.‘Tradic nalmente se denomina acidofilia, (gr. fr Tein, amar)\a la eras ee tincion. de colorantes.deidos y basofilia a la capa- cidade tincian dales colorant a pero la designacién de colorants “dci- dos” y “basicos” proviene de la era clési- a de la histologia, cuando las definicio nes de acidos y bases diferfan de las ac- tuales (un dcido es una sustancia capaz de liberat_un protén y una base es una sus- tancia capaz. de aceptar un-protén). En el Tenguaje histoquimico, un colorante éci- do (aniénico) tiene capacidad para formar Aun enlace electrostético (Iondgeno) con Jun grupo tisular_con_carga-positiva: En contraste, ain 6 fe basico (catiénico) puede formar un enlace electrostatico con “un grupo tisular con carga nogativa. Asi, las uniones entre colorantes dacidos (aniénicos) y bésicos (catiénicos) y los grupos tisulares tienen, esencialmente, caracteristicas electrostatics. En un corte de tejido, el esqueleto proteico y muchas otras macromoléculas contienen grupos ionizables, capaces de former enlaces electrostaticos con los colorantes. Las dis- tintas proteinas de un corte de tejido tie- nen diferentes puntos isoeléctricos, dado que varian las composiciones de amino- dcidos. Para las tinciones histolégicas co- munes se utiliza un pH del que se conoce por experiencia su buen contraste de co- Jor. Con el pH elegido, algunos compo- nentes tisulares son acidéfilos, mientras y m Ley que otros serin basofilos (fig. 2-18), pero siempre en relacién con el pH, A pli neu- tro, el DNA y el RNA presentan fuerte ba- Sofilia, debido a la disociacion de los gru- pos fosfato-de las moléculas (fig. 2-23) Conese mismo pH, Ja mayoria de las pro- tosnas cltoplasmsticas son acidéfilass ndo se desea analizar si la basofilia pineaie Seine poe asicos, plo el RNA, antes de la tincién se puede tratar el corte control con la enzima ribonu- cleasa. De esta manera se elimina el RNA del corte control, por lo que las zonas ricas en RNA ya no serén bas6filas. El DNA se identified de modo similar, con 1a aplica- Con la fijacion se modifican las propie- dades de las proteinas, debido a la desna- turalizacion, y el resultado es un aumento de la afinidad por el colorante. Para algunos métodos de tincién, por ejemplo la coloracién_tricrémica de Ma- llory. se utilizan_varios colorantes, todos cidos, que tiften distintas estructuras tisu- Jares. Se desconoce 6! fandamento quimico de Ia tinién entre los colorantes y los com- ponentes tisulares, debido a que estos mé- todos no son especificos, desde el punto de vista histoquimico. Por el contrario, se de- nominan selectives cuando tiflen determf nados componentes tisulares (fig. 2-24). Los métodos do tincidn selectivos tienen Fig. 2-24. Fotomicrogratia de un preparado de Ja capsula de un drgano, coloreado por el méto: do de Mallory. Se observa una tincién selecti- va, dado que, entre otras, las numerosas fibras colagenas del telido conectivo se colorean de azul intenso. «275, METODOS HISTOLOGICOS 39Sitio do unién en ol polianion tie Molécula de colorante Motacromasia at Ortocromasia (azul) Fig. 2-25. Dibujo esquematico de la metacro- ‘asia, que muestra la agregacién de las mole- Culas de colorante sobre la superficie de un po limoro poliangnico de elevado peso moloculat (6. 6),,un glucosaminoglucano en un cartlago) on viraje del color azul del colorante a voleta ‘oj20. (Segtn Bradiey y Woll) sgran valor préctico, dado que el mayor con- traste de color facilita la identificacion de los distintos componentes del tejido. ‘Metacromasia Cuando se tifien ciertos componentes tisulares, como por ejemplo, la matriz car- tilaginosa, con el colorante azul de tolui- dina, se modifica el color azul a purpura 0 rojo violéiceo por unién con el tejido. Esta variaci6n cromética se denomina meta- cromasia (gr. meta, variacién; kroma, co- lor) y los colorantes capaces de sufrir esta transformacién se denominan colorantes metacromaticos. Pertenecen a este tipo de agentes ciertos colorantes basicos, de los cuales los mas importantes son los deriva- dos tiazinicos azul de toluidina y tionina. Una solucién diluida de un colorante tiazinico es azul, debido a que se encuen- tra como mondmero. Si la solucién es concentrada, el colorante s0 agroga y for- ma polimeros, por lo que el color vira al rojo. Asi, un colorante tiazinico puede presentar distinto color, de acuerdo con el estado de agregacién de las moléculas y es precisamente este estado de agroga- cidn, que puede ser modificado por los componentes tisulares, el que produce la metacromasia. Si se tifie un corte con una solucién diluida de azul de toluidina, es- te colorante cati6nico forma enlaces elec- trostaticos con los sitios aniénicos y, por los componentes tisulares capaces de ser teftidos metacromaticamente (hay poli- aniones de alto peso molecular), se agre- 40 METODOS HISTOLOGICOS gan las moléculas del colorante (fig. 2-25). En consecuencia, el colorante vira a rojo. Los componentes tisulares que se colo- rean por metacromasia son, en*su mayor parte, los muy dcidos glucosaminogluca- nos sulfatados de la matriz. cartilaginosa (fig. 2-26) y los mastocitos del tejido co- nectivo, que contienen la sustancia po- liani6nica heparina. Las nucleoproteinas. presentan metacromasia moderada. Métodos basados en Ia reaccién de Schiff para grupos aldehido El reactivo de/Schiff es la leucofucsina formada por el tratamiento del colorante rojo fucsina con bisulfito. La leucofuesina es incolora, pero forma un producto de ‘adicion estable rojo.con [as grupos aldehi- do, Esta reaccién se incluye como paso fi- nal de dos importantes métodos de tin- ci6n histoquimicos: la reaccién del écido peryédico-Schiff para compuestos ricos en hidratos de carbono y la reaccién de Feulgen para DNA. Método del acido peryédico-Schiff (PAS) La reaccién de\PAS se emplea para deter- aninarla presencia de macromoléculas ri- cas en -hidrates de carbono-camo el glucs- geno y Jas-glucoproteinas. El principio del método de PAS se basa en que el acido peryédico (HIO,) oxida primero los grupos hidroxilo libres de dos ‘tomos de carbono adyacentes, por lo que se transforman en grupos aldehido. Al mismo tiempo se escinde la unién entre los atomos de carbono, por lo que se detie- ne la oxidactén. Los grupos aldehfdo neo- formados reaccionan entonces con el Fig. 2-26. Fotomicrogra- fia de un corte de traquea tonide con hematoxilina- eosina, que muestra un ejemplo de metacroma- sla, La ancha zona inten- samente rojo violacea de la mitad inferior de la imagen es cartilago hiali- 10 (¢), cuya sustancia ba- sal se tile por metacro- masia. «110. CAPITULO 2Fig. 2-27. Fotomicrogra- fia de una tincién con el método de PAS de un ‘preparado de la mucosa el Intestino delgado. En el epitelio se distinguen Ccélulas calicitormes de Contienen secrecién {una glucoproteina) que $e tine con la reaccién, 2:28. Muestra el -eliminados por hidro- APITULO reactivo de Schiff, para dar lugar a la apa- riciGn del color rojo magenta caracterfsti- co (fig, 2-27). Varios componentes tisulares reaccio- nan con el método de PAS, se dice que son “PAS-positivos”, como se verd en los préximos capitulos. Para determinar si una sustancia PAS-po- sitiva esté compuesta por glucdgeno se tra- ta un preparado control con la enzima ami- Jasa, que escinde el gluedgeno especifica- mente, antes de realizar la tincién de PAS. Método de Feulgen, Es un método espe- cifico para la doterminacién histoquimica de DNA, sobre la base del contenido de desoxirribosa en el DNA. Se eliminan los grupos purinicos del DNA por medio de una hidrélisis écida suave. De esta mane- ase abre el anillo de la desoxirribosa y se forma un grupo aldehido (fig. 2-28), que Fig. 2-29. Fotomicrogratia de un preparado de! ‘exiremo de la raiz de una cebolla, tenida con el método de Feulgen, especitico para DNA. Sé- lo se tine de rojo la cromatina del nucleo (que contiene DNA). El color verde del citoplasma se debe al colorante de contraste verde claro. En- ‘re otras, en el centro de la imagen se distingue tuna céluia en mitosis (divisi6n), donde los cro- mosomas estan bien teniidos. x40. reacciona con el reactivo de Schiff, con aparicién del color rojo caracteristico en el sitio que corresponde al DNA (fig. 2-29). Como control se utilizan cortes tratados con la enzima desoxirribonucleasa antes de la tincién do Foulgen. Por lo general, los materiales positivos para Foulgen se limitan a la cromatina nu- Clear. Como so veré, on ol capitulo 3, las mitocondrias poseen DNA, pero en canti- dad demasiado pequeia para ser detecta- da con el método de Feulgen. Determinacién histoquimica de lipidos Después do la fijacion de los Ifpidos con formalina se cortan secciones conge- Jadas, para evitar la extraccién de los Ifpi- dos mediante solventes orgénicos. Para la domostracién histoquimicase utilizan muy a menudo los denominados coloran- tes Sudén. Son casi insolubles en agua, por lo que so utilizan disueltos en alcohol diluido, que no disuelve las grasas. La ‘incidn” se produce cuando las molécu- las del colorante se distribuyen entre los Ipidos y el solvente, en relacién corres- pondiente a la solubilidad en los dos me- dios. Pare evitar la extraccién del coloran- METODOS HISTOLOGICOS 41Fig. 2-30. Fotomicrografia de un corte congela- 0 de tajido adiposo tenido cen rojo Sudan ppara los lipidos de ios adipocitos (se us6 “Light Green” como colorante de coniraste). «440. te y los Ifpidos se incluyen los cortes, des- pués de la tincién, en un medio acuoso. De este modo, los colorantes Sudén. fien con intensidad los triacilgliceroles, como por ejemplo, en la tincién de los adipocitos con rojo Sudan (fig, 2-30). Bl negro Sudan tiene gran utilidad en la tin- cion de las vainas de mielina de las fibras nerviosas, compuestas por lipoprotefnas. Determinacién histoquimica de enzimas Las enzimas tienen vital importancia en el metabolismo celular, dado que actéan como catalizadores biolégicos de casi to- das las reacciones quimicas colulares. En consecuencia, es muy importante conocer con exactitud la localizacién histoqufmica de las enzimas. Entre los numerosos méto- dos enzimohistoquimicos, algunos tam- bién se pueden utilizar para el microsco- pio electronico. En estos casos se requiere un producto electrondenso, compuesto por cantidad suficiente de particulas pe- quefias para sacar provecho del gran poder do resolucién del microscopio electronico. Las sustancias que son escindidas 0 afectadas de alguna manera por las enzi- mas se denominan sustratos. Las enzimas se caracterizan por la especificidad de sus. rato. Asi, en muchos casos una enzimaac- ‘tia s6lo sobre un tinico sustrato. Es preci- samente en la especificidad de sustrato que se basa la localizacién histoquimica exacta de las enzimas, dado que de distintas ma- neras se obtiene un producto de reaccién visible que se expresa en el sitio de la reac- cién y sefiala la localizacién de la enzima. Para muchas enzimas, la reaccién his- toquimica se puede describir de la si- guiente manera: A os ol sustrato, que se escinde a B + C. Se agrega un reactivo R, 42 METODOS HISTOLOGICOS capaz de formar un complejo insoluble con B 0 con C (fig. 2-31). La reaccién enzimética se produce cuando los cortes se incuban, es decir, se colocan en un liquide que contiene los reactivos necesarios para determina la actividad enzimatica en cuestién. En el esquema de reaccion de la figura 2.31, por lo gonoral BR 9s incoloro y dos- pués de la incubacién suele suftir una transformaci6n secundaria para dar un precipitado coloreado, que se observa con el microscopio éptico (fig. 2-32). Dado que casi todas las enzimas son proteinas, la mayoria de los fijadores dis- minuye la actividad enzimdtica, aunque en grado variable para las distintas enzi- mas. Se conserva la mayor parte posible de la actividad enzimética cuando se sec- cionan en un eriéstato cortes congelados de tejido no fijado, entre 10°C y ~20°C. (fig. 2-33), aunque con el riesgo de que la enzima s¢ extraiga por dilucién, cuando se descongele el corte. La fijacién impide o inhibe esta extraccién. Métodos inmunohistoquimicos El organismo esté en condiciones de reaceionar ante sustancias extrafias @ anti- genos, y formar anticuerpos espectficos, que se unen con los antigenos. Por lo gene- ral acttian como antigenos las macromolé- culas proteicas 0 polisacdridas. Los anti- Fig. 2-32. Fotomicrogratia de la determina- ion de fostatasa dcida mediante métodos hhistoquimicos en un corte de tejido renal Dentro de las células, la fostatasa dcida esta lo- ‘aalizada en organelas redondeadas denomina- {das lisosomas que, en consecuencia, se identi fican en la imagen como granos 0 esferas ne- ras. »870. Fig. 2-31. El esquema muestra la forma en que habitualmente se produce la reaccién histoquimica con una enzima (véase el texto para los detalles). CAPITULO BZFig. 2-34. Fotomicrogratia {eaptada con microscopia '@e fluorescencia de un cor- fe de musculo de pollo. E! corte se colorea primero ‘eon anticuerpo fluores ‘Cente contra miosina de ppollo, y se bafia en una Solucion del anticuerpo. La fentimiosina se une alas Bandas A ricas en miosina, for lo que éstas se ven Guorescentes (blancas en Eeimagen). «750. (Segun Finck, Holtzer y Marshall.) GAPiTULO 2 Fig. 2-3. La ilustracién muestra ol corte de trozos de tojido on un eridstato. En principio se trata de una e4mara fria, en la que se ubica lun micrétomo, que se opera a través de dos ofificios en la parte anterior: el corte se vigila por una ventana calefaccionada. Los cortes de tejido so congoian instantaneamente al ser x= ttaidos y se mantienen asi a temperatura baja constante (p. ej, -20°C), durante todo ol proco- 0 de corte, lo que reviste especial importancia en enzimobistoquimica, cuerpos son proteinas producidas por las denominadas eélulas plasmaticas y circu- Jan por la linfa y la sangre. Las células pro- ductoras de anticuerpos pertenecen al sis- tema inmune del organismo, que protege al individuo contra las macromoléculas extraias que intentan ingresar, por ejem- plo, como componentes de bacterias o vi- rus. Asi, los anticuerpos son un eslabon importante en la defensa del organismo contra las enfermedades infecciosas (véase con més detalle en el cap. 16). La reaccién entre un antfgeno y su anticuerpo es en ex- tremo especifica. Los métodos inmunohistoquimicos se hasan sobre la utilizacion de un anticuer- po especifico, que se marca mediante un Fig. 2-35. Fotomicrogratia de neuronas tenidas ‘mediante inmunohistoquimica con anticuer- po contra la molécula transmisora serotonina (-hicroxitriptamina), unido a peroxidasa. La determinacién enzimohistoquimica de la perox!- dasa permite la identificacion del anticuerpo después de su unién con el antigeno del corte de tejido y da origen a una reaccion de color ro- Je parduzco. «440. enlace quimico en una sustancia que se ‘puede transformar en visible, sin afectar 1a capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antigeno. EI principio se ilustra con Ia denominada técnica de anti- cuerpo fluorescente. Para localizar la pro- teina muscular miosina se inyecta en un conejo miosina purificada de mtisculo de pollo. Al cabo de cierto tiempo, el suero del conejo contendra anticuerpos contra el antigeno miosina de pollo. A continuaci6n se extrae el anticuerpo del suero del cone- jo y se adosa a fluorescetna. Cortes histolé- gicos extraidos de pollo se banan en una Solucién del anticuerpo fluorescent (anti miosina), que se une especificamente con la miosina del corte, El anticuerpo en ex- ceso so elimina por lavado y se analiza el preparado con ¢l microscopio de fluores- cencia (figs. 2-34, 2-36 y 2-37), En lugar de marcar el anticuerpo con flnoresceina se puede acosar a la enzima peroxidasa, por lo que se pueden identi ficar complejos antigeno-anticuerpo me- diante la determinacién enzimohisto- quimica de la peroxidasa (fig. 2-35). De a manera es posible utilizar el método para la microscopia electronica. Ade- mis, se puede acoplar el anticuerpo a la protefna electrondensa que contiene hie- METODOS HISTOLOGICOS 43Fluoresceina ro, ferritina, o a particulas de oro, que también se puede identificar con el mi- croscopio electrénico (fig. 2-36). La especificidad de los métodos inmu- nohistoquimicos depende totalmente de que el antigeno utilizado se aisle sin mez- clas con otras sustancias, para que sea po- sible producir anticuerpos puros con la inmunizacién. En consecuencia, la inves- tigacion del grado de pureza dei antigeno es un importante control del método. Se obtiene un antigeno totalmente puro cuando se lo sintetiza, por ejemplo un po- lipéptido de secuencia de aminodcidos conocida. Es esencial sefialar que no es necesario aislar el anticuerpo primario pecffico de la fraccién mezclada de anti- Cuerpos en el conejo inmunizado ni los anticuerpos especificos anticonejo en la cabra (véase recuadro). Inmunohistoquimica indirecta EL método inmunohistoquimico antes escrito también se denomina método di- recto, hoy reemplazado casi totalmente por una técnica més sensible, lamada método indirecto. En principio es un procedimiento que consta de dos pasos: primero se hace reaccionar el preparado a analizar con un anticuerpo primario no marcado dirigido contra el componente que se desea demostrar. Cuando el anti- cuerpo primario reaccioné con el prepa- rado se elimina el exceso, no fijado, y se hace reaccionar el preparado con un an- 44 METODOS HISTOLOGICOS — @= — @= En los tiltimos aos ha sido posible ob- tener gran cantidad de moléculas de anti- cuerpo totalmente iguales, los denomina- dios anticuerpos monoclonales. La técnica para formarlos implica una fusion celular de células de mieloma (una linea celular tumoral transformada) murinos con los denominados linfocitos B, productores de anticuerpo, del timo de ratones previa- monte inmunizados por la inyeccisn del antigeno que se desea demostrar con el anticuerpo monoclonal. Después de la fu- sion celular, las denominadas células de hibridoma (hibridas de mieloma) forma- das han adquirido la capacidad de las cé- lulas del mieloma de desarrollar un creci- miento prolongado en cultives celulares y la capacidad de los linfocitos B de produ- cir determinado anticuerpo. Después de la clonizacién de las células hébridas indi- ticuerpo secundario marcado (p. 0j.. Aluorescento), dirigido contra el anticuer- po primario. Por ejemplo, si se obtuvo el anticuerpo primario contra una protefna X del preparado por inyeccién de X en un conejo, el anticuerpo secundario po- dria ser un anticuerpo de cabra dirigido contra anticuerpos de conejo en general, obtenido por inyeccién del anticuerpo de conejo en una cabra. Este método es més sensible porque cada molécula del anti- cuerpo primario reacciona con varias moléculas del anticuerpo_secundario ‘marcado, y la reaccién se refuerza. Fig. 2-36. Dibujo esque. matico dal principio de ta inmunohostoquimica, Se presentan los tres mé- todos mas usuales de de- terminacion histoquimica de proteinas eepeciticas mediante anticuerpos marcados. CAPITULO 2Fig. 2-37. Fotomicrogra: fia de un microtabulo den. tro del citoplasma de fi- Droblastos provenientes e un cultivo de telido, Gemostraco por inmuno- histoquimica mediante fa utilizacién de un anti- cuerpo tuorescente mo- oclonal contra la protei fa tubulina que conforma 1 microtdbulo. Los micro fibulos citoplasmaticos se distinguen de color verde fuorescente sobre fondo egto. x400. (Cedida por H. Hager.) GAPituLo 2 cada clon produce grandes can tidades de anticuerpo monocional idénti- 0 (fig. 2-97) Los métodos inmunohistoquimieos son uno de Tos mas importantes utilizados en las investigaciones histolégica y biolégica celular. En principio es posible demostrar la localizacin de cada una de las protes ‘nas que se forman on el organismo. Por ejemplo, en muchos casos se ha podido es: tablecer cudles son las células que forman determinada hormona. Los anticuerpos también se pueden formar contra otras moléculas, distintas de las proteinas, ya sea antigenos en si mismos o, en los casos de moléculas pequefias, compuestos que se acoplan a sustancias antig las protefnas, a veces debido a otro trata miento. Por ejemplo, se ha podido demos. trar la existencia de pequefias moléculas transmisoras como la serotonina (5-hidro- xitriptamina) (fig. 2 Histoquimica con lectinas Las lectinas son protefnas (on su mayor parte oxtrafdas de vogetales, por ejemplo, porotos rojos) qu n sitios de union especificos para hidratos de carbono, Dis. tintas lectinas se unen con diferentes mo- léculas de hidratos de carbono o secuen cias de éstas con notable especificidad. Asi, existon lectinas que se unen a gluco. proteinas y glucolipidos especificos de la superficie externa de las membranas celu- lares y a determinados proteoglucanos del tojido conoctivo. La utilizacién histoqui- mica de las lectinas se debe a que, al igual que a los anticuerpos, se las puede mar- car, por ejemplo con un colorante fluores- cente 0 con la enzima peroxidasa, que permiten su localizacién en un corte de tojido. La histoquimica con lectinas tiene amplia aplicacién para demostrar la exis. tencia de determinadas secuencias de hi- dratos de carbono en las moléculas de las membranas celulares. Hibridacién in situ La hibridacién in situ se basa sobre la capacidad que poseen los acidos nucleicos para hibridizarse entre sf, 0s decir, la ca: pacidad de unirse entre sf que presentan las monocadenas de dcidos nucleicos que tienen secuencias de bases complementa rias. La hibridacién puede ser de DNA- DNA, DNA-RNA, 0 RNA-RNA. Debido a la caracteristica muy especifica de la hibrida- cién es posible demostrar con gran especi- ficidad la presencia de determinadas se- as de DNA o de RNA en su localiza- cin on la célula. Para la técnica de hibri dacién in situ so utiliza una sonda (ing. sonde, probe), formada por un écido nu: cleico monocatenario con una secuencia de bases conocida, complementaria de la nencia de bases que se desea demos- trar. Las sondas son producidas en labora torios (p. oj., mediante técnicas de clona cidn de genes, véase con mayor detalle en el cap. 4) y se marcan con un isétopo ra- diactivo (para ser demostradas. por ra- dioautografia, véase la préxima seccién) 0 con una ramificacién adosada, que permi te identificar la sonda mediante otras téc- METODOS HISTOLOGICOS 45nicas, por ejemplo la inmunohistoquimi- a. Estas sondas varfan en longitud, desde 10-15 bases hasta varios miles de bases. Por ejemplo, si se desea demostrar la existencia de determinada secuencia de DNA en un cromosoma de las células de un corte histolégico o en un preparado es- pecial de cromosomas, primero se expone el preparado aun pH elevado (basico), que induce la separacion de la doble cadena de la molécula de DNA por desnaturaliza- cidn. Después se agrega la sonda, que pue- de poseer la secuencia complementaria de DNA 0 de RNA. Una voz hibridizada la sonda con las zonas complementarias del DNA de los cromosomas se transforma en visible la localizacién en los micleos celu- lares, por ejemplo, mediante radioautogra- fia o inmunohistoquimica, Si se desea demostrar la presencia de moléculas especificas de RNA, no se efec- tia ningtin tratamiento previo de los cor- tes histoldgicos con pH olevado, dado que precisamente se desea que las cadenas do- bles de las moléculas de DNA no se sepa- ren y, en consecuencia, no se unan a la sonda. En este caso es suficiente incubar los cortes de tejido con la sonda (después de una fijacién suave del tejido), que pus de contener una secuencia complementa- ria de DNA o de RNA. Asf, mediante la hibridaci6n in situ es posible demostrar las secuencias de 4 dos nucleicos correspondiente a determ nados genes (véase fig. 4-36), ademas de la expresin de determinados genes por la demostracién de la presencia de secuen- cias especificas de RNA mensajero (mR- NA). Radioautografia Con esta técnica es posible obtener in- formaci6n directa respecto al sitio dentro de la célula donde se sintetiza un produ to y los componentes quimicos que lo for- man, ademés de sus eventuales desplaz mientos dentro de la célula o hacia otras localizaciones del organismo, después de salir dela célula. Ademés, es posible seguir los desplazamientos de toda la célula y su posterior destino en el organismo. Por lo tanto, la radioautografia provee de infor- macién referida a los aspectos dindmicos de la morfologia de las células y los tejidos. La radioautografia se basa sobre dos principios fundamentales: 1) la radiacion ionizante tiene el mismo efecto sobre una emulsién fotografica que la luz visible. 2) Un precursor biolégico con marca radiac- tiva, por ejemplo, un aminoscido, tiene exactamenie iguales propiedades biolégi- cas y destino metabélico en el organismo que la molécula correspondiente sin mar~ ca. Por marca radiactiva se entiende que 48 METODOS HISTOLOGICOS un dtomo de la molécula determinada es reemplazada por su isétopo radiactivo co- ‘respendiente, pot sjemplo el reemplazo de hidrégeno por el proto slants aaa het eae de ser el siguiente, por ejemplo: en un ani- mal de experimentacién se inyecta una molécula de importancia biolégica marca- da con un isétopo radiactivo, por ejemplo sH-leucina, que interviene en la formacién de varias ‘protefnas. Las moléculas con marca radiactiva son integradas répida- mente a las macromoléculas, que se pue- den conservar en los cortes de tejido al ha- cerlas insolubles por fijacién. Las molécu- Jas inyectadas son solubles y se eliminan por lavado durante la preparacién de los Cortes histolégicos, a menos que hayan si- do incorporadas al producto de sintesis macromolecular antes de ser sacrificado el animal. Después del montaje de los cortes, se les agrega en cémara oscura una capa muy delgada de emulsién fotografica (cris- tales de bromuro de plata en emulsién de gelatina) (fig. 2-38). Durante el posterior periodo do exposicién, que puede durar algunos dias 0 semanas, de acuerdo al tra- bajo experimental, desde los sitios radiac- tivos del tejico se emiten particulas o ra- yos gamma. Algunos de ellos atraviesan la emulsi6n fotografica ¢ inciden en los cris Fig. 2-8. Dibujo esquematico de un preparado radioautografico para uso en el microscopio. electrénico. Parte superior. el preparado du- ‘ante la exposicion. Una particula beta prove- niente de un compuesto tritiado en el corte de tejido ha incidido sobre un cristal de bromuro de plata (grisado) de Ia emulsién fotografica s. prayacente y generado una transformacién par- ial de los iones plata del cristal on plata metéli- a (preseniado como una mancha negra arriba ala izquierda del cristal). Parte inferior. el pre- parade tras el revelado y la fijacion. El cristal Cidido se ha transformado totalmente en. granu- lo de plata metalica y se eliminaron los demas cristales (no incididos). (Segin Caro.) f 5 — Gelatina on Cristal de AgBr 0.061 — Corte de tojido 2.98 Pelicula de sosten Gelatina ~ — corte de tejido Pelicula de sostén’ CAPITULO 2APITULO 2 is Fig. 2-39. Fotomicrogratia de un preparado radioautogratico para microscopia ptica de tejido renal. En el animal vivo se inyect6 timid na tritiada, que antes de ser sacrificado el ani- ‘mal se incorpor6 al DNA en todos los nucleos Celulares en fase de sintesis como paso previo alla division celular. Los puntos negros repre- Sentan los grénulos de plata metalica y se loca- lizan en los nicleos de las células marcadas (nétese que, por lo general, las células total- mente desarrolladas no se dividen en los tubu- los renales, pero en este caso fueron estimula- das experimentalmente para la division). 870. (Cedida por R. Rasch.) tales de bromuro de plata, que se transfor- man entonces, en parte, de iones plata a plata motélica. Después de un periodo prudencial de exposicién se aplica un re- velador quimico que transforma todos los cristales incididos por los rayos en plata metilica. Por diltimo se eliminan todos los cristales no incididos mediante una solu- cidn de tiosulfato (Fijacién fotogréfica). A continuacién se puede tratar el corte de la misma manera que cualquier otro, por ejemplo tefiirlo de manera adecuada, con posterior deshidratacién ¢ inclusién En la observacién con el microscopio se distinguen los granos de plata metélica como pequeftas manchas 0 puntos negros en los sitios de localizacién de la sustan- cia radiactiva en ol corte de tojido subya- cente (fig. 2-39), E] poder de resolucién, entendido como Ja exactitud de la localizacién del is6topo radiactivo, os de alrededor de 1 jum con el microscopio éptico, pero si se utiliza el mi- croscopio electronico (fig. 2-40) es posible obtener un poder de resolucién de alrede- dor de 0.1 jum, En las imagenes obtenidas por microscopio electrénico a menudo los grénulos ocultan varias estructuras y el es- tudio mas exhaustivo de las radioautogra- fias puede requerir un andlisis estadistico. EI método sélo demuestra. sustancias que se incluyen en los componentes tisu- Tares, mientras que el material marcado se encuentra dentro del organismo. Pri samente por ello es posible obtener infor- macién sobre las relaciones dinémicas de Jos procesos metabélicos. Una importante Fig. 2-40. Imagen de un preparado radioauto- grafico de eritrocitos y reticulocitos (glébulos ro- Jes inmadures), captada con microscopio electro nico, Previo a la preparacién para la radioauto: ‘gratia para el microscopio elactrénico se incuba- on las células in vitro con leucina triad; se ob- sserva gran cantidad de grénulos de plata por so- bre un reticulocito (A), pero ninguno sobre los dos eritrocitos (). Esto se debe a que el reticu locito incorporé la leucina radiactiva durante la incubacién, puesto que ain es capaz de sintet Zar hemogiobina (proteina que requiere leucina), mientras que los eritrocitos maduros han perdido la capacidad de sintosis proteica. ~80.000.(Cedi- do en préstamo por A.B. Maunsbach.) aplicacién de la radiautografia es el mar~ cado de los micleos celulares (fig. 2-39), tras el cual se puede seguir el desplaza: miento y el destino de las células marca- das deniro del organismo. Si, por ejemplo, se inyecta timidina marcada con tritio (que en el organismo se incluye como la base timina en ol DNA) en un foto, seré in cluido en el miicleo de todas las células que sintetizaban DNA en el momento de la ;6n, como paso previo para la di- visi6n celular, En la actualidad el método €s muy importante para el estudio de la histogénesis (el desarrollo de las células embrionarias indiferenciadas a células es- pecializadas en un tejido).. Problemas en la interpretacién de cortes de tejido Por tiltimo so veran algunas condici nes que conviene recordar respecto de la microscopia éptica practica. METODOS HISTOLOGICOS 47Attificios. La palabra artificio significa producto artificial y designa estructuras del preparado que no existen en el tejido vivo, pero que aparecen artificialmnte du- rante el procedimiento de preparacién. ‘Algunos de los artificios més comunes son la retracci6n (fig. 2-414). que en mayor ‘o menor grado son una consecuencia inevi- table de la preparacién habitual de los cor- tes tisulares. La retracci6n se presenta en los tejidos como hendiduras u orificios va~ fos y sin estructuras (p. ej., no presentan, como los capilares, una cubierta endotelial hacia el interior del espacio vacio). Los pre- cipitados de colorante se observan como cristales coloreados, a menudo ubicados por encima del corte (fig. 2-41b). Los plega- mientos se pueden formar en el momento de la seccién 0 durante el posterior proce- samiento de los delgados corts (fig. 2-41), mientras que las imperjecciones de la cu- chilla del micrétomo causan defectos en el corte que se visualizan como lineas rectas que atraviesan las estructuras biol6gicas (ig. 2-414). La rotura del tojido durante la extraccién, por ejemplo debido a la pinza, puede dar lugar a la formacién de groseras variaciones del aspecto de las células. Por tiltimo se debe nombrar la fijacién dema- siado lenta o insujiciente como causa de cortes de mala calidad, debido a la degene- racién post mortem (véase con mayor deta- Ie en la secci6n de lisosomas, en el cap. 3). 48 METODOS HISTOLOGICOS Interpretacién tridimensional de un corte. Siempre se debe recordar que los cortes de tejido representan una delgada y, en principio, bidimensional rodaja de tun objeto tridimensional. En la figura 2-42 se muostra cémo un corte seccionado a través del mismo objeto puede presentar aspectos totalmente diferentes de los mis- mos tipos celulares. Muchas estructuras histoldgicas son tubulares, y la figura 2-43 presenta el aspecto muy variable de dis- tintos cortes transversales de la misma es- tructura tubular. Para establecer la forma tridimensional correcta de un érgano o de una estructura de gran tamano a menudo se realizan cortes seriados, en los que se presentan sucesivas secciones a través de toda la estructura U 6r- ‘gano. Mediante el cuidadoso andlisis de las relaciones entre los cortes de toda la serie es posible obtener una representacién mas cierta de la conformaci6n espacial, en algu- nos casos después de construir un modelo sobre la base de la sorie do cortes. La infor- macién obtenida en el andlisis también se puede transferir a una computadora, capaz de reconstruir un modelo tridimensional. ‘Aqui termina la somera introduccién a la microscopia préctica, recordando que para el diagnéstico es’ mds importante descubrir la estructura de las células y los tejidos que los colores, dado que estos pueden variar de una técnica a otra. Fig. 2-41. Estas 4 fotomi- Ccrogratias (a-d) de cortes ccoloreados con hematoxi- lina-eosina muestran ‘ejemplos de los artifi- clos histolégicos mas comunes. a muestra es- ppacios como consecuen- Cia de retraccién (ie- ‘ohas), mientras que en bse observa un cristal grande de colorante so- bre el tejido (fecha). ¢ es, un ejemplo de plega- miento del corte al sor ‘montado, mientras que d muestra lineas debi- das a muescas en la cu- cchilla del micrétomo (fechas). CAPITULO 2APiTULO Una celula de 15 um. Fig. 2-42. Dibujo esquematico que muestra co- mo un corte fino entre un grupo de células si- milares puede presentar un aspecto totalmen- te diferente cuando se observa el corte por e! microscopio. (Segin Ham.) Cuestionario sobre métodos histoldgicos 1. :Qué se entiende por poder de reso- lucién? 2. Qué se entiende por aumento? 3. 4Cuél es el méximo poder de resolu- cidn para el ojo a distancia normal de lectura, los mejores microscopios ticos y los mejores microscopios electrénicos? 4. Qué se entiende por in vivo e in vitro? 5. 3Qué es un clon celular, y qué es la clonacién? 6. Intente explicar en pocas palabras el método de fraccionamiento celular aque utiliza Ia contrfugacion diferen- cial es el objetivo de la fijacién de os te)idos cuando se preparan cortes histologicos? 8, Gull es la importancia clinica de la técnica de cortes por congelacién? 9. ;Qué se entiende por cartes semifi- hos y cuél es su espesor? 10. :Cuél es el objetivo de usar métodos histolégicos? 11. {Qué se entiende por acidofilia y ba- Sofilia? Corte de 5 um que atraviesa Fig. 2-43. Este dibujo esquematico muestra co- mo cortes en distinta direccion a través de la misma estructura tubular pueden presentar aspectos totalmente diferentes. 12. Nombre un colorante metacromético y algunas sustancias tisulares que presentan metacromasia. 13. ,Cudl es el principio basico del méto- do de PAS y qué se demuestts con él? 14. 4Cudl es ol principio basico del méto- io de Feulgen y qué demuestra espe- officamente? 15, Describa brevemente el principio bé- sico de un métado enzimohistoqui- 16. Intente explicar brevemente el prin- cipio fundamental de un método i munohistoquimico directo. 17. 4Se puede utilizar la inmunohisto- quimica a nivel de microscopia elec- tr6nica? 18, ;Qué sustancias se pueden demostrar modiante la histoquimica con lecti- 419, Intante explicar brevomente ot prin- cipio fundamental de la hibridacién. in situ. 20. {Qué se entiende por marca radiacti- va de una molécula? METODOS HISTOLOGICOS 49Lecturas complementarias sugeridas Berns MW, Laser scissors and tweezers. Sei Amer. Abril 1998:52-57. Bjugn R, Bastholm L, Nielsen MH. ‘Antigenpavisning for lys- og elek- tronmikroskopi. Nordisk Medicin. 1988;103:273-274. Bryndorf TE, Christensen B, Philip J. Ikke-radioaktiv in situ hybridisering med kromosomspecifikke prober, Ugeskr Laeger. 1992;154:1487-1491. Chemnitz J, Rasmussen L. Basisbog i Gelledyrkning. Gad, Copenhague. 1990. Evennett PJ. Light microscopy. En Image analysis in histology: conven- tional and confocal microscopy (eds. R Wootton, DR Springall y JM Polak). pp 134-150. Cambridge University Press, 1995, Hopwood D. Cell and tissue fixation, 1972-1982. Histochem J. 1985:17:389- 442, Kleinsmith LJ, Kish VM. Principles of Cell and Molecular Biology. 2 ed. Harper-Collins College Publishers, Nueva York, 1995. 50 METODOS HISTOLOGICOS Lichtman JW. Confocal microscopy. Sei ‘Amer. Agosto 1994;80-35. Rasmussen N.: Gell fractionation bio- chemistry and the origins of ‘cell biology’. TIBS, 1996;21:319-321. ‘Schuster TM, Toodt JM. New revolu- tions in the evolution of analytical ultracentrifugation. Current Opinion in Structural Biology. 1996;6:650-058. Stanley MW, Skogge L., Lowhagen T. Fine-needie aspiration cytopathology. En Oxford Textbook of Pathology. Vol 2b, Pathology of Systems (eds. JO'D ‘McGee, PG Isaacson y NA Wright). pp 2327-2383. Oxford University. Press, Oxford, Nueva York-Tokio, 1992. Starklint H, Clausen PP, Pedersen NT. Landvindinger indenfor diagnostik pa celler og vaev. 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