Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat PHAN MO DAU 1. LY DO CHON DE TAI Mang sinh hoc ( Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) 6 céu triic vi dic tinh rat gidng véi cellulose ctia thye vat (g6m cdc phan tir glucose lién két voi nhau bang lién két B-1,4 glucorit) cellulose vi khuan khac véi cellulose thye vat & ché: khéng chita cée hop chat cao phan tir nhu: ligin, hemicellulose, peptin va sap nén...do vay ching cé nhimng dic tinh vugt trdi véi d6 déo dai, bé chic.[17] ‘Trén thé giéi mang Bacterial cellulose da duge img dung rat nhiéu trong cdc fh cho qué trinh pin va ning lugng cho té linh vue céng nghé khéc nhau: nh ding lam mang phan t xir li nude, chdt mang die bigt cho 1o.ding lam, chat bién déi 46 nhét trong san xuat cdc sgi truyén quang, lim méi truéng co chat trong sinh hoc, thyc phim hay thay thé thyc pham. Dac biét trong linh vue y hoc, ming BC 4a duge img dung lim da tam thei thay thé da trong qua trinh digu tr] béng, loét da, lim mach mau nhan tao diéu tri cde bénh tim mach; lim mat na dung da cho con ngudi.[13] G Vigt Nam, vige nghién ciru va img dung mang BC cin & mire 49 khiém tén, cde nghién ciru img dung méi chi dimg lai bude dau nghién ctru. Cac két qua mg dung cia mang BC hau nhu méi chi dimg lai & diéu kién thi nghiém. Trong nhig nam gin day phong thi nghigm Thye vat - Vi sinh Trung Dai hhgc Sw pham Ha NGi 2 phan lap tuyén chon duge ching A. xylinum BHN, c6 kha ning tao mang BC va nhimg nghién ciru buéc dau cho thay mang BC tir ching A. xylinwn BHN, ¢6 kha nang img dung cho tri bong cho thé Ia eo sé 6 tgo ra mang tri béng cho ngudi. SV: Nguyén Duy KhanhKhéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat ‘Véi mye dich tim hidu di tich va thé tich ign quan dén a6 thong Kkhi trong, qua trinh tao mang BC trong diéu kign nuéi tinh ching tdi chon dé tai: “ Nghién citu dnh hiing cia th 1p S/V t6i khd nding tgo mang BC tie vi khudn Acetobacter xylinum BHN, ” 2. Myc tigu va ¥ nghia khoa hge ciia d@ tai - Nghién citu anh hudmg cia ty 1 S/V t6i kha nang tao ming BC tir vi KhuN A. xylinum BHN, phan gp tic ngudn nguyén ligu tir phong thi nghigm. - Khao sit kha nding tao ming BC cia vi khuN: 4. xylinum BHN, . - BO sung thém cdc kién thire vé vi khuNa A.xylinum nhim img dung tao mang BC duge tt nhat. 3. NOi dung nghién cia - Nghién ciru anh hudng cia ty A. xylinum BEN, ié S/V t6i kha ning tao mang ciia vi khuNi Nghién citu anh huéng ciia théi gian nudi cdy dén ty 1¢ S/V thich hop nhat dén kha ning tao mang BC cia ching 4. xylinum BHN, . - Nghién ciu anh huéng cia nhiét 46 nudi cdy dén ty 1¢ S/V thich hgp nhat én khd nang tao mang BC cia chiing A. xylinum BHN, ~ Nghién cru mét sé tinh chat vat ly clia mang BC duge tgo ra tir ching A.xylinum BHN, ti 6 dinh huéng cho img dung trong trj bong. SV: Nguyén Duy Khanh 7Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat PHAN NOI DUNG CHUONG 1. TONG QUAN TAI LIEU 1.1, Dai cuong vé vikhudn 4, Xylinum va mang BC 1 Phan logi va dc diém hinh thai cia A. Xylinum Theo hé théng phan loai eta nha khoa hoe Bergey thi A.xylinum thude giéng Acetobacter, ho Pscudomonadaceae, b§ Pseudomonadales, Iép Schizommycetes. Vigc phin loai vi khuNi nay cén nhiéu tranh cai, c6 mét sd tac gid coi A. xylinum nhu mt loai phy cia A. Aceti.[21] A. xylinum c6 dang hinh que, thing hay hoi cong, ¢é 11 i dong hay Khong di dng, khong sinh bao tir, Chiing 1 vi khuNh Gram am, nhung dic diém nhugm Gram cé thé thay déi do té bao gia di hay do diéu kigén mdi trvémg. Ching c6 thé dimg rigng Ié hay xép thanh chudi, Hinh 1: Két qua nhugm Gram eta 4. xylinum BHNz Khu lac ca A.xylinum 6 kich thuée én (duémg kinh khuNi lac dat 2-5mm), tron, bé mat nhy va tron béng, phan gitta khuNa lac Idi lén, dy hon va sim mau hon cdc phan xung quanh, ria mép khuNa lac nhan.[18] —————— SV: Nguyén Duy KhanhKhéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat 1.1.2. Dac diém sinh hy inh hoa cita A. Xylinum Vi khuNs A. xylinum phat trién & nhigt 46 25-35°C, pH = 4-6. Nhigt d6 va pH téi wu tly thuge vao giéng. 6 37°C, té bao sé suy thoai hoan toan ngay ca trong méi truéng téi wu. A. xylinum c6 kha nang chju duge pH thap, vi thé thudng bd sung them acid acetic vao méi truéng nudi cdy dé han ché sy nhiém khuNi la.[12] Cée dic diém sinh hod ding dinh danh cia A. xylinum bao gm: Oxy hod ethanol thinh acid acetic, CO,, 1,0; Phan img catalase duong tinl Khéng ting trudng trén mdi trudmg Hoyer; Chuyén hod glucose thinh aci Chuyén hoa glycerol thanh dihydroxyaceton; Khéng sinh sic 16 hop cellulose.[12] 1.1.3, Mang BC cia vi khudin 4. xylinum ‘Trén méi truéng dich thé, trong diéu kign nuéi cdy tinh, vi khuNa A. xylinum hinh thanh nén mét lop mang c6 ban chat Li cellulose, durge tip hgp bai nhimg bé s¢i cellulose lién két véi nhau durge goi la mang Bacterial cellulose hay mang BC. * Cu trac ciia ming Bacterial cellulose: Cellulose durge cau tao béi chudi polyme f -1,4 glucopynanose mach thing. Cé thanh phan hoa hoe déng nhat véi cellulose thye vat, nhumg céu tne va die tinh Iai khée xa nhau, két véi nhau tao ‘Chuéi polyme f -1,4 glucopynanose mdi hinh thanh lit thanh soi mhé (subfibril) e6 kich thuée 1,5nm, Nhimg soi nhé két tinh tao soi 16m hon- sgi vi mé ( microfibril) (Tonas and Farah, 1998), nhimg soi nay két SV: Nguyén Duy Khanh 7Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat hop véi nhau tao thanh bé va cudi ciing tao dai ribbon (Yamanaka et.al 2000). Dai ribbon cé chidu dai trong khoang tir 1-9nm. Nhimg dai ribbon duge kéo ra tir bio nay s@ lign két véi nhimg dai ribbon cita té bao khae bang lién két hidro hodc lye vandesvan tao thinh cau trie mang luéi hay mot I6p mang méng trén bé mat mGi trudng nuGi edy.[15] Do dai ribbon cia ming BC cé duéng kinh nhé hon cita PC, chi s6 két tinh cao (khoang 60%), 46 polyme hod Ién nén ming BC cé d6 bén co hoc cao, kha nang hép thy nude lén. Bacterial cellulose san xuat bi vi khuNa A. xylinum duge nghién ctu dau tién bdi Brown nim 1886, Né da thu hiit sy chai tir mia sau ctia thé ky XX, nhimg nghién citu tap trung sau vao co ché téng hop, cfing nhu cau tric va ic tinh eita cellulose.[22] 1.2, Anh huéng cia méi trudng dinh duéng dén kha nang tao mang BC tir vi khuan A.xylinum: 1.2.1.Anh hong ham legng glucose Nguén cacbon ¢6 anh huéng manh mé t6i sinh trxéng cing nhu tong hgp cellulose cha Acetobacter xylinum. Theo két qua nghién citu cia Thac sf Nguyén Thi Nguyét trén ching Acetobacter xylinum HNS thi nguén cacbon 6 anh huéng lén nhat dén sy hinh think ming ciia Acetobacter xylinum li glucose, Dé tao mang phyc vu mye dich nghién ctu, Thac sy Tran Nhu Quynh dé quyét dinh sir dung ham hrgng glucose 20 g/l cho cde nghién ciu tren ching 4. xylinum BHN, .[14] 1.2.2, Anh hiréng cia ham hegng (NH)2S0, SV: Nguyén Duy Khanh >Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat Vi sinh vat va tat ca cdc co thé séng khéc déu can nite trong qua trinh séng dé xay dymg té bao. Nhan té (NH,)SO, li mét trong nhiig nhan t6 cé anh huéng lén dén sy phat trién cia Acetobacter xylinum, 1a nhan t6 quan trong cung cp nguén nito cho té bao phat trién. Vi vay, néu nguén nito trong méi truéng qué it s anh huéng dén hoat déng séng cia té bao, tir dé anh huéng: én qué trinh tao mang BC. G néng 46 2,0 g/l méi trréng cho higu suat mang. BC cao nhat.[14] 1,2,3, Anh hwong cia ham lugng MgSO, 7H;0 MgSOg 6 néng dé 2 g/l cho sin Iugng BC cao nhat, theo PGS-TS Dinh Thi Kim Nhung, magie 1a nhan t6 tham gia vao viéc tao thanh cac enzim, nhimg enzim nay xéc ltée cho cdc phan img chuyén héa cae chAt trong qué trinh hinh, thanh mang BC.[14] 1.2.4, Anh hong cia ham lgng KH;PO, Phospho ngoai vai trd tham gia cau triic cdc thanh phan ciia té bao, n6 con 66 vai trd hét site quan trong trong téng hgp cellulose & vi khuN: Acetobacter ayrlinum (Ross etal, 1991). Sir dung ndng 46 2g/1 KH2PO, sé cho sin hrong BC cao nhat.[14] 1.3, Anh huéng cia diéu kign nudi cdy dén kha nang tao mang BC tir vi khudn A.xylinum 1.3.1. Anh hwéng ciia thdi gian lén men va ham long gidng. Lugng giéng va théi gian mudi cdy 14 2 yéu t6 quan trong anh hudng ‘rong qua trinh Ién men cellulose vi khuNh. SV: Nguyén Duy Khanh %Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat Dé dai cia mang phy thudc rat nhiéu vao sy két tinh cla mang BC, d6 két tinh cia mang lai chiu anh huéng 1én vé théi gian 1én men thu nhin ming. Vi néu thu sém d9 polymer hod va két tinh chwa cao s& anh huéng dén tinh chat co hge ciia mang BC. Nguge lai néu dé lau trong méi tong nghéo dinh dudmg mang chim xuéng, vi khuNi sé tién hdnh phan huy thu nang hrong cung cap cho hoat déng séng cua té bio. Déi v6i lodi Actobacte xylinum, trong qué trinh 1én men, phan lon cde té bao lién két véi phan tir glucose dé hinh thanh 1ép mang BC trén bé mat nuéi cay. Lép mang nay ngan can sy tigp xite cua oxy voi méi truéng dich thé. Vi vay viée nghién ciru xde dinh duge Iugng giéng bé sung ban dau cho pha hgp c6 ¥ nghia quan trong dé thu duge mang BC véi nang suat cao nhat. San lugng cellulose thu duge trong qué trinh 1én men déu ting theo ty I gidng va thoi gian lén men.[14] 1.3.2, D6 thong khi ‘Vi khuN: A. xylinum 1a vi khuNa hiéu khi bit budc. Didu kign tién quyét khi 1én men tao sinh khéi 1a diéu kign théng khi. Trong co ché cua qua trinh lén_ men, Iugng oxy cin cung cdp 1a twong déi lén. Trong thu té 46 théng khi quyét dinh nang sudt BC. Vi vay hinh thie suc khi cung cdp oxy va sit dung canh khudy trong lén men déng 1a pha hgp cho san lugng BC cao trong 1én men chim. Lén men tinh can sir dung dung cu cé bé mat rong, thoang va lop méi trrémg méng,[19] Wanatabe va Yamanaka (1995) phat hign ra ap suat oxy cing anh huéng dén kha nang hinh thinh cellulose vi khuNi, Cellulose hinh thinh duéi 4p sudt oxy thdp cé sy phan nhénh nhiéu hon so véi trong diéu kign 4p suat SV: Nguyén Duy KhanhKhéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat oxy cao. Do dé anh hudng tryc tiép dén hinh dang va dé chiu Iye cla lép mang BC.[20] 1.3.3. Nhigt d6 Nhiét d6 thich hop véi vi khuNh A. xylinwm tit 25-30°C. 6 nhiét 46 thdp qué trinh Ién men xdy ra chm. G nhigt d6 cao sé tte ché hogt dong va dén mite ndo dé sé dinh chi sy sinh sén cia té bao va higu sudt 1én men sé gidm,(21] 1.3.4, D6 PH Vi khuNi A. xylinum phat trién thuan loi trén méi traéng 6 pH thap. Do dé trong méi trréng nuéi cay can bé sung thém acid acetic nhim acid hod méi trang. Déng théi acid acetic con c6 tac dung sat khuNn, gidp ngin chin su phat trién cua vi sinh vat ¢6 hai.[21] 1.4, Ung dung ciia ming BC 1.4.1. Ung dung ciia BC trong mét sé linh vec Ming BC cé nhigu Igi diém vugt tr6i nhur: 46 tinh sach, 6 két tinh, 46 bén site cing, 46 dan hdi, 6 co gidn, kha nang git hinh dang ban dau, kha ning gitt nude va hit nude cao, bé mat tiép xc Ion hon bot go thudmg, bs day cia vi sqi duéi 100nm, bj phan huy sinh hoe, ¢6 tinh twong thfch sinh hoe, tinh tro chuyén hod, khéng d9c vi khéng gay di img. Mang BC cé cdc img dung da dang trong nhiéu lanh vue nhwr_y hoe, thyte phNn, my phNn, bio vg méi truémg, cong nghigp [22] 1.4.2, Ung dung ciia mang BC trong diéu tri bong Béng 1a mot tai nan thudmg gap trong lao dng va sinh hoat hing ngay. SV: Nguyén Duy Khanh ¥Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat Ngoai t6n thuong da, truéng hgp béng nang cén gay ri loan ngi tang, dé lai di chimg nang dén kha nang van d6ng, thNn mf va site khde cua ngudi bénh. G Vigt Nam, chi ring Vign Bong Quéc gia (Ha N@i) mdi nim tiép nhin khoang hon 400 ca béng. Céc te nhan gy bong chii yéu la bong nude s6i, Ngoai ra cde tée nhan khde 18 xing, diu, mde canh néng, acid, voi 161 néng.[6] ‘Viée diéu tri tai chd vét thuong béng 14 mét cong tac c6 ¥ nghia dic bigt quan trong. Déi véi vét bong néng digu tri tai chd vét bong cé tac dung lam giam dau ngan chan cac bién chimg nhiém khuM, tao diéu kign tét cho qué trinh t4i tao phyc héi. Déi voi nhimg truéng hgp béng sau, diéu tri tai ché 06 tac dung 1én trong viée diéu tri dy phong cac bién chimg ciia nhiém khuM: tai chd, khéng dé nhiém khuN: toan than, ngan ngira sy mat mide va dich trong co thé (li nguy co din dén tir vong cao), loai bé nhanh cae t6 chire hoai tir, tao diéu kign t6t cho qué trinh hinh thanh mé hat va biéu mé héa hinh thanh so, chuNn bj tot nén ghép da trong phau thuat.[6] 1.5. Tinh hinh nghién ciru vé mang BC 6 Vigt Nam va trén thé gidi 1.5.1. Trén thé gidi Nghién ciru vé mang BC tit vi khuNa A.xylinum va nhimg mg dung cia né da duge tién hanh 6 nhiéu nude trén thé gidi, Tac gia Brown, 1989, ding ming BC lim méi tradng phan téch cho qué trinh xir ly muée, ding lam chat § bao. Brown (1989), Jonas va Farad, 1998, ding mang nhu 1a m6t chat dé bién d6i 46 nhét, dé lam ra cic mang dic biét cho céc pin va ning hrong cho sgi truyén quang, lam méi truéng co chat trong sinh hoc, thye phNn hodc thay thé thye phNn, Die bigt Brown (1989) 4a ding BC lam vai dic bidt, Nogiet va cs (2005), Jonas va Farad, 1998, Soloknicki va cng sy (2006) SV: Nguyén Duy Khanh 3Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat ding mang BC dé san xuit gidy chat Iwgng cao, lam co chat dé 6 dinh protéin hay cho séc ki.[5] Tuy nhién, nhimg img dung thug thay trén thé gidi cla mang BC 1a ding trong nganh duge phNn va mj phNn, Céc tac gid: Hamlyn va cs (1997), Cienchanska (2004), Legeza va cs (2004) Wan va Millon (2005), Czaja va (2006) sir dung ming BC dap lén cdc vét thong hé, vét bong da thu durge két qua t61. Dic biét tac gia Wan (Canada) da dugng ding ki ban quyén vé lam ming BC tir Axylinum ding tri béng. Cac tae gid Jonas va Farad (1998), Czaja va es (2006) da ding mang BC lam da nhan tao, lam mit na dudng da cho phu nir[5] 1.5.2. O Viet Nam Tai Viét Nam tinh hinh diéu tri bong trong nuée ngay cing duge cai tién. Céng tac diéu tri bong bao gm viée cay ghép, phau thuat, tao ra mét sé mang trj bong nhu mang 6i, trung bi da lgn, da éch, mang chitosan, sis dung cdc chat cé nguén géc tir ty nhién c6 tac dung diéu tri bong ... Ti nam 2000 nhém nghién ctu cia tac gid Nguyén Van Thanh va cong sy da cé mét sé céng trinh nghién ctu vé mang BC th A. xylinum va bude dau nghién ciru ve cée dic tinh ming BC thu duge 1A co sé dé ché to ming sinh hoe ding trong, trj bong 6 Vigt Nam[9] Didu tri bong bang cac thudéc cé nguén géc tir ty nhién di duge 4p dung tir rat lau va phé bién 6 tat cd cdc nude. Cac thudc nay cé sin trong thién nhién va cé nhiéu dic tinh tét cho diéu tri bong ciing nhu chita céc vét thuong, vét loét. Mang BC cé nhiéu wu diém dé te thanh chat mang cdc hop chat c6 nguén géc tir thién nhién sit dung trong diéu tri bong.[14] SV: Nguyén Duy Khanh vKhéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat 1.6. MOt sé cong trinh nghién ciru cé lién quan dén dé tai Luan van thac si vi sinh hoc 2009 : “Nghién citu mOt sé déc tinh vét lf cia mang BC tie Acetobacter xylinum, teng dung trong trj bong” cia Tran nhu Qujmh- DHSP Ha N6i da lam duge mot sé van 48 sau: - Nghién ciru mot sé dic tinh sinh Iy, sinh héa eba ching vi khuNi A.xylinum BEN: - Nghién ctru anh hudng cia mét u t6 dén qua trinh lén men tao mang BC cia ching A.xylinum BHN;, qua d6 Iya chon duge mdi trudng thich hyp cho ching A.xylinum BHI; Ién men tinh, + Diéu kign nudi cay: ham Iugng giéng bé sung ban dau cho lén men tao mang 18 10% thé tich 1én men, véi PH ban dau ctia méi traéng 1én men tir 4,5- 55. + Mi trig dinh dugng: him hugng duong glucose 20g/1; (NH,)SO4: 2 g/l; KH;PO,: 2 g/l; MgSO,.7H,0: 2 g/l. - Nghién ctu duge ty 1é dign tich b& mat va thé tich lén men cho ching A.xylinum BHN, tao mang t6t nhat, - Xit ly ming BC img dung trong didu tri bong va khio sit cée dic tinh eita mang: kha ning khéng khuNi cao, d6 bén eo hoe 3,62 kN/m, d6 thé khi 120ml/phét, kha nang hit mede 6,82g/100cm?/24 gid; ming khéng 6 trigu chimng kich img, - Mang BC tNn dau ma u va kem nghé lam lanh vét thong sau 19 ngay digu tri, SV: Nguyén Duy KhanhKhéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat CHUONG 2: V, PHAP NGHIEN CUU T LIEU VA PHUO! 2.1. Vat ligu 2.1.1. Vit ligu chinh ‘Déi tuong nghién ctu 1a cdc ching A. xylinum BHN, duge phong thi nghigm Thy vat - Vi Sinh Khoa sinh - KTNN Truémg Dai hoc Su pham Ha NOi 2 cung cip. 2.1.2. Hoa chat va thiét bi 2.1.2.1, Hoa chat ~ Ngudn Cacbon: Rugu etylic, Glucose, Sacrose, Manitol, Lactose, Fructose, Dihyroxyaceton, Axit acetic. ~- Ngudn Nito: Cao nam men, Pepton, (NH,):SO4 - Cae mudi khoang: KH4PO4, CaCOs, MgSO..7H,0, NaOH, CuSO, = Cac chat kich thich sinh truémg: Cao ném men, cao ngo. - Thude thit: Dung dich Fehling, dung dich Blue Bromophenol. - Thudc nhuém: Tim gentian, Fueshin, Lugol. - Ngodi ra edn sit dung : Céc loai bia, made dita, cdc loai mre chiét qua. 2.1.2.2. Thiét bj ‘Ti Am, ti s4y Binder (Ditc). ‘Noi hip Tommy (Nhit). Méy so mau UV — vis ( Nhat). Méy do pH (MP 200R - Thuy Sj). Méy lic Orbital Shakergallenkump (Anh). May li tam Sorvall (Mj). Mictopipet Jinson (Php), cdc loai tit 20, — 10ml SV: Nguyén Duy Khanh 7Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat jén vi quang hgc Carl Zeiss (ite): Axioskop 40, (Precisa XT 320M - Thuy s9). ‘H6p ling, éng nghiém, binh tam gic, que trang, dén cén.. 2.1.3, Mai trang 2.1.3.1, Moi trursng phan lp giéng (MT1) Glucose: 20 g (NFi)2S04:3 g KH,POg 2g MgS0,.7H,0: 2 g CaCOs : 10g Agar: 20g Axit acetic: 2% (b6 sung sau khi khit tring). Rugu etylic: 2% (bd sung sau khi khtr tring). Nurée may: 100ml. 2.1.3.2, Méi trang nhan gidng co ban (MT2) Glucose: 20 g (NH,)SOq: 3 g KH,PO,: 2g MgS0,.7H,0: 2 ¢ Pepton: 4g Axit acetic: 2% (b6 sung sau khi khir tring). Rurgu etylic: 2% (b6 sung sau khi khir tring). Nurse may: 100ml. 2.1.3.3. Mai trudng nghién cru kha nang tao mang Glucose: 20 g (NH,)2S04: 3 g KH,PO.: 2g MgS0,.7H,0: 2 g Cao ndm men: 3g Pepton: 4g Axit acetic: 2% (b6 sung sau khi khir tring). Rugu etylic: 2% (b6 sung sau khi khir tring), Nude dira: 1000ml, SV: Nguyén Duy Khanh 7Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat 2.2, Phuong phap nghién cu 2.2.1. Phong phip hoat héa gidng A.xylinum BIN, Gidng tir 6ng nghiém dugc bao quan trong tu lanh truée khi dem sir dung phai hoat héa gidéng “lam thie tinh giéng”, nhan giéng dam bao dui sé lugng +8 bao vi sinh vat cho qué trinh lén men. Phuong phap hoat héa giéng sir dung. ‘méi trréng tigu chuNi khéng cé thach agar, dem hap thanh tring 6 121°C trong 20 phit, Sau dé dem xit If trong dén tim 15 phat dé khir khuNi, sau d6 cay chuyén gidng tir dng thach nghiéng vao va nudi lic 135 vong/phut trong 24 gid. 2.2.2.Phwong phap lén men tao mang BC tir vi khudn A.xylinum BHN, Sir dung méi truéng 1én men tao mang dem hap thanh tring & 110°C trong 20 phit dé trinh phin di duimg. Sau dé khir khuNi & dén eye tim trong 15 phit. Sau dé tién hanh Ién men tao mang BC bang cach bé sung vao méi truéng 1én men 5% giéng da hoat héa. Nuéi cdy & digu kign tinh trong 7-10 ngay. 2.2.3. Phwong phép bio quan ching giéng A.xylinum BHN, trén mdi trudng thach nghiéng C&e ching gidng sau khi nhan ti phong thi nghiém vi sinh sé duge cdy trén mdi trutmg thach nghiéng (MT! da loai bd CaCOs), nudi trong ti dm 3 — 4 ngay 6 30°C. Sau dé, git lanh 6 ti 4°C dé bao quan giéng. Cay truyén gidt gidng trén méi trang thach nghiéng méi thing m9t Lin.[4] 2.2.4, Phuong phap nghién ciru ty 1g S/V dén kha ning tao ming BC tir ching A. xplinum BEN, SV: Nguyén Duy Khanh 7Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat 2.2.4.1. Phuong phap nghién ciru tim ty If S/V dén kha ning tao mang BC tot nbat tir ching A. xylinum BHN, S: dign tich bé mat 1én men tao mang BC (em’) Vs thé tich dich én men tao mang ( cm’) ‘V6i phuong phap cé dinh dign tich bé mat 1én men tao mang, thay déi thé tich dich 1én men dé tim ty 1 S/V thich hyp dén kha nang tao mang BC tét nhat tir ching 4.xylinum BHN, , ching t6i tién hanh theo cdc bude sau: - Buée 1: Tinh dign tich bé mat lén men tao mang BC. Quy di thé tich tir don Ig SIV. vi ml sang don vi cm’, Sau 46 tinh + Dung cy Ién men tao mang li khay nhya hinh chit nhat ¢6 kich thuée 15 x 10x 4 cm, tir dé ta tinh duge dign tich bé mat lén men tao mang BC la. S= 15 x 10= 150 (cm’), + Thé tich dich 1én men duge do bing ml nhung dé tinh duge ty 1¢ $/V thi ta phai quy ddi ml sang cm’, Ta a biét Iml=1em". Ta 6 bang sau: SV: Nguyén Duy KhanhKhéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat Bang 1: Tinh quy di S/V thi nghigm nghién cu S (cm) ‘V (ml scm’) SIV (cm") 150 150 1.0 150 167 09 150 1875 08 150 215 07 150 250 06 150 300 05 ~ Bude 2: Tién hanh lén men bé mat tao mang BC tir chiing 4.xylinum BHN, v6i cdc tigu chi: théi gian xuat hién mang, mau sic, 46 nhin, d6 day, d6 dai, can nang, trong Iugng khé dé tim S/V thich hgp tao mang BC tét nhat, 2.2.4.2, Phuong phip xc dinh dai (49 bén co hgc) ciia mang BC DG chiu kéo(d dai)(tensile strenght): Lye kéo Ién nhat ma mau thir chju duge true Khi dirt trong diéu kign xée dinh cua phuong phép thir tigu chuNa.[14] D6 bén kéo(d6 dai) c6 thé duge hiéu nhw 1a khi mGt lye tac dong ting dan dén khi vat ligu dang sqi hay try bj dirt, 6 gid tr Ie kéo gidi han cho sy dist ciia vat ligu duge ghi lai duge ky higu 0,. D6 bén kéo duge img dung rat nhiéu cho cdc vat ligu trong cdc linh vye nhu thiét ké ché tao may, xay dung, khoa hge vat ligu.(14] SV: Nguyén Duy Khanh %Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat Dé xée dinh 46 dai ctia mang ti da ding mét lye ké(don vi 1a N- ‘Niuton). Sau khi thu mang t6i tién hanh do 46 dai bing cach: + C6 dinh dau truée ciia mang + Tidp dén lay hye ké 16 xo c6 dinh vio dau sau N. + Kéo mang xem tdi da mang dé c6 d6 bén kéo dat duge bao nhi 2.2.4.3. Phong phap nghién cru thi gian dén ty 1¢ S/V thich hgp nhat dén kha nang tgo mang BC tir ching A. xylinum BHN , ‘Tién hanh thi nghiém nghién ciru théi gian tir 1-7 ngay dén ty 1é S/V thich hop nhat dén kha nang tao mang BC tir ching A. xylinum BHN, theo cac tigu chi: thai gian xuat hién mang, mau sic, d6 nhin, d6 day, d6 dai, can nang, trong long khé tir dé tim théi gian thich hop tao ming BC tét nhat. 2.2.4.4, Phuong phap nghién ciru anh hwéng cia nhigt d9 dén ty 1g S/V. thich hgp nht dén kha nang tao mang BC tir chiing A. xylinum BHN , ‘Tién hanh thi nghiém nghién ciru nhiét 46 tir 20-40°C dén ty 16 S/V thich hop hat dén kha ning tao ming BC tir ching 4. xylinum BHN, theo cée tiéu chi: thai gian xudt , 46 nhin, d6 day, 46 dai, cin nang, trong lugng khé tir dé tim nbigt d6 thich hop tao ming BC 16t nhat, *n mang, mau si SV: Nguyén Duy KhanhKhéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat 2.2.5. Phuong phap thong ké va xir ly két qua. Xir ly théng ké cdc két qua thi nghigm theo mét sé phuong phap trong cuén “Ung dung tin hge trong sinh hgc” va “Théng ké va img dung” nhu: trung binh cng: Ding dé tinh gia tri trung binh ciia cdc Lin lip lai thinghigm, ¥-1y°x, Bana * Trung bin binh phuong ede sai Ich 5 = i * Sai sO dai dign cua trung binh cGng — 4m= g * Hé s6 bién thién trung binh céng: SV: Nguyén Duy Khanh ¥Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat CHUONG 3. KET QUAN SHIEN CUU VA THAO LUAN 3.1. Anh hwéng cia cée ty 1g S/V ti kha nang tao mang ciia vi khudn A. xylinum BHN, Sau mt thdi gian nghién eiru lén men bé mat go mang BC tir ching A.xylinum BHN , v6i céc tiéu chi; théi gian xuat hign mang, mau sac, d6 nhin, 6 day, 46 dai, An ning, trong lugng khé tuyét di dé tim $/V thich hop tao mang BC tét nhat, ching t6i thu duge két qua thé hign 6 bang 3.1 nh sau: Bang 3.1. Nghién citu ti l@ S/V dén kha nang tao mang BC tot nhdt tie vi khuan A. xylinum BHN , (Anh huéng ty I§ dign tich bé mit va thé tich len men) SV: Nguyén Duy Khanh 5Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat Ty Die diém mang | Thoi Mausic, | Dé Dé dai | Cin | Trong sw | 8 ae anin | MY OBE nding) come xudt sau kéo) | sau | khb (em) yy khi khi ign 1 bom yy M| @ man; len len ® 7) men men (mm) @ os 4 Tring duc, | 0,50 6 417 [0.10 san siti a6 4 Tring duc, [1,510 854 [014 san siti 07° \4 Tring duc, |1,9 14 8,61 | 0,15 san siti 08/3 ‘Mang tring | 3,00 18 22,22 | 0,31 trong, nhan. 09/3 Mang tring [2,50 16 18,17 | 0,35 trong, nhén, 10 |3 Mang tring | 2,00 12 13,36 | 0,30 trong, nhan. SV: Nguyén Duy Khanh byKhéa lufn t6t nghigp ‘Chuyén nganh: Vi sinh vat Biéu dé 3.1.1 Thé hign méi quan h@ giiea S/V véi khéi lugng mang Khéi lugng mang ( 25: 5 0 (g) 05 06 07 08 09 10 SV Biéu dé 3.1.2, Thé hign méi quan hé gitea S/V voi dp bén kéo mang Dé bén kéo cia mang ) 18 1.6 14 12 4 08 06 0.4 0.2 0 05 06 O07 08 09 10 S/W SV: Nguyén Duy Khanh 2Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat Tir bang 3.1 va biéu dé 3.1.1 va 3.1.2 t6i thay kha nang hinh thanh mang tét nhat 6 ty 1€ S/V = 0,8 véi chiéu cao méi trvéng trong dung cu lén men h =1,25 cm. Véi ty 18 S/V thap hon hogc Ién hon 0,8 46 két tinh cua mang kh6ng cao, ming dé bi réch kha ndng chju lc kéo kém hon. 3.2 Anh hwéng ciia thii gian nudi cdy dén kha nang tao mang BC tot nhét cia chiing A. xylinum BUN , vai 1g S/V=0,8 Sau mt thai gian tién hinh thi nghiém nghién ciru thai gian tit 1-7 ngay véi ty 1g S/V-0,8 dén kha nang tgo mang BC tir chiing 4. xylinum BHN, theo cde tigu chi: théi gian xudt hign ming, mau sic, 46 nhin, 46 day, 46 dai, can nang, trong lugng kh6 tuy¢t d6i tir dé tim thai gian dé d6 két tinh et ming dat trang thai t6t mht va thu nhan mang t6t nhat, ching t6i thu durge két qua thé hign & bang 3.2 nhu sau: SV: Nguyén Duy Khanh ByKhéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat Bang 3.2. Nghién ciru anh hing thoi gian nudi cdy dén kha nang tao mang BC tit nhdt tir ching A, xylinum BHN, v6i B18 SIV=0,8 Thai gian (nga) | | 2 3 4 5 6 7 Xudthign | | + + + $ + mang Mausée, | - | - | Mang | Mang | Mang | Mang | Mang “a tring | tring | tring | tring | tring ip trong, | trong, | trong, | trong, | trong, nhin | nkén | nhin | nhén | nhén Dp diysau | = 10 | 20 | 20 | 30 | 32 Khi len men (mm) Dp dail | - 6 | ub 18 Is bin kéo) ) Cin ning : 861 | 13,36 | 1647 | 22,22 | 23,36 sau khi ten men(g) Trong legng - = 012 | 030 | 035 | ast | 045 Kho (@) Chik thich: + 68 =: Khong SV: Nguyén Duy Khanh 7Khéa ludn t6t ng! Biéu do 3.2.1.Thé hign méi quan hé giiea thai gian voi khoi legng mang Khdi lwong ming ) 25 5 Thoi gian 0 (ngay) 1 2 3 4 5 6 7 Biéu dé 3.2.2. Thé hign mdi quan hé gitta thoi gian véi a6 bén kéo mang ‘Dé bén kéo cia mang ) hoi gian 1 2 3 4 5 6 7 (ngiy) SV: Nguyén Duy Khanh 7Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat Qua bang 3.2 va hai biéu dé 3.2.1 va 3.2.2, t6i thay sin lwgng cellulose thu duge trong qué trinh 1én men déu ting theo théi gian lén men ké tir khi xuat hign ming. Sau 6 ngiy lén men t6i nbn thay mang bat du cé dau higu chim xudng trong méi truéng lén men va kha ning sin xudt ming BC bit dau giam dan, Cae két qua trén 1a trung binh cia nhiéu lan lap lai, t6i nhan thay: Sau thei gian 6 ngay 46 két tinh cia mang dat trang thai tét nhat. Véi S/V= 0,8 ti thdy thu nhan mang sau 6 ngay lén men 1a t6t nhat. 3.3 Anh hwing ciia nhigt d§ nudi cdy dén khé nang tgo mang BC tét nhat ita chiing A. xylinum BHN , vii t} 12 S/V=0,8 Nhiét 46 1 mét trong nhimg yéu td anh hudng 16 rét dén kha ning tao mang BC tir vi khuNh A. xylinum BHN, « V6i sy khao sat anh hwéng ciia nhigt d6 mudi cay véi ty 18 S/V=0,8 dén kha ning tao mang BC tét nhat cia ching A.xylinum BHN, ching t6i thu durge két qua thé hign & bang 3.3: SV: Nguyén Duy Khanh 7Chuyén nganh: Vi sinh vat Khéa luan tét nghiép Bang 3.3. Nghién citu dnh ncéng ciia nhigt dp nudi cy voi ty I S/V-0,8 dén kha nang tao mang BC tét nhdt tie chiing A, xylinum BUN. Gt dp eo 20 25 30 35 40 5 3 3 3 xudt hign mang(ngay) ‘Mau sic, | Mang | Mang | Mang | Mang trang! . win} wring tring | trong, nhén| dp nhin 6 6 6 ‘s - trong, trong, | trong, hin nhiin | nhén Dp daysau| 1 25 30 20 hi lén men (mm) Dp datas | 10 i 8 1s bén kéo) ™) Cin nang | 8,61 16,47 | 22,22 2 - sau khi ten men (g) Tronglugng| 012-035 | 0,51 0,30 kho(g) SV: Nguyén Duy Khanh %Khéa ludn tot nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat Biéu dé 3.3.1. Thé hign méi quan h@ gitea nhigt dp voi khdi long mang Khdi lugng cia mang 257) 20. 15: 10: 5 0 gt a 20 25 30 3540 ('e) Biéu dé 3.3.2. Thé hign méi quan hé giita nhi¢t dé voi dp bén kéo mang ‘D@ bén kéo cia mang @) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 Nhigt 49 0 (eo) 20 25 30 35 40 SV: Nguyén Duy Khanh 7Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat Qua bang 3.3 va hai biéu d6 3.3.1 va 3.3.2 trén, t6i nhan thay nhigt 46 thich hop véi vi khuNa A.xplinum BHN, tir 25-30°C va nhiét a6 thich hop nhét 18 30°C . G nhigt 46 thip qua trinh Ién men xay ra cham. O nhiét d6 cao sé tte ché hoat déng va dén mic nao dé sé dinh chi sy sinh san cua té bao va higu suat lén men sé giam. Vi SIV= 0,8, t6i thay 1én men tao mang BC tit vi khuNi A.xylinum BHN, & nbigt d6 30°C 1a t6t nat, SV: Nguyén Duy Khanh FKhéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat PHAN KET LUAN VA DE NGHI 1. Két wan - Nghién ctru duge ty 1¢ dign tich bé mat trén thé tich dich lén men tir ching A. xylinum BHN, tao ming BC tét nhat 1 S/V= 0,8. ~ Nghién ciru durge anh huéng cia théi gian nudi cdy véi ty 1 S/V=0,8 dén kha nang tao mang BC tot nhat cua ching 4. xylinum BHN, 1a 6 ngay. - Nghién ciu duge anh huéng ciia nhigt 46 nudi cdy voi ty 18 S/V=0,8 dén kha ning tao ming BC tt nhat ciia chiing 4. xylinum BHN, 18 30°C. ~ Nghién ciru duge mét sé tinh chat vat ly ela ming BC duge tao ra tir ching A, xylinum BHN, 14 mang ¢6 46 day 2-3mm véi mau tring trong, bé mat nhin min, dai dap img yéu cau vé 46 chiu lye cia mang tri bong. Tit dé dinh huréng cho img dung trong tri bong, 2. Dé nghj Trén day 1a nhimg két qua nghién ctu bude dau trong tuyén chon va khio sat so b6 vé ching A.xvlinum BHN, cé kha nang téng hgp cellulose. Dé san phNnn c6 thé img dung vao thy tin ching 16i dé nghi - Khi lén men tao mang BC can lén men 6 nhiét 46 30°C, thi gian thu nhan mang tdt nhat 1a 6 ngay véi ty 16 S/V=0.8. - Tiép tuc nghién ciru anh huéng ciia cdc diéu kign nudi cdy khac dén ty 16 S/V thich hop nhat dén kha ning tao mang BC. SV: Nguyén Duy Khanh 3Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat TAI LIEU THAM KHAO. Tai ligu tiéng vigt: 1, Nguyén Lan Ding, Pham Thi Tran Chiu, Nguyén Thanh Hién, Lé Dinh Lyong, Doan Xuan Muon, Nguyén Dinh Quyét, Pham Van Ty. Mét sé phurong phap nghién citu vi sinh vat hoc. Nxb khoa hoc ki thuat, 1978 2. Nguyén Lan Ding, Nguyén Dinh Quyén, Pham Van Ty. Vi sinh vat hoc, Nxb Gido duc, 1998, . 3. Nguyén Thanh Dat, Co sé sinh hoe vi sinh vat, Nxb Gido duc, 1999, 4, Nguyén ‘Thanh Dat, Nguyén Duy Thao, Vong Trong Hao. Thy hanh vi sinh vat hoe. Nxb Giéo duc, 1990. 5, Dang Thi Hong, Phan lap, tuyén chon va nghién ctru m6t s6 dic tinh sinh hoc ctia vi khuNn Acetobacter xylinum ché tao mang sinh hoc (BC). Luan an thac sf sinh hoe DHSP Ha N6i, 2007, 6, Huynh Thj Ngge Lan, Nguyén Van Thanh. Nghién eitu cée dc tinh mang cellulose vi khuNi tir Acetobacter xylinum sit dung lim mang tri bong. Tap chi Durge hoc s6 361/ 2006. tr 18 - 20. 7. Chu Van Min, Ung dung tin hge trong sinh hoc. Nxb DHQG Ha N6i, 2003. 8. Dinh Thj Kim Nhung. Nghién etru m6t s6 dc diém sinh hoe eta vi khuN Acetobacter vi img dung chiing trong lén men axétic theo phuong php chim. Lun n phé tién si khoa hge sinh hoc, 1996, 9, Nguyén Thi Nguyét. Nghién citu vi khuNi Acetobacter xylinum cho ming Bacterial Cellulose lim mat na duéng da. Luan an thae si sinh hoc DHSP Ha N6i, 2008 10. Tran Thj Thanh (2003), Céng nghé Vi sinh, Nha xut bin Giéo dye. SV: Nguyén Duy Khanh 30Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat 1, Trinh Hu Hing, DS Céng Quynh, Sinh ly he ngudi va dong Khoa hoc vi kj thudt Ha i, 2001, tr. 173, 184 -187. 12. Nguyén Dite Luong (2000), Cong nghé Vi sinh vat t@p 1-2-3, Nhd Xudt ban Dai hoe Quée Gia TP.HCM. 13, Nguyn Thy Hirong(2006). Chon loc déng A.xylinum thich hgp cho cée Jogi moi truéng dung trong sin xudt cellulose vi khuNa véi quy m6 Ién. 14, Tran nhu Quynh.Nghién ctu mot sé dic tinh vai ly cia ming BC tit Acetobacter xylinum, img dung trong tri bing, Ludn van thae si vi sinh hoc DHSP Ha NGi, 2009. Tai ligu tiéng anh: 15, Alina Krystynowiez, Maria Koziolkiewiez, Agnieszka Wiktorowska- Jezierska, Stanistaw Bielecki, Emilia Klemenska, Aleksander Masny, Andrzej Phucienniczak. Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum. Vol. 52, . 3, hitp://www.actabp pl, 2005, p. 691-698 16. Bergey. H, John, G. Holt, Bergey's manual of dererminativa bacteriology. Wolters Kluwer health, 1992, p.71-84. 17. Cazfa, W., Young, D.J. Kaweehi, M & Brown, R. M. Tr (2007). The future Prospects of microbial cellulose in bio medical application, Biomacromolecules, 8, 1 ~ 12. 18, Thesis Homles. Bacterial cellulose. Department of chemical and process Engineering University of Canterbury Christchurch, New Zealand, 2004, p. 1-65. 19, Cheng H.P., Wang P.M., Chen J.W., Wu W.T. (2002), Cultivation of SV: Nguyén Duy Khanh 7Khéa luan tét nghiép Chuyén nganh: Vi sinh vat Acetobacter xylinum for bacterial cellulose production in a modified airlift reactor, Biotechnol. Appl. Biochem. 35, p. 125-132. 20. Walker. K. T, ToidiJ. The ' Catalase test’, with special reference to Acetobacter species. Vol 37, The College of Technology, The University of Manchester, 1942, p 10-12. 21. Dieter Klemm, Dieter Schumann ,Ulrike Udhardt, Silvia Marsch. Bacterial synthesized cellulose-artificial blood vessels for microsurgery. Vol. 26, Inssue 9, Progress in polymer science, 2001, p. 1561-1603 22. Brown. E, Bacterial cellulose/ Themoplastic polymer nanocomposites. Master of sience in chemical engineering, Washington state university, 2007. SV: Nguyén Duy Khanh 32