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CRECIMIENTO MICROBIANO

CRECIMIENTO CELULAR

Es el aumento en la cantidad de constituyentes y estructuras


celulares.
En ausencia de divisin celular, el crecimiento implica aumento en el
tamao y peso de la clula.
cuando el crecimiento es seguido de divisin celular hay un
aumento en el nmero de clulas.
Se toma como base el crecimiento de bacterias (se puede extender
a levaduras y hongos).
El crecimiento de una poblacin resulta de la suma de los ciclos
celulares de todos los individuos de dicha poblacin.
Ciclo celular : proceso de desarrollo de una bacteria aislada.

CRECIMIENTO CELULAR
Los microorganismos en un medio de cultivo apropiado, se dividen
empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para
producir nuevos microorganismos.
Este proceso contina hasta que algn nutriente del medio de
cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene.
Tambin puede detenerse el crecimiento por acumulacin de
alguna substancia inhibidora formada por los mismos
microorganismos
Hay tres aspectos determinantes del crecimiento microbiano:
Los factores del crecimiento.
El estequiomtrico, por el cual la concentracin final de
microorganismos obtenidos depender de la concentracin y
composicin del medio de cultivo
El cintico, que indica la velocidad del proceso.

1.- FACTORES DEL CRECIMIENTO


MICROBIANO

1.1.- REQUERIMIENTOS FISICOS

Temperatura
pH
Actividad de Agua
Presin Osmtica

1.a.- Temperatura
Cada microorganismo prefiere una T de desarrollo.
Temperatura mnima, por debajo ella que no hay crecimiento
La falta de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a:
Reduccin en la velocidad de reaccin (segn leyes cinticas)
Cambio de estado de los lpidos. (aumento de viscosidad)
Temperatura ptima a la que la velocidad es mxima.
El incremento de la velocidad de crecimiento con la temperatura
se debe al incremento generalizado de la velocidad de las
reacciones enzimticas con la temperatura.
. Temperatura mxima por encima de ella no hay crecimiento

Tipos microbianos
Sicrfilos: -5 20C, ptimo < 15oC
organismos marinos, algas: Chlamydomonas nivalis (nieve rosada),
bacterias: Pseudomonas, Flavobacterium
membrana con alto % de c. grasos insaturados
Psicrtrofos 0-35C, ptimo 20-30oC
Pseudomonas - crecen en el refrigerador
( psicrtrofos son mesfilos que pueden crecer a temperaturas bajas, es
importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran
contaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de
refrigeracin (4 - 8C) y de producir infecciones en los consumidores del
alimento (30 - 35 C).
Mesfilos 15-45 C, ptimo: 30-40C
Mayora de los m.o (del suelo, aguas, patgenos)
Termfilos 40-70C, ptimo de 55-65oC Tienen membrana con alto % de
cidos grasos saturados, y enzimas estables al calor
Bacillus stearothermophilus, (compostaje)
Hipertermfilos 80-113C, ptimo > 90o Pyrococcus, Pyrodictium (aguas
termales)

1.b.- pH
El pH interno en la mayora de m.o. est en 6.0 a 7.0.
Los rangos de pH tolerables son distintos.
Hay microorganismos acidfilos que pueden vivir a pH=1.0 y alcalfilos que
toleran pH=10.0
Como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de crecimiento suele bajar.
Si la nica fuente de nitrgeno es
amonio, se produce liberacin de iones H,
bajando el pH.
Si la fuente de nitrgeno es solo nitrato,
se deben tomar iones H del medio para
formar amonio, subiendo el pH.

La bajada del pH del medio que


producen ciertos microorganismos les
confiere una ventaja selectiva frente a
otros microorganismos competidores.
Ejplo. Bacterias lcticas. Reducen el pH
del medio a 4.5.
Los cidos orgnicos de cadena corta son
txicos para algunas bacterias por s
mismos.
La evolucin del CO2, tambin hace
variar apreciablemente el pH.

1.c.- Disponibilidad del agua


El agua es el componente principal de las clulas, por lo tanto
un suministro de agua adecuado es indispensable para lograr el
mantenimiento y crecimiento microbiano.

Tambin el agua es el medio de transporte de los sustratos (o


contaminantes) hacia el interior de las clulas, y de los
compuestos que se producen dentro de la clula.
Los microorganismos necesitan presencia de agua, en forma
disponible, para crecer y llevar a cabo sus funciones metablicas.

La disponibilidad de agua se mide con actividad de agua (aw).

Actividad del agua. (aw)


Relacin entre la presin de vapor de agua del medio (P) y la
presin de vapor del agua pura (Po).

Algunas molculas del agua se orientan en torno a las molculas


del soluto y otras quedan absorbidas por componentes
insolubles de las soluciones. En ambos casos, el agua queda
en una forma menos reactiva.
Estas contribuyen menos a la presin de vapor del medio

Actividad del agua y Presin osmtica


La presin osmtica est relacionada
con la aw a travs de la expresin

V . = R . T . Ln.aw

donde
R es la constante de los gases,
T la temperatura absoluta,
la presin osmtica,
V el volumen molar parcial del agua
Puede definirse como la presin que se
debe aplicar a una solucin para
detener el flujo neto de disolvente a
travs de una membrana
semipermeable.
La Presin osmtica alta, causa prdida
de agua y plasmlisis celular.

Efectos de la presin osmtica


Los valores mnimos: bacterias aw > 0.90, levaduras aw > 0.85,
hongos filamentosos aw > 0.80.
La utilizacin de almbares, salmueras y salazones reduce la
actividad de agua de los alimentos, y permite su conservacin.
(ejemplo mermeladas, leche condensada, etc)
Halfilos.
El agua de mar tiene una concentracin del 3%. Los m.o. halfilos:
requieren condiciones salinas:
Discretamente halfilo (1-6%),
Moderadamente halfilo (6-15%),
Halfilos extremos (15-30%)

La principal estrategia de los m.o. halfilos para adaptarse al estrs


osmtico se basa en la acumulacin de compuestos en el citoplasma
para compensar la presin osmtica externa. Estos compuestos
pueden ser inicos o no inicos.

Ejemplo del Mar muerto


La salinidad promedio del agua de los ocanos est entre
3,13,8%, en Mar muerto es 28%.
Son aguas ricas en calcio, magnesio, potasio y bromo, y
relativamente pobres en sodio, sulfatos y carbonatos.
All solo viven microorganismos halfilos: un protozoo ciliado,
algunas algas y bacterias de los gneros Flavobacterium,
Halococcus y Halobacterium, y las artemias.
Debido a la elevada densidad de sus aguas (1 240 kg/m) una
persona puede flotar, debido al empuje superior a la del mar
(1 027 kg/m)

1.d.- Concentracin de oxigeno.


Cuando el O2 es el sustrato limitante, la tasa de crecimiento
especifica varia con la concentracin del oxigeno disuelto, de acuerdo
a una cintica de saturacin.
El oxigeno se introduce al caldo de cultivo normalmente
esparcindolo en el medio.
La transferencia del oxigeno desde las burbujas de gas, hasta las
clulas esta limitada por la transferencia de oxigeno a travs de la
pelcula liquida que rodea las burbujas de gas

2.- FORMAS DE CULTIVO


Las fermentaciones, pueden clasificarse en: continua, semicontinua o
intermitente.
a.- PROCESO INTERMITENTE. Fermentacin Batch.
Se refiere al crecimiento de clulas en sistema cerrado.
En el inicio del cultivo, el medio estril se inocula con un volumen
adecuado de microorganismos y se permite que se lleve a cabo la
fermentacin en condiciones ptimas. A lo largo del proceso no se
aade ningn nutriente, salvo el oxgeno, por lo que se produce el
agotamiento de los nutrientes, lo que ocasiona cambios
fisicoqumicos en el caldo que dan origen a fases tpicas de un cultivo
microbiano.
Consecuencia: Varan el pH, temperatura y la concentracin de
nutrientes con el tiempo.
CICLO DE CRECIMIENTO MICROBIANO.
El crecimiento no es lineal y sigue un patrn

Crecimiento microbiano en medio lquido

Fase lag. Adaptacin al nuevo ambiente.


Fase exponencial (log) - velocidad mxima de crecimiento bajo
condiciones particulares.
Fase estacionaria - sin crecimiento neto, vc=0.
vc=vm (vel. crecimiento = vel de muerte), por nutrientes limitantes,
acumulacin de desechos, inhibicin del crecimiento
Fase de muerte. velocidad de muerte celular > velocidad de divisin
celular

Fase de latencia
Cuando se introduce un inoculo en medio fresco, el crecimiento
usualmente no comienza de inmediato sino despus de un tiempo
llamado de latencia o acostumbramiento.
En este periodo de transicin los microorganismos, producen las
enzimas necesarias para aprovechar un nuevo medio ambiente.
En esta fase no hay incremento en el nmero de clulas, pero hay
actividad metablica, aumento en el tamao individual de las clulas,
en el contenido proteico, ADN y peso seco de las clulas.
Si un cultivo que est creciendo en fase exponencial es inoculado al
mismo medio de cultivo bajo las mismas condiciones de crecimiento,
no se observa fase de latencia y el crecimiento exponencial sigue a la
misma velocidad.
Si una poblacin se transfiere de un medio de cultivo rico a un
medio pobre, se observa latencia porque las clulas para poder
seguir creciendo deben tener las enzimas necesarias para sintetizar
algunos metabolitos esenciales que no estn presentes en el medio.

Factores que afectan la fase de latencia


Generalmente la fase de latencia aumenta con la edad del inoculo.
Si un cultivo que est creciendo en fase exponencial es inoculado al
mismo medio de cultivo bajo las mismas condiciones de crecimiento,
no se observa fase de latencia y el crecimiento exponencial sigue a la
misma velocidad.
Se puede producir una pseudo fase de latencia, cuando el inoculo es
pequeo o con baja porcin de clulas viables.
Si se desea minimizar la fase de latencia es recomendable:
- Las clulas deben estar adaptadas a las condiciones del medio
donde crecer.
- Las clulas debe ser jvenes (en fase exponencial)
- El tamao del inoculo debe ser entre el 5% y 10% v/v.

Fases de latencia mltiples.


El crecimiento diaxico es un tipo de
crecimiento microbiano que tiene lugar cuando
hay presentes dos sustratos diferentes que
pueden ser utilizados como fuente de carbono.
En este caso se observa una curva de crecimiento
bifsica debido a la utilizacin secuencial de
distintas fuentes de carbono.
El metabolismo del organismo es selectivo para
uno de los sustratos (se usa la fuente de carbono
que permite un crecimiento ms rpido) y cuando
la agota, comienza a metabolizar el otro.
En bacterias lcticas, por ejemplo, la presencia
de glucosa que es fcilmente asimilable, induce un
efecto de represin por catabolito sobre el opern
lac que es necesario para el metabolismo de
la lactosa, un disacrido de ms difcil asimilacin.
Como consecuencia se produce un crecimiento
diaxico en medios de cultivo que contienen una
mezcla de glucosa y lactosa.

Fase exponencial o fase logartmica


Es el perodo en el cual, cada vez que pasa un tiempo de
generacin la poblacin microbiana se duplica. La velocidad de
crecimiento es mxima.
En esta fase la concentracin de nutrientes es alta, y la tasa de
crecimiento celular es por tanto independiente de la concentracin
de nutrientes.
Es un periodo de crecimiento balanceado, en el cual todos los
componentes celulares se incrementan en la misma proporcin.

Fase de desaceleracin. En esta fase el crecimiento desacelera


debido a la escases de algn nutriente esencial o de la acumulacin
de algn producto toxico, resultado del crecimiento previo.
Estos factores ocasionan un crecimiento desbalanceado,
ocasionando cambios en las estructuras celulares, para aumentar
sus perspectivas de crecimiento en un medio hostil.
Un ejemplo de producto inhibitorio es el etanol producido por las
levaduras alcohlicas.
Si de algn modo se remueve el producto toxico, puede haber una
nueva fase de crecimiento.
Fase estacionaria
En esta fase la velocidad de muerte celular se iguala a la velocidad
de reproduccin de las sobrevivientes.
En esta fase las clulas sobrevivientes, producen metabolitos
secundarios (como los antibiticos).
Las limitaciones del crecimiento ocurren por: agotamiento de
algn nutriente esencial, por acumulacin de productos txicos, o
por una combinacin de las causas anteriores.

Fase de muerte
Ocurre una disminucin progresiva en el nmero de clulas
viables.
velocidad de muerte celular > velocidad de divisin celular
Cuando la concentracin de sustrato es mnima, la clula se ve
forzada a metabolizar su propio protoplasma (se conoce como
metabolismo endgeno)
Manejo industrial.
La fase de latencia, no es deseable, por que se pierde tiempo y
acarrea prdidas econmicas
Para minimizar esta fase, se hace crecer el inculo aparte, en un
medio de cultivo igual al que se va a emplear en el bioproceso
(cultivo o fermentacin) y luego se procede a transferirlo cuando
las clulas ya se encuentran en la fase exponencial (inoculacin).

Ventajas y Desventajas del proceso batch.


Su mayor ventaja es la sencillez.
Desventajas: alto requerimiento de mano de obra, y demasiados
tiempos muertos.
Tiempos muertos: Fase de adaptacin, fase de decaimiento,
periodo de descarga, y renovacin de la carga del reactor para un
nuevo batch.

Proceso semicontinuo
Se evitan las fases de adaptacin y decaimiento.

Peridicamente se extrae medio agotado y se repone medio


fresco.

Criterios:
mantener la concentracin de sustrato suficientemente alta para
evitar escases.
la concentracin del producto suficientemente baja para no
sobrepasar los lmites tolerables.

2,b.- Proceso semicontinuo


Se operan de forma similar a los batch, pero slo se cosechan
parcialmente a intervalos regulares, reponiendo el cosechado con
medio fresco.
Es como repetir un cultivo batch indefinidamente, pero ahorrando
la mayor parte del tiempo de servicio entre lotes.
Los parmetros a controlar: volumen y tiempo de adicin, se
calculan de modo que el cultivo se mantenga en fase logartmica.
Si el volumen extrado es muy grande puede diluirse el medio, tanto
que la masa microbiana puede volver a la fase de
acostumbramiento.
Si el volumen extrado es muy pequeo para igual tiempo el cultivo
puede agotarse y pasar a la fase estacionaria.
Si el tiempo de renovacin es muy grande el cultivo puede alcanzar
a la fase estacionaria y si es muy pequeo el cultivo puede regresar a
la fase de acostumbramiento.

PROCESO EN CULTIVO CONTINUO

2.c.- Proceso en cultivo continuo


Constantemente se suministra
nuevo medio de cultivo al bioreactor,
con agitacin, y se retira producto y
clulas.
Cuando el sistema alcanza estado
estacionario, la concentracin de
clulas, productos y sustrato
permanecen constantes.
Proporciona condiciones constantes
para el crecimiento celular, y la
formacin de productos y se pueden
obtener productos de calidad
uniforme.
Se usa, cuando el producto de inters
se sintetiza en la fase logartmica. Por
tanto, interesa que las bacterias estn
en esa fase el mayor tiempo posible,
para lo que requieren ms medio.
Sistemas de control: quimiostato y
turbidostato

Control por quimiostato


El elemento de control la es la concentracin de un
nutriente limitante (C o N).
Los dems nutrientes en el medio se encuentran en
exceso.
Los parmetros a tener en cuenta son:
F (m3/h);
volumen del reactor (m3);
densidad celular (x);
factor de dilucin (D): Es la relacin entre el caudal
de alimentacin, y el volumen de cultivo. D=F/V (h -1)
D indica las veces que se renueva el volumen del
biorreactor por unidad de tiempo. D= 0.25 h-1 indica
que en una hora se renov 25 % del volumen de
cultivo, o bien que cada 4 h se renueva el volumen
de cultivo.
Si la tasa de crecimiento se hace igual al factor de dilucin
(D), entonces dx/dt=0. Por tanto, la cc de las clulas se
hace constante (x=x) y el cultivo se encuentra en estado
dinmico de equilibrio.

Con altas tasas de dilucin el cultivo puede drenarse totalmente


(DC: dilucin crtica).
Es decir, el cultivo se lava porque su velocidad de crecimiento es
inferior a la tasa de dilucin.
A muy bajas diluciones (D) el quimiostato no funciona si el
nutriente limitante es la fuente de energa.
Ello se debe a que en esas condiciones, la fuente de energa slo
se usa para reacciones de mantenimiento de la integridad celular,
pero no queda para el crecimiento.

Aplicaciones:
Procesos industriales de fermentacin (produccin de bebidas
alcohlicas, de antibiticos, de aminocidos, etc)
Su aplicacin ms conocida es para la depuracin de aguas
residuales, por procesos aerbicos o anaerbicos.
El medio de cultivo fresco es el agua residual que entra en la
planta y alimenta a los fangos activados por MO que luego se
retiran por decantacin

Turbidostato: elemento de control, la turbidez.


La alimentacin se regula mediante el monitoreo de la densidad
ptica del cultivo. Se alimenta medio fresco cuando la turbidez supera
un lmite prefijado.
Se usa menos que el quimiostato porque es ms elaborado y porque
el medio cambia

3.- DETERMINACION DE LA
CONCENTRACION CELULAR
Existen diversos mtodos, con diferentes propuestas de
clasificacin.
Se pueden agrupar en dos:
mtodos directos y
mtodos indirectos.
Directos obtienen una medida de la masa celular por:
Tcnicas de conteo,
Medida de concentracin de masa celular: peso celular,
absorbancia.
Indirectos miden la concentracin de algn componente celular
(ADN, protenas, etc).

a. Conteo celular
Se cuentan directamente las clulas, determinando la masa celular
por unidad de volumen.
En el mtodo la suspensin de la muestra se coloca en una cmara
de recuento en una cuadriculada de dimensiones conocidas, y se
tapa con el cubre objetos. Como se conoce el rea de las cuadrculas
y la altura de la cmara de recuento, el volumen ocupado por la
suspensin en cada cuadrculas queda determinado.
Para obtener el nmero de bacterias por mililitro de suspensin, se
requiere
contar el nmero de microorganismos en varias
cuadriculas, calcular el promedio de recuento por cuadrcula y
multiplicar este promedio por el factor correspondiente.
Estos mtodos presentan algunas limitaciones:
- No se pueden distinguir clulas vivas de clulas muertas.
-Las clulas muy pequeas son difciles de contar.
-La precisin es difcil de lograr
-El mtodo no es adecuado para suspensiones celulares de
baja densidad, es decir las soluciones deben contener
aproximadamente 107 clulas/mL o ms.

Cmaras de recuento
Existen cmaras especificas como: Cmaras de Neubauer, Cmara
de Petroff-Hausser, el hemocitmetro, Microscopio graduado de
Helber, etc.
Cmara de Neubauer.
Esta cmara est adaptada al microscopio de campo claro o al de
contraste de fases
Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente
deprimidas en cuyo fondo se ha marcado con la ayuda de un
diamante una cuadrcula de dimensiones conocidas.
Se cubre la cmara con un cubreobjetos que se adhiere por simple
tensin superficial (en especial una vez que se haya aadido la
muestra lquida).

Cuadrado de 3 x 3 mm.
El rea sombreada y marcada L es 1
mm2.
La depresin tiene 0.1 mm de
profundidad.
El volumen de la superficie L, bajo el
cubreobjetos es de 0.1 mm3 (0.1
microlitro)
Los cuadrados L estn subdivididos en
16 cuadraditos de 0,0025 mm2 cada
uno.
El cuadrado del centro est dividido en
5 cuadrados por lado con una longitud
lateral de 0,2 mm, y superficie de 0,04
mm2.
Al contar las cuatro reas sombreadas
(L), si hay un total de x clulas entre las
cuatro reas, la concentracin en la
suspensin celular ser :

clulas / mL = 10000 (x/4)

Cmara de Neubauer

Tcnica de conteo
Para que las clulas, no se
cuenten dos veces, reglas:

-Se cuentan las clulas dentro


de la zona definida.
- Tambin se cuentan las
clulas, que se apoyan o tocan
en dos caras , p.ej. en la lnea
de medida izquierda y
superior.

Observaciones sobre el recuento


Efectuar conteo en forma de meandro
a) En los conteos de cmaras, el diafragma del condensador en el
microscopio deber estar cerrado en gran parte.
b) El valor medio de los conteos se aplica luego en una frmula de clculo o
se multiplica por el factor correspondiente.

Cmara Petroff-Hausser
El retculo del fondo est
dividido en 25 cuadrados
grandes
Cada cuadrado grande tiene
16 cuadraditos
Volumen de la cmara= 0,02
mm3
rea de la cmara 1 mm2

Determinacin de la concentracin celular

Clculo del nmero de clulas


por mL de muestra:
Se observan 12 clulas.
12 x 25 = 300 (nmero de
clulas en 0,02 mm3).
300 x 50= 15000 (nmero de
clulas en 1 mm3)
150000 x 1000 = 1,5 x 107
(nmero de clulas en 1 mL)

Calculo del numero de clulas/ ml

Cmara de conteo SEDGEWICK RAFTER


Es una cmara graduada de 50 x 20 x 1 mm (= 1 cm).
La cmara de conteo tiene 1 mm de profundidad. El rea total es
de 1000 mm2 y el volumen de 1000 mm3 o 1 ml.
Consiste en un marco de cermica rectangular. Posee un grabado
de 1000 cuadrados y est cubierto por un cubreobjetos espeso.
Esta diseada para contar plancton en un microscopio compuesto
o en un microscopio invertido,
medicin cuantitativa del nmero exacto de partculas en un
volumen preciso de un fluido.

b) Equipos automticos
"Cell Coulter" de Beckman-Coulter
Se basa en medir los cambios en la resistencia
elctrica que se producen cuando una partcula
no conductora en suspensin en un electrolito
atraviesa un pequeo orificio.
El contador consta de dos cmaras separadas
por un material no conductor, en el que hay un
orificio de tamao similar al de las clulas.
Cada cmara contiene un electrodo, la
suspensin de clulas a ser contadas se coloca
en una de las cmaras y se aplica presin para
que las clulas pasen a la otra cmara a travs
del orificio, cada vez que una clula pasa a travs
del orificio ocasiona un cambio en la
conductividad elctrica que es registrado por un
dispositivo electrnico y de esta manera el
contador indica el nmero de clulas en esa
suspensin.

Cell Coulter :Ventajas y desventajas


Es posible contar y medir varios miles de partculas por
segundo, independientemente de su forma, color y
densidad.
Las limitaciones de este mtodo son:
- Se cuentan clulas vivas y muertas.
- Las suspensiones deben estar libres de
partculas diferentes a los microorganismos que se
cuentan, por que el aparato no puede distinguir entre
una u otra.

c.- Conteo de clulas viables


En los mtodos anteriores se determina el nmero de
clulas totales, pero en muchos casos nicamente
interesa contar clulas viables. (clula que es capaz de
dividirse y forma una progenie)
La manera usual de hacer este conteo es determinando
el nmero de clulas en la muestra, capaces de formar
colonias sobre un medio de cultivo slido (agar) y esto
se conoce como recuento en placa. (UFC) y numero
mas probable (NMP)

c.1.- Conteo en placas.


En este procedimiento se
realizan diluciones seriadas
de la muestra
Se inoculan pequeos
volmenes conocidos, de
cada dilucin, en placas de
Petri con un medio slido
adecuado y se extiende con
una varilla de vidrio
Luego las placas se incuban
en las condiciones optimas
hasta que aparezcan las
colonias que son fcilmente
contables.

c.1.- Conteo en placas.


Se asume que cada colonia ha sido formada por una nica clula del
medio de cultivo original. Esta suposicin puede subestimar la
densidad de poblacin.
Las clulas son entonces medidas como unidades formadoras de
colonia UFC.
Para realizar el recuento se seleccionan las placas de la que
contengan entre 25 y 250 colonias.

c.1.- Conteo en placas.: Ejemplo.


En un recuento en placa, se hacen diluciones seriadas con un factor
de dilucin de 100, para ello se toma 1 mL del cultivo de bacterias en
suspensin, y se aade a un frasco de dilucin que contiene 99 mL
del diluente adecuado, se agita y se toma de esta primera dilucin
(1:100 10-2) 1 mL y se transfiere a un segundo frasco con 99 mL del
diluente adecuado, se agita y se toma de esta segunda dilucin
(1:10.000 10-4) 1 mL y se transfiere a un tercer frasco de dilucin
que contiene 99 mL del diluente adecuado (esa corresponde a la
dilucin 1:1.000.000 10-6).
De cada dilucin se siembran por triplicado muestras de 1 mL y se
incuban por 24 horas y se cuentan las colonias.
Si el promedio de las 3 placas de la dilucin 1/1000, es de 32
colonias entonces el recuento es de 32.000 UFC/mL de muestra =
3.2x105 UFC

Conteo en placas Ventajas y desventajas


Ventajas.
Se usa frecuentemente, para estimar poblaciones
bacterianas en leche, agua, y otros productos.
Es fcil de realizar y se adapta a la medicin de
poblaciones de cualquier densidad.
Desventajas:
Tiempo largo, (requieren 24 horas)
Exigen muy buenas tcnicas de esterilizacin
Puede dar errores cuando se trata de clulas agregadas

Placas petrifilm (3M)


Son placas prefabricadas con
el medio de cultivo adecuado
para el microorganismo que se
desea contar.
Las placas Petrifilm de 3M
para Coliformes dan resultados
en 24 h.
Tres etapas:
1) Sembrar. Levantar la
pelcula y aadir la muestra
2) Incubar. El diseo de las
placas ahorra espacio en la
estufa
3) Contar. Las colonias rojas
asociadas a burbujas de gas.

c.2.- Nmero mas probable (NMP)


Es una tcnica de estimacin estadstica basada en el hecho que a
mayor nmero de bacterias en una muestra, mayor ser la dilucin
necesitada para reducir la densidad hasta el punto en que ninguna
bacteria se le permita crecer en una serie de tubos de dilucin.
Se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo)
de clulas en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de
muestras.
Muestras microbianas son aadidas a tubos con caldos adecuados en
unas cinco replicas e incubados, la presencia o ausencia de gas y
turbiedad formados en la fermentacin da un estimado del nmero de
clulas.
Aquellos tubos que recibieron una o ms clulas microbianas
procedentes de la muestra, se pondrn turbios, mientras que los tubos
que no recibieron ninguna clula permanecern transparentes.

c.2.- Nmero mas probable (NMP)


Se toma la muestra original y se subdivide unas 10 veces, o mas para
evaluar la presencia/ausencia en mltiples replicas.
El grado de dilucin para el cual comienza a aparecer la ausencia
indica que los elementos se han diluido tanto que hay muchas
submuestras en las que no aparece.
Al aumentar el factor de dilucin, se alcanza un punto en el que
algunos tubos contendrn tan slo un microorganismo y otros tubos
no contendrn ninguno.
Se usan las tablas de Cochran.
Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido
ninguna clula, se puede estimar el nmero ms probable (NMP) de
microorganismos presentes en la muestra original, a partir de una
tabla estadstica.
El NMP es una afirmacin que existe 95% de probabilidad que la
poblacin bacteriana sea de rango correcto.
Este mtodo es ms til cuando las bacterias a contar no crecen en
medios slidos, o cuando la bacteria puede crecer en un medio
lquido diferencial, como sucede con las bacterias coliformes, que
usan selectivamente lactosa.

Nmero mas probable (NMP) para 6 tubos, lectura


6,3,1
10 mL de inculo

6 tubos positivos
(com crescimento
bacteriano)

1 mL de inculo

0,1 mL de inculo

3 tubos positivos

1 tubos positivos

Tabla: NMP de
bacterias por 100
g (ml) de material
analizado
empleando cinco
tubos inoculados
con 10, 1 y 0.1 ml
o g de material
Tsoumada de:
Enumeration of coliforms,
faecal coliforms and of e.
Coli in foods using the
MPN methoD MFHPB-19
April 2002 por Donna
Christensen Crawford y
Rick Szabo

Uso de la tabla
Consideremos positivos los siguientes cultivos:
(1) 5 tubos inoculados con 10 ml de la dilucin (1/10) del material :
los cinco (5) son postivos
(2) 5 tubos inoculados con 1 ml de la dilucin (1/10) del material:
solo uno (1)es positivo
(3) 5 tubos inoculados con 0,1 ml de la dilucin (1/100) del material:
ninguno (0) es positivo
Cada uno de los cinco tubos de las tres diluciones representan
respectivamente a 1, 0.1 y 0.01 g (ml), del material analizado.
La lectura se toma en la ubicacin de la Tabla correspondiente a la
lectura 5-1-0 (NMP de 33) si se hubiesen utilizado 10, 1 y 0.1 g (ml)
de material.
Como se usaron cantidades 10 veces menores (1/10) de aquellas
con las que se construy la tabla, el valor de 33 debe multiplicarse
por 10, lo que proporciona un valor de 330 organismos por 100 g
(ml) de material.
Como usualmente se expresa por g (ml) de material, este valor
(330) debe dividirse por 100.
El recuento obtenido por el NMP es en este caso de 3,3 organismos
por g (ml) de material analizado.

c.3.- Membranas Filtrantes


En poblaciones con menos de una clula por mililitro (agua de
piscina), no son aplicables los mtodos UFC o NMP. La muestra debe
concentrarse antes del recuento, por filtracin.
Los mtodos de recuento en placa o del nmero ms probable
pueden detectar una clula microbiana viable, en un mililitro de la
muestra.
La concentracin de los microorganismos de las muestras se hace,
generalmente, por filtracin
Consiste en hacer pasar la muestra que contiene los
microorganismos a travs de una membrana de acetato de celulosa
(0.45m) colocada en un dispositivo de filtracin.
Los microorganismos quedan retenidos en la membrana filtrante, la
cual se retira despus de terminado el proceso de filtracin y se
coloca en una placa de Petri con un medio de cultivo adecuado.

c.3.- Membranas Filtrantes


Despus de incubar, aparecen sobre la membrana las colonias de los
microorganismos.
Esta tcnica permite el anlisis de grandes cantidades de la muestra,
tratndose por ejemplo de agua o de aire, pueden filtrarse a travs
de la membrana grandes volmenes, concentrando as la poblacin
microbiana.

d. Peso seco.
Se basa en secar volmenes conocidos de medio con las
clulas en crecimiento, hasta obtener un peso constante.
Es til para grandes volmenes.
Para levadura se puede usar una centrfuga con velocidades
de 4-6x103rpm. Se obtiene una masa hmeda de clulas, luego
esta masa se lava y seca a 80C por 24 horas, y se pesa.
En clulas bacterianas, se usan filtros de membranas para
obtener la masa celular hmeda, y luego se seca.
(1 mg de peso seco equivale a una masa bacteriana de
5 x 10 9 bacterias)
Puede ser usada cuando el medio no contiene slidos en
suspensin.

Desventajas:
Los componentes voltiles de la clula pueden perderse.
La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado,
principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.
Requiere muestras muy grandes y el proceso es lentos.

e. Absorcin de luz.
Consiste en hacer incidir una luz monocromtica a la suspensin
de microorganismos, y se mide la luz transmitida a travs de la
suspensin, la que es inversamente proporcional a la
concentracin de biomasa, segn la ley de Beer.
Usar, turbidmetro o espectrofotmetro 600- 700 nm.
Se necesitan de 10 millones a 100 millones de clulas por mililitro
para hacer una suspensin suficientemente turbia para ser leda.

e. Absorcin de luz.
Hay que hacer una curva de
calibracin que relacione
medidas directas (recuento en
placa o microscopa) con las
indirectas de turbidez
Teniendo esta curva, se podr
determinar las ufc/ml de otras
muestras luego de leer la
absorbancia de las mismas.
Valores altos de OD (mayores a
0.3) afectarn la linealidad en la
respuesta.
El principal inconveniente es
que no distingue clulas vivas
de muertas, o entre clulas y
otras particulas. Sin embargo, es
una tcnica que puede ser
utilizada on-line para
mediciones continuas

f. Masa de un componente celular.


Medida de algn componente celular que sea parte
constante del peso seco total de las clulas.
Pueden ser: protenas, nitrgeno, ADN, RNA, y ATP
celulares, los cuales estn presentes en cantidades
mas o menos constantes por especie.
Se detecta la presencia de ATP, por bioluminiscencia
usando luciferasa, aunque hay algunos problemas
experimentales que hacen que la tcnica sea
controvertida.

g. Efectos fsicos.
Se puede medir la variacin de algn factor
externo por efecto del crecimiento celular, tales
como;

el calor generado por el crecimiento,


el oxgeno captado por el medio, y que deja
un vaco medible.

4.- CINETICA DEL CRECIMIENTO


La velocidad de crecimiento es el cambio en el nmero de clulas
en la unidad de tiempo.
El crecimiento es una consecuencia del hecho de que cada clula se
divide dando dos clulas hijas, las cuales se dividen luego, cada una
en otras dos, de modo que en cada perodo de divisin la poblacin
se duplica.
Parametros:
Tiempo de duplicacin.
Tasa de crecimiento.

a.- Tiempo de duplicacin. (g)


Es el tiempo necesario para duplicar una biomasa.
Xo ----g--- 2Xo
Al tiempo 0
X = Xo
Despus de: 1 generacin
X= 2.Xo.
En 2 generaciones
X = 2(2Xo.) =22 Xo
En 3 generaciones
X = 2(22 Xo)= 23Xo
En n generaciones

X = 2nXo , Y =2n.Xo

El nmero de generaciones en un tiempo t ser:


n = t/g (1)

Aplicando logaritmos: X = 2n Xo
(2)

Log X = log Xo + n log 2

(3)

Sustituyendo log 2 por su valor 0.3010, se tiene que 1/0.3010 =


3.3
n = 3.3(logX logXo)
n = 3.3 log (X/Xo)
(4)
Reemplazando en ec.1: n = t/g
g= 0.3 t / log (X/Xo)
(5)
En ln la ec.3: n= (LnX-LnXo)/Ln2
O tambin LnX=nLn2+LnXo (6)
(ln 2=0.69), y remplazando n =t/g se tiene:
g =0.693 t/(lnX-lnXo)
(7)

Tiempos de generacin en bacterias


Bacteria

Medio

Tiempo de generacion
(min)

E. Coli

Glucosa-sal

17

Bacillus megaterium

Sacarosa-sal

25

Streptococcus lactis

Leche

26

Staphylococcus aureum

Caldo infusion de corazon

27-30

Streptococcus lactis

Caldo lactosa

48

Lactobacillus acidfulus

Leche

66-87

Rhizobium japonicum

Leche

344-461

Mycobacterium
tuberculosis

Sinttico

792-932

Ejemplo.1
Se tienen 1000 bacterias en un medio de cultivo ptimo y
despus de 4 horas de incubacin, creciendo exponencialmente,
se obtienen 100 000 bacterias. Calcule el tiempo de generacin.
Xo = 1000
X = 100 000
T = 4 horas =240 minutos
g =? g = t/n

Clculo de n de la ec (3):
n = 3.3 log X/Xo , n = 3.3 log 100000/1000 = 6.6 generaciones
g =t / n
g = 240/6.6 = 36,36 minutos
Otra forma: con g =0.693 t / (lnX - lnXo)
g= (0.693 x 4) / (ln100) = 0.602 hr = 36.12 min

Ejemplo 2.
En un cultivo se tiene inicialmente 5x107 bacterias y despus de 6
horas se tiene 5x108 Calcule el tiempo de generacin
Ecuaciones:
n=t/g, : n= (LnX-LnXo)/Ln2
Reemplazando:
n = (20-17.7)/0.693
n = 3.3
g = t/3.3 = 6/3.3
g =Td = 1,8 h

Ejemplo 3.
En un proceso de fermentacin microbiana, se toman datos del
conteo celular, obtenindose los siguientes:
t (hr)
X

0 0.5
1
2

1
4

1.5 2
8 16

2.5
32

3 3.5
4 4.5
5 5.5
6
6.5
7
64 128 256 512 1024 2048 4096 8192 16382

Calcular el tiempo de generacin.


t (hr)
X
lnX

0 0.5
1
1
2
4
0 0.7 1.4

1.5
8
2.1

2
16
3

2.5
3
32
64
3.47 4.16

3.5
128
4.9

4
256
5.5

4.5
5
5.5
6
512 1024 2048 4096
6.2 6.93 7.62 8.32

Solucin por correlacin:


La ecuacin de la recta es: LnX = 1.3863 t + 0.00001
De la Ec. 5, LnX=nLn2+LnXo.
LnX=Ln2(t/g) + LnXo
Se observa que: Pendiente: m = 1.386 = Ln2/g = 0.693/g
g = o.5 h

6.5
7
8192 16382
9.01 9.704

Solucin Grfica:
(criterio)
La pendiente de la
lnea de ajuste
corresponde a la
variacin del doble
del valor de X en la
ordenada y de un
valor g en la abscisa.
Por tanto: m=Ln2/g

Se observa que: Pendiente: m =0.693/g = 1.386


m = 1.386 = 0.693/g
g = 0.5 h

b.- Tasa de crecimiento


La velocidad de crecimiento para la fase exponencial es
directamente proporcional a la concentracin de clulas y est dada
por la siguiente relacin:
Reemplazando el signo de proporcionalidad

(8)

Unidades de rx son (biomasa / L.h)

rx = X

(9)

rx=Velocidad o tasa de crecimiento bacteriano en la fase de


crecimiento logartmico
X=concentracin de microorganismos
=Velocidad especfica de crecimiento, dado por la ecuacin de
Monod.

Valor de . Velocidad especfica de crecimiento ()


Para un m.o. dado depende de: La composicin y concentracin del
medio, Presencia de inhibidores, Temperatura y pH.

Ec. de Monod. (10)

x = concentracin de microorganismos g/l


t = tiempo, h
= velocidad especfica de crecimiento h-1,
S = Concentracin del sustrato, masa/unidad de volumen
Ks=Constante promedio de velocidad. Concentracin de sustrato a la mitad
del mximo de velocidad de crecimiento. masa/unidad de volumen
ko = mxima velocidad de utilizacin de sustrato por unidad de masa de
microorganismos.

Limitaciones de la Ec. De Monod


Posee limitaciones
1) A muy bajas concentraciones de sustratos no va bien
2) A muy altas concentraciones de sustratos Ks real es cte
Extensin: de las ecuaciones 8 y 10, se tiene:

5.- ESTEQUIOMETRIA
Estudia el grado en que un microorganismo puede
transformar los componentes del medio de cultivo en nuevas
clulas (biomasa) y productos.
Esto determina la viabilidad de un proceso industrial.

Se puede establecer las relaciones estequiometrias a travs de:

balance de materiales.
los coeficientes de rendimiento.

5.1.- Coeficientes de rendimiento


a.- Coeficiente de rendimiento biomasa-sustrato
Definicin. Es la relacin entre la variacin de la biomasa y la
variacin del sustrato.

Yx/s= -X/S

(5)

Yx/s =Coeficiente de mximo rendimiento en biomasa (masa de


clulas formadas/masa de sustrato consumidos).
Si para obtener 30 gl-1 de levadura para panificacin, se consumen
60 gl-1 de fuente carbonada, el rendimiento ser Yx / s= 0.5 g de
levadura/gr de sustrato.
En un medio especfico, la relacin de la velocidad de utilizacin de
sustrato y la velocidad de crecimiento, esta dada por:

Yx/s = - rx/rsu

rx = -Yx/s . rsu

(6)

rsu = Velocidad de utilizacin del sustrato. masa/unidad de


volumen tiempo.

a.- Coeficiente de rendimiento biomasa-sustrato


(7)
El trmino m/Y = k, representa la mxima velocidad de
utilizacin de sustrato por unidad de masa microbiana.
Reemplazando en la ecuacin (7) se tiene:

Para organismos aerobios que crecen en glucosa se tiene


que los Yx/s tpicos son:
para levaduras y bacterias vara entre 0.4 y 0.6 g/g,
en condiciones anaerobias el valor de Yx/s es
substancialmente menor.
En metano, con bacterias el Yx/s ser 0.6 y 1.0 g/g

b.- Coeficiente de Rendimiento biomasa-oxgeno.


Esta dado por la relacin de biomasa producida y el
consumo de O2 del medio.
Yx/o2 = -X/O2
Yx/O2 para bacterias y levaduras aerobias que crecen en
glucosa es de 0.9 a 1.4 g/g
Un cambio en el sustrato ocasionar variaciones en el
valor del coeficiente.
Los mismos m.o. en las mismas condiciones, pero en
metano tendrn un Yx/O2 de alrededor de 0.2 g/g.

Coeficientes para m.o aerobios


Organismo

Sustrato

Enterobacteraergenes

Yx/s

Yx/o2

g/g

g/mol

g/g-C

g/g

Maltosa

0.46

149.2

1.03

1.50

Manitol

0.52

95.2

1.32

1.18

Fructosa

0.42

76.1

1.05

1.46

Glucosa

0.40

72.7

1.01

1.11

Candida utilis

Glucosa

0.51

91.8

1.28

1.32

Penicillium chrysogenum

glucosa

0.43

77.4

1.08

1.35

Pseudomonas fluorescens

glucosa

0.38

68.4

0.95

0.85

Rhodopseudomonas spheroides

glucosa

0.45

81.0

1.12

1.46

Saccharomyces cerevisiae

Glucosa

0.50

90.0

1.25

0.97

Enterobacter aergenes

Ribosa

0.35

53.2

0.88

0.98

Succinato

0.25

29.7

0.62

0.62

Glycerol

0.45

41.8

1.16

0.97

Lactato

0.18

16.6

0.46

0.37

Piruvato

0.20

17.9

0.49

0.48

Acetato

0.18

10.5

0.43

0.31

Coeficientes para m.o aerobios


Organismo

Sustrato

Yx/s

Yx/o2

g/g

g/mol

g/g

g/mol

Cndida utilis

Acetato

0.36

21.0

0.90

0.70

Pseudomonas fluorescens

Acetato

0.28

16.8

0.70

0.46

Cndida utilis

Etanol

0.68

31.2

1.30

0.61

Pseudomonas fluorescens

Etanol

0.49

22.5

0.93

0.42

Klesbiella sp.

Metanol

0.38

12.2

1.01

0.56

Metylomonas sp.

Metanol

0.48

15.4

1.28

0.53

Pseudomonas sp.

Metanol

0.41

13.1

1.09

0.44

Metyloccocus sp.

Metano

1.01

16.2

1.34

0.29

Pseudomonas sp.

Metano

0.80

12.8

1.06

0.20

Metanol

0.60

9.60

0.80

0.19

Metano

0.56

9.00

0.75

0.17

Pseudomonas metnica

c.- Coeficiente de formacin de producto (qr), o


Yp/s.
Yp/s = - P/S
Puede variar segn el producto y la forma como se
producen.
Los productos microbianos pueden ser clasificados
en tres categoras: productos asociados al crecimiento,
productos no asociados, y productos asociados mixtos.
En productos asociados. La formacin de producto es
proporcional a la tasa especfica de crecimiento (). Ej.
La produccin de una enzima constitutiva.
Productos no asociados. Antibiticos

5.2.- Balance del consumo de sustrato


Resulta de gran inters conocer el destino del sustrato durante
el crecimiento microbiano.
El sustrato es utilizado por las clulas como fuente de energa y
como materia prima para la sntesis de macromolculas
constitutivas.
Por tanto en un tiempo cualquiera, el consumo de sustrato (S)
es:

s = sx + sp + sE

Donde:

(8)

S = Sustrato total consumido


Sx = Fraccin de sustrato utilizado en formacin de biomasa
Sp = Fraccin de sustrato utilizado en formacin de producto
SE = Fraccin de sustrato utilizado para obtener energa

a.- Balance de biomasa en reactor abierto


En un biorreactor continuo, el
sustrato entra al digestor, donde
existen las condiciones (pH,
temperatura, nutrientes,
oxigeno.) adecuadas para el
crecimiento celular.
En el biorreactor, el sustrato es
convertido a productos y nuevas
clulas por los microorganismos
presentes en el medio.
Con el tiempo, la cantidad de
biomasa se incrementa a
expensas del sustrato que
disminuye.
El balance de biomasa para
reactor aerobio de mezcla total
es:
Qo Xo + V(rx) = Qe Xe (12)

rx=Tasa de crecimiento celular.


Reemplazando el valor de rx, se
tiene:

Balance de biomasa en reactor abierto


QoXo + V(r'g) = QeXe (10)

Qo=Flujo de agua en el influente.


Qe=Flujo de agua producto o agua en el efluente.
So=Concentracin de sustrato en el influente.
S=Concentracin de sustrato en el reactor.
Se=Concentracin de sustrato en el efluente
Xo=Concentracin de biomasa en el influente.
X=Concentracin o masa de biomasa en el reactor.
Xe=Concentracin o masa de biomasa en el efluente
V=Volumen del reactor.
r'g=Tasa o velocidad real de crecimiento de los microorganismos.

RESUMEN DE TRMINOS CINTICOS EN TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES

=Velocidad especifica de crecimiento


m=mxima velocidad de crecimiento
Ks=Constante promedio de velocidad. Concentracin de sustrato a la mitad del
mximo de velocidad de crecimiento. mg DBO/L
S=Concentracin del sustrato. mg DBO/L

rg=velocidad o tasa de crecimiento celular

rg= -Yrsu
Y=Coeficiente de mximo rendimiento medido durante un periodo finito en la fase
de crecimiento logartmico. Se define como la masa de clulas formadas/masa de
sustrato consumidos.

rsu=Velocidad de utilizacin del sustrato. masa/unidad de volumen tiempo.

rd = velocidad de decaimiento por metabolismo endgeno


rd = kdX
kd=constante especifica de velocidad de decaimiento endgeno dias-1
X=concentracin de clulas en el reactor mg SVS/L
r'g=rg-rd
r'g=velocidad neta de crecimiento de clulas en el reactor
r'g =(mXS/Ks+S)- kdX

b.- Balance de carbono


La base del balance, es la composicin celular en los elementos
mayoritarios (C, N, H, O).
Se ha encontrado que la composicin elemental de un
microorganismo durante un cultivo no se modifica mayormente y,
que las composiciones elementales de distintos tipos de
microorganismos (bacterias y hongos) son semejantes.
Se puede definir un "microorganismo promedio" con una
composicin (% p/p) de: C = 46.5; H = 6.49; 0 = 31.0; N = 10.85, y
el contenido de sales 5%.
Sin embargo, la composicin macromolecular, esto es: protenas,
cidos nucleicos, etc., varia en el proceso.
El contenido de tomos para 1 C, de la formula global ser:
n =(%n/%C)*(PAC / PAn)
Aplicando se obtiene la frmula global de un m.o. promedio
ser: CH1,79O0,5N0,2 (representa el 95% p/p de la biomasa)

c.- Mol de biomasa.


CH1,79O0,5N0,2 (representa el 95% p/p de la biomasa)

1 C-mol de biomasa es la cantidad de biomasa que contiene 1


tomo gramo de C, su peso ser:

Por tanto una concentracin de X en gL-1 de biomasa es


equivalente a X/25.8 C-mol de biomasa l-1, o bien Xox /12 C-mol de
biomasa l-1 .
Donde ox es la fraccin de Carbono de la biomasa (0.465 para el
"microorganismo promedio").
ox se obtiene de bibliografa, o se puede suponer ox = 0.465.
1 C-mol de glucosa (C6H12O6), se representa por CH2O y pesa 30 g, y
1 C-mol de etanol (C2H60) se representa por CH3O0.5 y pesa 23 g.

En general para un compuesto de la forma CnHlOqNm, 1 C-mol esta


representado por C Hl/n Oq/n Nm/n.

d.- C-mol de fuente de energa, y 1 C-mol de


producto.
El crecimiento puede representarse por la "reaccin qumica:

Donde NH3 es la fuente de nitrgeno, y los coeficientes


estequiomtricos estn dados en 1 C-mol de fuente de C y
energa.
yx/s representa los C-moles de biomasa formada por cada Cmol de fuente de C y E consumida., b los moles de O2
consumido por cada C-mol de fuente de C y E consumida, etc.
Los valores de yx/s e yp/s se calculan a partir de Yx/s e Yp/s:

e.- El grado de reduccin" ()


Es el nmero de electrones transferidos desde 1 C-mol del
compuesto a oxidar, al O2.
En la tabla estn los valores de para la oxidacin de 1 C-mol de
distintos compuestos orgnicos a CO2 y H2O, y el calor de reaccin q.

Clculo de por estequiometria


De la tabla se observa que: La cantidad de calor liberado por cada
mol de electrones transferidos al oxgeno (q/ ), es similar, con un
valor promedio de:
qo = 27.5 k cal (mol electrones transferidos al O2)-1
En general para calcular el grado de reduccin de un compuesto se
plantea la ecuacin de oxidacin del mismo a CO2 y H2O, y el valor de
se obtiene multiplicando por 4 el coeficiente estequiomtrico del O2
(ver tabla).
Si el compuesto contiene nitrgeno, deber especificarse su estado
de oxidacin final.
En un compuesto dado por CHaObNc, y para calcular el valor de y
con respecto al nivel de referencia dado por CO2 , H2O y NH3 ser: De
la ecuacin de oxidacin:
El valor de ser igual a 4n.

Calculo directo de
Por balance elemental de C, H, O y N se tiene:

Por tanto ser:

(7)

Tanto para CO2, H2O y NH3 es = 0 (no tienen electrones


disponibles) por ser ste el nivel de referencia elegido.

Si en lugar de NH3, se elige N2: = 4 + a - 2b.


Para aplicar el balances de materia y energa, se plantea la
"reaccin qumica" que representa al cultivo.
Para simplificar el tratamiento suponer que la fuente de C y E no
contiene nitrgeno (es lo usual) y que la fuente de nitrgeno es una
sal de amonio, por lo que estar dado por la ecuacin 7

e.- Ecuaciones de balance en C-mol


Balance de Carbono:

Con los rendimientos referidos a 1 C-mol de fuente de Carbono y


energa, resulta:

(8)

Balance de grado de reduccin:

Los electrones disponibles a la izquierda y a la derecha de la


reaccin debern ser iguales, luego:

(9)
Para: NH3 , H2O y C02 es = 0. Adems el grado de reduccin del
O2 es -4.
Reordenando la ecuacin (9) queda:

(10)
O bien:

(11)

e.- Ecuaciones de balance en C-mol


Donde: , , representan la fraccin de energa transferida a la
biomasa, al producto y al oxgeno respectivamente.
Por cada mol de electrones transferidos al O2 se liberan qo =
27.5 k cal, y el calor producido esta dado por:
q = 4 bqo (k cal / C-mol fuente de C y E) (15)
e representa la fraccin de energa disipada como calor.
Mediante las ecuaciones (8) y (10) es posible analizar los
resultados y verificar si las determinaciones han sido correctas.
Se puede aplicar las ecuaciones para calcular un rendimiento no
medido, por ejemplo yp/s en base a los dems.

Ejemplo 1:
Se cultiv la levadura Candida utilis en un medio conteniendo
glucosa, S04(NH4)2 y sales. La concentracin inicial de
microorganismos fue de 0.53 gL-1, y la glucosa 15.2 gL-1. Al cabo de
9.5 horas, se consumi totalmente la glucosa, se consumieron 0.123
mol de O2 L-1, se produjeron 0.179 mol de CO2 L-1 y la biomasa
alcanz un valor de 6.07 gL-1. Se desea averiguar si, adems de
biomasa, se form algn producto.
Datos:
Xo = 0.53g/L , So= 15.2 g/L
t= 9.5 hr.
Sf= 0, Xf= 6.07 g/L
consumo: O2= 0.123 mol/L
Productos: CO2= 0.179 mol/L .
Criterios de solucin: se usa formula de microorganismo promedio,
y el valor de C-mol.

Ejemplo 1:
Ecuacin de reaccin:

CH2O + O2 + SO4(NH4)2 ---Yx/s(CH1.79O0.5N0.2) +yp/sP


Biomasa formada = (6.07 -0.53)/25.8 = 0.215 C-mol/L
Glucosa consumida = 15.2/30= 0.506 C-mol/L
Rendimiento: yx/s = 0.215/0.506 = 0.425

yco2/s = 0.179/0.506= 0.354.


Puesto que la suma de yx/s y yco2/s es inferior a 1, es obvio
que se ha formado algn producto:
yp/s= 1 - (0.425 + 0.354) = 0.22

6.- MODELOS CINETICOS


El crecimiento microbiano es un proceso difcil de modelar debido
a las mltiples interacciones entre las clulas y el medio, y a la gran
cantidad de reacciones bioqumicas que intervienen en la actividad
celular.
Varios modelos conceptuales y matemticos se han formulado con
el objeto de explicar y replicar el comportamiento que muestran los
sistemas biolgicos.
Estos modelos se han clasificado segn las consideraciones
asumidas respecto a la estructura de las clulas o a la distribucin
de la poblacin celular.
La clasificacin ms general incluye modelos no-estructurados,
estructurados y segregados
Modelo

No estructurados

No segregados

CAJA NEGRA

Segregados

estructurados
CASO REAL

a.- Modelos No-Estructurados


Son los modelos ms simples para describir el crecimiento
microbiano.
Se asume que las clulas son una entidad en solucin, que
interacta con el ambiente.
No se reconoce ninguna estructura celular interna, ni la
diversidad de la poblacin.
Por tanto, todos los componentes celulares se representan por una
nica concentracin, la de la biomasa (X).
Los modelos no segregados no estructurados suelen llamarse del
tipo "Caja Negra".
Los mas usados son:
Modelo de Monod, Modelo de Contois, Modelo de Mosser,

Modelo de Monod
Monod en 1942 desarroll una ecuacin cintica simple.
Parte de suponer que slo una enzima con cintica Michaeliana es la
responsable del consumo de S.
El modelo asume tambin que la produccin de biomasa depende
exclusivamente de la concentracin de un sustrato limitante.
Representacin:

Modelo de Monod
X : Concentracin de microorganismos.
: tasa efectiva de crecimiento K S
S : Concentracin de substrato, mg/L
m : tasa mxima de crecimiento
Ks : Constante de saturacin. Relacin inversa con afinidad del m.o
por el sustrato. L valor de S cuando = m/2
Cuando S > > Ks, toma el valor de m y rx slo depende de x.
En general Ks tiene valores muy bajos, del orden de los mg/l.
En promedio:
En bacterias m
Las levaduras
Los hongos filamentosos

0.9 h-1
0.45 h-1
0.25 h-1

El modelo tiene limitaciones para concentraciones de sustrato bajas


y altas.

Modelo de Monod

El coeficiente Yx/s, estar dado por:


Yx/s=
(aumento de biomasa)

descenso en conc. de sustrato

= (dX/dt) = dX
(dS/dt)
dS

Modelo de Monod

Utilizacin del sustrato

Linearizacin del modelo


La solucin emprica del modelo requiere hacer la linearizacion
de Lineweaber-Burk.

Otros modelos no estructurados


Modelo de Contois.
Muestra
una
dependencia de la
tasa especfica de la
reaccin con respecto
a la concentracin de
organismos
activos
presentes.

m S
K sx x [S ]

Ejemplo
Una cultivo de microorganismos BATCH en crecimiento,
en sustrato de glucosa, dio los siguientes datos.
TIEMPO
(h)

CONC. CELULAS (X)


(g/l)

ln X

CONC. GLUCOSA
(g/l)

1.25

0.2231

100.00

2.45

0.8961

97.00

16

5.10

1.6292

90.40

23

10.50

2.3514

76.90

30

22.00

3.0910

48.10

34

33.00

3.4965

20.60

36

37.50

3.6243

9.38

40

41.00

3.7136

0.63

a) Calcular la velocidad mxima de crecimiento.


b) Calcular la variacin de sustrato (coeficiente biomasa-sustrato)
c) Cul es la concentracin celular mxima que podra esperarse si
150g de glucosa fueron usados con la misma cantidad de inoculo.
Rpta. a)

ln X

ln X

t (h)

y ln X
tg m

x
t
b) Rpta.

ln 37.5 ln 5.1
m
0.1 h 1
36 16

Calcular la variacin de sustrato por el crecimiento celular.

X celuar
Rango de Conc. Celular

S sustrato
Rango de Conc. Sustrato

41 1.25
y
0.40 gr de clulas / gr de sustrato
0.63 100

c) Rpta.

X max X 0 Y .S 0
X max 1.25 0.4(150)
X max 60.25

g clulas
lt

Modelo logistico
Los modelos anteriores representan el comportamiento de los
m.o, slo en la fase log de un cultivo batch (donde es
constante)
Si se quiere representar todo el proceso, es necesario recurrir
al modelo logstico.
Este modelo es capaz de arrojar una curva sigmoidal
Se obtiene combinando la ecuacin de Monod con la
expresin de y la de rendimiento biomasa-sustrato (Yx/s).
dX = m(Yx/s.So + Xo X) . X
dt (Ks.Yx/s + Yx/s.So +Xo-X)22

Modelos Estructurados
Los modelos estructurados modelan a la clula como un
sistema de componentes mltiples (ribosomas, enzimas,
membranas,etc.), y esta se describen con ms de una
variable.
En estos modelos, los componentes de la biomasa se
juntan en algunas variables clave que son representativas
del comportamiento celular.
La actividad microbiana es funcin de variables abiticas y
de la composicin celular, adems la actividad microbiana
depende de las condiciones ambientales que el cultivo ha
sufrido en el pasado.
Estos modelos tienen mayor capacidad de prediccin que
los modelos no-estructurados

Modelos estructurados.
Al construir el modelo se debe decidir cuantos componentes
celulares se tomaran en cuenta. (de 2 a 40)
Estos modelos consideran: las concentraciones intrnsecas,
(cantidad de un componente por unidad de masa celular) (Ci/X), y
las concentraciones extrnsecas o cantidad de un componente por
unidad de volumen del reactor.
d(Ci/X) = (1.dCi) - ( Ci. dX/dt)
dt
X.dt
X. X
Un resultado aceptable se produce usando al menos 3
componentes celulares.
Con mas componentes el modelo ser mas preciso, pero tambin
mas complejo.
Ci, es la concentracin de cada componente.

Modelos estructurados.
Con ms de un substrato limitante se pueden usar modelos
modelos multiplicativos, modelos aditivos y modelos
nominativos
Son desarrollados con amplitud en el libro de Shuler-Kargi.
El modelo aditivo toma la forma:

= W1.S1 + W2.S2 + ... + Wn. Sn


max

donde W1, W2, ..., Wn son funciones del peso, y sigue la


cintica Monod.

Modelos segregados
Los modelos segregados tienen en cuenta que la poblacin
celular es heterognea, reconoce a las clulas como discretas,
por lo que resultan complejos.
Estos modelos pueden reconocer como diferentes a las
"clulas ms viejas" de las "clulas ms jvenes".
Se aplican a sistemas microbianos en los cules se observa
que la diferenciacin de las clulas juega un papel importante
en el desempeo global del cultivo, y que las cinticas de
crecimiento y la productividad del cultivo son afectadas por la
aparicin de ms de un tipo de clula. (Paz Astudillo)