Aplicación de Marcadores Moleculares para Cribado de QTLs en Diferentes Fuentes de Resistencia A Tizón Tardío (Phytophthora Infestans) en Papa

Memoria presentada por
D. Julio Luis Gabriel Ortega

Para optar al grado de
Doctor en Producción Agraria y Biotecnologia
por la Universidad Pública de Navarra
Aplicación de marcadores moleculares para cribado de QTLs en

diferentes fuentes de resistencia a tizón tardío (Phytophthora infestans)
en papa
Directores:
Dr. ENRIQUE RITTER AZPITARTE. Investigador principal de
NEIKER - Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario.
Dr. JOSÉ IGNACIO RUIZ DE GALARRETA GÓMEZ.

Investigador principal de NEIKER - Instituto Vasco de Investigación y
Desarrollo Agrario.
Tutor:
Dr. ANGEL MINGO CASTEL. Profesor titular del Departamento de
Producción Agraria de la Universidad Pública de Navarra.
Universidad Pública de Navarra

E.T.S. Ingenieros Agrónomos
Pamplona, 2008
D. ANGEL MINGO CASTEL en su calidad de Profesor titular del Departamento de
Producción Agraria de la Universidad Pública de Navarra.
D. ENRIQUE RITTER AZPITARTE en su calidad Investigador principal de

NEIKER - Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario.
y D. JOSÉ IGNACIO RUIZ DE GALARRETA GÓMEZ en su calidad de

Investigador principal de NEIKER - Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo
Agrario.
CERTIFICAN:
Que D. JULIO LUIS GABRIEL ORTEGA, Ingeniero Agrónomo ha realizado bajo

nuestra dirección, el trabajo de investigación correspondiente a la presente Memoria de
Tesis Doctoral in titulada:
“Aplicación de marcadores moleculares para cribado de QTLs en

diferentes fuentes de resistencia a tizón tardío (Phytophthora infestans)
en papa”
Y para que así conste en cumplimiento de la legislación vigente, expedimos el siguiente

certificado
Pamplona, 01 de diciembre del 2008
Fdo. Enrique Ritter Fdo. José Ignacio Ruiz de Fdo. Angel Mingo Castel
Azpitarte Galarreta
Agradecimientos
El presente trabajo es el fruto de mucho esfuerzo y dedicación de muchas horas y
muchas personas que con su ejemplo, enseñanza, dedicación, amistad y profesionalismo
hicieron posible alcanzar esta meta anhelada en mi formación. A todos quienes de una
u otra manera contribuyeron a este logro quiero expresar mis sinceros agradecimientos y
les ruego me perdonen si no logro nombrar a todos, no es por omisión voluntaria.
En principio deseo agradecer de manera especial al Dr. Antonio Gandarillas,

Gerente General de la Fundación PROINPA en Bolivia por su amistad, confianza y
apoyo permanente para alcanzar esta meta, que es la culminación de un largo anhelo y
sacrificio; y por intermedio de él al Directorio y al personal de la Fundación PROINPA,
por depositar su confianza en quienes trabajamos en esta noble institución dedicada al
desarrollo agrícola de mi país. Por ende, también agradecer al laboratorio de biología
molecular en la persona de mi gran amigo y colega Dr. Jorge Rojas y su equipo técnico,
Yola Sánchez y Eliana Alba. A Giovanna Plata y al Centro Toralapa por facilitarme los
invernaderos y la ayuda necesaria para hacer la evaluación de resistencia en hoja y
tubérculo a P. infestans.
Quiero agradecer de manera expresa y especial a mis dos directores de tesis, los
Dres. Enrique Ritter y José Ignacio Ruiz de Galarreta, de Neiker Tecnalia, no sólo por la
dirección de la tesis, sino por su gran amistad, confianza, apoyo, esfuerzo y
profesionalismo, razones que me han permitido pueda culminar este trabajo.
Agradezco de manera particular a la Dra. Pamela Anderson, Directora del CIP, y

por intermedio de ella a la sra. Mercedes Suito, Victor Mares y a todo el equipo que
maneja las becas INIA-España, en el CIP - Lima, Perú, por la permanente preocupación
para que no me falte nada; y muy especialmente agradezco a la sra. Angeles Navarrete
y la Dra. María Teresa Dobao y a todo el equipo del INIA - España por financiar mis
estudios doctorales en la UPNA, España. Gracia por invertir en mi país y mi gente.
A la Dirección de Neiker Tecnalia, por haberme acogido en esta prestigiosa

institución del país Vasco, España - para realizar los trabajos de laboratorio para mi
formación científica en el mundo de la Biología Molecular durante estos tres años y
medio.
Al programa doctoral bajo la coordinación del Dr. José Antonio Mendizabal del
Departamento de Producción Agraria de la Universidad Pública de Navarra, por su
amistad y por permitirme la presentación del presente trabajo y en especial al Dr. Ángel
Mingo Castel por aceptar la tutoría de esta tesis, y facilitarme en los primeros años toda
la comprensión y ayuda necesaria; al igual que la Dra. Beatriz Amoreno, que me acogió
en un primer momento en el Instituto de Agrobiotecnologia de Arrosadia.
Al proyecto europeo FOOD-CT-2005-513959 (Bioexploit) y al proyecto

patrocinado por el gobierno de Alemania BMZ, liderado acertadamente por la Dra.
Anne Forbes, por apoyar financieramente el presente trabajo de investigación, que sin
el patrocinio de estos hubiese sido muy difícil culminar este trabajo.
De manera muy especial quiero expresar mi agradecimiento a Mónica Hernández,

por su amistad, esmero, dedicación, paciencia y gran profesionalismo, que me enseño y
me ayudó a introducirme y entender este complejo mundo de la biología molecular; y de
igual manera deseo expresar mi gratitud a Leire Barandalla y Rakel López que con
mucho denuedo, paciencia y amistad me han ayudado de manera decidida a alcanzar
este logro. Seguro estoy que sin la gran ayuda de todas ellas no hubiese logrado sacar
adelante este trabajo.
A la Dra. Sonia Castañon, jefa del departamento de biotecnología de Neiker

Tecnalia por permitirme trabajar y tener un lugar en el laboratorio de biología
molecular. A Maite por su trabajo tan importante como es el preparando el material de
laboratorio, para que todos puedan trabajar con las facilidades necesarias.
Quiero agradecer de forma muy especial a ese equipo maravillo de personas de

Neiker Tecnalia: Noemí, Isi, Ana A., Imanol, Raquel M., Judith, Ana H., Jhon, Monse,
Gorka, Nuria, Helena, Carlos, Marina, Arguiña, Ziortxa, Eugenia, Ernesto, Pablo, Inés,
Susana, Begonia, Iratxe, por su gran amistad, confianza y constante apoyo, que me han
hecho sentir como en mi casa y mi país.
A Claudia por su apoyo y facilitación del material bibliográfico en la biblioteca de

Neiker Tecnalia.
A Gregorio, Víctor e Ignacio del departamento de mantenimiento de Neiker
Tecnalia, que en muchas oportunidades me facilitaron el transporte a la estación de
buses para ir a Pamplona a cumplir las clases en la UPNA.
A toda la gente que he conocido durante estos años y que me han ayudado cuando
les he necesitado.
No puedo dejar de agradecer su confianza, cariño y apoyo de mi familia,

particularmente de mi madre Elsa Ortega, y mis hermanos Fernando, Edwin y Miguel y
mis cuñadas Nevia, Martha y Jimena. En especial agradezco a mi esposa Angélica por
su apoyo, paciencia, esfuerzo, oración, amistad y cariño y a mis hijitas Angy, Keila y
Alejandra por soportarme en estos tres largos años y medio de estudio y ausencias de mi
hogar y mi país. Agradezco a Rodrigo y Raquel, Job y Mabel, Justo y Julieta, Anita,
Marcelino y todas mis sobrinas, Humberto y Liz Vargas y Roberto por sus oraciones y
su gran amistad.
Tampoco puedo olvidar de agradecer a mis grandes amigos y amigas como Hugo
Ramírez y su linda familia, Laura N., Salomé P., Lourdes G., Juan V., Enrique C.,
Pablo M., Noel O., Willman G., Jorge B., Javier F., Esther A., Edson G., Ximena C.,
Hermeregildo E., Ada A., Jimena C., Carolina C, Susana, Ana María C., Elizabeth P.,
Samantha C., Jury M., Raúl G., Rolando O. y a todos que de manera directa o indirecta
me han colaborado para alcanzar esta meta.
Muchas gracias.
“Buena es la ciencia con herencia y provechosa para los
que ven el sol, porque escudo es la ciencia, y escudo es el
dinero; más la sabiduría excede, en que da vida a sus
poseedores; mira la obra de Dios, porque ¿quién podrá
enderezar lo que él torció?”
Eclesiatés 7:11-12
Dedicatoria
Al Señor mi Dios, que me ha dado la vida, fortaleza, sabiduría e

inteligencia.
A mis padres Julio Gabriel A. (+) y Elsa Ortega
Al Dr. Nelson Estrada (+).
A mi esposa Angélica y a mis hijas Angy, Keila y
Alejandra.
A mis amigos agricultores paperos de Bolivia.
Índice
1. Introducción ..................................................................................................................... 1
1.1. Origen e importancia económica y social de la papa ............................................ 2
1.2. Factores bióticos que la afectan ............................................................................. 3
1.3. Características biológicas de Phytophthora infestans ........................................... 4
1.4. Reproducción ......................................................................................................... 5
1.4.1. Reproducción asexual .................................................................................. 6
1.4.2. Reproducción sexual ................................................................................... 7
1.5. Síntomas causados por P. infestans ....................................................................... 8
1.5.1. En follaje .................................................................................................... 8
1.5.2. En tallos ....................................................................................................... 9
1.5.3. En tubérculos ............................................................................................... 9
1.6. Condiciones climáticas favorables para el desarrollo de P.infestans .................. 10
1.7. Distribución geográfica de la enfermedad ........................................................... 11
1.8. Importancia económica de la enfermedad ........................................................... 12
1.9. Fuentes de resistencia en el género Solanum....................................................... 13
1.10. Resistencia genética a P. infestans ...................................................................... 15
1.10.1. Tipos de resistencia ................................................................................. 15
Resistencia monogénica ........................................................................ .17
Resistencia oligogénica ......................................................................... .17
Resistencia Poligénica ........................................................................... .17
1.11. Componentes de resistencia.................................................................................. 18
1.12. Técnicas Moleculares en la mejora genética ....................................................... 19
1.12.1. Marcadores moleculares ........................................................................... 19
1.12.2. Mapas genéticos ....................................................................................... 21
1.12.3. Integración de caracteres cualitativos ....................................................... 22
1.12.4. Análisis de QTL ....................................................................................... 23
1.12.5. Genotipado de QTA ................................................................................. 25
1.12.6. Identificación e integración de genes candidato ....................................... 25
1.12.7. Mapas funcionales .................................................................................... 27
2. Objetivos......................................................................................................................... 28
3. Materiales y métodos ...................................................................................................... 30
3. 1. Resistencia a tizón en follaje ................................................................................. 31
3.1.1. Material vegetal y preparación .................................................................... 31
3.1.2. Aislados de P. infestans .............................................................................. 32
3.1.3. Preparación de folíolos ................................................................................ 33
3.1.4. Preparación de inoculo ................................................................................ 33
3.1.5. Inoculación .................................................................................................. 34
3.1.6. Diseño experimental .................................................................................... 35
3.2 Variables de respuesta y análisis estadístico ........................................................ 35
3.2.1. Intensidad de Esporulación (IE) .................................................................. 35
3.2.2. Área bajo la Curva de Progreso de P. i. total (ABCPPI) ............................. 35
3.3. Evaluación de la resistencia en tubérculos ............................................................. 36
3.3.1. Diseño experimental ..................................................................................... 37
3.3.2. Aislados de P. infestans ................................................................................ 37
3.3.3. Preparación de tubérculos ............................................................................. 38
3.3.4. Preparación de inoculo ................................................................................. 38
3.3.5. Inoculación ................................................................................................... 38
3.4. Variables de respuesta y análisis estadístico ......................................................... 38
3.5. Obtención de mapa de referencia para genotipado de QTA ................................... 39
3.5.1. QTLs y genes de resistencia conocidos para el análisis por SSRs ligados . 39
3.5.2. Proyección de QTLs, genes y SSRs ............................................................ 42
3.5.3. Otros marcadores y genes utilizados para el QTA genotyping .................... 46
3.6. Técnicas moleculares............................................................................................... 48
3.6.1. Extracción de ADN ....................................................................................... 48
3.6.2. Cuantificación de ácidos nucleicos................................................................ 48
3.6.3. Determinación en geles de agarosa ............................................................... 49
3.6.4. Análisis de marcadores SSR .......................................................................... 49
3.6.5. Análisis de genes candidato.......................................................................... 52
3.6.6. Análisis de marcadores CAP ......................................................................... 52
3.7 Análisis de alelos .................................................................................................... 54
4. Resultados....................................................................................................................... 55
4.1. Análisis de resistencia ............................................................................................. 56
4.1.1. Análisis de la resistencia a P. infestans en hoja ........................................... 56
4.1.2. Análisis de la resistencia a P. infestans en tubérculo .................................... 62
4.1.3. Correlación de la resistencia entre hoja y tubérculo ...................................... 66
4.3. Análisis de co-localización de SSRs y genes en el mapa poblacional UHD ........... 67
4.4. Resúmen de los resultados del QTA genotyping .................................................... 74
4.5. Análisis de genes candidato y otros marcadores ..................................................... 79
5. Discusión ........................................................................................................................ 82
6. Conclusiones................................................................................................................... 89
7. Referencias .................................................................................................................... 92
Resumen ..................................................................................................................... 106
Summary ..................................................................................................................... 107
Acrónimos ................................................................................................................... 108
Aplicación de marcadores moleculares para el cribado de QTLs en diferentes fuentes de resistencia a tizón tardío (Phytophthora infestans) en papa Julio Luis Gabriel Ortega
1. Introducción
1
1.1. Origen e importancia económica y social de la papa
La papa (es su nombre en quechua1) pertenece a la familia de las Solanáceas y al género

Solanum y posee, probablemente, más especies silvestres relacionadas que cualquier otro
cultivo. El género Solanum engloba alrededor de 2.000 especies, las cuales se extienden por
todo el mundo, exceptuando el Norte y el Sur más extremos. La evolución filogenética y las
fuerzas evolutivas de selección, migración, mutación, hibridación, poliploidización e
introgresión, han contribuido a la divergencia y a explicar el origen de la gran variabilidad
genética presente en las especies silvestres y cultivadas (Egúsquiza 1987).
Probablemente, la papa se domesticó hace 10.000 años en el altiplano, entre Perú y

Bolivia, donde se encuentra la mayor variabilidad genética de especies silvestres y variedades
cultivadas (Engel 1964). Las primeras papas domesticadas eran especies diploides de la
especie Solanum stenotomum (Hawkes 1979). Estudios citoplasmáticos, consideran que S.
andigena se originó de S. stenotomum y S. phureja. A partir de S. andigena se originó S.
tuberosum. A través de los años, múltiples cruzamientos con diferentes especies silvestres,
contribuyeron a la introgresión tanto de genes de resistencia como de caracteres de calidad
(Grun et al. 1977).
El número básico de cromosomas de las papas cultivadas y especies silvestres

emparentadas es x= 12. Es una especie poliploide y varía desde 2n=24, 36, 48, 60 y 72
cromosomas. Se cree que la evolución hacia las papas actuales se realizó a nivel diploide
(Ross 1986, Hawkes 1990).
La papa es uno de los cultivos alimenticios más importantes y difundidos a nivel

mundial. En producción de proteína por unidad de tiempo y superficie y en la obtención de
energía es superior al resto de los cultivos (Estrada 2000). En cuanto a rendimiento, la papa
ocupa el cuarto lugar, después del arroz, trigo y maíz (FAO 2004).
En Bolivia ocupa el primer lugar entre los tubérculos cultivados con una superficie
aproximada de 130.000 ha y rendimientos promedio de 5 t/ha, mientras que la media mundial
se sitúa entre14 y 26 t/ha (Horton 1992, Zeballos 1997). Su cultivo involucra
1
La palabra "papa" es un préstamo lingüístico del término quechua papa, con el mismo significado del cruce entre batata (Ipomoea
batatas), palabra originaria de la isla “La Española” , y papa resulta "patata", nombre que, por la similitud de formas, le fue aplicado en un
principio por los conquistadores tanto a la papa como a la batata. "Papa" aparece por escrito por primera vez hacia 1540 . Por su parte,
"patata" se usa en 1606 con el significado de batata y sólo a partir del siglo XVIII con el significado de papa. Así, en la mayor parte de
España se llaman "patatas", excepto en las Islas Canarias y en parte de Andalucía , donde predomina la palabra "papa", al igual que en el
resto de los países hispanohablantes
http://es.mobile.wikipedia.org/transcode.php?go=Solanum+tuberosum&PHPSESSID=c925f5fd1f466d36c446fe1e348156d6)
2
aproximadamente a 200.000 agricultores, lo que representa el 50% de las unidades agrícolas

del país (Gabriel y Carrasco 1998) y aún hoy es la principal fuente de alimentación e ingresos.
El consumo per cápita está de 60 - 80 kg/año (Estrada et al. 1994, Fernández-Northcote et
al. 1999).
1.2. Factores bióticos que afectan la papa
La producción de papa está fuertemente afectada por diversas enfermedades. Hooker

(1980) menciona 25 virus, 38 hongos, 6 bacterias, 2 micoplasmas y un viroide; además de 68
especies de nematodos y 128 insectos-plaga, totalizando unos 266 patógenos y plagas.
También diezman la papa factores abióticos como las heladas y la sequía. Pero de las más
importantes es el oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary, que causa el tizón
tardío. Esta enfermedad generalmente se controla con fungicidas, que inciden
significativamente en los costos de producción, afectan al medio ambiente y la salud humana,
además inducen a la aparición de nuevas razas del patógeno que son resistentes a fungicidas
(Andrade y Revelo 1994, Pineda y Corzo 1994, Egúsquiza 1994). Por ello es necesario
considerar otras medidas de control, como el empleo de variedades resistentes, que además
posean altos rendimientos y calidad culinaria aceptable para el mercado.
P. infestans, antiguamente clasificado en el reino fungi, Sub Reino talófitas, en la

División Mycota, en la Subdivisión Eumycotina, en la Clase Oomycetes, Sub Clase
Oomycetidae, Orden Peronosporales, Familia Phytiaceae, Género Phytophthora, Especie
infestans (Agrios 1991, Robertson 1991). Se le consideraba como hongo inferior
(Eumycotina), por ser un microorganismo formado por una sola célula continua, tubular,
ramificada, sin clorofila, con tejidos conductores y produciendo esporas asexuales en el
interior de un saco denominado esporangio.
Estudios bioquímicos y moleculares (Brasier y Hansen 1992) evidencian características

particulares de los Oomycetes, que los distancian del grupo de los hongos, por lo cual se
clasifican en uno diferente.
Evidencias de su similaridad estructural con los flagelados, su aparato mitótico, su

oogamia, su retículo citoplasmático, la estructura microfibrilar de su pared celular, el
metabolismo oxidativo, el almacenamiento de β 1-3 Glucanasas, sus flagelos Hetecariontes y
la secuencia de sus ácidos nucleicos, los encuadran filogenéticamente en el reino de las algas
3
Heterocariontes. El género Phytophthora está actualmente incluido en el reino Choromista

(Ribeiro 1995, Dick 1990, Vleeshouwers 2001).
1.3. Características biológicas de P. infestans
Si se examina al microscopio un corte transversal de una hoja, de una de las manchas, se

observa micelio intercelular, hialino continuo de 3-4 µ de diámetro ramificado en algunos
sitios, de paredes delgadas y rico en protoplasma. Es fácil ver en los bordes las manchas; en
los tubérculos, el micelio es parecido al de las hojas, pero puede ser hialino o ligeramente
parduzco (Urquijo et al. 1971). Los conidios tienen forma parecida al limón y son hialinos y
continuos, sus dimensiones son entre 27-30µ por 15-20µ. La ramificación del conidióforo es
simpódica (Fig. 1).
Esporangio
(27-30 x 15-20µ)
Micelio (3-4µ Ǿ)
Figura 1. Micelio y esporangios de P. infestans (Foto: Urquijo et al. 1971)
La principal característica de los Oomycetes, es la presencia de un micelio cenocítico,

diploide en su estado vegetativo y producir dos tipos de esporas: zoosporas a partir de
zoosporangios y oosporas mediante la fusión de gametos morfológicamente distintos (Phillips
y Keane 1993).
Según el proceso de infección que produce, P. infestans se clasifica como un patógeno

hemibiotrófico, porque tan pronto ocurre el proceso de infección, el tejido de la planta
hospedante muere, siendo este grupo intermedio entre los patógenos biotróficos y los
4
necrótroficos. Es decir que son biotróficos en el perímetro de la lesión, pero necrotróficos

cerca al centro de la lesión (Niks y Lindhout 1999, Parlevliet 1997a).
1.4. Reproducción
A P. infestans se lo considera como el causante de una epidemia policíclica. Para ser

considerada como tal, debe tener ciclos de infección completa y repetida, es decir, la infección
debe ser seguida por el desarrollo del patógeno, la producción de inoculo nuevo, la dispersión
del inoculo a nuevos sitios susceptibles y finalmente nuevas infecciones, todo ello dentro de
un solo ciclo del cultivo. Un buen ejemplo es el tizón de la papa, donde en un solo ciclo de
infección desarrolla lesiones, esporulación, dispersión de los esporangios (Fig. 2) e
infecciones nuevas dentro de cinco días, ocurriendo muchos ciclos superpuestos
simultáneamente durante períodos de tiempo favorable. Cada ciclo puede aumentar más de
diez veces el número de esporangios que aterrizan sobre sitios susceptibles, que resulta en
epidemias explosivas. La mayoría de las enfermedades de plantas ocasionadas por bacterias
son policíclicas y muchos de los virus de plantas, con la ayuda de sus vectores de insecto,
también pueden producir repetidos ciclos de infección en una temporada
(http://arneson.cornell.edu.)
Figura 2. Ciclo de la enfermedad (epidemia policíclica) (Fuente: Adaptado de Hooker 1980)
5
1.4.1. Reproducción asexual
Entre tres y diez días después de la infección, según las condiciones ambientales, los
órganos portadores de esporas (esporangióforos) emergen a través de estomas en la superficie
de las hojas (Fig. 3). Como los estomas son más frecuentes en el envés que en el haz de la
hoja, la esporulación en el envés es más abundante que en el haz (Henfling 1987).
Figura 3. Esporulación de P. infestans en el envés de las hojas (Foto: Oscar Navia)
Los zoosporangios (esporangios o conidios), se desarrollan en el extremo de los

esporangióforos (Fig. 4); cuando están maduros, estos se desprenden fácilmente y son
diseminados por el viento. La mayoría de las esporas caen a los pocos metros. Sin embargo,
pueden llegar a recorrer distancias de más de 30 Km. El tamaño de los zoosporangios se
encuentra justo debajo del límite de detección del ojo humano. Su forma se parece a la de un
limón (Henfling 1987).
Figura 4. Producción de esporangios en el esporangióforo (Foto: Henfling 1987).
6
Los zoosporangios pueden germinar directa e indirectamente; la primera a temperaturas

mayores de 20 ºC (la óptima es de 24ºC). Un zoosporangio se comporta como una simple
espora, forma un tubo germinativo que puede entrar en el tejido de la planta.
Estos germinan indirectamente a temperaturas de 12 a 16ºC, desprendiendo entre 10-20

esporas móviles (zoosporas). Activadas por dos flagelos las zoosporas permanecen móviles
durante un tiempo que varía de algunos minutos a varias horas. Bajo ciertas condiciones
pierden los flagelos, forman una pared celular y a continuación un tubo germinativo (Henfling
1987).
En las hojas y en los tallos los tubos germinativos pueden penetrar directamente en la
epidermis de la planta (no se requieren estomas). En los tubérculos, los tubos germinativos
penetran a través de lentícelas o de lesiones. Como el hongo no puede sobrevivir un tiempo
prolongado fuera del tejido hospedante, los zoosporangios o zoosporas mueren si no
encuentran un tejido hospedante apropiado (Henfling 1987).
1.4.2. Reproducción sexual
Hasta 1984, el estado sexual de P. infestans solo había sido señalado en México y partes
de Centro América. Fry et al. (1993) describió su aparición en otras partes del mundo,
especialmente en el Este de Europa.
Cuando los micelios de diferentes tipos del hongo, llamados tipos de apareamiento A1 y
A2 crecen juntos, uno de ellos puede formar células masculinas (anteridios) y la otra célula
femenina (Oogonios). El oogonio crece a través del anteridio, permitiendo la fertilización y
fertilizado se convierte en una espora de descanso de paredes gruesas (oospora). Las oosporas
a diferencia de los zoosporangios y las zoosporas, pueden resistir condiciones desfavorables,
como sequías y bajas temperaturas (Fig. 5). La recombinación genética puede generar nuevas
razas virulentas, haciendo que este tipo de reproducción sea peligrosa para el cultivo de papa.
La formación de oosporas ayuda a P. infestans y las especies afines a sobrevivir en

condiciones adversas como invierno, períodos secos y ausencia de hospederos. Las oosporas
de P. infestans germinan mediante la formación de un esporangio que es similar a los
descritos en la reproducción asexual (Fig. 5). Después de producirse la infección en un
hospedero, las zoosporas resultantes pueden iniciar un nuevo ciclo de vida (Henfling 1987).
7
Figura 5. Núcleo del anteridio dentro del Oogonio (Foto: Anónimo).
1.5. Síntomas causados por P. infestans
1.5.1. En Follaje
En campo, los primeros síntomas de la enfermedad se presentan con frecuencia en las

hojas inferiores. Estos consisten en pequeñas manchas de color verde, entre verde claro y
verde oscuro, que se convierten en lesiones pardas o negras según la humedad del ambiente.
Las lesiones se inician frecuentemente en las puntas y los bordes de las hojas. Una aureola
verde clara o amarilla de algunos milímetros de ancho suele separar el tejido muerto del sano
(Fig. 6). Bajo condiciones de alta humedad (mayor a 90%) y temperaturas bajas (0 a 22 ºC)
las lesiones se expanden rápidamente. La esporulación puede verse en el envés de las hojas
como un moho blanco que rodea las lesiones. Puede volverse poco notable durante el día
mientras las lesiones se secan y arrugan. En menos de una semana la enfermedad puede
propagarse desde los foliolos infectados en unas pocas plantas, hasta casi todas las plantas de
una parcela pudiendo llegar a caerse las hojas (Navia y Fernandez-Northcothe 1996).
Figura 6. Síntomas en hoja del ataque de P. infestans en papa (Foto: CIP 1996)
8
1.5.2. En Tallos
Las lesiones pueden desarrollarse por infección directa o por extensión a partir de las
hojas, en los pecíolos y los tallos, donde se expanden longitudinalmente. Presentan manchas
necróticas alargadas de color marrón oscuro, tomando las partes afectadas una consistencia
vítrea (Fig. 7). Los tallos infectados se debilitan, pueden tener un colapso y morir de la lesión
hacia arriba; además de quebrarse por acción del viento. En algunas zonas los agricultores de
Bolivia lo conocen como “p’aqui p’aquí” (es su nombre en quechua) (Navia y Fernández-
Northcothe 1996).
Figura 7. Síntomas en tallos por el ataque de P. infestans en papa (Foto: Henfling 1987).
1.5.3. En Tubérculos
Los tubérculos son infectados por las esporas que la lluvia lava de las hojas y los tallos y
penetran en el suelo hasta llegar a los tubérculos. Presentan en la parte externa áreas
irregulares y ligeramente hundidas de color marrón oscuro y de apariencia húmeda; una
decoloración superficial e irregular (Fig. 8). Partiendo el tubérculo, se observa una pudrición
corchosa de color pardo claro a oscuro debajo de la piel y hacia el interior del tubérculo
(Henfling 1987); este síntoma es conocido por los agricultores de Bolivia como “k’anura” (es
su nombre en quechua) (Navia y Fernández-Northcote 1996). Los patógenos secundarios,
principalmente bacterias, pueden convertir la casi inodora pudrición seca, típica de P.
infestans, en una pudrición blanda maloliente, lo cual limita la comercialización de éstos
tubérculos. El tizón tardío no se propaga normalmente durante el almacenamiento; sin
embargo, las infecciones secundarias pueden contaminar los demás tubérculos (Navia y
Fernandez-Northcote 1996).
9
Figura 8. Síntomas en tubérculos (Foto: Julio Gabriel)
En Latinoamérica no hay muchos estudios sobre la resistencia en el tubérculo, porque no

se presentan daños. Sin embargo, en Europa, es un problema importante, así Kapsa (2007),
menciona que la presencia de la enfermedad de tizón es un factor crítico en la sanidad de los
tubérculos en Polonia y otros países europeos. Encontró que los síntomas de tizón varían en
años particulares. La infección de tubérculos en 1998 fue de 19.5%, en 2003 del 21.8% y en
2006 del 14.8%. La alta incidencia de tizón sobre los tubérculos se relacionó con la presencia
de lluvias en agosto y septiembre, correlacionándose con la virulencia del patógeno.
Se ha observado en tubérculos un tipo de resistencia horizontal. No se ha encontrado

correlación entre resistencia de las hojas y la de tubérculos (Stegemann y Schnik 1985), pero
si se ha estudiado los compuestos fenólicos involucrados en la resistencia, tales como lignina,
suberina, calosa y las fitoalexinas (Estrada 2000).
1.6. Condiciones climáticas favorables para el desarrollo de P. infestans
Henfling (1987) indica que el hongo desarrolla favorablemente a una alta humedad (90-
100%), propiciada por lluvias frecuentes o rocío abundante y a temperaturas de 9 a 22 ºC. El
desarrollo del hongo en la hoja es poco afectado por la humedad del ambiente, pero los
esporangios se forman solo cuando la humedad relativa (HR), dentro el follaje es superior a
95%. La enfermedad se desarrolla y propaga con mayor rapidez a temperaturas bajas y alta
humedad, puede sobrevivir en el hospedante a temperaturas entre 0 y 28ºC.
Cuando la temperatura es óptima se requieren 8 horas de alta humedad para la producción

de esporangios, su liberación y penetración. Tiene que existir agua (rocío, lluvia) en la
superficie de las hojas durante un mínimo de dos horas para que las zoosporas se formen,
germinen y penetren (PROINPA 1998).
10
1.7. Distribución geográfica de la enfermedad
La enfermedad se presenta en casi todas las zonas donde se produce papa, abarcando una
amplia distribución en la mayoría de los países de los cinco continentes y provocando grandes
daños (Junchaya 1983).
P. infestans emigró de México a Estados Unidos y luego a Europa hacias el año 1840
introducido y diseminado en tubérculos-semilla. La dispersión del patógeno se dio en primer
lugar desde Europa, por una primera migración. Se presume que existió una segunda
migración del patógeno en los años 1970s desde México a Europa (Fry et al. 1993, Forbes
1994, García 1997). En 1845 causó epidemias severas en la papa de Europa y América del
Norte, ocasionando la hambruna, migración y muerte de más de un millón de personas en
Irlanda. Esto llevo a la institucionalización del mejoramiento genético de la papa y al
nacimiento de la fitopatología como una ciencia (Estrada 2000).
El tizón en Bolivia (Fig. 9), se encuentra en los departamentos de La Paz, Cochabamba,

Santa Cruz, Oruro, Potosí, Chuquisaca y Tarija (PROINPA 1996). Las zonas de mayor
incidencia del tizón son: Morochata, Monte Punku, Epizana, Candelaria, Valle de
Cochabamba, Escalante y Capinota (Cochabamba); Comarapa, San Isidro y Valle Grande
(Santa Cruz); y las zonas bajas de los departamentos de Tarija, La Paz, Potosí, y Chuquisaca.
En Cochabamba las zonas endémicas de mayor incidencia de tizón son Morochata, seguida
por Chullchunq’ani, Lope Mendoza, Candelaria y Mizque (Otazu et al. 1982).
11
o Area de incidencia de A2
Zonas con tizón
Figura 9. Distribución del tizón en Bolivia (Fuente: PROINPA 1998)
1.8. Importancia económica de la enfermedad
El tizón tardío es considerado como la más grave enfermedad de la papa en todo el

mundo. Ocurre en casi todas las zonas donde se cultiva este tubérculo. En los países en
desarrollo, la pérdida de rendimiento debido a la enfermedad se calcula cerca de 2,75 mil
millones de dólares (2,20 mil millones de EUR) cada año. Además, son muy cosotosos los
fungicidas (http://www.cipotato.org/potato/pests_diseases/late_blight/, Landeo et al. 1998).
Por ejemplo, en el norte de Ecuador, los agricultores gastaron, en promedio, 120 dólares (96,3
EUR) por hectárea en fungicidas, que es un 10% del total de sus costes de producción.
En Bolivia, en términos económicos, el tizón tardío es una de las enfermedades más

importantes de la papa y se estima que más de 40.000 familias de pequeños agricultores
paperos se ven afectadas. En las 20.000 hectáreas de papas afectados por la enfermedad, las
pérdidas directas son de unos 30 millones de dólares por año (24 millones de EUR). La mayor
parte de la zona afectada se encuentra en las regiones productoras de semilla de papa, que en
la actualidad, apenas cubren el 5% de las necesidades nacionales de semilla de calidad. Esta
12
pérdida causada por la enfermedad pone de relevancia la importancia de la enfermedad en

Bolivia como un factor que limita la producción y la productividad de las papas,
principalmente de las variedades Waych’a, Sani Imilla, Alpha, Desirée, etc., que son los más
importante en la economía agrícola del país (Bojanic 1995, Estrada et al. 1994, Fernández-
Northcote et al. 1999, Navia et al. 2002).
1.9. Fuentes de resistencia en el género Solanum
Los recursos genéticos de especies silvestres de papa tienen un valor probado en los
programas de mejoramiento genético para resistencia a enfermedades, estreses ambientales y
otros caracteres agronómicos de interés (Ross 1986, Spooner et al. 1991, Spooner and
Bamberg 1994, Ruiz de Galarreta et al. 1998, Jansky 2000, Ochoa 2001, Spooner et al. 2004).
Las especies del Norte y Centro América son particularmente ricos en cada característica. Por
ejemplo muchas de las especies silvestres tienen alto nivel de resistencia contra P. infestans
(Bamberg et al. 1994, Song et al. 2003).
A principios del siglo XX se identificaron especies silvestres tuberíferas como S.

demissum para utilizarlas como fuentes de resistencia a P. infestans. Sobre la base de esta
identificación, se inició la introgresión de genes de resistencia mediante cruzamientos. A
partir de 1920, numerosas expediciones científicas a México, América Central y Sudamérica,
lugares que corresponden con los centros de origen y diversidad de la papa, permitieron
recolectar y describir taxonómicamente unas 200 especies silvestres y ocho especies
cultivadas (Hawkes 1990).
Diversos fitomejoradores han considerado que el uso de las especies silvestres es tedioso,
difícil y de larga espera para obtener logros. Esto posiblemente se ha debido en gran parte a
que la mayoría de los fitomejoradores en Europa y Norteamérica han trabajado más que todo
en la especie S. tuberosum ssp tuberosum y sus haploides. En ellos la fertilidad, especialmente
del polen es muy restringida y también la viabilidad genética. El problema se vuelve más
crítico cuando se híbrida con las especies silvestres (Peloquin et al. 1989, Estrada 1991,
Gabriel 1994).
Realmente sólo después de 1950 Ross (1986) ha intentado utilizar las especies silvestres,
especialmente con los trabajos de investigadores holandeses, alemanes, escandinavos,
polacos, españoles y rusos. También en Canadá, Estados Unidos y en Latinoamérica (Wastie
1991, Rivera-Peña 1992, Romero 1993, Ruiz de Galarreta 1998).
13
La excepción han sido los trabajos de Peloquin (1989) y su equipo de la Universidad de

Wisconsin, que utilizaron dihaploides de S. tuberosum con S. phureja o los trabajos de
Simmonds (1977) y Glendining (1975) en Scottish Plant Breeding Station de Escocia y
Plaisted et al. ( 1975) en Cornell University que lograron obtener tipos neotuberosum,
extraídos de la misma S. andigena, adaptándola en varias generaciones de selección a los días
largos del hemisferio norte, obteniendo así los cultivares neotuberosum.
En Latinoamérica los mejoradores contaron con ventajas comparativas muy grandes

como son la alta fertilidad y la flexibilidad de ploidía que muestran los cultivares nativos
(Estrada 1984a, 1984b, 1990, 2000, Estrada y Gabriel 1991, Gabriel et al. 1995, Gabriel et al.
2007, García et al. 2007, Contreras 2008).
La manipulación genética bien dirigida ha abierto las puertas para explotar mucho más
rápidamente, pocas generaciones (dos o tres), los grandes atributos de muchas especies
silvestres. Los trabajos de varios investigadores han contribuido a desarrollar mejores y más
eficientes métodos de mejoramiento genético (Peloquin et al. 1989, Rivera-Peña 1992,
Nietherhauser 1993, Estrada 2000).
A pesar de la gran diversidad genética disponible en las especies silvestres de este género,
sólo un pequeño número de ellas han sido utilizadas para la introgresión de caracteres de
resistencia en los cultivares. Se estima que apenas un 5% han sido utilizados en programas de
fitomejoramiento (Gabriel et al. 1995, Colque 1996, Estrada 2000, Gabriel et. al. 2001, Coca
y Montealegre 2006, García et al. 2007). Esto se debe, por un lado, a los problemas que
existen entre determinadas especies al cruzarse. El potencial de hibridación de la papa
depende, en primera instancia, de la ploidia que presente la especie silvestre o cultivada y del
número de balance del endospermo (EBN). S. tuberosum presenta una ploidia/EBN = 4x
(4EBN), y el potencial de hibridación es mayor con las especies 4x (4EBN) y 6x (4EBN),
mientras que presenta un potencial de hibridación menor con especies 4x (2EBN) y con
especies 2x (2EBN) (Spooner y Hijmans 2001). Por otra parte, en los cruzamientos, se
produce la introgresión de caracteres silvestres no deseados junto con los caracteres de
resistencia. Esto conlleva el desarrollo de múltiples ciclos de retrocruzamientos para
eliminarlos.
Existen papas nativas cultivadas originarias de los Andes que presentan una gran
variabilidad genética, entre las que se encuentra resistencias a factores abíóticos (helada,
sequía) y bióticos (hongos, bacterias, virus, nematodos); además de factores de calidad. La
14
introgresión en este germoplasma ha sido mínima y es posible que la evolución de estos

cultivares continúe in situ (Ugarte et al. 1994, Estrada 2000, Gabriel et al. 2007).
1.10. Resistencia genética a P. infestans
Se entiende la resistencia como cualquier característica heredada de una planta

hospedante para reducir el crecimiento y/o desarrollo del patógeno y/o parásito después que
se ha iniciado o establecido el contacto. Se debe hacer la distinción de ésta definición con el
término tolerancia, que es cuando la planta susceptible, a pesar de estar infectada
severamente, soporta el ataque y logra producción.
1.10. 1. Tipos de resistencia
La resistencia de las plantas a enfermedades, se puede investigar y determinar desde

diversos puntos:
a) Los científicos que trabajan en el campo de la patología de plantas tienen mayor interés
en los mecanismos que confieren resistencia a la enfermedad, para lo que se considera: 1)
la infección y el establecimiento del patógeno en plantas infectadas, 2) la colonización y
esporulación y/o 3) la reducción de los efectos adversos sobre la expresión del
rendimiento. Por esta razón hay diferencias importantes entre la resistencia a la infección,
resistencia a la colonización y esporulación y resistencia a la enfermedad o capacidad
para no perder rendimiento (Van der Plank 1984; Király et al. 1991, Sutic y Sinclair
1991).
b) Los mejoradores de plantas y genetistas han estudiado el grado de especificidad de la

resistencia con las razas patogénicas (Van der Plank 1968, 1984, 1991), identificándose
dos tipos de relación: 1) resistencia a la raza específica (vertical) y 2) resistencia a la raza
no específica (horizontal). El primer tipo de resistencia es efectivo en contra de pocas
razas, especificas, del patógeno y ha sido usada intensivamente (Colon y Budding 1988 y
1993); la sintomatología consiste en una reacción hipersensitiva temprana y rápida que
produce un área necrótica alrededor del punto de infección; es una respuesta específica la
infección de cierta raza (Gabriel et al. 1988, Parlevliet y Niks 1989). El segundo tipo de
resistencia es eficaz en contra de muchas razas patogénicas. Sin embargo, esta resistencia
no es perfecta, y no está asociada con una respuesta de hipersensibilidad. Como regla
15
general se atribuye que la resistencia no especifica está determinada por el efecto de

muchos genes (Simmond y Wastie 1987).
c) El interés de los biólogos o bioquímicos en la resistencia es completamente diferente.

Ellos hablan acerca de una resistencia preformada (pasiva y activa) e inducida
(adquirida). La resistencia preformada pasiva y activa está basada en la existencia de
barreras físicas o químicas en las plantas, sean éstas infectadas o no. La resistencia
inducida sólo será dada cuando exista inducción de reacción en la relación planta -
patógeno (Daly 1984, Parlevliet y Niks 1989, Sutic y Sinclair 1991, Király et al. 1991,
Agrios 1991).
Varios investigadores han revisado los componentes bioquímicos de la resistencia (Sutic y

Sinclair 1991). Sin embargo, se han hecho pocas tentativas para relacionar estos con la
resistencia de campo; así, Duke y Tomiyama citados por Wastie (1991), examinaron el papel
de las glucanasas, quitinasas y componentes fenólicos, que al parecer son capaces de degradar
la pared celular del hongo y han sido estudiados muy ampliamente por diversos
investigadores.
En trabajos realizados por Miller y Bérger citados por Sutic y Sinclair (1991) encontraron
que al inocular una raza incompatible de P. infestans, las plantas reaccionaban
hipersensitivamente. De igual manera, al inocular una raza compatible en una variedad
susceptible de papa, observaron que el patógeno no se establecía. Esto les permitió deducir
que existen compuestos que ellos llamaron fitoalexinas, responsables de la resistencia.
Sustancias como la risitina (Keen 1982, Agrios 1991) sólo se sintetizan en el momento en que
existe una interacción entre la planta y el patógeno. Se sabe, además, que un daño simple
sobre las hojas, tallos, raíces, frutos, etc., así como tejidos sometidos a radiación, son capaces
de producir fitoalexinas. Sin embargo, Schöber (1992) y Wastie (1991), mencionan que esta
respuesta no está necesariamente correlacionada con la resistencia.
En resumen, no se puede afirmar con certeza si el patógeno infeccioso en las plantas

resistentes es en realidad inhibido como resultado de algún mecanismo, o a la inversa, el
patógeno activa mecanismos en el hospedero hipersusceptible.
Dentro del carácter de resistencia, es posible considerar aquellos caracteres gobernados

por un solo gen, unos pocos genes o muchos genes, recibiendo en cada caso los nombres de
monogénica, oligogénica y poligénica, respectivamente.
16
Resistencia monogénica
El gen de la resistencia monogénica puede ser estudiado en detalle e identificado

individualmente, por letras, números o de ambas maneras, por ejemplo Sr6, Sr11, Sr40, etc.,
que confieren resistencia en trigo a la roya; los genes R1, R2, R3, R4, …, R10, etc. En S.
demissum para resistencia a diferentes razas de P. infestans; los genes A, B, F, etc. que dan
resistencia a la avena contra la roya del tallo; los genes Lr y Yr para roya de la hoja y roya de
las glumas del trigo. La resistencia que estos genes puede ser dominante o recesiva. Cuando la
resistencia monogénica prevalece, es posible observar que las progenies segregantes pueden
ser clasificadas sin dificultad en clases discontinuas de individuos resistentes y susceptibles
(herencia mendeliana). Este tipo de resistencia está íntimamente aociado a la relación gen a
gen, que involucra dos pares de genes acoplados: un par está en el hospedante y el otro está en
el patógeno (Flor 1971)
Resistencia oligogénica
La herencia de la resistencia oligogénica es parecida a la resistencia monogénica y, como

ésta última, está asociada con genes mayores, los cuales no interaccionan con el ambiente o
interaccionan muy poco.
Resistencia poligénica
La herencia de la resistencia poligénica es más compleja. Los genes que intervienen, en la

mayoría de las veces son difíciles de contarlos e identificarlos individualmente, conociéndose
el efecto combinado de dichos genes como un total. Las plantas en las poblaciones
segregantes varían continuamente de resistencia sin poder ser agrupados claramente en grupos
definidos. La resistencia poligénica está asociada con genes menores de efectos aditivos los
cuales interaccionan fuertemente con el ambiente. Sin embargo, es necesario notar que,
normalmente es menos propensa a romperse por la aparición de nuevas razas patogénicas;
además su expresión no es siempre del tipo de alta resistencia o inmunidad como en el caso
de la resistencia monogénica (Rivera-Peña 1992, Niederhauser 1993).
1.11. Componentes de la resistencia
La introducción de muchos genes deseables de resistencia puede ser posible, pero es

difícil identificar éstos individualmente por métodos tradicionales dado su efecto cuantitativo,
lo cual hace la investigación, así como el mejoramiento, difícil. Por esta razón, se han hecho
17
diversos intentos para separar los componentes de la resistencia parcial, los cuales van
afectando a los diferentes estados en el ciclo del patógeno (Parlevliet 1997a, b, Parlevliet y
Niks 1989). Se han distinguido cinco componentes en P. infestans que determinan el
desarrollo de la epidemia (Van der Plank 1984, Colon y Budding 1988, Király et al. 1991,
Sutic y Sinclair 1991) que pueden ser afectados por la planta hospedante y de este modo ser
utilizado en el mejoramiento: eficiencia de la infección (EI), periodo de latencia (PL), tasa de
crecimiento de la lesión (TCL), tamaño de lesión (TL), periodo de infección (PI) e intensidad
de la esporulación (IE). Para determinar la contribución relativa de estos componentes de la
resistencia se han utilizado generalmente dos procesos (Van Oijen 1992; Colon et al. 1993,
Gabriel et al. 2007): 1) determinación experimental de la correlación entre los componentes
de la resistencia individual y tasa de progreso de la enfermedad y 2) construcción de modelos
matemáticos de los patosistemas y un análisis de sensibilidad.
Spielman et al. (1992) midieron tres componentes de agresividad (eficiencia de la

infección, área de la lesión y capacidad de la esporulación), para lo cual utilizaron 8 aislados
de P. infestans y una variedad susceptible 'Norchip'. Ninguno de los componentes fueron
predictores satisfactorios de la agresividad en campo por la influencia de los factores físicos
del ambiente. La correlación fue alta y negativa entre el rendimiento en campo y el tamaño de
la lesión.
Por su parte, Hidalgo et al. (1998) en un estudio de componentes de resistencia horizontal

encontró correlación significativa entre EI, PI, TCL y TL con el Area bajo la curva de
progreso de P. infestans (ABCPPI). Recomendando la EI, PI, TCL y TL como parámetros de
selección para resistencia horizontal en clones previamente seleccionados.
Umareus y Lihnell citados por Wastie (1991) hicieron mediciones cuidadosas de la

eficiencia de la infección, crecimiento de la lesión y producción de conidios en evaluaciones
de laboratorio, y posteriormente utilizaron estos parámetros para calcular el área destruida por
el patógeno. Esta aproximación analítica es un ejemplo de cómo puede medirse la importancia
relativa de los parámetros individuales, así como su valoración como criterios de selección.
Por otra parte estudios realizados por Parlevliet (1979 y 1997a, b) sobre el periodo de
latencia de la roya de la roja del trigo Puccinia hordeí, mostró que la temperatura, el día largo
y la intensidad de luz no son importantes en el PL; pero si el estado de desarrollo de las
plantas. Demostrándose que el PL en plántulas no predicen bien el PL relativo de plantas
adultas. Trabajos recientes en Bolivia han encontrado una buena correlación entre TL, rango
18
de crecimiento de la lesión (RCL) e IE con el ABCPPI y que estos componentes pueden ser
utilizados eficientemente en evaluaciones de plantas en invernadero para selección de
genotipos resistentes (Gonzáles et al. 1999, Orellana 2001, Gabriel et al. 2007).
1.12. Técnicas moleculares en la mejora genética
Desde la prehistoria, el hombre ha seleccionado y mejorado especies vegetales, animales

y microbianas basándose en el fenotipo. Las mejoras genéticas eran posible gracias a la
variabilidad genética, a la heredabilidad del carácter que se quería aislar, a la eficacia e
intensidad de la selección aplicada, y al tiempo necesario para realizar un ciclo de selección.
Sin embargo, quedan muchos aspectos desconocidos, como son en muchos casos el número
exacto y efecto de los genes implicados en la expresión de un carácter y sus interacciones, así
como la localización de estos genes, y el análisis de su función fisiológica.
Los avances en la biología molecular y, particularmente, en la genómica y proteómica

permiten aplicar nuevas estrategias y técnicas eficientes para el detallado análisis genético de
cualquier fenotipo.
1.12.1. Marcadores moleculares
Los marcadores moleculares constituyen la herramienta básica para los fines que se
describe en el primer párrafo del punto 1.12. Los marcadores son elementos discriminativos
que permiten distinguir y clasificar objetos.
Afortunadamente, la aparición de los marcadores moleculares está ayudando a eliminar

tanto los inconvenientes de una selección basada en el análisis exclusivo del fenotipo, como la
identificación de especies y variedades de una forma más rigurosa y repetitiva. Los
marcadores moleculares son biomoléculas que se pueden relacionar con un rasgo genético.
Éstas pueden ser marcadores moleculares como las proteínas (antígenos e isoenzimas) y el
DNA (de genes conocidos o fragmentos de secuencia y función desconocida).
Un marcador molecular monomórfico es invariable en todos los organismos estudiados,

pero cuando presenta diferencias en el peso molecular, actividad enzimática, estructura, o
sitios de restricción, se dice que es polimórfico. A veces el grado de variación es tal que se
denominan hipervariable (www.ndsu.nodak.edu/insctruct/mcclean/plsc431/markers/ y
opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MG01.html.).
19
Los primeros marcadores desarrollados en papa a finales de los 70 se basaron en la

identificación de proteínas e isoenzimas por electroforesis en geles de almidón o
poliacrilamida. Con ellos se abrió el conocimiento de la estructura y heterogeneidad genética
entre diferentes especies, variedades, y poblaciones de distinto origen geográfico. Pero esta
técnica tenía una limitación muy importante: no era capaz de detectar suficiente polimorfismo
entre variedades o especies próximas debido a que las proteínas son el resultado de la
expresión génica, que puede ser distinta de unos tejidos a otros, de una etapa de desarrollo a
otra, de un medio ambiente a otro, y de una época del año a otra. Los avances de la tecnología
del DNA han permitido el desarrollo de los marcadores moleculares basados en el DNA,
consiguiendo estabilidad en la identificación de especies y variedades.
El estudio genómico de una especie, normalmente, comienza con el desarrollo de

marcadores moleculares. Los primeros marcadores de DNA descritos en papa fueron los
RFLPs (Gebhardt et al. 1989a). Esta técnica requiere gran cantidad de ADN, es laboriosa y
costosa, aunque presenta una técnica fiable. El descubrimiento y la explotación de la técnica
PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) facilitaron enormemente el desarrollo y las
aplicaciones de marcadores moleculares.
Consecuentemente, se desarrollaron y aplicaron en la papa otros tipos de marcadores,

dominantes y codominantes, como los RAPD, AFLP (van Eck et al. 1995), SSR (Milbourne
et al, 1998), ISTR, ISSR, SCAR y CAP (Oberhagemann et al. 1999). Entre las aplicaciones
más importantes de estos marcadores figuran la identificación y la determinación de la pureza
varietal (Görg et al. 1992) así como el análisis de la biodiversidad y estudios filogenéticos en
el género Solanum (Debener et al. 1990).
Se pueden distinguir marcadores dominantes y codominantes. Esto implica que los

marcadores dominantes pueden ser específicos para un parental o comunes a ambos
parentales, segregando 1:1 y 3:1 respectivamente en una progenie. En todos los casos existen
alelos nulos (ausencia del marcador dominante) que representan los otros alelos desconocidos
en una progenie.
Los marcadores codominates revelan cada uno de los diferentes alelos de un locus
conocido hasta diferente. A estos pertenecen generalmente los SSRs2, ESTs y TDFs (van Eck
2
Los SSRs (“Simple Sequence Repeats”), detectan regiones hipervariables del genoma. Un marcador SSR es
una repetición de unas pocas bases (2-5) y está flanqueado por un único DNA, son marcadores codominantes y
mapean regiones cromosómicas idénticas en diferentes entornos genéticos. Debido a estas características,
20
et al. 1995). Ellos también sirven para alinear los mapas genéticos individuales de cada
parental y producir un mapa integrado (Ritter et al. 2008a).
Por otra parte hay marcadores indirectos y directos. Los marcadores indirectos son
aquellos que determinan la distancia entre el marcador y un gen de interés. En cambio, los
marcadores directos permiten la identificación directa de los alelos de un gen de interés y se
pueden aplicar independientes del entorno genético.
De particular interés son aquellos marcadores que mapean en diferentes entornos

genéticos a la misma posición genómica, ya que permiten por ejemplo alinear mapas de
diferentes entornos genéticos. Obviamente tienen que ser “single copy” para evitar
confusiones. Entre ellos figuran generalmente copias simples de SSRs, TDFs, EST y COS.
(Oberhagemann et al. 1999).
1.12.2. Mapas genéticos
Para muchas aplicaciones genéticas es necesario localizar el conjunto de marcadores

moleculares en el genoma. Para ello sirven los mapas genéticos. El mapa genético se deriva
de procesos estadísticos y refleja la estructura física de un genoma con sus correspondientes
cromosomas. Los mapas de ligamiento genético se construyen a partir de cruzamientos
controlados utilizando marcadores moleculares. En papa se han construido diferentes mapas
de ligamiento genético a nivel diploide y tetraploide y en diferentes entornos genéticos. El
primer mapa a nivel diploide se basó en marcadores RFLPs (Bonierbale et al. 1988). Luego el
construido por Gebhardt et al. (1989b).
En la actualidad existen muchos mapas genéticos disponibles basados en diferentes

marcadores moleculares y se encuentran alineados con otros mapas de papa y tomate
mediante sondas comunes.
Cabe destacar que el mapa de SSRs fue descrito por Milbourne et al. (1998), que
contiene marcadores RFLPs mapeados también en el mapa de papa de la base de datos Gabi
(Pomamo) y sondas de tomate. Este mapa pudo ser anclado al mapa de Coromel et al. (2003),
el cual fue obtenido en una población de S. tuberosum x S. spegazzinii y mapa de tomate
(Tanksley et al. 1992). El mapa ultradenso (UHD) de papa por Isidore et al. (2004) y van Os
estos marcadores son utilizados para el alineamiento entre los mapas individuales obtenidos para cada parental,
así como para alinear mapas construidos a partir de diferentes poblaciones (Valadez y Kahl 2005).
21
et al. (2006), que a parte los 10.000 marcadores AFLPs, contiene 40 marcadores RFLPs y
SSRs que se utilizaron como marcadores directos. Por otro lado, este mapa está alineado con
el mapa de tomate (Tanksley et al. 1992) mediante sondas RFLPs y cuenta con 66 marcadores
comunes al mapa de papa de Caromel et al. (2003). Recientemente, Ritter et al. (2008a), han
contribuido con un mapa completo de transcriptoma constitutivo expresando genes del
genoma de la papa, que se ha construido utilizando cDNA-AFLP. Los TDFs fueron anclados
a las cajas del mapa UHD.
1.12.3. Integración de caracteres cualitativos
La disponibilidad de mapas genéticos permite integrar en los mismos datos fenotípicos

que pueden ser causados por un gen (carácter monogénico), por varios e incluso muchos
genes.
Los caracteres monogénicas como por ejemplo la resistencia al virus Y de la papa (PVY)
se pueden tratar estadísticamente igual que un marcador molecular (presencia vs. ausencia)
para su integración en un mapa.
Ritter et al. (2005) menciona que en los mapas genéticos de la papa se han integrado
caracteres cualitativos como resistencia monogénica a PVY (Rysto, Brigneti et al. 1997,
Ryadg, Hämäläinen et al. 1997), PVX (Rx1, Rx2, Ritter et al. 1991; Nb, De Jong et al. 1997,
Nxp, Tommiska et al. 1998), nematodos (Gro1, Barone et al. 1990, H1, Gebhardt et al. 1993,
Gpa1, Kreike et al. 1994, Gpa2, Rouppe van der Voort et al. 1997, Gpa5, Rouppe van der
Voor et al. 2000) y P. infestans (R1, Leonards-Schippers et al. 1994, R3, El-Kharbotly et al.
1994, R2, Li et al. 1998, R6 y R7, El-Kharbotly et al. 1996).
1.12.4. Análisis de QTL
Sin embargo, la variación cuantitativa observada para la mayor parte de los caracteres
fenotípicos en plantas es causada por genes poligénicos, que frecuentemente interacciona con
el medio ambiente (Vargas et al. 2006). La acción colectiva de los loci genéticos en la
expresión de un carácter se ha denominado QTL (Geldermann 1975). Los efectos
cuantitativos de los QTLs no se pueden estudiar mediante el análisis mendeliano, sin embargo
cuando un marcador molecular segrega según un patrón mendeliano y está ligado a un QTL,
la posición en el cromosoma del QTL y su contribución fenotípica puede ser estimada
(Thoday 1961).
22
Hasta ahora, hay numerosos modelos estadísticos para el análisis QTL, que determinan la
posición y el efecto de cada loci que influye en el carácter cuantitativo (Lander y Botstein
1989, Knapp et al. 1990, Martínez y Curnow 1992, Jansen y Stam 1994, Zeng 1994).
En papa, se han desarrollado diferentes análisis de caracteres cuantitativos, considerando

resistencias poligénicas a P. infestans (Leonards-Schippers et al. 1994) y G. pallida (Kreike et
al. 1993, Caromel et al. 2003). También, se realizaron otros análisis de QTL considerando los
componentes del rendimiento (Schäfer-Pregl et al. 1998), la tuberización, la dormancia (van
den Berg et al. 1996), la forma del tubérculo (van Eck et al. 1994) y el contenido de azúcares
y almidón (Menéndez et al. 2002).
Los análisis de caracteres cuantitativos han revelado que muchos QTL coinciden o están
localizados cerca de genes con determinadas propiedades biológicas. En estudios de
resistencia a P. infestans se ha determinado que la posición de un QTL con efecto importante
coincide con la del gen R1 y con otros genes Prp, que están involucrados en reacciones de
defensa tras la invasión de patógenos (Leonards-Schippers et al. 1994).
El presente trabajo se centra en el análisis de QTLs de resistencia a P. infestans. Dada la

importancia de este patógeno existen numerosos estudios de QTLs a este carácter en
diferentes entornos genéticos. Así, Ghislain et al. (2001) analizaron una población de S.
phureja (phu) con un dihaploide de S. tuberosum (dih tbr), en la que encontraron dos
importantes QTLs (loci de caracteres cuantitativos) en los cromosomas VII y XII como una
contribución de ambos progenitores. Otro QTL fue detectado en el cromosoma XI como una
contribución del parental phu, y otros tres fueron detectados en los cromosomas III, V y VIII,
como una contribución del parental dih tbr. Bormann et al. (2004), seleccionaron 30
marcadores basados en DNA que se conocía estaban ligados con loci de resistencia a P.
infestans en papas diploides y fueron probados como marcadores ligados a loci de caracteres
cuantitativos (QTL) para la resistencia a P.infestans y madurez en dos poblaciones de medios-
hermanos tetraploides de papa.
Sorensen et al. (2006), evaluaron en campo dos poblaciones originadas de un

cruzamiento entre un clon de S. vernei y dos clones de S. tuberosum, por su resistencia al
tizón. S. vernei no fue previamente mapeado para QTLs. El ABCPPIrel fue estimado y
utilizado para el mapeo de QTLs. Se construyó un mapa de S. vernei, con 11 grupos ligados,
de los cuales nueve podrían ser asignados a los cromosomas. Los resultados indicaron que la
resistencia en S. vernei era de herencia cuantitativa. Se identificaron, asimismo, QTL
23
significativos en los cromosomas VI, VIII, y IX. Adicionalmente, fueron detectados en los
cromosomas VII y IX QTLs potenciales. Un QTL posible para rendimiento en tubérculo fue
encontrado en los cromosmas VI y VII, pero no estaba asociado a resistencia. El QTL de
resistencia a P. infestans fue mapeado para el cromosoma IX, y podría ser utilizado en mejora
genética para P. infestans, el mismo está asociado al marcador SSR STM1051, en ambas
poblaciones.
Un caso interesante es el descrito por van der Vossen et al. (2005), que mencionan una
posición clonada de S. bulbocastanum del cual derivó el gen blb2 RPI-gen, el cual cuando se
presenta en papa confiere una amplia resistencia al P. infestans. El gen RPI-blb2 fue
inicialmente mapeado en varias poblaciones de retrocruzamientos de tetraploides, derivados
de un complejo de hibridos interespecíficos con alta resistencia denominado ABPT (un
acrónimo de cuatro especies de Solanum: S. acaule, S. bulbocastanum, S. phureja y S.
tuberosum), en la misma región del cromosoma VI como el gen Mi-1 de tomate, que confiere
resistencia a nematodos, pulgones y mosca blanca. Los marcadores ligados a QTLs que
controlan caracteres de interés, posibilitan la selección asistida por marcadores moleculares
(SAM).
Sin embargo, si el mapa contiene solo pocos marcadores, la distancia genética existente
entre el marcador y el QTL es en muchos casos insuficiente para que este marcador permita
un buen diagnóstico del carácter. Con el objeto de resolver esta situación, es conveniente
desarrollar mapas de ligamiento genético de alta densidad, para poder disponer de marcadores
moleculares física y estrechamente ligados al QTL que controle el carácter de interés (Ritter
et al. 2004).
1.12.5. Genotipado de QTA
Independiente del modelo particular del análisis de QTL, la estrategia clásica para la
detección de genes que influyen en un carácter cuantitativo consiste en: a) establecer
progenies apropiadas a partir de cruzamientos, b) la construcción de mapas genéticos basados
en marcadores moleculares en estas progenies y c) en la realización de un análisis estadístico
de QTLs (Leonards-Schippers et al. 1994).
Esta estrategia representa una tarea laboriosa sobre todo si se quiere procesar varias
progenies a su vez. Con el fin de ahorrar trabajo para el análisis de QTLs en diferentes
progenies se podrían analizan únicamente aquellas posiciones genómicas de QTLs para
resistencia a P. infestans que se hayan publicado previamente. Para ello los SSRs son
24
marcadores ideales, ya que son altamente polimórficos, muestran una herencia codominante y
sobre todo mapean en diferentes entornos genéticos a posiciones genómicas idénticas. En el
caso de la papa ya existe un mapa denso de SSRs que cubre todo el genoma (Milbourne et al.
1998). Esto permite determinar los QTLs y sus posiciones genómicas en los diferentes
parentales de las progenies, así como obtener directamente marcadores (aquí alelos de SSRs)
para la selección asistida en los programas de mejora genética.
La estrategia que denominamos QTA genotyping (Quantitative trait allele genotyping)

también se ha empleado en el presente trabajo, utilizando varias progenies con diferentes
parentales como fuentes de resistencia a P.infestans (entornos genéticos diferentes).
1.12.6. Identificación e integración de genes candidato
Tradicionalmente, los marcadores empleados para el mapeo de ligamiento y análisis de

QTL fueron marcadores neutrales e identificaban DNA genómico en general. Pueden estar
más o menos vinculados a un alelo de QTL y su configuración depende de los antecedentes
genéticos particulares. Por lo tanto, sería conveniente para detectar directamente los genes que
influyen en un carácter de interés para analizar y comparar los efectos de sus diferentes alelos.
Estos tipos de marcadores podrían ser aplicados directamente en la selección asistida por
marcadores moleculares con ayuda de la selección, independiente de los antecedentes
genéticos y son útiles para establecer mapas funcionales.
Los genes candidato, son los genes conocidos o sospechosos de tener un papel funcional
en la expresión fenotípica de un rasgo que co-localiza con QTL para el mismo carácter
(Pflieger et al, 2001). A este tipo de marcadores pertenecen los CAPS (Cleaved Amplified
Polymorphic Sequence, Secuencia polimórfica amplificada y cortada) descritos por
Konieczny y Ausbel (1993). Los fragmentos amplificados se someten a una restricción
enzimática y se migra en un gel de agarosa, para detectar polimorfismo, después de una
amplificación de PCR (Nuez y Carrillo 2000). Las variaciones se detectan por presencia o
ausencia de sitios de restricción. Se pueden así localizar cambios finos en una zona específica.
Se trata de un marcador ampliamente utilizado, sobre todo tras la conversión de otros tipos de
marcadores en marcadores de PCR.
Bormann et al. (2004) evaluaron marcadores basados en DNA que se sabe están
vinculadas a loci de resistencia del patógeno en dos familias tetraploides de papa. En el CIP,
Kreuze et al. (2006, no publicado) evaluó en la población PCC1 algunos de estos genes
25
candidatos que fueron objeto en el cromosoma XI y encontró alta asociación con la resistencia
a P. infestans. Además, Manosalva et al. (2000) evaluaron los marcadores correspondientes a
la planta de genes de defensa a través de la vinculación con el desequilibrio cuantitativo de
resistencia a P.infestans en una población diploide y tetraploide mapeadas. Algunos de estos
genes resultaron estar asociados con QTLs y basado en PCR marcadores de osmotina y genes
STH para PCR, mostró una asociación significativa con la resistencia. Kreuze et al. (2006, no
publicado), diseño primers utilizando secuencias de BAC- finales sobre la base de secuencias
del marcador NL27 (Marczewski et al. 2001) y ambos se relacionaron con resistencia a P.
infestans en la población PCC1.
Trujillo (2004), reportó cuatro marcadores provenientes de AFLPs, ligados a QTL de tbr
en el cromosoma XII. Estos fueron convertidos en marcadores de secuencia específica para
facilitar su detección en poblaciones segregantes.
Otros genes candidatos desarrollados se obtuvieron a través de análisis transcripcional

utilizando microarrays de cDNA y la mayoría está relacionada con el metabolismo, defensa
de la planta, señalización y regulación de la transcripción, envueltos todos con el proceso de
defensa de las plantas como respuesta a patógenos. Así por ejemplo, Hernández et al. (2008)
utilizó cDNA-AFLP diferenciales para detectar cDNAs que se expresan en forma diferencial
después de una inoculación con P. infestans y posteriormente se ha analizado su significado
biológico. Además, realizaron un ensayo de microarrays para detectar genes de respuesta o de
resistencia a la infección de P. infestans, diseñando cebadores de los genes candidatos
(nuevos o ya conocidos), con el propósito de integrarlos en el mapa de referencia de la
especie. De estos estudios obtuvieron polimorfismos segregantes en el caso de BS2
(TC148920). Este cDNA pudo ser mapeado en un mapa de referencia de papa en el
cromosoma XI. Se observó que este cDNA, esta co-localizado con el QTL Pi-11b.
Tras el diseño de cabadores apropiados basados en sus secuencias estos genes candidatos
se dejan también integrar en un mapa genético si se obtienen productos de amplificación
segregantes. Estos se pueden utilizar igual que los otros marcadores para el mapeo. Si están
asociados a un particular QTL conocido, entonces puede representar un gen candidato
potencial para este carácter.
En el presente trabajo se han utilizado varios marcadores de genes candidatos para

complementar el QTA genotyping con SSRs.
26
1.12.7. Mapas funcionales
Es conveniente unir toda la información con respecto a marcadores de DNA, mapas

genéticos, caracteres cualitativos, QTLs, genes y otra información en un único "mapa
funcional consensuado" (Gebhardt et al. 1999). El volumen de datos que generan los
proyectos genómicos es enorme y es necesario presentar los datos combinados e interpretados
a cualquier usuario con el fin de obtener sinergia y colaboración complementaria entre
diferentes grupos de investigación. Para maximizar la difusión de resultados y estimular la
explotación de los recursos generados es necesario establecer una base de datos en Internet
con amplias opciones de búsqueda.
En nuestro trabajo hemos utilizado varias de estas bases de datos en Internet para recabar
información sobre marcadores y genes y QTLs de resistencia a P. infestans.
27
2. Objetivos
28
El presente trabajo de investigación se planteó con los siguientes objetivos:
¾ Evaluar la resistencia a P. infestans en follaje y tubérculo en cinco progenies de papa

obtenidas de cruzamientos interespecíficos entre especies silvestres (oka, can, buk,
jam, rap) y especies cultivadas (phu, gon y un dihaploide de tbr).
¾ Identificar marcadores discriminatorios para genes de resistencia a P. infestans

aplicando como estrategia de “genotipado de QTA” (QTA genotyping) utilizando
SSRs ligados a QTLs conocidos de resistencia a P. infestans en las diferentes
progenies.
¾ Evaluación de marcadores y genes candidatos conocidos de resistencia a P. infestans

en algunas progenies.
29
3. Materiales y métodos
30
3.1. Resistencia a tizón en follaje
Los estudios de resistencia fueron realizados en las instalaciones de la Fundación para la

Promoción e Investigación de Productos Andinos (PROINPA) en Cochabamba, Bolivia y en
Neiker Tecnalia, Vitoria-Gasteiz, España.
3.1.1. Material vegetal y preparación
En el marco del proyecto europeo FOOD-CT-2005-513959 (Bioexploit) y BMZ-CIP, se

obtuvo semilla sexual de familias de cruzamientos entre especies silvestres diploides
S.okadae, S. canacense, S. bukasovii, S. jamesii (oka 498063.6, can 310956.8, buk 210042.5,
jam 27521.48 y rap 636) y cultivadas diploides S. phureja, S. goniocalyx (phu 81ccc, gon CIP
703354 y H88.31/34 (dihaploide de Solanum tuberosum). Todas ellas conservadas en el
Banco de Germoplasma de Raíces y Tubérculos Andinos de la Fundación PROINPA en
Bolivia y una de ellas (H88.31/34 x rap 636) obtenida en NEIKER derivada del programa de
mejora genética de papa (Tabla 1). Las especies silvestres utilizadas en la presente
investigación, fueron estudiadas y caracterizadas como nuevas fuentes de resistencia a P.
infestans en estudios previos (Colque 1996, Estrada 2000).
Tabla 1. Parentales y progenies de cruzamiento entre especies silvestres (Solanum okadae,

S. canasense, S. bukasovii, S. jamesii y S. raphanifolium) con especies cultivadas
diploides (S. phureja y S. goniocalyx) y un dihaploide de S. tuberosum.
Genealogía No. genotipos
evaluados
Código
Hembra Macho
experimental
C oka 498063.6 phu 4238.1 (81 ccc) 50
D can 310956.8 gon 60324/41 (CIP 703354) 83
E buk 210042.5 phu 4238.1 (81 ccc) 66
G jam 27521.48 gon 60324/41 (CIP 703354) 72
N H88.31/34 rap 636 96
Total 367
oka = S. okadae, can = S. canasense, buk = S. bucasovii, jam = S. jamesii, phu = S. phureja,
gon = S. goniocalyx, rap = S. raphanifolium, H88.31/34 = Dihaploide de S. tuberosum (dih
tbr)
Antes de la siembra se sumergió la semilla sexual (TPS) en una solución de ácido

giberélico a 1.500 ppm, (disolviéndose 0,75 g en medio litro de agua destilada esterilizada)
por 24 horas, con el propósito de romper la dormancia y uniformizar la germinación.
31
Tras secar la semilla, fueron sembrados en bandejas de almácigo utilizando sustrato de

musgo, arena, tierra en una proporción 2:1:1. Se sembró 100 TPS/cruza y se regaron los
almácigos tres veces al día. Al mes las plantas fueron trasplantadas a macetas de 500 g para su
crecimiento, con el mismo tipo de sustrato esterilizado.
3.1.2. Aislados de P. infestans
Una vez que se presentó la enfermedad en parcelas de agricultores en la zona de

Chullchunq’ani en Cochabamba, Bolivia, se recolectaron hojas de papa, infectadas con tizón
de variedades cultivadas en la zona. Las hojas fueron recolectadas en bolsas de plástico,
teniendo el cuidado de no tocarlas con las manos. Se guardaron en una caja tecnopor, con
hielo, para asegurar que las muestras se conserven en buen estado, hasta su procesamiento en
laboratorio.
Plata (1998), Colque (1996) y Gabriel et al. (2007) indicaron que la raza de P. infestans
de la zona de Chullunq’ani (en Cochabamba, Bolivia) es del tipo de apareamiento A2, es
compleja, agresiva y tiene diez genes de virulencia (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11). El patrón de
virulencia del aislamiento fue verificado utilizando el set internacional de 11 diferenciales
cultivados (Tabla 2).
Tabla 2. Set internacional de diferenciales cultivados utilizados para verificar el patrón

de virulencia del aislamiento de Chullchunqani.
Diferenciales Genes mayores
702514 (Chata Blanca) R

800986 R1
800987 R2
800988 R3
800989 R4
800990 R5
800991 R6
800992 R7
800993 R8
800994 R8
800995 R10
800996 R11
800997 R1R2
800998 R1R3
800999 R1R4
801000 R2R3
801001 R2R4
801002 R3R4
801003 R1R2R3
801004 R1R2R4
801005 R2R3R4
800979 R1R2R3R4
32
La figura 10 muestra la expresión de los síntomas de tizón en foliolos sueltos de

diferenciales de raza de papa con diferentes niveles de expresión de la resistencia.
RP S h
Figura 10. Expresión de síntomas de tizón en foliolos de variedades de papa con

diferentes niveles de expresión de resistencia : RP = Resistencia parcial
(Isquierda), S = susceptibilidad (centro) , h = hipesensibilidad (derecha).
(Foto: Giovanna Plata)
3.1.3. Preparación de foliolos
Se prepararon placas Petri con agar-agua, de acuerdo a lo requerido para cada caso con
un total de dos placas para cada genotipo. El experimento se realizó con un total de 742 placas
Petri de las cinco progenies y cuatro parentales.
Los foliolos se recolectaron en invernadero antes de las 9:00 a.m., previo riego de las
plantas para que estuvieran turgentes. Los foliolos fueron recolectados en bolsas plásticas,
previamente identificadas, se tomaron hojas del tercio superior de la planta; se desinfestaron
con hipoclorito de sodio al l% (v/v) durante un minuto, se enjuagó en agua destilada estéril y
se secó cuidadosamente con papel toalla. Una vez secos se depositaron en las placas Petri con
agar-agua invertidas, con el envés hacia arriba e identificadas. Finalmente las placas
conteniendo los foliolos, fueron dispuestas en un estante de crecimiento, con iluminación
artificial con temperatura ambiental promedio de 18 ºC.
3.1.4. Preparación de inoculo
En la cámara de flujo laminar se lavó cada foliolo recolectado de campo con la ayuda de
un bastoncillo y agua destilada estéril. La solución obtenida se filtró a través de una gasa,
luego por un filtro de 30µ y finalmente por un filtro de 10µ, dejando en el filtro de 10µ
aproximadamente 3-5 ml de solución, que se transfirió a un vaso de precipitación de 200 ml
estéril, con la ayuda de una pipeta Pasteur.
33
La concentración de esporangios/ml, se determinó con ayuda de un hematocímetro (Fig.

11). Si la solución era demasiado concentrada, se diluyó con agua destilada estéril, hasta
alcanzar la concentración requerida. Plata (1998) y Gabriel et al. (2007) encontraron que la
concentración apropiada para evaluar componentes de resistencia al tizón es de 20.000
esporangios/ml. Tras contar los esporangios se calculó la concentración empleando la
siguiente relación, recomendada por French y Herbert (1982):
Concentración = Σ(A+B+C+D+E) x 2000 = esporangios/ml
donde:
A, B, C, D = Campos de contaje del hematocímetro
Figura 11. Hematocímetro, empleado para la determinación de la concentración del inoculo
Una vez obtenida la concentración de 20.000 esporangios/ml, el vaso de precipitación

con inoculo fue colocado en una caja de tecnopor a una temperatura de 8-12ºC durante dos
horas para que los esporangios germinen y liberen las zoosporas.
3.1.5. Inoculación
Después de preparar el inoculo se procedió a inocular todos los foliolos, colocando una
gota de 20-25 µl a ambos lados de la nervadura central de cada folíolo, agitando la suspensión
entre foliolo y foliolo inoculado. En las placas que sirvieron de testigos se colocó gotas de 20-
25 µl de agua destilada estéril. Las placas fueron colocadas en un estante de crecimiento para
suministrar la luz y temperatura adecuada para el desarrollo del tizón (Fig. 12).
34
Figura 12. Estante de crecimiento con las cajas Petri con agar-agua, conteniendo los foliolos
desinfestados (Foto: Julio Gabriel).
3.1.6. Diseño experimental
Para evaluar la resistencia en invernadero y laboratorio, se distribuyeron cuatro foliolos

sueltos por genotipo en diseño completamente aleatorizado (1484 foliolos). Los foliolos
fueron depositados en placas Petri (dos foliolos por placa). Con un total de 742 placas Petri
de 10 cm de diámetro (cuatro foliolos/dos placas). Se evaluaron 371 genotipos de los
cruzamientos C, D, E, G y N y de los padres gon, phu, can, jam y rap (Tabla 1)
3.2. Variables de respuesta y análisis estadístico
3.2.1. Intensidad de Esporulación (IE)
Al 5º, 6º y 7º día después de la inoculación (ddi) se evaluó el porcentaje de área

necrosada (esporulación), considerando a cada foliolo como 100 %, tal como recomienda
Gabriel et al. (2007).
3.2.2. Área bajo la Curva de Progreso de P. infestans (ABCPPI)
El ABCPPI total se determinó en porcentaje de daño-día con la formula desarrollada por

Shanner y Finney (1977) y Cambell y Madden (1990). Se consideraron dos factores: 1)
Factor tiempo de evaluación y 2) Factor familia (cruzamiento). El modelo matemático
utilizado fue el siguiente:
35
ABCPPI = Σn ((yi+1 + yi )/2* (ti+1 –ti)
donde:
ABCPPI = Área Bajo La Curva de Progreso de Phytophthora infestans, tiene unidades

de porcentaje-día
n = Número de evaluaciones
yi = Intensidad de esporulación (IE) en la fecha i (altura de un rectángulo,
estimado como el punto medio entre (yi+1 + yi ).
(ti+1 –ti) = Tiempo en días transcurridos entre la observación yi y yi+1
El valor de ABCPPI se estimó en base a los valores obtenidos de la IE. El ABCPPI es

una expresión o medida de avance de la enfermedad o incremento de daño de la enfermedad
en el tiempo (porcentaje-días). Para que las familias sean estadísticamente comparables, se
cálculo el Area Bajo la Curva de Progreso de P. infestans relativa (ABCPPIrel), dividiendo el
ABCPPI total entre el área máxima alcanzada (Bonierbale et al. 2008) y se transformó a raíz
cuadrada empleando el factor √ X + 1, para ajustar a una curva normal.
Los análisis de varianza y la comparación de medias fueron realizados utilizando el Proc

GLM del SAS para cada una de las variables evaluadas (SAS Users Guide 1998). Pero para la
interpretación de los análisis, se consideraron las medias reales del ABCPPIrel.
3.3. Evaluación de la resistencia en tubérculos
Fueron seleccionados cuatro tubérculos sanos de cada genotipo, uno de los tubérculos fue
empleado como testigo que fue inoculado con agua destilada estéril. En tres tubérculos se
efectuaron heridas con un estilete esterilizado. Los tubérculos fueron dispuestos sobre una
rejilla dentro una caja previamente esterilizada donde se colocó papel secante que era mojada
dos veces al día para conservar la humedad adecuada para la propagación del patógeno (Fig.
13).
36
Figura 13. Evaluación de resistencia en tubérculos (Foto: Julio Gabriel)
La concentración de esporangios/ml, se determinó con ayuda de un hematocímetro. Si la

solución era demasiado concentrada, se diluyó con agua destilada estéril, hasta alcanzar la
concentración requerida de 20.000 esporangios/ml.
3.3.1. Diseño experimental
Para evaluar la resistencia de tubérculos en laboratorio, se distribuyeron cuatro tubérculos

por genotipo en diseño completamente aleatorizado (Martinez-Garza 1988). Los tubérculos
fueron alojados en cajas húmedas y se evaluaron 294 genotipos de los cruzamientos C, D, E,
G y N (Tabla 3).
Tabla 3. Número de individuos de la familias C, D, E, G y N, evaluados por su resistencia

en tubérculos.
Genealogía No. genotipos
evaluados
Código
Hembra Macho
experimental
C oka 498063.6 phu 4238.1 (81 ccc) 42
D can 310956.8 gon 60324/41 (CIP 703354) 68
E buk 210042.5 phu 4238.1 (81 ccc) 68
G jam 27521.48 gon 60324/41 (CIP 703354) 58
N H88.31/34 rap 636 58
Total 294
oka = S. okadae, can = S. canasense, buk = S. bucasovi, jam = S. jamesii, phu = S. phureja,
gon = S. goniocalyx, rap = S. raphanifolium, H88.31/34 = Dihaploide S. tuberosum (dih tbr)
3.3.2. Aislados de P. infestans
Una vez que se presentó la enfermedad en parcelas de agricultores en la zona de Corani

Pampa en Cochabamba, Bolivia, se recolectaron hojas de papa, infectadas con tizón de
37
variedades cultivadas en la zona. Las hojas fueron recolectadas en bolsa plástica, teniendo el
cuidado de no tocarlas con las manos. Se guardaron en una caja tecnopor, con hielo, para
asegurar que las muestras se conserven en buen estado, hasta su procesamiento en laboratorio.
La raza de P. infestans de la zona de Corani Pampa (en Cochabamba, Bolivia) es del tipo
de apareamiento A2 (Colque 1996), es compleja, agresiva y tiene nueve genes de virulencia
(1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 11).
3.3.3. Preparación de tubérculos
Los tubérculos se recolectaron en el invernadero temprano . Posteriormente fueron

llevados a laboratorio y se desinfestaron con hipoclorito de sodio al l% (v/v) durante un
minuto, se enjuagó en agua destilada estéril y se secó cuidadosamente con papel toalla. Una
vez secos, cada tubérculo fue herido, en un patrón regular, y luego fueron dispuestos en cajas,
sobre una rejilla que tenía en el fondo papel toalla húmedo.
3.3.4. Preparación de inoculo
Una vez obtenida la concentración de 20.000 esporangios/ml. Cada vaso de precipitación

con inoculo fue colocado en una caja de tecnopor a una temperatura de 8-12ºC durante dos
horas para que los esporangios germinen y liberen las zoosporas. Tras esta operación el
inoculo estaba listo para su aplicación en los tubérculos.
3.3.5. Inoculación
Previo a la inoculación se hicieron heridas a los cuatro tubérculos y luego se asperjo cada
genotipo con 30 ml de inoculo. Para este proceso se emplearon cámaras húmedas.
3.4. Variables de respuesta y análisis estadístico
Para la evaluación de la resistencia, se estimó el porcentaje de la superficie infectada,

empleando una escala porcentual que va de 0 a 100% de tubérculo infectado a los 8, 11 y 14
días después de la inoculación. Con estos datos posteriormente se obtuvo un promedio de
porcentaje de infección de tubérculo por genotipo para hacer los análisis de resistencia.
Finalmente se realizó un análisis de correlación de Pearson de la resistencia a P. infestans

de hoja y tubérculo en las cinco progenies de papa estudiadas.
38
3.5. Obtención del mapa de referencia para el genotipado de QTA (QTA-genotyping)
Como mapa de referencia para el QTA-genotiping se utilizó el mapa ultradenso de papa

elaborado por Isidore et al. (2003) y van Os et al. (2006) y el desarrollado por varios socios
en el marco del proyecto Europeo APHOPHIS (QRLT-2001-01849).
En este mapa se integraron todos los QTLs y genes publicados para resistencia a P.
infestans como los SSRs de Milbourne et al. (1998). más cercanos a estos loci. A parte de los
SSR mencionados se ubicaron otros marcadores y genes candidato de resistencia a P.
infestans conocidos para el genotipado de QTA (QTA-genotyping).
3.5.1. QTLs y genes de resistencia conocidos para el análisis por SSRs ligados
Para el genotipado de QTA se ubicaron los QTLs y genes de resistencia a P. infestans

que se expresan en la Tabla 4.
Leonards-Schippers et al. (1994) y Trognitz et al. (2002) reportaron la presencia del los
QTL/genes Pi-7 para resistencia a P. infestans en el cromosoma III. En el cromosoma V
Collins et al. (1999) reportó la presencia del QTL/gen PIFT-5d.
Oberhagemann et al. (1999) y Leonards-Schippers et al. (1994) reportaron en el

cromosoma VI un QTL (Pi-6b), asociado con el resistencia a P. infestans. En el cromosoma
X, Ewing et al. (2000) reportó en el cromosoma X el QTL Rber involucrado en resistencia a
P. infestans. Gebhardt y Valkonen (2001) detectaron dos clusters en el cromosoma V, uno
para la resistencia a P. infestans y otro para PVX, que previamente fueron observados por en
sus estudios sobre la organización de genes R y QTLs en papa. El cluster formado por tres
genes que confieren resistencia vertical a P. infestans observado en el cromosoma XI y en el
cromosoma IV, posteriormente los mismos autores re-detectaron otro cluster compuesto por
el gen R2 y un QTL para el mismo carácter.
En el cromosoma IV, el gen R2 que confiere resistencia vertical a varias razas de P.

infestans se asoció con un QTL de resistencia. En el cromosoma XI, se identificó un cluster
formado por tres genes que confieren resistencia monogénica a P. infestans, R3, R6 y R7. A
su vez, en el cromosoma V, observó que el gen R1, que confiere resistencia vertical a varias
razas de este patógeno, se localizó junto a dos QTLs diferentes para esta resistencia.
Las zonas del genoma más evidentes, donde se congregan múltiples genes R y
resistencias cuantitativas a diferentes patógenos, principalmente compuestos por QTLs de
39
resistencia para P. infestans, nematodos del quiste de la papa (G. pallida y G. rostoquiensis),
y E. carotovora, se mostraron en los cromosomas V, XI, y XII (Gebhardt y Valkonen 2001).
Oberhagemann et al. (1999) y Trognitz et al. (2002) encontraron en el cromosoma III,

QTls Pi3c, d. asociado con la resistencia a P.infestans, en el cromosoma VII observaron el
QTL FB-6 que confiere resistencia a P. infestans. Finalmente observaron la presencia del
QTL Pi-7b, que está involucrado en la resistencia a P. infestans.
40
Tabla 4. QTLs y genes de resistencia a tizón (P.infestans) recopilados en los 12

cromosomas, intervalo de marcadores flanqueantes (MF) para cada QTL/gen
y la respectiva referencia bibliográfica.
Nº Crom Gen/QTL MF Referencia
1 I Pi-1 CP11 Oberhagemann et al. 1999
2 II Pi-2 GP23 Oberhagemann et al. 1999
3 Pi-3 GP26 Oberhagemann et al. 1999
4 Pi-3 rbcS2-GP504 Oberhagemann et al. 1999
5 III FB-1 GP25 Collins et al, 1999
Leonards-Schippers et al. 1994
7 Pi-5 TG135 Ewing et al. 2000
9 Pi-7 4CL Leonards-Schippers et al. 1994
Trognitz et al. 2002
10 Pi-4-1 GP180 Oberhagemann et al. 1999 ;
11 Pi-4-2 TG123-TG62 Oberhagemann et al. 1999
12 IV Pi-4b Stm3016 Milbourne et al, 1998
13 R2 TG123-TG22 Li et al. 1998
14 V PiFTve-5a GP21 Collins et al. 1999
15 PiFTve-5b Stpto Collins et al. 1999
16 PiFTve-5c GP179 Collins et al. 1999
17 PiFTve-5d GP21-GP179 Collins et al. 1999
18 PiFTve-5ª GP21 Collins et al. 1999
30 Pi-5a GP21, GP179 Zimnoch-Guzowskaa et al. 2000 ; Leonards-
Schippers et al. 1994
31 Pi-5b CP113 Oberhagemann et al. 1999
32 VI Pi-6a GP79 Oberhagemann et al. 1999
33 Pi-6b GP76 Oberhagemann et al. 1999 ; Leonards-Schippers et
al. 1994
34 FB-6 STM1100 Collins et al., 1999
35 VII Pi-7a GP127-AGPaseB(a) Oberhagemann et al. 1999
36 Pi-7b CP134(b) Oberhagemann et al. 1999

37 VIII E-5 STM1056 Collins et al. 1999
38 E-6 STM1024 Collins et al. 1999
39 Pi-8 GbssI(wx), Osm Oberhagemann et al.1999
Trognitz et al. 2002
40 Rblc CP53 Naess et al. 2000
41 IX Pi-9 Prp1, PALa Oberhagemann et al. 1999 ; Leonards-Schippers et
al. 1994
42 X Rber TG63 Ewing et al. 2000
43 XI Pi-11 GP125 Oberhagemann et al. 1999 ; Leonards-Schippers et
al. 1994
44 RP-11 TG105(a), GP185, GP250 El-Kharbotly et al. 1994
45 RP-11 GP185, GP250 El-Kharbotly et al. 1996
46 RP-11 GP185, GP250 El-Kharbotly et al. 1996
47 Pi-19 GP185, GP250 Oberhagemann et al. 1999
48 XII Pi-12 GP34 Ghislain et al. 2001
49 Pi-12 GP34, CP60 Oberhagemann et al. 1999
Crom = cromosoma; MF = marcadores flanqueantes
41
3.5.2. Proyección de QTLs, genes y SSRs
Para la recopilación de los QTLs/genes conocidos en papa se utilizaron las publicaciones

citadas en la Tabla 4 y bases de datos: Gabi (Pomamo database) y Solgene (USDA-ARS). Se
anotaron la posición de cada QTL/gen recopilado, los marcadores flanqueantes al QTL/gen y
la posición de estos en el mapa de origen.
Para integrar los QTLs/genes recopilados dentro de un bin determinado del mapa ultra
denso se utilizó la proyección coseno tal como describe Ritter et al. (1990) y Ritter y Salamini
(1996). Este método está basado en la distancia relativa de ese QTL/gen en cuestión, con
respecto a un intervalo común en diferentes mapas, asumiendo que la frecuencia de
recombinación en esta zona es la misma en las poblaciones comparadas. Los cálculos de este
método se basan en el teorema de los triángulos rectángulos (Figura 14).
M2r
Cosα=c/a
Mapa R
Cosα=d/b Dr
b
Xr
a
a/b=c/d M1r α
α
c
M1p Xp? M2p
d
Dp
Mapa P
Fuente: Sánchez (2006)
Figura 14. Teorema de los triángulos rectángulos (izquierda) aplicado a la proyección de

marcadores y QTLs (derecha).
R: Referencia, P: Proyección, M1r y M2r: Posiciones de los marcadores comunes flanqueantes al QTL en el
mapa de referencia, Xr: posición del QTL en el mapa de referencia, M1p y M2p: Posiciones de los marcadores
comunes flanqueantes al QTL en el mapa de proyección, Xp: posición del QTL en el mapa de proyección, Dr:
distancia correspondiente al intervalo común en el mapa de referencia (M2r-M1r), Dp: distancia correspondiente
al intervalo común en el mapa de proyección (M2p-M1p).
Dependiendo de los datos disponibles en los mapas genéticos utilizados, se hicieron tres
casos de proyecciones. En la Figura 15 se pueden observar las diferentes situaciones
analizadas. En los casos A y B se dispuso de dos marcadores comunes en el mapa de
proyección y en el mapa de referencia. Sin embargo, en el caso C, se detectó sólo un
marcador común en ambos mapas.
Se aplicó la equivalencia de los triángulos rectángulos y se obtuvo la siguiente relación

(Figura 14).
42
Xp=Abs[M1p+(Xr-M1r)*Dp/Dr] (1)
Siendo Xp: posición del QTL en el mapa de proyección; M1p: posición del marcador
común flanqueante al QTL en el mapa de proyección; Xr: posición del QTL en el mapa de
referencia; M1r: posición del marcador común flanqueante al QTL en el mapa de referencia;
Dp: distancia correspondiente al intervalo común en el mapa de proyección (M2p-M1p); Dr:
distancia correspondiente al intervalo común en el mapa de referencia (M2r-M1r).
A) B) C)
Xp? M1r
Xr M1p
M1p M1p Xr
M1r M1r Xp?
Xr Xp?
M2r M2r M2p

M2p
Mapa R Mapa P Mapa R Mapa P Mapa R Mapa P
Figura 15. Diferentes casos de proyección A) Cuando dos marcadores (Mi) comunes flanqueantes al QTL están
disponibles en el mapa de proyección (P) y en el mapa de referencia (R), con posiciones M1p, M1r y
M2p, M2r. B) Cuando dos marcadores (Mi) comunes adyacentes están disponibles en el mapa de
proyección (P) y en el mapa de referencia (R), con posiciones M1p, M1r y M2p, M2r. C) Cuando
sólo un marcador común (Mi) está disponible en el mapa de proyección (P) y en el mapa de
referencia (R), con posiciones M1p, M1r y M1r se sitúa a menos de 10cM de Xr.
La ecuación (1) no sólo se aplicó para la proyección de QTLs/genes, también fue útil para
la proyección de marcadores indirectos utilizados en el proceso de proyección de QTLs/genes.
Para las proyecciones de tipo C (Figura 15), si la posición del marcador común en el
mapa de referencia (M1r) se localizaba a una distancia relativamente cercana al QTL/gen
(menor de 10 cM) la proyección fue directa aplicando la siguiente relación
Xp= Abs [M1p+(Xr-M1r)] (2)

Siendo Xp: posición del QTL en el mapa de proyección; M1p: posición del marcador
común en el mapa de proyección; Xr: posición del QTL en el mapa de referencia; M1r:
posición del marcador común en el mapa de referencia.
Además, en todos los tipos de proyección, a la hora de alinear mapas, fueron

consideradas las cinco inversiones paracéntricas conocidas entre el mapa de papa y tomate
(Tanksley et al. 1992). Por ello, en algunos casos, el cromosoma completo y en otros, parte
43
del brazo del cromosoma, tuvo que ser invertido para conseguir una orientación idéntica en
diferentes mapas. Las inversiones fueron consideradas utilizando la fórmula:
Xi=Ia+Ib-X (3)
Donde: Xi es la posición del marcador invertido X, mientras que Ia e Ib representa el

comienzo y el final de la inversión, respectivamente.
Las posiciones de los QTLs/genes y marcadores en otros mapas se expresan

generalmente en unidades de cM. Para la proyección al mapa UHD, éstas se convirtieron en
bins. Un bin representa un patrón de expresión de un fragmento (presencia/ausencia) en los
genotipos de la población de mapeo del mapa UHD. En general, un bin corresponde a 0,8 cM,
ya que la distancia mínima entre dos bins adyacentes es una recombinación, en un genotipo
específico.
En el proceso de proyección de QTLs/genes y marcadores moleculares se utilizaron los

siguientes mapas genéticos:
a) El mapa ultra denso de papa (Isidore et al. 2004, van Os et al. 2006). Este mapa, a parte de
los 10.000 marcadores AFLPs, contiene 40 marcadores RFLPs y SSRs que se utilizaron
como marcadores directos. Por otro lado, este mapa está alineado con el mapa de tomate
(Tanksley et al. 1992) mediante sondas RFLPs.
b) El mapa de papa de Caromel et al. (2003) obtenido en una población de S. tuberosum x S.

spegazzinii. De este mapa se utilizaron por una parte, 40 marcadores semi-directos, que
también están localizados en los bins del mapa UHD. Estos marcadores posibilitaron el
anclaje de ambos mapas. Por otra parte, este mapa contiene 66 marcadores, generalmente
RFLPs de tomate (marcadores indirectos) mapeados a su vez en el mapa (c).
c) El mapa de tomate (Tanksley et al. 1992), cuenta con 66 marcadores comunes al mapa de
papa de Caromel et al. (2003) que posibilitaron su anclaje.
d) El mapa de papa de la base de datos Gabi (Pomamo), disponible en la página web

https://gabi.rzpd.de/projects/Pomamo. Contiene unos 865 marcadores de los cuales 30 son
de tomate y permitieron relacionar este mapa con el (c).
44
e) El mapa de SSRs de Milbourne et al. (1998) que contiene marcadores RFLPs mapeados
también en el mapa de papa de la base de datos Gabi (Pomamo) y sondas de tomate. Este
mapa pudo ser anclado al mapa (c) y (d).
f) Los mapas involucrados en las publicaciones de los QTLs/genes. Estos mapas fueron
relacionados con algún mapa de los anteriormente mencionados por medio de los
marcadores adyacentes al QTL.
Con objeto de incrementar el número de marcadores proyectables, se consideró que los

mapas a, b, c y d estaban altamente saturados debido al número de marcadores que tenían. De
esta forma, los marcadores distales de cada cromosoma y de cada mapa se localizaron en el
cebador (primer) y último bin del mapa UHD, respectivamente.
El proceso de proyección siguió el esquema general que se describe en la Figura 16. Se

partió del modelo de que en el mapa de estudio el QTL está flanqueado por los marcadores
M1 y M2, se pueden distinguir tres casos de proyección. Ambos, sólo uno o ninguno de los
marcadores flanquentes pueden estar presentes en el mapa UHD (marcadores directos), por lo
que, aparte de proyectar el QTL y dependiendo del caso, también tuvieron que ser
proyectados individualmente en el mapa UHD los marcadores indirectos.
En la mayoría de los casos no existían marcadores directos, y previamente a la

proyección del QTL/gen se realizaron múltiples proyecciones a través de los diferentes mapas
numerados anteriormente, hasta conseguir la localización de M1 y M2 en el mapa UHD y
finalmente proyectar el QTL/gen (proyecciones indirectas).
QTL
M1
M2
M1Y M2 SÓLO M1 SÓLO M2 NADA

DISPONIBLES DISPONIBLE DISPONIBLE DISPONIBLE
EN EL MAPA EN EL MAPA EN EL MAPA EN EL MAPA
UHD UHD UHD UHD
PROYECTAR M2 PROYECTAR M1 PROYECTAR M1 Y M2

EN EL MAPA UHD EN EL MAPA UHD EN EL MAPA UHD
PROYECTAR QTL EN EL MAP A UHD
Figura 16. Esquema del proceso general de proyección de QTLs/genes en el mapa UHD donde principalmente
se distinguen tres casos de proyección. M1 y M2 representan la posición de los marcadores
comunes flanqueantes al QTL en el mapa de referencia y en el mapa de proyección.
45
En función de la disponibilidad de los diferentes tipos de marcadores en los distintos

mapas, se distinguieron tres casos de proyección. El diagrama de flujo de toma de decisiones
muestra cada caso (Figura 17).
En el caso de que MI (marcador flanqueante de referencia MI; I = 1 ó 2) fueran sondas de

tomate presentes en el mapa de tomate (Tanksley et al. 1992), se proyectaron al mapa UHD a
través del mapa de papa de Caromel et al. (2003) (Figura 17 Caso 1).
En el caso de que MI fueran sondas de papa presentes en el mapa de papa de Caromel et

al. (2003) se proyectaron directamente en el mapa UHD. En el caso contrario, los MI se
proyectaron al mapa de tomate (Tanksley et al. 1992) y se prosiguió como en el caso 1
(Figura 17 Caso 2).
En el caso de que los MI fueran SSRs presentes en el mapa de Milbourne et al. (1998), se
proyectaron al mapa de papa de la base de datos Gaby (Pomamo) y se prosiguió como se
describe en el caso 2 (Figura 17 Caso 3).
Caso 1 Caso 2 Caso 3
RFLP de tomate en RFLP de patata en SSRs en el mapa

el mapa UHD? el mapa UHD? UHD?
SI Posición SI Posición SI Posición

NO directa NO directa NO directa
RFLP de tomate en el mapa de RFLP de patata en el mapa de SSRs en el mapa de Milbourne et

patata de Caromel et al. (2003)? patata de Caromel et al. (2003)? al. (1998)?
SI Proyección en SI Proyección en SI Buscar

NO el mapa UHD NO el mapa UHD NO intervalo
común en
elmapa de
RFLP de tomate en el mapa de RFLP de patata en el mapa de No es Gabi y
tomate de Tanksley et al.,1992? (1) Gabi? (2) posible continuar en (2)
proyectar
Buscar Buscar
SI intervalo SI intervalo
NO común en el NO común en el
mapa INRA mapa INRA
No es No es
posible Proyección en posible
proyectar proyectar SI
el mapa INRA NO
Proyección en
Proyección en el mapa de Buscar
el mapa UHD patata de intervalo
Caromel et al. común en el
(2003) mapa tomate
de Tanksley
et al.,1992 y
Proyección en continuar en
el mapa UHD (1)
Figura 17. Diagrama de flujo de toma de decisiones que muestra los 3 casos de proyección en función de que
MI (posiciones de los marcadores comunes flanqueantes al QTL en el mapa de referencia, I = 1 ó 2)
sean sondas de tomate (caso 1), sondas de papa (caso 2) o SSRs (caso 3).
3.5.3. Otros marcadores y genes utilizados para el QTA-genotyping
También se han utilizado otros marcadores para realizar el genotipado de QTA, los
mismos que se describen en la Tabla 5. Estos fueron sugeridos y recomendados por el CIP
[Gonzáles et al. 2007 (no publicado)].
46
Tabla 5. Otros marcadores utilizados para el genotipado de QTA.

Nombre Cromosoma Cebador directo Cebador reverso T° A Protocolo
(°C)
Marcadores
SSR
STM5121 XII (PDf,m) CACCGGAATAAGCGGATCT TCTTCCCTTCCATTTGTCA 55 PCR
Genes
candidato
GP125 XI AGCAGCTCTGATGGCAATGC GAGCCTAGCTGCCCAGCTTC 55 CAP1
AGA GTC GTT TTA CCG ACT CAP
NL25 XI TATTGTTAATCGTTACTCCCTC 60
CC
NL27 XI CTCCCGTCCTCCTTATTATTC TGCAGAAGCCTTTACCGAACA 62 CAP
Marcadores
derivado de
AFLPs
E46M42.g XII GATATCTTGGAAAGCCTTAG CTTACAAGGTTGTTGGATG 60 CAP
Genes
candidato
desarrollado a
través de
expresión
diferencial
Hin1-like I (BCT) GCTATGTCCAACTTGAACGG AATCCAACCAATCTTTAGCC 55 PCR
Protein XII (PDm) TTGTGATGTAGAGGATTGTTTC GCATCTTGATTAGTCCGTTTCT 51 PCR

phosphatase-2C
Gen candidato
obtenido por
expresión
diferencial
obtenido por
cDNAs y
Microarrays
Protein BS2 XI (blb8008) GAGAAATGGCATATGCTGCTC TGAGGCGATCAAGTATGGTG 55 PCR
(TC148920)
1
CAP = Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, Secuencia polimórfica amplificada y cortada
La Tabla 6 describe las condiciones de uso de cada CAP, incluyendo las enzimas de
restricción adecuadas para cada caso.
Tabla 6. Condiciones para el uso de los CAPs.
Características GP125 NL 25 NL 27 E46M42.g

T°a CIP 55 60 62 60
T°a MWG 55 60 53 47
Pares de bases 650 700 780 172
Hpa III
Enzima de restricción
Nla III Hpa III Hae III Eco R1
T° incubación 37°C 37°C 37°C 37°C
Tiempo 5 min 5 min 5 min 150 min
T° inactivación 80°C 65°C Fenol/Cloroformo 65°C
Tiempo 5 min 5 min 15 min
47
3.6. Técnicas moleculares
Las técnicas moleculares fueron realizadas en el laboratorio del Departamento de

Biotecnología de NEIKER, en el marco del proyecto FOOD-CT-2005-513959 (Bioexploit).
3.6.1. Extracción de DNA
Se extrajo DNA genómico de genotipos de las poblaciones D, E, G y N. Para las

extracciones se utilizó el kit “DNeasy ® Plant mini” (Qiagen, Izasa S.A. 69106), que incluye
todos los componentes necesarios para la extracción, incluido columnas, buffers y enzimas.
La cantidad de material vegetal fresco de partida fue de aproximadamente 100 mg. Los
foliolos se trituraron hasta convertirlo en polvo con ayuda de nitrógeno líquido,
posteriormente se mezcló vigorosamente con 400 ml de buffer de extracción AP1 que
previamente fue calentado en un baño maría a 65ºC y con 4 µl de RNasa A (100 mg/ml).
Luego se incubó la mezcla 10 min a 65ºC. Se añadieron 130 µl de buffer AP2, se mezcló
mediante vortex y se incubó 5 min en hielo. Pasado este tiempo, la mezcla se centrifugó a
6.000 x g durante 5 min y el sobrenadante se añadió a la columna QIAshredder (color lila).
Esta columna se centrifugó a 6.000 x g durante 2 min. El sobrenadante se transfirió a un tubo
nuevo y añadieron 1,5 volúmenes del Buffer AP3 mezclándose suavemente. Seguidamente, la
mezcla se añadió a una columna Dneasy Mini Spin (color blanco) y se centrifugó 1 min a
4.000 x g. Se descartó la fase líquida del tubo y se añadió sobre la misma columna el resto de
la mezcla repitiéndose la centrifugación. A continuación se añadieron 500 µl de buffer AW
sobre la columna. Se centrifugó durante 1 min a 8.000 rpm y se descartó la fase líquida. La
columna se centrifugó de nuevo para secarse completamente. Finalmente se añadieron 100 µl
de buffer de elución AE precalentado a 65ºC y se incubó 5 min a temperatura ambiente.
Posteriormente, se recuperó el DNA centrifugando la muestra a 6.000 x g durante 1 min. Se
tomó una alícuota de 1µl de la muestra y se visualizó en un gel de agarosa al 1% (p/v) para
comprobar la integridad del DNA.
3.6.2. Cuantificación de ácidos nuecleicos
La cuantificación del DNA se realizó mediante la determinación de la absorvancia a 260

ηm en el espectrofotómetro (eppendorf Biophotometer), lo cual permite el cálculo de la
concentración de los ácidos nucleicos en la muestra. Una DO=1 corresponde
aproximadamente a 50 µg/ml de ADN de doble cadena, 40 µg/mL del ADN de cadena
sencilla y de ARN y 20 µg/ml de oligo nucleótidos de cadena sencilla (Valadez-Moctezuma y
Kahl 2005). La relación entre la lectura de absorbancia a 260 y 280 nm (DO260/280) aporta una
48
estimación de la pureza de los ácidos nuecleicos. Las preparaciones puras del ADN y del
ARN tienen valores que van desde 1.8 a 2.0 a (DO260/280) respectivamente.
La concentración de ADN en la solución se cálculo con la siguiente fórmula:
Concentración de ADN (µg/ml) = [(DO x 100 (factor de disolución) x 50 µg/ml]/1000
3.6.3. Determinación en geles de agarosa
El grado de degradación del DNA fue estimado por la electroforesis de una alícuota de la
muestra en geles de agarosa. El DNA de peso molecular alto apareció como una banda
definida en la parte superior del gel a poca distancia de los pozos, mientras que el material
parcialmente degradado, formó barrido (parecido a una mancha) de fragmentos pequeños a lo
largo del carril haciendo que la definición citada, pierda su nitidez o no se aprecie.
La cantidad de de ácidos nucleicos en la muestra fue estimada comparando el campo

fluorescente de los mismos respecto a la serie de estándares utilizados como el fago lambda.
3.6.4. Análisis de marcadores SSR
Se analizaron 321 genotipos mediante reacciones de PCR utilizando marcadores o

primers (SSRs) específicos diseñados para buscar genes asociados para resistencia a P.
infestans (Tabla 7).
Inicialmente se realizó una pre-selección en un número pequeño de genotipos elegidos al

azar de cada progenie. Tras de observar la segregación en estas se aplicaron los marcadores a
toda la población.
Tabla 7. Número de genotipos analizados mediante reacciones de PCR, utilizando

microsatélites (SSRs).
Familia Genealogia No. Genotipos
evaluados
D can 310956.8 gon (CIP 703354) 89
E buk 210042.5 phu (81 ccc) 78
G jam 27521.48 gon (CIP 703354) 58
N H88.31/34 rap 636 96
Total 321
oka =S. okadae, can = S. canasense, buk = S. bucasovi, jam = S. jamesii, phu = S. phureja,
49
Se han utilizado diferentes marcadores que han sido compendiados en una lista de
marcadores potenciales SSR que están ligados y co-localizados con QTLs para P. infestans en
un mapa referencial de papa (Ritter et al. 2005, Ritter et al. 2008 a y b).
La Tabla 8 muestra los marcadores microsatélite (SSRs) utilizados en la presente

investigación.
Tabla 8. Secuencias de los cebadores utilizados para amplificar los correspondientes SSRs
utilizados en las poblaciones D, E, G y N de papa para el cribado de QTL
conocidos.
Chrom Marcador Repetición Secuencia del marcador (5’- 3’) 1F - 2R T°a (°C)
I STM2020 (TAA)6 F CCTTCCCCTTAAATACAATAACCC 60.2
R CATGGAGAAGTGAAAACGTCTG 58.8
I STM1029 ( C)12 F AGGTTCACTCACAATCAAAAGCA 59.8
R AAGATTTCCAAGAAATTTGAGGG 59.8
I STM2030 (CA)3(TA)5 F TCTTCCCAAATCTAGAATACATGC 58.7
R AAAGTTAGCATGGACAGCATTTC 59.7
II STM0038 (TA)4 ((TG)12 F AACTCTAGCAGTATTTGCTTCA 53.0
R TTATTTAGCGTCAAATGCATA
II STM1064 (TA)12…(TG)4 GT (TG5) F GTTCTTTTGGTGGTTTTCCT 51.0
R TTATTTCTCTGTTGTTGCTG
III STM1054 (AATT)4 F CACCAAACCTCAACAAAAG 54.1
R ATTTATGGTATTACTTGGGTTACA
III STM0040 (AT)20 AG…(AT)2 (GT)11 F GCAATAATGGCCAACACTTC 58.0
R TGGGAAATGTTAGTCAAAAATAGC
III STM1025 (T)15 (A)8 F ATACAGGACCTTAATTTCCCCAA 46.0
R ATTTCGTTGCTTACCTACTA
IV STM3016 (GA)27 F TCAGAACACGCAATGGAAAAC 60.0
R GCTCCAACTTACTGGTCAAATCC
IV STM1050 (AT)16 F CTACATATATACAATTATCTAACCG 49.4
R TTCTCTATGTTAGGCTAGAGTG 51.0
R TTAATATTTTTTACTCGGCTATTG 46.5
V STM1020 (T)12 (A)9…(TA)7…(ATA)6 F TTCGTTGCTTACCTACTA 50.8
R CCCAAGATTACCACATTC
VI STM0019 (AT)7 (GT)10 (AT)4 (GT)5 (CG)4 (GT)4 F AATAGGTGTACTGACTCTCAATG 52.0
R TTGAAGTAAAAGTCCTAGTATGTG
VI STM1100 (TA)22 F GCTTCGCCATCTTAATGGTTA 52.0
R TCTTCGAAGGTACGTTTAGACAA
STM1056 (AAAAT)4 F AGGTAAGTTTTATTTTCAATTGC 53.9
R GGGTATGGGAATAGGTAGTTT 53.9
VII STM1003 (TA)10 F CACTTAATATGGATTAGAGGAAGTA 53.0
R GAACTTATGCTTTATCATTCA
VII STM0052 (AC)5…(AC)6 (AC)16 F TAGGCTCGGGTCATTACAATAA 58.0
R GCTCGCCTGTGTTTGTTGT
VIII STM1056 (AAAAT)4 F AGGTAAGTTTTATTTTCAATTGC 53.9
R GGGTATGGGAATAGGTAGTTT 53.9
VIII STM1024 (TTG)6 F ATACAGGACCTTAATTTCCCCAA 60.0
R TCAAAACCCAATTCAATCAAATC
VIII STM1005 (GTA)6 F ATGCCTCTTACGAATAACTCGG 59.0
R CAGCTAACGTGGTTGGGG
IX STM 1102 (TA)8 F GGAAGAATTTGTAGGTTCAA 53.7
R AAAGTGAAACTTCCTAGCATG 53.9
IX STM1051 (TAT)4TTT(TAT)7 F TCCCCTTGGCATTTTCTTCTCC 65.7
R TTTAGGGTGGGGTGAGGTTGG 65.3
IX STM3012 (CT)4…(CT)8 F TCTCACCAGCCGGAACAT 60.3
R AAGCTGCGGAAGTGATTTTG 60.0
X STM0051 (AC)7…(AC)7…(AT)4 F TAGGCTCGGGTCATTACAATAA 52.0
R GCTCGCCTGTGTTTGTTGT
XI STM1009 (AT)30 F ATTAGCATACGACTCAAC 45.2
R TTATTTTCATTTTTCAGC 46.1
XI STM0037 (TC)5(AC)6AA…(AC)7 (AT)4 F AATTTAACTTAGAAGATTAGTCTC 47.7
R ATTTGGTTGGGTATGATA 48.2
XI STM0025 (TG)13 F AACTATCAACTAAATGCCTTTTT 53.0
R TTAATATTTTTTACTCGGCTATTG
XII STM0007 (AC)9 F GGCAAGCTGTGAAGTTTAT 52.0
R AATTGAGAAAGAGTGTGTGTG 52.7
XII STM0030 Compound ((GT/GC) GT)8 F AGAGATCGATGTAAAACACGT 54.0
R GTGGCATTTTGATGGATT 54.1
XII STM2028 (TAC)5…(TA)3…(CAT)3 F TCTCACCAGCCGGAACAT 60.2
R AAGCTGCGGAAGTGATTTG 60.4
1 2
F (Forward) = Cebador Directo, R (Reverse) = Cebador Reverso
T°a = Temperatura de anillamiento
Milbourne et al. (1998)
50
Las condiciones de la reacción de la PCR fue la descrita en la Tabla 9 (Ghislain et al.

2004, con modificaciones)
Tabla 9. Reactivos necesarios para la reacción de PCR.
Reactivos Volumen
dd H2O 2,0 µl
10 x NH4 PCR buffer 10x 1,0 µl
MgCl2 (50mM) 0,5 µl
dNTPs (2,5mM) 0,8 µl
Primer directo (10 pmol/µ) 0,4 µl
Primer reverso (10 pmol/µ) 0,4 µl
IRD M13 (1 µM) 1,8 µl
Taq DNA polimerasa (5U/µ) (Invitrogen Inc. Barcelona, España) 0,1µl
Volumen final 7,0 µl
DNA (30 ng) 3,0 µl
Todos los productos de amplificación fueron desarrollados en el termociclador Primus 96

(MWG AG Biotech) usando Taq DNA polimerasa recombinante (Invitrogen Inc. Barcelona,
España). Los productos amplificados se mezclaron con 7 µl de formamida-loading buffer
(98% (v/v) formamida, EDTA 10mM pH 8.0, Azul de bromofenol 0,1% (p/v); Xilenecyanol
0,1% (p/v)). Para la amplifación se utilizó el programa de PCR desarrollado por Ghislain et
al. (2004) con modificaciones. La mezcla se desnaturalizó en el termociclador durante 8 min
a 95ºC, y se enfrió rápidamente en congelador a -20 ºC. Posteriormente los fragmentos
amplificados se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% (p/v) y 7M de
urea, y se visualizaron en el analizador LICOR (DNA Analyser Gene Reader 4200, LICOR,
MWG-Biotech) utilizando su manual (Fig. 18).
Figura 18. Imagen del analizador LICOR (Foto: Julio Gabriel)
51
3.6.5. Análisis de genes candidato
El gen candidato Protein BS2 (TC148920) descrito en la Tabla 5 fue detectado por
Hernandez et al. (2008), quienes utilizaron la técnica de cDNA-AFLP diferenciales para
detectar cDNAs que se expresen de forma diferencial después de una inoculación con P,
infestans y posteriormente analizaron su significado biológico. Además, realizaron un ensayo
de microarrays para detectar genes de respuesta o de resistencia a infección con P. infestans.
Con un microarrays de papa con 10.000 genes o cDNAs del Instituto TIGR (Rockville MD,
USA). Este chip detecta genes que se expresan de forma diferencial después de la inoculación
con el patógeno utilizando mARN marcados. Luego diseñaron cebadores para los genes
candidatos (nuevos o ya conocidos) con el objeto de integrarlos en el mapa de referencia de la
especie.
Este nuevo cDNA (gen candidato) diseñado para PCR fue utilizado como gen candidato
para detectar genes de resistencia en la poblaciones D. E, G y N. La amplificación de este
marcador se realizó en un termociclador tipo 2720 A&B (MWG AG Biotech) a una
temperatura de anillamiento 55°C. Los productos de amplificación se desnaturalizaron y
separaron en geles de poliacrilamida al 6% (19:1) y se visualizaron en un secuenciador 116
LICOR 4200-S1 (LICOR, Lincoln, Nebraska, USA) según el manual del equipo.
3.6.6. Análisis de marcadores CAP
Los marcadores CAP se evaluaron inicialmente mediante PCR y posteriormente se

procedió a la digestión del producto de amplificación utilizando las enzimas que se indican en
la Tabla 6.
Previamente, se realizó una pre-selección en seis genotipos elegidos al azar de la

progenie N. Despues de observar la amplificación (producto de PCR) se procedió a realizar la
digestión y una vez observado el polimorfismo de bandas a través de diferentes cortes por la
enzima utilizada se aplicó a toda la población.
Las condiciones para la reacción de la PCR fueron las que se muestran en la Tabla 10.
52
Tabla 10. Condiciones de la PCR para CAPs.
Reactivos Volumen
dd H2O 16,2 µl
10 x NH4 PCR buffer 10x 3,0 µl
MgCl2 (50mM) 1,2 µl
dNTPs (2,5mM) 2,4 µl
Primer directo (10 pmol/µ) 0,75 µl
Primer reverso (10 pmol/µ) 0,75 µl
Taq DNA polimerasa (5U/µ) (Invitrogen Inc. Barcelona, España) 0,2µl
DNA (50 ng) 5,0 µl
Todos los productos de amplificación fueron desarrollados en el termociclador 2720

A&B (MWG AG Biotech) usando Taq 1kb Plus DNA Ladder (Invitrogen Inc. Barcelona,
España). Para la amplifación se utilizó el programa desarrollado por el CIP con
modificaciones (Gonzáles et al. 2007). Posteriormente, los fragmentos amplificados se
separaron por electroforesis en gel de agarosa preparado con 0,5 g de agarosa + 0,5 ml de
TAE 1x al 1% + 0,5 µl de Bromuro de Etidio. Los geles se visualizaron en el transluminador
BIORAD utilizando su manual.
Una vez que se separó el producto de amplificación en el gel de agarosa y se comprobó

que se obtuvo un fragmento del mismo tamaño, se procedió a la digestión del producto de
PCR con enzimas de restricción (Tabla 6), las misma que se adquirieron de Fermentas
(eurofins MWG Gmb H, Barcelona). Para la digestión se utilizaron los reactivos de la Tabla
11.
Tabla 11. Reactivos necesarios para la digestión.
Producto
Reactivos
de PCR
dd H2O 17,0 µl
Buffer 2,0 µl
DNA 10,0 µl
Enzima (según el CAP analizado) 1,0 µl
Los productos digeridos se separaron por electroforesis en gel de agarosa preparado con
0,5 g de agarosa + 0,5 ml de TAE 1x al 1% + 0,5 µl de Bromuro de Etidio. Se preparó el
marcador con 2 µl de marcador (1kb Plus DNA Ladder + 5 µl H2O y la muestra con 15 µl del
53
Producto de PCR + 2 µl Louding. Los geles se visualizaron en el transluminador BIORAD,

utilizando su manual.
3.7. Análisis de alelos
Las huellas genéticas generadas por hibridación o por PCR, son heredadas a la
descendencia de acuerdo las leyes mendelianas (Valadez-Moctezuma y Kahl 2005). Por lo
tanto, las bandas que son polimórficas entre los progenitores se pudieron seguir en las
poblaciones segregantes de las cruzas y se analizó desde el punto de vista de ligamiento en
cada uno de los individuos. Es decir, los marcadores segregantes de cada progenie fueron
tratados como un sistema de marcador dominante con un patrón de segregación 1:1 ó 3:1
según el modelo de segregación mendeliana (ab x aa), (aa x ab) ó (ab x ab), donde el alelo “a”
representa la ausencia de la banda (0), y el alelo “b” representa la presencia de fragmentos
amplificados (1) (Tabla 12). De esta forma, se dedujo fragmentos específicos de sólo un
parental ab x aa; aa x ab respectivamente y factores comunes a ambos parentales (ab x ab).
Los geles fueron analizados de forma visual, utilizando una matriz de presencia-ausencia del
fragmento amplificado para el QTA-genotyping.
Tabla 12. Nomenclatura de análisis de marcadores moleculares y/o TDFs.

Modelo de Tipo de Ausencia Presencia Codificación de
Origen segregación segregación de banda de banda genotipos
Marcador común ab x ab 3:1 aa b- (ab ó bb) ab, bb = 1, aa = 0
Parental aa x ab 1:1 aa ab ab = 1, aa = 0
Parental ab x aa 1:1 aa ab ab = 1, aa= 0
La presencia o ausencia de cada marcador segregante, tanto de la progenie como de los

parentales, se anotó según la codificación de la Tabla 12. Se almacenaron en archivos con
formato EXCEL para su posterior análisis estadístico.
Para cada marcador ensayado se aplicó un t-TEST para comparar las medias de niveles
de resistencia en los genotipos que pertenecen a cada clase de marcadores
(ausencia/presencia) en cada caso utilizando Proc t-test del software SAS (SAS Users Guide
1998).
54
4. Resultados
55
4.1. Análisis de la resistencia
4.1.1. Análisis de la resistencia a P. infestans en hoja
El análisis de ajuste de normalidad de las familias C, D, E, G y N mostró que las

distribuciones del Area Bajo la Curva de Progreso de P. infestan relativa (ABCPPIrel) no se
ajustaron a curvas normales (P<0.05), por lo que se transformaron los datos para su análisis
de varianza mediante raíz cuadrada como fue descrito en la metodología. Con esto se logró el
ajuste apropiado, obteniendo coeficientes de variación (C.V.) entre 5.44 y 8.36% (Tabla 13).
En general todas la poblaciones evaluadas para ABCPPIrel mostraron una distribución

asimétrica hacia derecha o izquierda (A > 0 ó A < 0) y con empinamientos platicurticos (K <
3).
Tabla 13. Características de las distribuciones del ABCPPrel de las familias C, D, E, G y N.
Momentos Familia Familia D Familia E Familia G Familia N

C
N 200 332 264 288 288
Media 0.20 0.19 0.22 0.18 0.33
Asimetria (A) -0.267 0.418 0.269 0.489 -0.332
C.V. 5.44 7.04 8.26 7.21 8.36
Varianza 0.004 0.006 0.008 0.006 0.009
Empinamiento (K) -1.171 -0.835 -1.418 -0.958 -1.289
Pr<W 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001
El análisis de varianza para el ABCPPIrel mostró un C.V. de 7.42%, y fue altamente

significativo (Pr<0.01) entre las progenies y parentales evaluados (Tabla 14). Las progenies
y parentales involucrados mostraron diferentes grados de resistencia al tizón tardío (P.
infestans) (Fig. 19). Esto indicó que existieron diferentes niveles de expresión de la
resistencia a P. infestans entre las progenies, en la que estuvieron involucrados posiblemente
genes mayores o genes R, genes menores y/o genes R vencidos, que han sido trasferidos de
las especies silvestres diploides utilizadas (oka, jam, buk, can y rap).
Tabla 14. Análisis de varianza para el ABCPPIrel en hoja.
Fuentes de variación Grados de Cuadrados medios Prob< F

libertad
Total 1386
Familias 8 0.112 0.0001
Error 1378 0.007
C.V. 7.42
R2 0.09
56
La separación de medias del ABCPPIrel mediante la prueba de Duncan al Pr < 0.05

(Tabla 15), mostró que las progenies G, C, D, E, N y el parental diploide phu, no fueron
significativamente diferentes (Pr<0.05) entre sí (ABCPPIrel = 0.05 – 0.33), pero si
significativamente diferentes (Pr < 0.05) al parental diploide cultivado gon (ABCPPIrel =
0.47). Las progenies D, C, E y N no fueron significativamente diferentes (Pr<0.05) entre sí,
pero si (Pr<0.05) con gon (ABCPPIrel = 0.47). Las progenies G, D y los parentales jam y
can no muestraron diferencias significativas entre sí (ABPPIrel = 0.00 – 0.18), pero si fueron
significativamente diferentes a gon. Finalmente se observó que la progenie N y el parental
gon (ABCPPIrel = 0.33-0.47) no fueron significativamente diferentes (Pr<0.05) entre sí, pero
fueron significativamente diferentes (Pr<0.05) a los parentales jam y can (ABCPPIrel= 0.00 –
0.05).
Tabla 15. Comparación de las medias del Area Bajo la Curva de Progreso de P. infestans
relativa (ABCPPIrel), evaluados en foliolos sueltos de plantas adultas, campaña
2007.
Genotipo/Familia Genealogía ABCPPIrel*
Hembra Macho
jam 0.00 C
can 0.05 C
phu 0.05 BC
G jam 27521.48 gon 0.18 BC
D can 310956.8 phu 0.19 B
C oka 498063.6 phu 0.20 B
E buk 210042.5 phu 0.22 B
N H88.31/34 rap 0,33 A B
gon 0.47 A
DMS 0.17
gon = S. goniocalyx, rap = S. raphanifolium, H88.31/34 = Dihaploide S. tuberosum
*Medias con las mismas letras no son significativamente diferentes entre sí al Pr < 0.05
ABCPPIrel = (ABCPPI)/300= Area Bajo la Curva de Progreso de P. infestans Relativa
Para comprender e interpretar los niveles de resistencia de las progenies se hizo un

análisis individual de varianza para cada progenie.
Se observaron en el análisis de varianza de la progenie C (oka 498063.6 x phu),

diferencias altamente significativas (Pr<0.01) entre genotipos, con un coeficiente de variación
(C.V.) de 2.44% y un coeficiente de coincidencia de (R2) de 84%, parámetros que reflejaron
un ajuste apropiado al modelo utilizado para el análisis y los datos mostraron que existieron
diferentes niveles de resistencia al P. infestans en la progenie (Tabla 16).
57
Ningún punto necrótico o manchas

herrumbrosas (0). Signo de alta
resistencia en el parental S. jamesii
Mancha necrótica o mancha

dendrítica con 0.1 a 60 % de
esporulación. Signo de resistencia
parcial en el parental S. phureja
Esporulación de 60.1 a 100%. Signo

de extrema susceptibilidad en el
progenitor S. goniocalyx.
….
Figura 19. Porcentaje de Intensidad de Esporulación (IE) en hojas sueltas (Foto: Julio
Gabriel)
Tabla 16. Análisis de varianza del ABCPPIrel de la progenie C (oka 498063.6 x phu).
FV gl SC CM F Pr > F
Total 199 0.71
Genotipos 49 0.60 0.0007 17.15 0.0001
Error 150 0.11 0.0122
C.V. 2.44
R2 0.84
Se observa en la Fig. 20, que en la progenie C (oka 498063.6 x phu) tuvo un 44% de
genotipos resistentes a P. infestans (ABCPPIrel = 0.002 - 0.21), un 10% de genotipos
moderadamente resistentes (ABCPPI = 0.21 – 0.35) y un 46% de genotipos susceptibles (0.35
– 0.49). El mayor peso en esta progenie fue hacia la resistencia a P. infestans (54%).
Figura 20. Frecuencia del ABCPPIrel en hoja en la progenie C (oka 498063.6 x phu)
58
En el caso de la progenie D (can 310956.8 x phu), se observa en la Tabla 17, diferencias

altamente significativas (Pr<0.01) entre genotipos con C.V. de 4.81% y R2 de 64%. Estos
datos de igual manera que el anterior caso, mostraron un ajuste apropiado al modelo utilizado
para el análisis y denotó la existencia de niveles de resistencia a P. infestans entre los
genotipos de la progenie D.
Tabla 17. Análisis de varianza del ABCPPIrel de la progenie D (can 310956.8 x phu).
Total 331 1.94
Genotipos 82 1.26 0.015 5.58 0.0001
Error 249 0.68 0.002
C.V. 4.81
R2 0.64
En la Fig. 21, se observa que en la progenie D (can 310956.8 x phu) hubo 81% de
genotipos resistentes a P. infestans (ABCPPIrel = 0.002 - 0.32), 12% de genotipos
moderadamente resistentes (ABCPPI = 0.32 – 0.40) y 6% de genotipos susceptibles
(ABCPPIrel = 0.40 – 0.64). El mayor peso en esta progenie fue hacia la resistencia a P.
infestans (93%).
Figura 21. Frecuencia del ABCPPIrel en hoja en la progenie D (can 310956.8 x phu)
A continuación se muestra la Tabla 18, donde se hace el análisis de varianza para el

ABCPPIrel de la progenie E (buk 210042.5 x phu). En la que se mostró diferencias altamente
significativas (Pr<0.01) entre genotipos de la progenie, con un C.V. de 4.29% y un R2 de
80%, similar a los dos anteriores casos (Tabla 18).
59
Tabla 18. Análisis de varianza del ABCPPIrel de la progenie E (buk 210042.5 x phu).
FV Gl SC CM F Pr > F
Total 262 2.17
Genotipos 65 1.73 0.026 11.88 0.0001
Error 197 0.44 0.002
C.V. 4.29
R2 0.80
El análisis de la frecuencia absoluta del ABCPPIrel (Fig. 22), mostró que en la progenie
E (buk 210042.5 x phu), existió un 62% de genotipos resistentes a P. infestans (ABCPPIrel =
0.002 - 0.34), 6% de genotipos moderadamente resistentes (ABCPPI = 0.34 – 0.43) y 32% de
genotipos susceptibles (ABCPPIrel = 0.43 – 0.58), lo cual se reflejó en la presencia de un
mayor número de genotipos de la progenie con resistencia a P. infestans (68%).
Figura 22. Frecuencia del ABCPPIrel en hoja en la progenie E (buk 210042.5 x phu).
En el caso de la progenie G (jam 27521.48 x gon), el análisis de varianza realizado para

ABCPPIrel (Tabla 19), mostró diferencias altamente significativas (Pr<0.01) entre genotipos
de la progenie G, con C.V. de 5.18% y R2 de 61%. Cuyo comportamiento es similar a las tres
anteriores progenies analizadas, denotándose la existencia de diferentes niveles de resistencia
entre los genotipos de la progenie.
Tabla 19. Análisis de varianza del ABCPPIrel de la progenie G (jam 27521.48 x gon).
Total 288 1.75
Genotipos 71 1.07 0.015 4.86 0.0001
Error 217 0.68 0.003
C.V. 5.18
R2 0.61
60
La frecuencia absoluta del ABCPPIrel de la familia G (jam 27521.48 x gon) reflejada en

la Fig. 23, mostró el 77% de genotipos resistentes a P. infestans (ABCPPIrel = 0.002 - 0.26),
12% de genotipos moderadamente resistentes (ABCPPI = 0.26 – 0.35) y 12% de genotipos
susceptibles (ABCPPIrel = 0.35 – 0.58). La mayor tendencia de la los genotipos de la
progenie fue hacia la resistencia a P. infestans (89%).
Figura 23. Frecuencia del ABCPPIrel en hoja en la progenie G (jam 27521.48 x gon).
Finalmente, el análisis de varianza de la progenie N (Tabla 20), mostró diferencias

altamente significativas (Pr<0.01) entre genotipos de la progenie analizada, con C.V. de
4.48% y R2 de 81%. Denotando la existencia de diferentes niveles de resistencia entre los
genotipos de la progenie.
Tabla 20. Análisis de varianza del ABCPPIrel de la progenie N (H88.31/34 x rap 636).
Total 287 2.64
Genotipos 95 2.13 0.003 8.46 0.0001
Error 192 0.51 0.022
C.V. 4.48
R2 0.81
61
Analizando la Fig. 24 se observa que en la progenie N (H88.31/34 x rap 636), hubo 40%
de genotipos resistentes a P. infestans (ABCPPIrel = 0.002 - 0.25), 11% genotipos
moderadamente resistentes (ABCPPI = 0.25 – 0.34) y 49% de genotipos susceptibles
(ABCPPIrel = 0.34 – 0.67). Si bien se observó un 51% de genotipos resistentes, es notorio
observar que a diferencia de las otras cuatro progenies analizadas previamente, se observa un
mayor porcentaje de genotipos susceptible a P. infestans (51%).
Figura 24. Frecuencia del ABCPPIrel en hoja en la progenie N (H88.31/34 x rap 636).
4.1.2. Resistencia a P. infestans en tubérculos
Se realizó previamente un análisis de ajuste de normalidad de la severidad de infección

de tubérculos de las progenies C, D, E, G y N cuyas distribuciones no se ajustan a curvas
normales (Pr<0.05) y sus C.V. oscilan entre 22.19 y 47.90% (Tabla 21). Las progenies C, D,
E, G y N (A>0) estaban ligeramente inclinadas a la derecha. En referencia al empinamiento o
altura de la curva, se observó (Tabla 21), que las progenies C, D, E y N fueron platicúrticas
(K<3), en cambio la progenie G fue leptocúrtica (K>3).
Tabla 21. Normalidad de la distribución de la severidad de infección (%) en tubérculos.

Moments Familia C Familia D Familia E Familia G Familia N
N 42 68 68 58 58
Media 7.34 6.78 12.38 10.77 11.38
Asimetria (A) 0.94 0.76 0.59 3.36 0.22
C.V. 47.90 38.43 28.77 42.63 22.19
Varianza 1.57 1.00 1.02 1.81 0.58
Empinamiento (K) -0.32 0.013 -0.06 4.76 -1.79
Pr<W 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001
El análisis de varianza de infección de tubérculos (Tabla 22) mostró diferencias altamente

significativas (Pr < 0.05) para las progenies analizadas, con C.V. de 37.27%, lo cual indicaba
62
que existen diferencias de expresión de la resistencia a P. infestans en tubérculos entre los

genotipos de las progenies evaluadas.
Tabla 22. Análisis de varianza para porcentaje de severidad de infección en tubérculos.
Fuentes de Grados de Cuadrados medios Prob< F

variación libertad
Total 294
Familia 4 12.56 0.0001
Error 290 1.168
C.V. 35.18
R2 0.12
Realizando el análisis de comparación de medias a través de la prueba de Duncan (Tabla

23), se observó que las progenies E, N y G (severidad = 10.77 – 12.38 %) no son
significativamente diferentes (Pr<0.05) entre sí. De igual manera ocurre con las progenies G,
C y D (severidad = 6.78 – 7.34%), que tampoco fueron significativamente diferentes (Pr <
0.005) entre sí. Sin embargo, es notorio observar que las progenies mencionadas, mostraron
diferencia significativas (Pr<0.05) con las progenies E, N y G.
Tabla 23. Comparación de las medias de la severidad de infección (%) en tubérculos,

campaña 2007.
Genotipo/Familia Genealogía Severidad (%)*
Hembra Macho
D can 310956.8
phu 6.78 B
C oka 498063.6
phu 7.34 B
G jam 27521.48
gon 10.77 A
N H88.31/34
rap 11.28 A
E buk 210042.5
phu 12.38 A
DMS 2.78
*Medias con las mismas letras no son significativamente diferentes entre sí al Pr < 0.05
Para deducir el comportamiento de los niveles de resistencia en tubérculos, a

continuación se hace un análisis de las frecuencias absolutas de cada una de las progenies
evaluadas.
En la Fig. 25 se observa que la progenie C (oka 498063.6 x phu) mostró una frecuencia
absoluta de severidad amplia, donde 49% de los genotipos fueron resistentes (severidad = 0.5
– 16.5) y 53% genotipos fueron susceptibles (severidad = 16.5 – 26.5%) a P. infestans.
63
Figura 25. Frecuencia de severidad de infección de tubérculos en la progenie C (oka

498063.6 x phu).
En cambio en la progenie D (can 310956.8 x phu) se observó 77% genotipos resistentes

(severidad = 0.5 – 16.5%) y 23% genotipos susceptibles (severidad = 16.4 – 21.5%).
Mostrando esta progenie un mayor porcentaje de genotipos resistentes (Fig. 26).
Figura 26. Frecuencia de severidad de infección de tubérculos en la progenie D (can

310956.8 x phu).
De igual manera se observa en la Fig. 27 que la progenie E (buk 210042.5 x phu),

mostró 67% de genotipos resistentes (severidad = 0.5 – 18.5%) y 33% de genotipos
susceptibles (Severidad = 18.5 – 30.5%), con una proporción mayor a la resistencia.
64
Figura 27. Frecuencia de severidad de infección de tubérculos en la progenie E (buk

210042.5 x phu).
Por otra parte, la progenie G (jam 27521.48 x gon) tuvo 89% de genotipos resistentes
(severidad = 0.5 – 20.5%) y 11% de genotipos susceptibles (severidad = 20.5 – 70.5%).
Observándose que esta progenie tuvo la mayor proporción de genotipos resistentes (Fig. 28)
Figura 28. Frecuencia de severidad de infección de tubérculos en la progenie G (jam

27521.48 x gon).
Finalmente, observando la frecuencia absoluta de la severidad de infección en tubérculos

de la progenie N (H88.31/34 x rap 636), se observa (Fig. 29) que tuvo 71% de genotipos
resistentes (severidad = 3.5 – 9.5%) y 29% de genotipos susceptibles (severidad = 15.5 –
18.5%).
65
Figura 29. Frecuencia de severidad de infección de tubérculos en la progenie N (H88.31/34 x

rap 636).
4.1.3. Correlación de la resistencia entre hoja y tubérculo
Se realizó la correlación entre la resistencia de hoja y tubérculo para detectar si existía

relación. El análisis realizado (Tabla 24) mostró que en general, en todos los casos de las
progenies evaluadas, los coeficientes de correlación de la resistencia en hoja y tubérculo
fueron muy bajos y negativos (-0.069 a 0.328) y no hubo diferencias significativas (Pr<0.05).
Esto indicó, que no hubo correlación entre la resistencia en hoja, respecto de la resistencia en
tubérculo; por lo que se asumió que los genes de resistencia de hoja fueron diferentes a los
genes de resistencia en tubérculo.
Tabla 24. Correlación de Pearson de la resistencia a P. infestans de hoja y tubérculo en cinco

progenies de papa.
ABCPPI (C) ABCPPI (D) ABCPPI (E) ABCPPI (G) ABCPPI (N)
Severidad (%) -0.069 -0.226 0.328 -0.257 0.071
0.742 0.325 0.298 0.273 0.598
Coeficiente de correlación de Pearson/ Prob > |R| bajo Ho: Rho=0 / N
66
4.3. Análisis de co-localización de SSRs y genes en el mapa poblacional UDH
La Tabla 25, describe los resultados de los análisis de co-localización entre los
marcadores SSR y las posiciones de los QTL publicados para resistencia a P. infestans. En
total, 35 QTL – P.infestans y genes (en negrita) se considera que corresponden a 28 diferentes
lugares en los 12 cromosomas de papa. Se examinaron un total de 35 marcadores SSR
relacionados que se muestran en la Tabla 25. De esta manera, se ha desarrollado una
integración genética y fenotípica en un mapa poblacional UHD, el cual considera todos los
loci de QTL publicados hasta ahora. Este mapa se muestra en la Fig. 30 a y b.
La Tabla 26 a, b, c y d, muestra los resultados de QTA genotipado para tizón en hoja en

cuatro poblaciones mapeadas y la Tabla 27, muestra los resultados de QTA genotipado tizón
en tubérculo en tres poblaciones. En estas tablas se muestran los análisis de los diferentes
SSRs en los diferentes cromosomas de cada población y su asociación con los diferentes
QTLs publicados. La segregación de alelos detectados se indican en sus descendencias (DE),
el número de fragmentos observados (FR), el valor del promedio de resistencia para cada
clase marcador (presencia vs ausencia), la diferencia entre estas medias (Dif) y la
significancia de sus diferencias de acuerdo a la prueba del t-Test al Pr<0.05 de probabilidad.
Con respecto al tizón en hoja (Tabla 26), se detectó en la progenie D (can 310.956,8 x
phu) un QTL en el cromosoma VIII, que desciende de P2 (phu).
En la progenie E (buk 210042.5 x phu) se detectó cuatro QTLs que se encuentra en los
cromosomas III, V, VI y X. Sólo un QTL en el cromosoma III viene de la fuente de
resistencia P1 (buk).
En la progenie G (jam 27521.48 x gon) se detectaron tres QTLs seleccionables en los

cromosomas III, VI y VII de acuerdo a los valores de significancia. QTAlelos significativos
fueron observados en el cromosoma VI para el padre P2 (gon), y dos lugares para el
progenitor (jam).
En la progenie N (H88-31/34 x rap 636) fueron detectados tres QTLs seleccionables que
se encuentran en los cromosomas V, VI y VIII. Dos de ellos (en los cromosomas V y VIII)
descienden de la fuente de resistencia rap. Varios marcadores SSRs incluidos en la evaluación
no mostraron segregación de alelos SSR en todas las poblaciones, de modo que no fue posible
evaluar estos lugares genómicos.
67
Tabla 25. Lista de marcadores potenciales SSRs que están ligados y/o co-localizados con
QTLs para P. infestans en un mapa referencial de papa.
Crom I SH RH Crom V SH RH Crom VIII SH RH

Stm1029 30 13 Stm1041 2 E-5 12 21
Stm2020a 32 20 PiFTve-5a 12 13 STM1056 21
Pi-1 39 29 GP 21 12 13 Rblc 35 56
Stm2030 46 35 Pi-5a, R1 15 16 E-6 37 58
GP 179 19 STM1024 58
PiFTve-5c 19 20 STM1005 92
PiFTve-5b 30 30 Pi-8 67 95
Crom II SH RH Stm0013 39
Stm5011 0 0 Pi-5b 56 56
Pi-2a 7 7 Stm1020 63
Stm0038 10 10 Crom IX SH RH
Pi-2b 18 19 Stm 1102 0 0
Stm1064(2) 73 Stm 1051 4 4
Pi-2c 90 75 Pi-9 11 11
Stm 3012 13
Crom VI SH RH
Pi-6a 3 6
Stm 0019 9 Crom X SH RH
Stm 1100 59 Stm 0051 45
Crom III SH RH FB-6 52 59 Rber 34 49
Stm 1054 6 Pi-6b 61 68
PI-3b 6 5 Stm 1056 83
Stm 0040 23 Crom XI SH RH
FB-1, Pi-3a 35 30 Pi-11 7 10
Stm 1025 41 Stm1009 19 19
Pi-3c 53 55 Stm0037 22 22
Pi-3d 61 58 Crom VII SH RH RP-11, Pi-19 66 85
Pi-7a 34 30 Stm0025 66 85
Stm 1065 36
Stm 1003 72 67
Pi-7b 75 69
Crom IV SH RH Stm 0052 83
Pi-4a1 1 1 Crom XII SH RH
Pi-4b 20 23 Stm0007 18 25
Stm 3016 23 Stm0030 22 30
R2, Pi-4a2 28 33 STM2028 70 50
Stm 1050 35 Pi-12 71 51
QTLs y genes recopilados de la literatura en negrilla

bin = representa un patrón de expresión de un fragmento (presencia/ausencia) en los genotipos de toda la progenie
SH = Progenitor Paterno
RH = Progenitor Materno
68
Chr I Chr II Chr III Chr IV Chr V Chr VI

S1 ╫ R1 S1 ╫ R1 S1 ╫ R1 S1 ╫ R1 S1 ╫ R1 S1 ╫ R1
║ STM5011 ║ PI-3b ║ Pi-4a1 ║ AAC/TAG_133 ║ Stm 1041 ACT/TCC_136 ║
║ Pi-2a ║ S6 ╫ R5 ║ ║ S3 ╫ R6
║ S7 ╫ R7 ║ AAG/TCC_133 ║ ║ Pi-6 a ║
║ AAG/TCT_129 ║ AAC/TAT_70 ║ ║ PiFTve-5 a ║ GP 21 ╟ Stm 0019
║ STM0038 ╫ S10/R10 ║ ║ S12 ╫ R13 ║
║ ║ ║ ║ ACT/TGC_337 ║ ║
║ Pi-2b ║ ║ ║ S15 ╫ R16 ║
║ S18 ╫ R19 ║ Pi-4b ║ Stm 3016 Pi-5a, R1 ║ ║
║ AAG/TTA_449 ║ AAG/TAG_45 ║ S20 ╫ R23 ║ GP 179 ║
STM1029 ║ R13 ║ ║ Stm 0040 AAC/TAG_264 ║ S19 ╫ R20 ║
║ ║ ╟ R23 ║ PiFTve-5c ║ AAG/TAC_84 ║
║ ║ ║ R2, Pi-4a2 ║ ║ ║
║ ║ ║ S28 ╫ R33 ACC/TAT_122 ║ ║
STM2020a ║ ║ ║ AAT/TTC_124 ╟ Stm 1050 S30 ╫ R30 ║
S32 ╫ R20 ║ ║ ║ PiFTve-5b ║ ║
║ ║ FB-1, Pi-3a ║ ║ ║ ║
║ ║ S35 ╫ R30 ║ ║ ║
Pi-1 ║ AGA/TAC_315 ║ ╟ ACC/TCC_423 ║ ║ Stm 0013 ║
S38 ╫ R29 ║ ║ ║ ╟ R39 ║
AGA/TAT_342 ║ ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ Stm 1025 ║ ║ ║
║ ║ ╟ R41 ║ ║ ║
STM2030 ║ R35 ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ ║ FB-6 ║ Stm 1100
║ ║ Pi-3c ║ ║ Pi-5b ║ AAC/TTG_245 S52 ╫ R59
║ ║ S53 ╫ R55 ║ S56 ╫ R56 ║
║ ║ ACG/TAC_218 ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ ║ Stm1020 ║
║ ║ Pi-3d ║ ║ ╟ R63 Pi-6b ║
║ ║ S61 ╫ R58 ║ ║ S61 ╫ R68
║ ║ ║ ║ ║ ACT/TAT_243 ║
║ ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ ║ S68 ╫ R74
║ ║ ║ ║ ║ Stm 1056
║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ S77 ╫ R78
║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║
║ ║ STM1064(2) ║ ║
║ Pi-2c ╟ R73 ║ ║
║ S90 ╫ R75 ║ S91 ╫ R105
║ ║ ║
S95 ╫ R101 ║ ║
S97 ╫ R80 ║
S100 ╫ R80
Figura 30a
Chr VII Chr VIII Chr IX Chr X Chr XI Chr XII
S1 ╫ R1 S1 ╫ R1 STM1102 ╫ R1 S1 ╫ R1 S1 ╫ R1 S1 ╫ R1
║ ║ ║ ║ AAG/TCG_500 ║ ║
║ ║ STM1051 ║ R4 ║ Pi-11 ║ ACC/TCC_239 ║
║ ║ ║ AAC/TAG_70 ║ S7 ╫ R10 ║
║ ACC/TTT_410 ║ STM1056 S11 ╫ R11 ║ ║ ║
║ S12 ╫ R21 Pi-9 ╟ R13 ║ ║ ║
║ E-5 ║ ║ Stm 3012 ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ S19 ╫ STM1009 ║
║ ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ S22 ╫ STM0037 ║
║ ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ Stm 0051 ║ ║
║ ║ ║ ╟ R45 ║ ║
Pi-7 a ╟ ACC/TGC_200 ║ ║ Rber ╟ ACT/TAA_611 ║ ║
S34 ╫ R30 Rblc ║ ║ S34 ╫ R49 ║ ║
║ S35 ╫ R56 ║ ║ ║ ║
║ Stm 1065 S37 ╫ R58 ║ ║ ║ ║
╟ R36 E-6 ║ STM1024 ║ ║ ║ STM0007 ╫ R25
║ ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ ║ STM0030 ╫ R30
║ ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ ║ ║ ║ ║
║ ║ STM1005 ║ ║ AAC/TAC_146 ║ ║
║ AGA/TGG_264 ╫ R92 ║ ║ RP-11, Pi-19 ║ STM0025 ║
║ Pi-8 ║ ║ ║ S66 ╫ R85 ║
║ S67 ╫ R95 ║ ║ S67 ╫ R86 ║
║ Stm 1003 ║ ║ ║ ║ STM2028
Pi-7b ╟ R67 S70 ╫ R99 ║ S71 ╫ R102 Pi-12 ║ ACC/TGA_160
S75 ╫ R69 ║ S72 ╫ R51
AAC/TAA_92 ║ ║
║ ║
║ ║
║ ║
║ ║
║ ║
║ S84 ╫ R84
Figura 30b
Figura 30 a y b. Mapa de ligamiento integrado de los 12 cromosomas del mapa UDH mostrando todos los QTL/genes de
resistencia a P. infestans publicados y los correspondientes marcadores SSRs para selección molecular asistida. SSRs en
color amarillo fueron probados inicialmente, SSRs en color naranja fueron probados posteriormente
69
Tabla 26. Resultados de QTA genotyping para resistencia a P.infestans en hoja en cuatro
poblaciones mapeadas
a) Genotipado de QTA en la progenie D (can x phu)
Crom SSR QTL DE FR V1 V0 Dif Prob
I STM1029 Pi-1
I STM2020a Pi-1
I STM2030
II STM5011 Pi2a
II STM0038 Pi2b P2 1 57,46 58,45 -0,98 94,3
II STM1064 Pi2c
III STM1054 Pi3b
III STM0040 FB-1, Pi-3a P1 1 61,70 56,76 4,94 71,2
P1 2 57,21 61,42 -4,21 75,4
III STM1025 Pi3c,d
IV STM3016 Pi-4a1,4b
IV STM1050 R2,Pi-4a2
V STM1041 PiFTve-5a, Pi5a,R1, PiFTve-5c
V STM0013 PiFTve-5b P1 1 54,64 65,82 -11,18 42,6
P1 2 65,82 54,64 11,18 42,6
V STM1020 Pi-5b
VI STM0019 Pi-6a P2 1 63,82 53,09 10,73 43,5
P2 2 53,09 63,82 -10,73 43,5
VI STM1100 FB-6 P1 1 60,65 47,23 13,42 34,6
P2 2 55,66 53,09 2,57 85,2
P2 3 53,02 55,66 -2,63 85,2
VI STM1056 PI-6b
VII STM1065 Pi-7a
VII STM1003 Pi7b P1 2 66,97 51,04 15,94 24,0
C 3 51,16 66,97 -15,81 23,5
P1 4 60,95 56,02 4,93 73,4
C 1 56,02 60,95 -4,93 73,4
VII STM0052 Pi7b P2 1 62,56 50,65 11,91 37,6
C 2 57,08 60,94 -3,86 81,4
VIII STM1056 E-5
VIII STM1024 Rblc, E-6 P1 1 56,11 58,99 -2,88 83,9
P1 2 58,99 56,11 2,88 83,9
P2 3 58,99 57,37 1,62 90,4
VIII STM1005 Pi-8 P1 1 57,36 61,33 -3,97 77,0
P2 2 54,74 77,25 -22,51 4,7
IX STM1102
IX STM1051 Pi-9
IX STM3012 Pi-9
X STM1051 Rber P2 1 51,17 66,57 -15,40 27,0
P1 2 53,42 65,98 -12,56 37,3
C 3 58,48 70,38 -11,90 56,0
XI STM1009 Pi-11 P1 1 45.1 66.1 20.0 14,8
(via BS2) P2 2 53.7 64.9 11.2 20,8
XI STM0037
XI STM0025 RP-11,Pi-19 P2 1 64,50 56,51 7,99 57,9
C 2 58,77 59,92 -1,15 94,0
XII STM0007
XII STM0030
XII STM2028 Pi-12
70
b) Genotipado de QTA en la progenie E (buk x phu)

I STM1029 Pi-1
I STM2020a Pi-1
I STM2030
II STM5011 Pi2a No evaluado
II STM0038 Pi2b C 1 72,42 104,23 -31,81 10,8
P1 2 93,13 63,09 30,04 8,5
II STM1064 Pi2c
III STM1054 Pi3b
III STM0040 FB-1, Pi-3a C 1 67,89 88,24 -20,35 32,9
P1 2 97,19 51,70 45,49 1,0
III STM1025 Pi3c,d No evaluado
IV STM3016 Pi-4a1,4b No evaluado
V STM1041 PiFTve-5a, Pi5a,R1, PiFTve-5c, P1 1 87,80 72,23 15,56 37,4

V STM0013 PiFTve-5b P1 1 74,44 79,14 -4,70 79,2
C 4 76,66 78,36 -1,70 93,9
C 2 88,86 58,67 30,19 8,9
P2 3 61,47 97,02 -35,55 4,0
V STM1020 Pi-5b
VI STM0019 Pi-6a P2 1 103,09 62,72 40,37 1,8
P2 2 62,72 103,09 -40,37 1,8
P1 3 66,63 96,57 -29,94 8,3
P1 4 96,57 66,63 29,94 8,3
VI STM1100 FB-6 P1 1 66,75 83,53 -16,78 36,6
P1 2 88,85 63,75 25,10 18,0
P2 3 66,67 81,38 -14,71 44,6
VI STM1056a PI-6b
VII STM1065 Pi-7a
VII STM1003 Pi7b C 1 81,02 88,19 -7,17 77,9
P2 2 82,79 81,52 1,28 94,5
VII STM0052 Pi7b P2 1 83,68 76,62 7,05 68,9
VIII STM1056b E-5
VIII STM1024 Rblc, E-6 C 1 83,28 76,77 6,51 71,4
P2 2 80,66 80,48 0,19 99,2
VIII STM1005 Pi-8 P2 1 84,46 76,09 8,37 64,5
P2 2 80,22 80,96 -0,74 96,8
IX STM1102
IX STM1051
IX STM3012 Pi-9
X STM0051 Rber C 1 69,58 114,99 -45,41 3,1
P2 3 107,49 63,66 43,83 1,4
P1 2 83,84 74,33 9,52 59,2
XI STM1009 Pi-11
XI STM0037 Pi-11
XI STM0025 RP-11,Pi-19
XII STM0007
XII STM0030
XII STM2028 Pi-12
71
c) Genotipado de QTA en la progenie G (jam x gon)

I STM1029 Pi-1
I STM2020a Pi-1
I STM2030
II STM5011 Pi2a
II STM0038 Pi2b C 1 55,17 42,82 12,35 46,7
P1 2 47,93 56,12 -8,19 54,8
II STM1064 Pi2c C 1 51,40 54,15 -2,74 84,7
III STM1054 Pi3b
III STM0040 FB-1, Pi-3a P1 1 56,28 44,37 11,91 36,4
P2 2 56,91 47,79 9,12 46,8
III STM1025 Pi3c,d P1 1 38,50 61,30 -22,80 4,5
P2 2 61,71 45,57 16,14 24,0
V STM1041 PiFTve-5a, Pi5a,R1, PiFTve-5c P2 1 50,15 58,56 -8,41 56,5

V STM0013 PiFTve-5b P2 1 55,26 51,78 3,48 78,9
P2 2 49,48 56,97 -7,48 54,8
P1 3 50,79 59,47 -8,68 54,2
C 4 50,53 58,94 -8,41 53,7
V STM1020 Pi-5b
VI STM0019 Pi-6a C 1 55,51 49,40 6,11 64,9
P1 2 55,53 50,71 4,82 71,0
P2 3 49,74 67,02 -17,28 28,0
VI STM1100 FB-6 P2 1 37,48 77,02 -39,54 0,3
C 2 51,92 51,69 0,23 98,8
VI STM1056 PI-6b
VII STM1065 Pi-7a
VII STM1003 Pi-7b P1 1 46,83 80,82 -34,00 4,4
P2 2 48,98 55,40 -6,42 63,7
C 3 58,07 41,70 16,37 19,8
VII STM0052 Pi7b
VIII STM1056b E-5
VIII STM1024 Rblc, E-6 P1 1 41,78 56,64 -14,86 36,9
P2 2 49,91 54,45 -4,54 71,8
P1 3 56,64 41,78 14,86 36,9
P2 4 54,45 49,91 4,54 71,8
VIII STM1005 Pi-8 C 1 57,00 44,89 12,11 39,0
P1 2 43,19 58,64 -15,45 25,1
P2 3 51,56 59,64 -8,08 65,8
P2 4 54,53 51,56 2,97 86,4
IX STM1102
IX STM1051
IX STM3012 Pi-9
X STM0051 Rber C 1 54,32 47,87 6,45 61,9
P2 2 50,73 54,26 -3,53 78,1
XI STM2009 Pi-11
XI STM0037 Pi-11
XII STM0007
XII STM0030
XII STM2028 Pi-12
72
d) Genotipado de QTA en la progenie N (H88-31/34 x rap)

I STM1029 Pi-1
I STM2020a Pi-1
I STM2030
II STM5011 Pi2a
II STM0038 Pi2b P2 1 99,9 74,8 25,1 32,8
P1 2 92,3 95,8 -3,5 87,4
II STM1064 Pi2c P1 1 63,5 81,4 -17,9 33,1
P2 3 103,9 104,0 -0,1 99,6
C 2 111,8 81,0 30,8 21,4
III STM1054 Pi3b
III STM0040 FB-1, Pi-3a
III STM1025 Pi3c,d No se evaluó
IV STM3016 Pi-4a1,4b No se evaluó
IV STM1050 R2,Pi-4a2 No se evaluó
V STM1041 PiFTve-5a, Pi5a,R1, PiFTve-5c P1 1 96,8 99,8 -3,0 91,9
P2 3 66,8 113,7 -46,9 3,5
V STM0013 PiFTve-5b P2 1 121,8 94,3 27,5 22,9
P1 2 126,1 90,3 35,8 11,3
V STM1020 Pi-5b
VI STM0019 Pi-6a
VI STM1100 FB-6 C 1 106,4 98,1 8,3 72,8
P1 2 116,5 80,6 45,9 4,7
VI STM1056 PI-6b
VII STM1065 Pi-7a No se evaluó
VII STM1003 Pi7b C 1 110,8 154,4 -43,6 38,9
P1 2 113,9 116,4 -2,5 93,6
VII STM0052 Pi7b C 1 113,8 89,8 24,0 37,8
C 2 93,4 99,5 -6,1 80,1
VIII STM1056 E-5
VIII STM1024 Rblc, E-6 P1 4 85,6 87,3 -1,7 94,6
P2 2 109,3 63,1 46,2 4,9
VIII STM1005 Pi-8
IX STM1102 No se evaluó
IX STM1051
IX STM3012 Pi-9
X STM0051 Rber P2 1 102,9 98,6 4,3 85,2
XI STM1009 Pi-11 No se evaluó
XII STM0007
XII STM0030
XII STM2028 Pi-12
Leyendas: Crom: cromosoma; SSR: marcador SSR; QTL: QTLs asociados publicados; DE: descendencia de
alelos; P1: Madre, P2: Padre, C: Desconocido; FR: Número de fragmentos; V1, V0: Característica para la clase
de marcador presente, ausente de un alelo respectivamente; Dif: diferencia entre V1 y V0; Prob: nivel de
significancia [%] en negrilla; SSR marcado en gris muestra que no hubo segregación.
73
Con respecto al tizón en tubérculo (Tabla 27 a, b, c), se detectó en la progenie D (can

310956.8 x phu) tres QTLs en los cromosomas VII, VIII y XI. Sólo un alelo del cromosoma
XI proviene del progenitor P1 (can). El QTL en el cromosoma XI se deriva indirectamente de
cDNA fragmento BS2, que se encuentra cerca de STM1009 en el mapa UHD.
En la progenie G (jam 27521.48 x gon) fueron detectados cuatro QTLs seleccionables en

los cromosomas III, V, VI y X. El locus del cromosoma III mostró efectos significativos para
los alelos de ambos progenitores. También el locus del cromosoma V proveniente de la fuente
de resistencia jam.
En la familia N (H88-31/34 x rap 636), sólo se detectó un QTL para P.infestans tizón en
tubérculo y se detectó que desciende de P1 (H88-31/34) y se encuentra en cromosoma VI.
4.4. Resúmen de los resultados del QTA genotyping
La Tabla 27, resume y compara los resultados de QTA genotipados del tizón de hoja y
tubérculos en diferentes poblaciones mapeadas. Como puede verse en esta tabla, varios QTL
son comunes a dos bases genéticas en las progenies G y N a pesar de que descienden de
padres diferentes. Sin embargo, se observa QTLs no comunes en cuatro poblaciones. En
algunos casos los QTLs también son comunes para la resistencia en tubérculo y hoja en la
misma población como en las progenies G, D y N. Mientras que muchos de ellos son
específicos para los distintos órganos de la planta como se observó también en las progenies
G, D y N.
74
Tabla 27. Resultados del QTA genotyping para Resistencia en tubérculos para tizón en tres
poblaciones mapeadas
a) QTA genotyping en la progenie D (can x phu).
I STM1029 Pi-1
I STM2020a Pi-1
I STM2030
II STM5011 Pi2a
II STM0038 Pi2b P2 1 7,9 5,5 2,4 30,7
II STM1064 Pi2c
III STM1054 Pi3b
III STM0040 FB-1, Pi-3a P1 1 5,5 7,6 -2,1 39,1
P1 2 7,6 5,5 2,1 39,1
III STM1025 Pi3c,d
V STM1041 PiFTve-5a, Pi5a,R1, PiFTve-5c
V STM0013 PiFTve-5b P1 1 6,3 8,8 -2,5 32,0
P1 2 8,8 6,3 2,5 32,0
V STM1020 Pi-5b
VI STM0019 Pi-6a P2 1 7,4 6,2 1,2 66,0
P2 2 6,2 7,4 -1,2 66,0
VI STM1100 FB-6 P1 1 6,6 7,2 -0,6 84,6
P2 2 6,1 7,9 -1,8 52,4
P2 3 7,9 6,1 1,8 52,4
VI STM1056 PI-6b
VII STM1065 Pi-7a
VII STM1003 Pi7b P1 2 7,6 5,7 1,9 44,1
C 3 7,9 15,3 -7,4 11,6
P1 4 7,8 4,8 3,0 21,4
P2 1 6,3 14,0 -7,7 5,0
VII STM0052 Pi7b P2 1 5,2 9,1 -3,9 16,0
C 2 9,8 5,2 4,6 31,4
VIII STM1056 E-5
VIII STM1024 Rblc, E-6 P1 1 7,0 6,2 0,8 73,5
P1 2 6,2 7,0 -0,8 73,5
P2 3 7,0 6,2 0,8 73,5
VIII STM1005 Pi-8 P2 1 4,6 10,2 -5,6 4,8
C 2 8,2 10,3 -2,1 57,5
IX STM1102
IX STM1051 Pi-9
IX STM3012 Pi-9
X STM1051 Rber P2 1 5,6 6,2 -0,6 81,7
P1 2 7,0 4,3 2,7 25,2
C 3 13,9 7,4 6,5 11,5
XI STM1009 Pi-11 P1 1/3 11,4 4,2 7,2 3,5
(via BS2) P2 2/4 13,9 5,1 8,8 4,0
XI STM0037
XI STM0025 RP-11,Pi-19 P2 1 3,7 7,0 -3,3 18,7
C 2 9,4 8,0 1,4 63,8
XII STM0007
XII STM0030
XII STM2028 Pi-12
75
b) QTA genotyping en la familia G (jam x gon).

I STM1029 Pi-1
I STM2020a Pi-1
I STM2030
II STM5011 Pi2a
II STM0038 Pi2b C 1 7,9 15,3 -7,4 40,4
P1 2 9,8 9,0 0,8 81,9
II STM1064 Pi2c C 1 9,8 5,2 4,6 31,4
III STM1054 Pi3b
III STM0040 FB-1, Pi-3a P1 1 11,1 8,1 3,0 43,9
P2 2 11,9 7,1 4,8 29,1
III STM1025 Pi3c,d P1 1 14,1 4,9 9,2 2,0
P2 2 5,4 11,8 -6,4 4,7
V STM1041 PiFTve-5a, Pi5a,R1, PiFTve-5c P2 1 9,8 4,4 5,4 27,8
V STM0013 PiFTve-5b P2 1 7,2 12,3 -5,1 33,1
P2 2 11,0 7,6 3,4 48,1
P1 3 15,3 7,2 8,1 4,3
C 4 13,9 7,3 6,6 11,5
V STM1020 Pi-5b
VI STM0019 Pi-6a C 1 6,3 14,0 -7,7 11,5
P1 2 7,1 11,1 -4,0 30,3
P2 3 10,9 3,1 7,8 4,6
VI STM1100 FB-6 P2 1 10,8 5,6 5,2 12,2
C 2 9,4 8,0 1,4 63,8
VI STM1056 PI-6b
VII STM1065 Pi-7a
VII STM1003 Pi7b P1 1 4,4 9,8 -5,4 42,0
P2 2 8,7 9,7 -1,0 82,4
C 3 8,2 10,3 -2,1 57,5
VII STM0052 Pi7b
VIII STM1056b E-5
VIII STM1024 Rblc, E-6 P1 1 5,5 9,9 -4,4 33,9
P2 2 6,8 10,7 -3,9 23,0
P1 3 9,9 55,0 -45,1 33,9
P2 4 10,7 6,8 3,9 23,0
VIII STM1005 Pi-8 C 1 8,0 11,2 -3,2 51,0
P1 2 8,4 9,8 -1,4 72,4
P2 3 9,8 7,2 2,6 69,9
P2 4 6,2 9,8 -3,6 54,1
IX STM1102
IX STM1051
IX STM3012 Pi-9
X STM0051 Rber C 1 8,3 10,2 -1,9 68,7
P2 2 11,1 5,2 5,9 4,1
XI STM2009 Pi-11
XI STM0037 Pi-11
XII STM0007
XII STM0030
XII STM2028 Pi-12
76
c) QTA genotyping en la familia N (H88-31/34 x rap).

I STM1029 Pi-1
I STM2020a Pi-1
I STM2030
II STM5011 Pi2a No se evaluó
II STM0038 Pi2b P2 1 6,0 6,6 -0,6 30,8
P1 2 6,3 6,0 0,3 61,3
II STM1064 Pi2c P1 1 5,3 5,2 0,1 96,2
P2 3 6,3 5,8 0,5 44,0
C 2 6,3 5,5 0,8 20,2
III STM1054 Pi3b No se evaluó
III STM0040 FB-1, Pi-3a
III STM1025 Pi3c,d No se evaluó
IV STM3016 Pi-4a1,4b No se evaluó
IV STM1050 R2,Pi-4a2 No se evaluó
V STM1041 PiFTve-5a, Pi5a,R1, PiFTve-5c P1 1 6,5 6,2 0,3 70,6
P2 3 6,7 6,0 0,7 29,0
V STM0013 PiFTve-5b P2 1 5,7 6,5 -0,8 20,0
P1 2 6,4 5,9 0,5 37,4
V STM1020 Pi-5b
VI STM0019 Pi-6a
VI STM1100 FB-6 C 1 6,6 6,1 0,5 47,6
P1 2 6,7 5,6 1,1 4,9
VI STM1056 PI-6b
VII STM1065 Pi-7a No se evaluó
VII STM1003 Pi7b C 1 6,4 6,2 0,2 85,6
P1 2 6,4 6,4 0,0 92,1
VII STM0052 Pi7b C 1 5,9 6,4 -0,5 43,3
C 2 6,4 6,2 0,2 76,0
VIII STM1056 E-5
VIII STM1024 Rblc, E-6 P1 4 6,2 5,6 0,6 42,3
P2 2 5,3 6,3 -1,0 14,5
VIII STM1005 Pi-8
IX STM1102 No se evaluó
IX STM1051
IX STM3012 Pi-9 No se evaluó
X STM0051 Rber P2 1 6,0 6,2 -0,2 61,0
XII STM0007
XII STM0030
XII STM2028 Pi-12 No se evaluó
Leyendas: Crom: cromosoma; SSR: marcador SSR; QTL: QTLs asociados publicados; DE: descendencia de
alelos; P1: Madre, P2: Padre, C: Desconocido; FR: Número de fragmentos; V1, V0: Característica para la clase
de marcador presente, ausente de un alelo respectivamente; Dif: diferencia entre V1 y V0; Prob: nivel de
significancia [%] en negrilla; SSR marcado en gris muestra que no hubo segregación.
77
Tabla 28. Resumen de QTA genotipados para Resistencia a P. infestans (follaje + tuberculos) en cuatro diferentes poblaciones
Progenie: E (buk x phu) G (jam x gon) D (can x phu) N (dih tbr x rap)
hojas hojas tubérculos hojas tubérculos hojas tubérculos
Crom SSR QTL DE fr Prob DE fr Prob DE fr Prob DE fr Prob DE fr Prob DE fr Prob DE fr Prob
III STM0040 FB-1, Pi-3a P1 2 1,0
III STM1025 Pi3c,d P1 1 4,5 P1 1 2,0
P2 2 4,7
PiFTve-5a, Pi5a,R1,
V STM1041 PiFTve-5c P2 3 3.5
V STM0013 PiFTve-5b P2 3 4,0 P1 3 4,3
VI STM0019 Pi-6a P2 1 1,8 P2 3 4,6
P2 2 1,8
VI STM1100 FB-6 P2 1 0,3 P1 2 4,7 P1 2 4,9
VII STM1003 Pi7b P1 1 4,4
P2 1 5,0
VIII STM1024 Rblc, E-6 P2 2 4,9
VIII STM1005 Pi-8 P2 2 4,7 P2 1 4.8
X STM0051 Rber C 1 3,1
P2 3 1,4 P2 2 4,1
XI STM1009 Pi-11
XI Protein BS2 P1 1/3 3,5
P2 2/4 4,0
Leyendas: Crom: cromosoma; SSR: marcador SSR; QTL: QTLs asociados publicados; DE: descendencia de alelos; P1: Madre, P2: Padre, C: Desconocido; FR:
Número de fragmentos; Prob: nivel de significancia [%]
78
4.5. Análisis de genes candidato y otros marcadores
La Tabla 29 resume los resultados obtenidos en la utilización de los genes candidato y otros
marcadores moleculares descritos en la Tabla 4.
Tabla 29. Resultados de los marcadores y genes candidato analizados.

Marcador Productos de Selección Digestión Segregación
amplificación al azar
SSR
STM 5121 X X No aplica No hubo polimorfismo, se
observó que el marcador
fue monomórfico
Genes candidato basados en PCR
Hin -1 X X No aplica No hubo polimorfismo, se
fue monomórfico
Protein X X No aplica No hubo polimorfismo, se
Phosphatase – 2C observó que el marcador
fue monomórfico
Marcadores derivados de AFLPs (CAP)
E46M42.g X X X No hubo polimorfismo, se
fue monomórfico
Genes Candidato (CAP)
GP125 X X
No hubo polimorfismo, se X
fue monomórfico
NL25 X X X No hubo polimorfismo, se
fue monomórfico
NL27 X X X No hubo polimorfismo, se
fue monomórfico
Gen candidato obtenido por expresión diferencial obtenido por cDNAs y Microarrays
Protein BS2 X X No aplica Si hubo polimorfismo
(TC148920)
En el caso del CAP GP125 se observó una banda clara a los 1000 bp. Con el CAP
E46M42.g se observó una banda clara a los 179 bp. Trujillo (2004), observó que el marcador
CAP e46m42g estaba a 196 bp. El CAP NL27 mostró una banda a 1000 bp, pero no en todos
los genotipos. El CAP NL25 mostró una banda a los 850 bp de altura.
Una vez realizado la digestión de todos los marcadores que mostraban una banda de
interés en la progenie, está no evidenció ninguna segregación de alelos que indicaran la
presencia del gen de interés para resistencia a P. infestans. Se observaron dos bandas que
confirman la condición homocigotica de la progenie N, esto significa que los marcadores
79
CAPs probados fueron monomórficos para esta población. Trujillo (2004), encontró dos
bandas al aplicar el marcador CAP e46m42g en phu, revelando su condición homocigótica.
También se realizó la PCR para los marcadores CAP NL27 y NL25 en las progenies D, E
y G, pero no hubo amplificación.
Por otra parte, en el caso del gen candidato proveniente de cDNA y microarrays, el
marcador MA8 (BS2), se observó que los productos de amplificación segregaban en las
progenies (SEG), dando polimorfismos en las progenies D, E, G y N. En varios casos no hubo
productos de amplifacación (NA) y en varios los productos fueron monomórficos (NS). Este
es el caso del 34 K PORIN (MA4) y de marcador MA11 (putativo Acetil CoA
deshidrogenasa) en el mapa UHD. El precursor patatin (MA1) segregado en la progenie G
MA11 y el segregado en la progenie E. La proteína de resistencia a enfermedades BS2 (MA8)
segregó en todos casos estudiados (Tabla 30).
Table 30. Evaluación de poliformismo de genes candidato derivado del análisis de cDNAs y
microarrays en progenies fenotipadas para resistencia a P. infestans.
Código Gen Polimorfismo

Marcador UHD PrD PrE PrG PrN
MA1 Precursor putativo sucrosa –no-inducible S. brevidens -- NS NS SEG NS
MA2 Proteina putativa de Resistencia a enfermedades RPR1 -- NA NA NA NA
MA3 Proteina transportadora Ubiquitina 4 -- NA NS NA NA
MA4 34K porin – papa (S. tuberosum) SEG NS NS NS NS
MA5 Proteinas específicas serina/tronina-kinasa -- NS NS NS NS
MA6 Proteina resistente a enfermedades Prf – tomate -- NA NA NA NA
MA7 Proteina putativo acompañante de cobre Putative (CCH) -- NS NS NS NS
MA8 Proteina resistente a enfermedades BS2 SEG SEG SEG SEG SEG
MA9 Putative disease resistance protein I2 -- NA NA NA NA
MA10 myb-relacionado con la transcripción del factor THM18 - -- NS NS NS NS
tomate
MA11 Putativo acyl-CoA dehydrogenasa SEG NS SEG NS --
MA13 Proteina resistente a tizón tardío NS NS NS NS NS
PrD PrE PrG PrN = Progenies, NS = No segrega, NA = No Amplifica, SEG = Segrega
Respecto al tizón de hoja no se observó efecto de las bandas de los padres del gen
candidato MA1 (patatin precursor). El gen candidato protein BS2, mostró polimorfismo en la
progenie D, segregando dos productos de amplificación, uno de cada uno de los padres, que
puso de manifiesto marcadas diferencias en los niveles de resistencia a P. infestans entre sus
estados alélicos, pero sin significación estadística (Tabla 31a). Los resultados de asociación
con el mapa poblacional ultradenso indicaron que este cDNA se asocia con el QTL Pi-11 en
80
el cromosoma XI. Este gen candidato no mostró efectos significativos al Pr<0,05 de

probabilidad para P. infestans en la resistencia de hoja en la progenie N y D, así como el
gen candidato MA1 en la progenie G.
Sin embargo, con respecto a la resistencia en tubérculos se ha detectado en la misma

población D efectos significativos al Pr<0,05 del gen BS2 para el alelo de P2 (phu) (Tabla
31b). El mismo efecto se observó en la resistencia de hoja para el alelo de P2 (phu) del gen
BS2 en E y para la resistencia en tubérculo para el alelo de P1 (dih tub) en la progenie N.
Estos resultados confirman la importancia de este gen de resistencia conocida.
Tabla 31. Evaluación de genes candidato proteín BS2 (TC148920) derivado del análisis de
cDNAs y microarrays en progenies fenotipadas para resistencia a P. infestans.
a. P. infestans en hoja
Marcador Gen Progenie V1 V0 Dif Prob QTL Crom

asociado
MA1 – P2 Patatin precursor G 51.3 52.8 1.5 89.4% --- ----
MA8 – P1 Resistencia a enfermedades D 45.1 66.1 20.0 14.8% Pi-11 XI
protein BS2 (TC148920)
MA8 – P1 protein BS2 (TC148920) E 86.3 74.0 12.3 58.5% Pi-11 XI
MA8 – P2 Resistencia a enfermedades E 62.4 105.0 42.6 2.4% Pi-11 XI
protein BS2 (TC148920)
MA8 – P2 protein BS2 (TC148920) N 92.0 103.7 11.7 63.9% Pi-11 XI
MA8 – P1 Resistencia a enfermedades N 99.9 97.8 2.1 94.1% Pi-11 XI
Protein BS2 (TC148920)
MA11–P2 Putative acyl-CoA E 86.6 76.2 10.4 55.6% ---- ---
dehydrogenase
Continuación Tabla 31...
b. P.infestans en tubérculo
Marcador Gen Progenie V1 V0 Dif Prob QTL Crom

asociado
MA8 – P1 Resistencia a nfermedades D
Leyendas: Crom: cromosoma; Característica para la clase de marcador presente, ausente de un alelo
respectivamente; Dif: Diferencia entre V1 y V0; Prob: nivel de significancia [%] en negrilla
81
5. Discusión
82
En el presente estudio se analizaron y genotiparon progenies provenientes de

cruzamientos entre especies silvestres diploides (can, buk, jam y rap) y diploides cultivadas
phu, gon y un dih tbr.
Hemos encontrado en todas las progenies una elevada variación de la resistencia tanto en
hoja como en tubérculo a P. infestans, como prerrequisito para poder encontrar QTLs.
La correlación entre resistencia en hoja y resistencia en tubérculo fueron bajos, negativos

(-0.069 a 0.328) y no significativos. Esto indicó que probablemente los genes de resistencia a
P. infestans en hoja y tubérculo fueron diferentes. Estos resultados concuerdan con lo
reportado por Collins et al. (1999), que observaron una correlación negativa de la resistencia a
P. infestans entre ambos órganos, en una población segregantes diploide de papa.
Se han descrito QTLs para la resistencia a P. infestans en los 12 cromosomas de papa,

parte de ellos validados por varios autores. Los marcadores SSRs establecidos por Milbourne
et al. (1998), permitieron asociar los marcadores SSRs para todos los loci. La proyección de
los marcadores SSRs a QTLs conocidos permite reducir los esfuerzos en el análisis de las
características en un nuevo entorno genético. Todas las posiciones conocidas pueden ser
analizadas para detectar la presencia de un QTL, determinando solamente la estrecha
vinculación del marcador SSR en una nueva población. Se ha analizado estas posiciones de
QTLs por la presencia de QTAlelos diferenciados en cuatro diferentes progenies y se han
detectado QTLs seleccionables para resistencia de hoja y tubérculo en todos los experimentos.
De esta manera se ha creado una "impresión genotípica " de cada uno de los parentales (QTA
genotipado), indicando posiciones de QTLs seleccionables y los correspondientes marcadores
para selección asistida por marcadores moleculares (SAM) en los diferentes entornos
genéticos.
La progenie C (oka x phu) no fue posible genotiparla, pero si se estudió su resistencia a

P. infestans, por considerársela una fuente valiosa de resistencia a éste patógeno tanto en hoja
como en tubérculo. Cabe mencionar que oka es una especie silvestre diploide tuberífera, que
está distribuida entre Bolivia y Argentina (Ochoa 2001, Patiño et al. 2007, García et al. 2007.
Coca 2007, Saffarano et al. 2008). Se encontró en el presente estudio que los genotipos de la
progenie C mostraron buenos niveles de resistencia a P. infestan en hoja, confirmando lo que
afirman algunos investigadores como Barquero et al. (2005), que encontraron en genotipos
83
provenientes de las hibridaciones somáticas y/o cruces con las especies silvestres S.
bulbocastanum, S. circaeifolium y S. okadae, niveles altos de resistencia a P. infestans. De
igual manera Brigneti et al. (2004), han logrado encontrar niveles altos de resistencia en S.
bulbocastanum, S. brachistotrichum, S. mochiquense, S. berthaultii, S. microdontum. S.
okadae y S. neorossii y han logrado el mapeo de poblaciones para la mayoría de las
resistencias y el mapeo de genes R en las especies mencionadas. Sin embargo, no se ha
encontrado antecedentes de evaluaciones de resistencia en tubérculos en la especie oka y
tampoco en híbridos somáticos y/o en cruzamientos.
En el caso de la progenie D (can x phu), se observó una mayor proporción de genotipos

resistentes que en la progenie C, denotando altos niveles de resistencia en la progenie
evaluada. S. canasense es una especie silvestre diploide ampliamente distribuida en Perú y
Bolivia, (Ochoa 2001). Esta especie ha sido descrita como valiosa fuente de resistencia a
Streptomyses scabies (Hosaka et al. 2000), al nematodo-quiste (Globodera pallida) (Castelli
et al. 2006) e insectos. Hawkes (1991), reportó que can es una especie resistente a P.
infestans. El genotipado de la progenie D detectó un QTL en el cromosoma VIII (Pi-8). Este
QTL fue descrito por Oberhagemann et al. (1999) en un estudio de cinco familias, obtenido
del cruzamiento entre siete diferentes clones diploides de papa y Trognitz et al. (2002), lo
reportó en un estudio de una población diploide de phu x dih tbr y probablemente un QTL
localizado en el cromosoma X (Rber), que fue descrito por Collins et al. (1999), en una
población segregante de papa diploide. A nivel de resistencia en tubérculo se detectaron
cuatro QTLs en los cromosomas VII (Pi7b), VIII (Pi-8), XI (Pi-11), que provienen de can y
phu. La presencia de estos QTLs fueron reportados por Oberhagemann et al. (1999), Collins
et al. (1999) y Leonards-Schippers et al. (1994). Es importante resaltar que en el presente
estudio el QTL del cromosoma XI (Pi-11) fue detectado via un gen candidato BS2.
Una interesante fuente de resistencia a P. infestans ha sido la utilización de la especie

silvestre diploide S. bukasovii (progenie E), en el programa de mejora genética de papa. Esta
especie se distribuye principalmente entre Bolivia y Argentina (Ochoa 2001, Spooner et al.
1994, García et al. 2007, Patiño et al. 2007) y ha sido descrita como resistente a P. infestans
por Hawkes (1991). En el presente estudio se encontró que es posible transferir genes de
resistencia a P. infestans de buk a las cultivadas. En la progenie E, también se encontró altos
niveles de resistencia a P. infestans en tubérculos. En esta progenie se detectaron cuatro QTLs
seleccionables en los cromosomas III (Pi3c,d), V (PiTFve-5b), VI (Pi-6a) y X (Rber), que
84
provienen de buk. Resultados similares fueron reportados por Oberhagemann et al. (1999) y
Collins et al. (1999), que describieron la presencia de estos QTLs.
En la progenie G (jam x gon), hay una predominancia de genotipos con alta resistencia a
P. infestans, en follaje y en tubérculo, esto sugiere probablemente la presencia de genes R.
Solanum jamessi es una especie que está distribuida entre México y Estados Unidos y ha sido
reportada como tolerante a helada (Hijman et al. 2003). El genotipado de la progenie G, se
detectaron tres QTL seleccionables en los cromosomas III (FB-1, Pi-3a), VI (FB-6) y VII (Pi-
7b). Los QTAlelos significativos fueron observados en los cromosomas VI para gon y dos
lugares para jam. Estos resultados confirman lo reportado por Collins et al. (1999) y
Oberhagemann et al. (1999). Un aporte importante del genotipado de la progenie ha sido el
relacionarlo con la resistencia a P. infestans en tubérculos, en la que se detectaron QTL
seleccionables en los cromosomas III (Pi-3c,d), V (PiFTve-5b), VI (Pi-6a) y X (Rber). El
locus del cromosoma III mostró efectos significativos de los alelos de los parentales jam y
phu. También el locus del cromosoma V fue significativo para el parental jam.
En la progenie N (dih tbr x rap), fueron detectados tres QTLs seleccionables que se
encuentran en los cromosomas V (PiFTve-5a, Pi5a, R1, PiFTve-5c), VI (FB-6) y VIII Rblc,
E-6. Dos de ellos (en los cromosomas V y VIII) descienden de rap y una del dih tbr (VI).
Sólo se detectó un QTL para tizón en tubérculo en cromosoma VI (FB-6) y que proviene del
dih tbr y no así de rap. S. raphanifolium es una especie principalmente distribuida en Perú y
se considera que es un híbrido natural entre S. canasense y S. megistacrolobum, lo cual fue
mencionado por Ugent en 1970, y confirmado en un estudio por Spooner et al. (2001). Pérez
et al. (2002), reportaron a rap como una especie con alta resistencia a P. infestans, y con
presencia de resistencia cuantitativa y cualitativa. Posteriormente Wulff et al. (2003),
encontraron dos especies silvestres promisorias por su resistencia a P. infestans (S.
raphanifolium y S. megistacrolobum).
La diferencia en los QTLs seleccionables para P. infestans en cada progenie analizada

refleja la “no correlación” de la resistencia a P. infestans en ambos órganos. Al respecto
Oberhagemann et al. (1999), observaron que plantas con alelos en el QTL del cromosoma V,
mostraron incremento de la resistencia a P. infestans en hoja, pero hubo decrecimiento en la
resistencia en tubérculo.
85
Es importante resaltar que nosotros sólo podemos diferenciar QTL seleccionables. Esto
requiere que tanto el marcador sea polimórfico, como que la configuración alélica del QTL
sea apropiada.
Se debe enfatizar que lo que se mide son diferencias entre mezclas de genotipos y
diferencias de efectos de alelos probables en cada parental: q1/q2 x q3/q4 = [(q1q3 + q1q4)]
– [(q2q3 + q2q4)], los efectos entre q1 y q2 tienen que ser diferentes más las posibles
interacciones desconocidas. El QTL (gen que influye en el carácter) estará en todo caso, pero
no es detectable (configuración alélica desconocida) ni se conocen sus efectos.
Respecto al segundo requisito que el marcador indirecto tiene que ser polimórfico, hemos
visto que esto no se cumple en muchos casos. Por ejemplo no hemos podido evaluar QTLs en
los genotipos en los cromosomas I, IV, IX y XII de las progenies D, E, G y N, debido a que
varios SSRs no segregaban en ninguna familia.
Por otra parte aunque los SSRs en principio funcionan en diferentes entornos de la misma
región genómica, puede desaparecer su polimorfismo si por ejemplo el nuevo parental es
homocigoto para el alelo, esto hace que no haya segregación.
En el estudio se utilizaron novedosas fuentes de resistencia genética a P. infestans como

fueron las especies silvestres diploides (2n = 2x =24) can, oka, buk, rap y las diploides
cultivadas phu, gon y dih tbr. Las especies silvestres tienen altos niveles de resistencia a P.
infestans que pueden ser transferidos a sus progenies; sin embargo, la primera generación
filial que producen no son aptas para obtención de nuevas variedades por selección en campo,
por lo que será necesario que las progenies obtenidas sean evaluadas y seleccionadas por
resistencia a P. infestans en primera instancia y los individuos más aptos podrían entrar en un
programa de retrocruzamientos sucesivos hacia tbr y/o adg.
Este proceso de retrocruzamiento y selección se hace tedioso cuando se deben evaluar

muchas progenies, por lo que es en estos momentos cuando la SAM podría tener su aplicación
práctica e importante, ya que permitiría en corto tiempo seleccionar de manera segura los
genotipos que llevan el carácter de interés.
De ahí que en el presente trabajo, se han validado numerosos marcadores moleculares

SSRs y genes candidato, que fueron utilizados en otros diferentes entornos genéticos. Sin
86
embargo, con este estudio se ha podido detectar que varios de estos marcadores son válidos y
podrían ayudar a la SAM, a pesar de haberse obtenido en entonos genéticos particulares.
Es de resaltar que existen marcadores indirectos y directos. En los marcadores indirectos

hay ciertas distancias entre el marcador y un gen de interés y puede haber recombinaciones. A
este tipo de marcadores pertenecen los SSRs que son muy polimórficos pero se pueden
también seleccionar “falsos alelos”, debido a las recombinaciones. Esto requiere aumentar el
número de SSRs disponibles.
En cambio, los marcadores directos permiten la identificación directa de los alelos de un

gen de interés y se pueden aplicar independientes del entorno genético, son normalmente
derivados de regiones codificantes (coding regions) como ESTs, TDFs, utilizando diferentes
técnicas moleculares. Los genes candidato son interesantes en este sentido, pero tienen la
desventaja de que no son tan polimórficos que los SSRs. Así por ejemplo, nosotros evaluamos
CAPs en cuatro progenies, en los cuales no observamos polimorfismo.
Aun cuando se observaron amplificaciones de la PCR con los marcadores CAPs

utilizados; sin embargo, no se observó polimorfismo luego de la digestión con enzimas. Esto
no implica que los CAPs no funcionen, sino que es probable que en el entorno genético que
se evaluó no haya habido reacciones, pero será conveniente seguir afinando el método en
otros entornos genéticos para ir saturando los cromosomas donde se hallan posiciones de QTL
publicados en el mapa UHD para resistencia a P. infestans.
Estos marcadores probablemente se pueden aplicar en los programas de mejora genética

de papa para todos los cruzamientos que involucren el genotipo parental correspondiente
como fuente de resistencia.
La utilización de cualquier marcador para SAM de caracteres monogénicos resulta más

sencillo, pero no deja de ser un trabajo arduo, debido a que se debe poner inicialmente a punto
las técnicas, encontrando sus temperaturas de anillamiento apropiadas y ver si genera
polimorfismo en las poblaciones genotipadas, lo cual lleva tiempo, recurso y trabajo, Esto
requiere la automatización del proceso.
Por otra parte, existen varias aplicaciones prácticas para genes candidatos detectados
como análisis de su diversidad alélica, transformación genética o referencias cruzadas a través
de la integración en mapas de ligamiento. Los estudios de diversidad alélica en diferentes
87
germoplasmas puede permitir asociar variantes alélicas específicas con un genotipo particular
detectar los alelos más efectivos y de esta manera proporcionar marcadores útiles para la
selección asistida (SAM).
La referencia cruzada a mapas de ligamiento permite integrar los resultados de diferentes

estudios mediante el diseño de cebadores apropiados para mapeo. Si un cDNA particular se
integra en el mapa muy cercano a un QTL conocido, entonces dicho TDF puede
potencialmente explicar el QTL. Así por ejemplo, Hernández et al. (2008) obtuvieron
polimorfismos segregantes en el caso de BS2 (TC148920). Este cDNA pudo ser mapeado en
un mapa de referencia de papa en el cromosoma XI y fue co-localizado con el QTL Pi-11b. Se
observó que este cDNA segregó en la progenie D (can x phu), y representa el mismo QTL
para P. infestans en el cromosoma XI. Sin embargo, un gen ligado puede ser el verdadero
responsable del efecto del QTL. Por lo que será necesario en el futuro realizar experimentos
de silenciación para verificar la función. Si el gen candidato representara un falso positivo, al
menos podría ser utilizado como un marcador de un alelo específico para SAM.
Finalmente, las proteínas derivadas de los genes candidato que muestran una eficacia
probada contra patógenos, se pueden producir en sistemas de recombinación adecuados para
su aplicación como biopesticidas.
88
6. Conclusiones
89
1. Las progenies provenientes de los cruzamientos entre especies silvestres y cultivadas

mostraron una amplia variabilidad frente a la resistencia para P. infestans en hoja y
tubérculo.
2. No se ha encontrado correlación significativa entre la resistencia en hoja y tubérculo para

este patógeno en las familias generadas en los cruzamientos.
3. La no existencia de correlación se refleja en la detección de diferentes QTLs en hoja y

tubérculo.
4. Se ha realizado la integración genética y fenotípica en un mapa poblacional UHD de

todos los loci de QTL publicados hasta la fecha.
5. En la progenie D se ha detectado un QTL de resistencia a P. infestans en el cromosoma

VIII que proviene de Solanum phureja, lo que muestra que esta especie posee genes de
resistencia cuantitativa.
6. En la progenie E se detectaron cuatro QTLs de resistencia a P. infestans en los

cromosomas III, V, VI y X, que provienen de S. phureja y uno en el cromosoma III, del
parental S. bukasovii, lo que muestra que ambos parentales son fuentes valiosas de
resistencia a P. infestans.
7. En la progenie G, se han detectado dos QTL seleccionables en los cromosomas III, y VII,
provenientes del parental S. jamessii y un QTL de resistencia a P. infestans en el
cromosoma VI de S. goniocalyx, lo cual confirma a S. jamessi como una fuente potencial
de resistencia a esta enfermedad.
8. En la población N fueron detectados tres QTLs seleccionables en los cromosomas V, VI

y VIII; dos de ellos (en los cromosomas V y VIII) descienden del parental S.
raphanifolium, lo que mostró que ésta última especie se podría utilizar como otro
germoplasma de resistencia a P. infestans.
9. Varios marcadores SSRs utilizados no mostraron segregación de alelos SSR en todas las
poblaciones, lo que puede indicar que aunque en principio los SSRs funcionan en
diferentes entornos de la misma región genómica puede desaparecer su polimorfismo si el
parental es homocigoto para el alelo, lo que hace que no haya segregación.
10. Para tubérculo en la progenie D se han detectado tres QTLs seleccionables en los
cromosomas VII, VIII y XI que provienen de S. phureja, lo que confirma a esta especie
como una fuente de resistencia en tubérculo para este patógeno.
90
11. En la progenie G, fueron detectados cuatro QTls seleccionables en los cromosomas III,
V, VI y X. Dos de ellos (cromosomas III y V) provienen del parental S. jamesii y otros
dos (cromosomas VI y XI) de S. goniocalyx. Esto puede indicar que ambos parentales
son nuevas fuentes de resistencia.
12. En la progenie N se detectó un QTL en el cromosoma VI que provino del progenitor

dihaploide S. tuberosum, lo que mostró que S. raphanifolium, no transfiere genes de
interés a la progenie para resistencia a P. infestans.
13. Los QTAs genotipados de tizón de hoja y tubérculo mostraron QTLs comunes a dos
bases genéticas en las progenies G y N a pesar de que descienden de parentales
diferentes. Se han detectado también QTLs no comunes en cuatro poblaciones. En
algunos casos los QTLs también fueron comunes para la resistencia en tubérculo y hoja
en la misma población, como en la progenie G, D y N, mientras que muchos de ellos son
específicos para los distintos órganos de la planta como las progenies G, D y N. Esto
indica que probablemente varios genes de resistencia a P. infestans son comunes en las
diferentes especies para resistencia en hoja y tubérculo y que otros solamente lo son para
uno u otro órgano.
14. Los marcadores CAPs no mostraron segregación en la progenie N, lo cual indica que
fueron monomórficos y la progenie probablemente estaba en fase homocigótica.
15. El QTL del cromosoma XI (Pi-11) fue detectado via un gen candidato BS2, lo cual podría
ser útil como un marcador de un alelo específico para la selección asistida.
91
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Resumen
En el presente estudio fueron analizados y genotipados progenies resistentes a
Phytophthora infestans, derivados del cruzamiento entre especies silvestres (oka, can, buk,
jam y rap) y especies cultivadas diploides de papa (phu, gon y dih tbr). Diferentes niveles de
resistencia al oomycete P. infestans en hojas y tubérculos fueron encontrados en las cinco
progenies evaluadas. El análisis de co-localización entre los marcadores SSR y QTLs
posicionados publicados para resistencia a P. infestans reveló 28 marcadores SSR ligados y
localizados en los 12 cromosomas de papa. Por otra parte suficientes variaciones en los
niveles de resistencia se han obtenido dentro de la progenie de todas las fuentes de resistencia,
lo que permitió un eficiente análisis de QTL. La selección de QTLs para resistencia a P.
infestans en hojas a través de marcadores SSR reveló que en la progenie D (can x phu), sólo
un QTL fue detectado en el cromosoma VIII, que desciende de phu. En la progenie E (buk x
phu) se ha detectado cuatro QTL seleccionables ubicado en los cromosomas III, V, VI y X.
Sólo uno en el cromosoma III descendiente de can. En la progenie G (jam 27521.48 x gon) se
detectaron tres QTLs seleccionables en los cromosomas III, VI y VII de acuerdo a los valores
de significancia. QTAlelos significativos fueron observados en los cromosomas VI para el
parental gon, y dos lugares para jam. Algunos marcadores SSR no mostraron segregación de
alelos SSR en la población. La selección de QTL también se realizó para tubérculo de
P.infestans en tres poblaciones. El análisis de correlación de los niveles de infección de hoja y
tubérculo fueron bajos (-0.069 a 0.328) y no significativos. Esto también se reflejó en QTLs
detectados en cada población de resistencia en tubérculos. En la población G fueron
detectados tres QTLs seleccionables. El QTL en el cromosoma VI que desciende del parental
gon fue común para resistencia en tubérculo y hojas. Los otros dos QTLs se encontraron en
los cromosomas X y V y desciendieron de jam y gon, respectivamente. En la población D el
QTL de phu en el cromosoma VIII fue común para P. infestans de tubérculo y hoja. Además,
fue detectado un QTL en el cromosoma XI a partir del gen candidato BS2 que puede coincidir
con el QTL Pi-11 publicado. Se ha creado una "impresión genotípica" de cada uno de los
parentales, indicando las posiciones de QTLs seleccionables y los correspondientes
marcadores moleculares SSRs para la selección asistida por marcadores (SAM) en diferentes
progenies. Estos marcadores pueden ser aplicados en los programas de fitomejoramiento de
papa para todos los cruzamientos que involucran el correspondiente genotipo parental como
fuente de resistencia.
106
Summary
In the present study were analyzed and genotyped progenies resistant to Phytophthora
infestans, derived from crosses between wild diploid (oka, can, buk, jam and rap) and
cultivated species diploid potato (phu, gon and dih tbr). Different levels of resistance to
oomycetes P. infestans in the leaves and tubers were found in the five tested progenies tested.
Co-location analyses between SSR markers and published QTLs positions for P.infestans
resistance revealed 28 linked SSR markers located on all 12 potato chromosomes. On the
other hand sufficient variations in resistance levels were obtained within the progenies of all
resistance sources, allowing an efficient QTL analyses. QTL screening for P. infestans
resistance in leaves through linked SSR markers revealed that in progeny D (can x phu) only
one QTL was detected on chromosome VIII which descends from phu. In progeny E (buk x
phu) we have detected four selectable QTLs located on chromosomes III, V, VI and X. Only
one on chromosome III descended from can. In progeny G (jam x gon) were detected three
selectable QTLs on chromosomes III, VI and VII. Significant QT allele effects were observed
on chromosome VI for parent gon, and at two locations in jam. Some SSR markers did not
show segregating SSR alleles in the populations, so that it was not possible to evaluate the
corresponding genomic locations. QTL screening was also performed for tuber infections
with P. infestans in three populations. Correlation analyses between leaf and tuber infection
levels were low (-0.069 a 0.328) and not significant. This is also reflected in the detected
QTLs in each population. In population G three selectable QTLs for late blight resistance
were detected. The QTL on chromosome VI descending from gon was common for leaf and
tuber resistance. The other two QTLs were located on chromosomes V and X and descended
from jam and gon, respectively. In population D the QTL from phu on chromosome VIII was
common for tuber and leaf blight. In addition one QTL was detected on chromosome XI
which showed significant QTAllele difference between published QTLs for P. infestans
resistance and cDNAs. Moreover, on chromosome VII an additional, significant SSR allele
common to both parents was observed. We have thus created a "genotypic fingerprint" of
each of the parent, indicating positions of QTL selectable the corresponding SSR markers for
molecular markers assisted selection (MAS) in different progenies. These markers can be
applied in programs of potato breeding program for all crosses involving the corresponding
parental genotype as a source of resistance.
107
Acrónimos
ABCPPIrel = Area Bajo la Curva de progreso de P. infestans relativo
AFLP = Amplified Fragment Length Polymorphisms
bp = base pairs (pares de bases)
CAPS = Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (Secuencia polimórfica amplificada y

cortada)
cDNA = DNA complementario
COS = Conserved Ortholog Set
EST = Expressed Sequence Tag
ISTR = Inverse Sequence-Tagged Repeat
ISSR = Inter-Simple Sequence Repeat
PCR = Polimeraza Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa)
QTA = Quantitative Trait Alello
QTL = Qantitative Trait Loci
RAPD = Random Amplified Polymorphic
RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism (Polimorfismo de la longitud de los

fragmentos de restricción)
SAM = Selección Asistida por Marcadores moleculares
SCAR = Sequence Characterized Amplified Region
SSR = Simple Sequence Repeats (secuencia simple repetida o microsatélite)
TDF = Target DNA Fragment (Marcador segregante)
UHD = Ultra High Density (mapa ultradenso)
108

Aplicación de Marcadores Moleculares para Cribado de QTLs en Diferentes Fuentes de Resistencia A Tizón Tardío (Phytophthora Infestans) en Papa

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Aplicación de Marcadores Moleculares para Cribado de QTLs en Diferentes Fuentes de Resistencia A Tizón Tardío (Phytophthora Infestans) en Papa

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Memoria presentada por

D. Julio Luis Gabriel Ortega

Aplicación de marcadores moleculares para cribado de QTLs en

Dr. JOSÉ IGNACIO RUIZ DE GALARRETA GÓMEZ.

Universidad Pública de Navarra

D. ENRIQUE RITTER AZPITARTE en su calidad Investigador principal de

y D. JOSÉ IGNACIO RUIZ DE GALARRETA GÓMEZ en su calidad de

Que D. JULIO LUIS GABRIEL ORTEGA, Ingeniero Agrónomo ha realizado bajo

“Aplicación de marcadores moleculares para cribado de QTLs en

Y para que así conste en cumplimiento de la legislación vigente, expedimos el siguiente

Pamplona, 01 de diciembre del 2008

En principio deseo agradecer de manera especial al Dr. Antonio Gandarillas,

Agradezco de manera particular a la Dra. Pamela Anderson, Directora del CIP, y

A la Dirección de Neiker Tecnalia, por haberme acogido en esta prestigiosa

Al proyecto europeo FOOD-CT-2005-513959 (Bioexploit) y al proyecto

De manera muy especial quiero expresar mi agradecimiento a Mónica Hernández,

A la Dra. Sonia Castañon, jefa del departamento de biotecnología de Neiker

Quiero agradecer de forma muy especial a ese equipo maravillo de personas de

A Claudia por su apoyo y facilitación del material bibliográfico en la biblioteca de

No puedo dejar de agradecer su confianza, cariño y apoyo de mi familia,

Al Señor mi Dios, que me ha dado la vida, fortaleza, sabiduría e

1.1. Origen e importancia económica y social de la papa

La papa (es su nombre en quechua1) pertenece a la familia de las Solanáceas y al género

Probablemente, la papa se domesticó hace 10.000 años en el altiplano, entre Perú y

El número básico de cromosomas de las papas cultivadas y especies silvestres

La papa es uno de los cultivos alimenticios más importantes y difundidos a nivel

aproximadamente a 200.000 agricultores, lo que representa el 50% de las unidades agrícolas

1.2. Factores bióticos que afectan la papa

La producción de papa está fuertemente afectada por diversas enfermedades. Hooker

P. infestans, antiguamente clasificado en el reino fungi, Sub Reino talófitas, en la

Estudios bioquímicos y moleculares (Brasier y Hansen 1992) evidencian características

Evidencias de su similaridad estructural con los flagelados, su aparato mitótico, su

Heterocariontes. El género Phytophthora está actualmente incluido en el reino Choromista

1.3. Características biológicas de P. infestans

Si se examina al microscopio un corte transversal de una hoja, de una de las manchas, se

Figura 1. Micelio y esporangios de P. infestans (Foto: Urquijo et al. 1971)

La principal característica de los Oomycetes, es la presencia de un micelio cenocítico,

Según el proceso de infección que produce, P. infestans se clasifica como un patógeno

necrótroficos. Es decir que son biotróficos en el perímetro de la lesión, pero necrotróficos

A P. infestans se lo considera como el causante de una epidemia policíclica. Para ser

Figura 2. Ciclo de la enfermedad (epidemia policíclica) (Fuente: Adaptado de Hooker 1980)

1.4.1. Reproducción asexual

Figura 3. Esporulación de P. infestans en el envés de las hojas (Foto: Oscar Navia)

Los zoosporangios (esporangios o conidios), se desarrollan en el extremo de los

Figura 4. Producción de esporangios en el esporangióforo (Foto: Henfling 1987).

Los zoosporangios pueden germinar directa e indirectamente; la primera a temperaturas

Estos germinan indirectamente a temperaturas de 12 a 16ºC, desprendiendo entre 10-20

1.4.2. Reproducción sexual

La formación de oosporas ayuda a P. infestans y las especies afines a sobrevivir en

Figura 5. Núcleo del anteridio dentro del Oogonio (Foto: Anónimo).

1.5. Síntomas causados por P. infestans

En campo, los primeros síntomas de la enfermedad se presentan con frecuencia en las

Figura 8. Síntomas en tubérculos (Foto: Julio Gabriel)

En Latinoamérica no hay muchos estudios sobre la resistencia en el tubérculo, porque no

Se ha observado en tubérculos un tipo de resistencia horizontal. No se ha encontrado

1.6. Condiciones climáticas favorables para el desarrollo de P. infestans

Cuando la temperatura es óptima se requieren 8 horas de alta humedad para la producción

1.7. Distribución geográfica de la enfermedad

El tizón en Bolivia (Fig. 9), se encuentra en los departamentos de La Paz, Cochabamba,

1.8. Importancia económica de la enfermedad

El tizón tardío es considerado como la más grave enfermedad de la papa en todo el

En Bolivia, en términos económicos, el tizón tardío es una de las enfermedades más

pérdida causada por la enfermedad pone de relevancia la importancia de la enfermedad en