【biotin bioassay】

●試薬の調整
・M.R.S.培地 100ml
M.R.S.Broth 5.1g を DW100ml で溶解後（沸騰水浴中）、冷却後、 Tween 80 100ul を加え
る。
試験管に 3ml ずつ分注し、ステンレス栓でふたをする
オートクレーブ 121℃、15m、氷水中で冷却後、冷蔵保存

・ビオチン定量用基礎培地（用事調製）
　7.7g を DW80～90ml に加えて 2～3 分間煮沸溶解する。
　100ml にメスアップ（2N　HCl で pH7.1 に調整？）。オートクレーブで滅菌する。

・ビオチン標準溶液
　D-biotin（純度 97％以上、Wako）1mg を 50%Etoh 10ml に溶解後（100g/ml）、95%Etoh
で 10 倍希釈（10g/ml）。さらに、水で希釈し、標準溶液とした（1ng/ml）。

・0.9 ％NaCl
NaCl = 58.44（和光純薬工業株式会社、室温保存）
NaCl 4.5g を超純水で 500 ml にメスアップした．
3ml ずつ試験管に分注し、オートクレーブで滅菌する。

・2.25 M 硫酸
H2SO4 = 98.08
98.08 (mol / l)× 2.25 (M)× 10-3 × 50(ml) = 11.034
H2SO4 11.034 を秤量し，超純水で 10 ml にメスアップした。

・4.5M NaOH
　NaOH=40
　NaOH 9g を秤量し、超純水で 50ml にメスアップ。
　プラスチック瓶で保存する。

・サンプル
サンプル 100μl に 4.5N H2SO4100μl を加え、オートクレーブ 121℃、60m、行った後、
4.5N NaOH100μl で中和する。適宜希釈して用いる。
乳酸菌 Lactobacillus plantarum ATCC8014
　　　　　↓
前培養：M.R.S.Broth (Oxoid) 3ml で 37℃、CO25％、16～20h
　　　　　↓
3000rpm、10m
　　　↓　　　　　　　×3
0.9％NaCl で Wash
　　　↓
濁度が O.D. 610nm=0.14~0.16 になるように調整（菌溶液の約 0.01％）
　　　　　↓
接種菌液

サンプル 100ul またはビオチン標準溶液+

接種菌液（培地の 0.1%）＋ビオチン定量用基礎培地 100ul
ピペッティング
　　　↓
37℃、20h
　　　↓
吸光度測定（610nm）

ビオチン 接種菌溶液 1ng/ml

試験管 量(pg / 2 倍濃度基礎培 （OD 610nm=0.14～0.16） ビオチン標準液 滅菌水
No. tube) 地(l) （l） またはサンプル(l) （l）
1 0 100 10 0 100
2 20 100 10 20 80
3 40 100 10 40 60
4 60 100 10 60 40
5 80 100 10 80 20
6 100 100 10 100 0

サンプ 10 0
ル x 100 100