Βασικές αρχές της πρωτεωμικής ανάλυσης

και εφαρμογές στις αιματολογικές

κακοήθειες

Κων/νος Παπαδημητρίου, ΓΝΑ ΄΄Γ.Γεννηματάς΄΄ 1

Τι είναι το πρωτέωμα ?
 Το Πρωτέωμα είναι το σύνολο των πρωτεϊνών, που παράγονται από έναν
οργανισμό ή σύστημα, συμπεριλαμβανομένων των μεταβολών που
συμβαίνουν σε ορισμένες από αυτές.
 ο όρος "Proteome" χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά από τον Wilkins το
1995 για να περιγράψει το πρωτεϊνικό αντίστοιχο του γονιδιώματος

2
Η Πρωτεωμική είναι η μελέτη
 πρωτεϊνικής έκφρασης
 μετά-μεταγραφικής τροποποίησης
 αλληλεπιδράσεων
 οργάνωσης και λειτουργίας σε καθολικό επίπεδο

 O αριθμός των παραγόμενων πρωτεϊνών είναι 6 με 7 φορές μεγαλύτερος

από τον αριθμό των υπεύθυνων για την κωδικοποίησή τους γονιδίων
 Τα δύο μεγάλα πεδία της πρωτεωμικής είναι η λειτουργική και η
συγκριτική πρωτεωμική

3
Human Proteome Organization
Human Proteome Organization (HUPO,
www.hupo.org) has postulated in 2001 the
aims of proteomics in a more precise manner
as identification of all proteins coded by
human
genome (and other genomes, especially those
of model organisms) with the subsequent
assessment of

a) their (protein) expression in different cell

types of the organism - expression
proteomics,

b) protein distribution in subcellular

compartments of the organelles,

c) posttranslational
modifications of the proteins,

d) protein-protein interactions (b-d constitute

the
structural proteomics)

e) relation between protein structure and

function (functional
4
proteomics).
Τεχνικές και μέθοδοι ανάλυσης

5
Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης
(SDS-PAGE)

6
Ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων σε πήκτωμα
(2D-GE)

7
Υγρή Χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC)

8
Φασματομετρία Mάζας (MS)

 Από το 1899 - Wilhelm Wien!

 προσδιορίζεται η χημική σύσταση ενός μείγματος -
δείγματος με βάση την αναλογία μάζας προς
φορτίο των φορτισμένων μορίων όταν τα
σωματίδια διέρχονται απο ηλεκτρικό κα μαγνητικό
πεδίο

9
Για αρχή... Ιονισμός

MALDI
(Matrix Assisted Lazer Dissorption Ionization)

10
Electrospray ionization (ESI)

11
Tύποι φασματομέτρων

12
Υπολογισμός χρόνου πτήσης
(TOF, Time-of-flight)

13
Τετράπολο – Quadrupole

14
ιοντοπαγίδα – Ion Trap

15
Tandem mass spectrometry (MS/MS)
 δύο η περισσότερα φασματόμετρα της ίδιας ή διαφορετικής τεχνικής
στην σειρά με ενδιάμεση διάσπαση σωματιδίων.
 Triple quadrupole
 Q-TOF
 Ion Trap

16
 Ανάλυση διαγραμμάτων

Ένα πεπτίδιο/μόριο

Σχετική
συχνότητα /
counts

Εύρος m/z

17
 Πρόβλημα: Πως
καταλαβαίνουμε το φορτίο ?

Από την απόσταση των

ισότοπων !

18
Protein Chips

MALDI

SELDI
Surface Enchanced Lazer
Disorption-Ionization
• Ion exchange
• Antibodies
• Proteins
• DNA

19
Δυο βασικοί τρόποι χρησιμοποίησης των
μικροσυστοιχιών

20
Workflow and principle of protein microarray
technology

21
Εφαρμογές της
πρωτεωμικής στην
αιματολογία

22
Ανάλυση 2DΕ
 Μελέτη Χρόνιας Μυελογενούς Λευχαμίας (S. Griffiths 2003)

 DIGE analysis  σήμανση δειγμάτων με διαφορετικές χρωστικές στο ίδιο

πήκτωμα

 1000 spots ανά gel

 Σύγκριση 2 μορφών χρόνιας λεμφοκυτταρικής

λευχαιμίας (Cochran DAE, 2004)
 Χρησιμοποίηση εξειδικευμένου λογισμικού

23
Δημιουργία «προφίλ» Πρωτεϊνικής Εκφρασης
(Protein expression profiling)
 Serum Proteomics

24
 Καρκίνος Ωοθηκών
 Ε. Perticoin 2002
 Test που αναγνώρισε όλα τα παθολογικά δείγματα
 Correlogic  OvaCheck

Καρκίνος του μαστού

 Rui et al 2003
 MALDT-TOF  HSP27, 14-3-3sigma ξεχώρισαν όλα τα παθολογικά

Καρκίνος προστάτη
 Ornstein, 2006
 annexin I

25
Serum profiling reveals distinctive proteomic markers
in
chronic myeloid leukaemia patients

 SELDI-TOF ανάλυση σε 23 δείγματα CML (Mohamedali, 2009)

26
Ο στόχος των serum proteomics

27
Πρωτεωμική ανάλυση στο πολλαπλό μυέλωμα και
στο Waldenstrom

Δημιουργία συγκριτικών προφίλ μεταξύ Waldenstrom, B-CLL και

πολλαπλού μυελώματος  Το Waldenstrom είναι πιο κοντά στο
πολλαπλό μυέλωμα παρά στην CLL
(2007, Henry)

28
Quantitative proteomics
 διαφορές μεταξύ μίας κατάστασης των κυττάρων και μίας άλλης
 σχετική μεταξύ τους σύγκριση και όχι τόσο σε απόλυτη μέτρηση

SELDI-TOF mass spectrometry for the

identification of
differentially expressed proteins in follicular
lymphoma transformation.
A matched pair of follicular lymphoma and
its transformed
counterpart from the same patient was
assessed using
strong anionic exchange surface chemistry

29
SILAC
Stabe Isotope LAbeling in Cell culture

Shui 2009
Mycobacterium tuberculosis Vs
Μακροφάγο  μελέτη
κινητοποίησης ανοσολογικού
μηχανισμού και παθογενειας
νόσου

30
ICAT
Isotope Coded Affinity Tag
Χαρακτηρισμός έκφρασης
και αλλαγών 491
μικροσωμικών πρωτεϊνών
κατά την ανάπτυξη των
προμυελοκυττάρων (Han
DK, 2001)

31
Μελέτη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων
Crockett DK. Μελέτη Τ-
αναπλαστικών
λεμφωμάτων

Ανάλυση
αλληλεπιδράσεων
υβριδικής πρωτεΐνης
NPM-ALK  46
πρωτεΐνες !

32
Chip Power
Κατασκευή μικροσυστοιχίας με 60 μονοκλωνικά έναντι αντιγόνων (CD’s)
λευχαιμικών κυττάρων και σύγκρισή τους με φυσιολογικά (Belov V, 2001)
 Επαλήθευση με κυτταρομετρία ροής
 Ασθένειες που μελετήθηκαν:
◦ Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία (CLL)
◦ Χρόνια λευχαιμία από τριχωτά κύτταρα (HCL)
◦ Λέμφωμα της ζώνης του μανδύα (MCL)
◦ Οξεία μυελογενής Λευχαιμία
◦ Τ-χρόνια λεμφοβλαστική Λευχαιμία

33
Απο το 2D-GE στα protein arrays
 Μελέτες άρχισαν το 1980 για εύρεση πεπτιδίων που διαφοροποιούν τις
Οξείες Λεμφοβλαστικές Λευχαιμίες μεταξύ τους και συγκριτικά με τις
Χρόνειες Μυελογενείς Λευχαιμίες (Hanash, 2002)

34
Functional proteomic profiling of AML predicts response and
survival. (Steven M. Kornblau, 2009)

35
36
 Καρκίνος
ουροδόχου κύστης
 Εφαρμογή SELDI
για αναζήτηση
δεικτών στα
ούρα(Vlahou et al.,
2001)

 Ανάπτυξη
αλγόρυθμου
διαχωρισμού
φυσιλογικών-
παθολογικών μετά
από «εξάσκηση»
με γνωστά
δείγματα (Wu DL,
2007)

37
SELDI Vs 2D&MS

38
Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις

39
Phosphotyrosine mapping in Bcr/Abl
oncoprotein
 Μελέτη φωσφορυλίωσης των τυροσινών σε 9 περιοχές της υβριδικής πρωτεΐνης
Bcr/Abl
 Απομόνωση της BCR/ABL με SDS-PAGE  Πέψη με θρυψίνη  ανάλυση με
MS/MS quadropole-TOF
 Προσδιορισμός 6 νέων περιοχών φωσφορυλίωσης
 Στόχοι για κατασκευή νέων φαρμάκων

40
Μελέτη προς μίμηση

Η δύναμη της πρωτεωμικής :

6600 phosphorylation sites on 2400 proteins

 Global view of cellular regulation

41
Μελέτες σε επίπεδο κυτταρικών διαμερισμάτων

Εκκρινόμενες πρωτεΐνες - Secretome

B. anthracis strain RA3R
(pXO1+/pXO2-) secretome proteins in
each role family.
Walz et al. Proteome Science 2007 5:11
  doi:10.1186/1477-5956-5-11

42
Πρωτεωμική μελέτη της επιφάνειας των
κυττάρων (Cell surface proteomics)

Biotinylation reagents provide a 'tag' that transforms

poorly detectable surface-membrane proteins into
probes that can be recognized by a labelled detection
reagent. a, Intact cells are tagged using lipid-insoluble
biotin reagents. Tagged proteins are captured after cell
lysis using avidin columns and subsequently eluted.
Following a separation step using 2D gels or other
means, tagged proteins are detected with a labelled
avidin conjugate. Individual proteins are identified by
mass spectrometry. b, Close-up section of a 2D
pattern in which biotinylated proteins are selectively
visualized (top) in contrast with the pattern of the
same whole-cell lysate visualized by silver staining
(bottom). Several selectively visualized proteins were
found to have chaperone functions

Disease proteomics
Sam Hanash
Nature 422, 226-232(13 March 2003
43
Πρωτεωμική ανάλυση της κυτταρικής μεμβράνης των β-
λεμφοκυττάρων στην Β-ΧΛΛ  Αναγνώριση δυο νέων
πρωτεϊνών, BCNP1 και MIG2b

plasma-membrane fractions  one-dimensional gels  trypsinized fractions

 MALDI-TOF mass spectrometry.

44
Πρωτεωμική μελέτη των οργανιδίων

An organelle is isolated by biochemical methods such as density-

gradient centrifugation. a, Scanning electron microscopy shows the
result of purification of the human nucleolus. The organellar proteins
are then solubilized, optionally fractionated, and analysed by the
methods described in Fig. 1; this results in a list of proteins that are
candidate constituents of the complex. At this stage MS-based
proteomics is combined with imaging techniques such as laser
confocal scanning fluorescence microscopy of yellow fluorescent
protein (YFP)-tagged members of the complex. b, The right panel
shows localization of one of the new proteins found by proteomics to
subnuclear structures termed 'paraspeckles'. The left panel shows
that inhibition of transcription by actinomycin D leads to
reorganization of the nucleoli and concentration of the novel protein
to cap structures. c, Functional categorization of the proteins in the
organelle. More than 400 proteins have been found and can be
assayed for dynamic localization and biochemical function in the
context of the nucleolus.

Mass spectrometry-based proteomics

Ruedi Aebersold and Matthias Mann
Nature 422, 198-207(13 March 2003)

45
Συνολική Προσέγγιση όλων των κυτταρικών
διαμερισμάτων

Mining the plasma proteome for cancer biom

arkers
Samir M. Hanash, Sharon J. Pitteri & Vitor M.
Faca
Nature 452, 571-579(3 April 2008)
46
Που παμε ?

47
Tests

48
 Ο κόσμος των -omics
proteomics

metabolomics
genomics

transcriptomics

metallomics spliceomics

lipidomics kinomics
glycomics
Economic$

49
Ευχαριστώ πολύ !

50